PT98706B - Linhas celulares de hibridoma anticorpos monoclonais contra leptosphaeria produzidos por elas e metodos para a sua producao e utilizacao - Google Patents

Description

presente invento estã relacionado com o campo do diagnóstico de patologia vegetal. Mais especificamente, o invento está relacionado com anticorpos monoclonais úteis na detecção de espécies de fungos patogénicos do género Leptosphaeria. Mais especificamente, o presente invento proporciona anticorpos monoclonais que reagem especificamente com uma única espécie de Leptosphaeria.

Fungos patogénios

Os fungos são um grupo que causa muitas doenças nas plantas. Para fins de discussão os fungos podem ser classificados como pertencendo a uma das três principais classes taxonõmicas: Basidiomycetes, Phycomycetes e Ascomycetes.

Basidiomycetes: Os membros desta classe são identificados pela presença de uma estrutura formadora de esporos conhecida como basídio. As formas patogénicas incluem fuligens, ferrugens e espécies carnudas tais como cogumelos. Exemplos incluem ferrugem do trigo, ferrugem em pústulas do pinheiro branco, ferrugem da pinha do cedro e fuligens que causam doenças em milho, aveia, cevada, cebolas e trigo.

Ascomycetes: Os membros desta classe possuem uma estrutura reprodutora especializada (um asco) no qual se desenrolam a meiose e a formação de esporos sexuados. Exemplos das doenças de plantas mais comuns em que os Ascomycetes foram identificados como agente etiológico incluem: míldios pulverulentos em cereais, frutos e muitas outras colheitas; doença do elmo holandês; cravagem dos grãos, podridão castanha do pêssego e da ameixa; manchas negras das rosas assim como crostas das maçãs.

-3 —

Phycomicetes: Os membros desta classe são considerados como sendo mais primitivos do que os membros dos Ascomycetes ou Basidiomycetes, a sua característica morfológica distinta sendo a ausência de septos no micélio. Exemplos de doenças causadas por membros da classe incluem os míldios da videira e de outros hospedeiros, podridão da raiz e ferrugem tardia da batateira e do tomateiro.

Relativamente ao presente invento, os membros da classe Ascomycetes e a família Pleosporaceae e particularmente o género Leptosphaeria, são de particular interesse. 0 género é grande, contendo muitas espécies que são patogénicas para plantas de grande importância económica. Uma compilação recente dos fungos patogénicos para as plantas nos U.S. tem uma lista de 140 espécies de Leptosphaeria como patogéníos de plantas (Farr et al., 1989). O corpo de frutificação de Leptosphaeria é um pseudotécio ostiolato peritecióide contendo ascos bitunicados, cade um deles contendo oito ascósporos com três ou mais septos. Em muitos casos, os ascósporos são o mecanismo primário de sobrevivência de espécies patogénicas de Leptosphaeria na ausência de uma planta hospedeira susceptível ou em condições ambientais desfavoráveis. Os ascósporos muitas vezes também servem como fonte primária de inoculo num cultura hospedeira. Muitas das espécies de Leptosphaeria também produzem fases conidiais não-sexuadas; os conídios podem ser originados em picnidios, em acérvulos ou em conidióforos livres. Em muitos casos, a fase conidial é muitas vezes encontrada na natureza. A fase conidial é geralmente classificada separadamente a partir da fase sexuada com base na morfologia. Assim, espécies no género Leptosphaeria tem fases conidiais classificadas como um número de diferentes géneros dos Fungos Imperfeitos (Deuteromycetes).

O sistema de classificação de fases assexuadas dos fungos ascomicetes é geralmente considerada como artifical mas continua por razões práticas, uma vez que as fases sexuadas são muitas vezes díficeis de encontrar na natureza e podem ser díficeis de induzir em cultura pura. No entanto, o grau de relação das espécies umas com as outras reflecte-se na classifi, cação sexuada; i.e. duas espécies de Leptosphaeria estão provavelmente mais estreitamente relacionadas geneticamente uma com a outra do que duas espécies de Septoria as quais são designadas com base nas semelhanças morfológicas da fase assexuada.

>

As espécies patogénicas de Leptosphaeria cusam doença nas partes aéreas das plantas, a maior parte das vezes as folhas e caules. Os sintomas são lesões que podem englobar uma grande parte da área foliar em padrões irregulares ou regulares, dependendo da cultura. Uma série de doenças desvastadoras economicamente importantes a nível mundial são causadas por espécies de Leptosphaeria e requere a utilização de variedades resistentes e/ou fungicidas para controle. Leptosphaeria nodorum. mais normalmente conhecida pela sua fase assexuada, Septoria nodorum. causa perdas de rendimento na produção de trigo a nível mundial a menos que seja controlada por fungicidas ou variedades resistentes.

>

L. nodorum apresenta um período de latência de várias semanas após a infecção, em que o patogénio cresce no tecido mas os sintomas da doença (manchas da folha e da gluma) não são produzidos. Os fungicidas são mais eficazes no controle da doença se aplicados durante o período de latência, antes de ocorrer danos significativos sejam produzidos inóculos secundários que permitirão o alastramento da doença. No entanto, os tratamentos preventivos de rotina com fungicidas não são geralmente justificados economicamente ou em termos de ambiente, assim um sistema

que permita a detecção muito precoce deste patogénio, de preferência durante a fase latente do desenvolvimento da doença, será muito útil para assegurar que os fungicidas sejam usados adequadamente e proporciona benefícios económicos máximos. 0 presente invento permite que tal sistema seja colocado em prática ao proporcionar anticorpos monoclonais que sejam capazes de detectar a presença de antigénios de L. nodorum. permitindo assim o diagnóstico precoce da doença e possível prevenção do alastramentro de perdas nas culturas de trigo.

Tecnologia de anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura. Estas incluem a técnica de hibridomas originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (1980), a técnica de hibridomas de células B humanas (Kosbor et al., 1983) e a técnica de hibridomas com EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985). Cada uma das linhas celulares sintetiza uma imunoglobulina homogénea que representa um de uma miríade de tipos de anticorpos que um animal pode produzir em resposta a um antigénio in vivo. Uma vez que cada um dos clones produtor de imunoglobulina é caracterizado pelo único tipo de anticorpo que produz, foi adoptado o termo anticorpo monoclonal. As vantagens dos anticorpos monoclonais são numerosas; eles podem ser obtidos em grande quantidade; a preparação é homogénea relativamente à reactividade do antigénio e permanece assim ao longo do tempo.

O principio da tecnologia de hibridomas/monoclonais baseia-se na observação de que quando duas células somáticas são fundidas, o híbrido resultante apresenta características de ambos os tipos de células parentais. No caso da produção de anticorpos

monoclonais a capacidade para sintetizar o anticorpo particular deriva de uma célula imunocompetente (geralmente uma célula do baço) retirada de um animal dador imunizado, enquanto que a capacidade para se dividir continuamente em cultura celular é contribuída pelo outro parceiro de fusão, uma linha celular tumoral (muitas vezes mieloma). As fusões iniciais foram dificultadas pelo facto de a linha celular de mieloma também produzir um anticorpo monoclonal; assim o híbrido muitas vezes produzia dois tipos de anticorpo monoclonal, um derivado de mieloma e o outro dirigido pela informação genética da célula imunocompetente. Subsequentemente foram usadas linhas de células tumorais incapazes de produzir os seus próprios anticorpos monoclonais, e.g., SP2/O-Agl4 ou X63-Ag8.653, simplificando assim a análise dos produtos de fusão resultantes.

Uma outra consideração técnica envolve a selecção da casos de fusão com êxito (células híbridas) a partir dos dois tipos de células parentais. De rotina usa-se um milhão ou mais de células de cada tipo no protocolo de fusão e uma vez que a fusão não ocorre com 100% de frequência, o trabalho de tentar recuperar produtos de fusãoa partir do elevado fundo de células parentais não fundidas ou auto-fundidas pode ser demasiado. Conforme mencionado, os hibridomas são formados pela fusão de células (do baço) produtoras de anticorpos e células de mieloma de cultura contínua. O resultado pretendido é uma linha celular com tempo de vida indefinido em cultura que produz anticorpo. Uma vez que as células do baço têm um tempo de vida finito em cultura pode-se simplesmente esperar um período adequado para que todas as células do baço não fundidas ou auto-fundidas morram; no entanto, deve.se ainda recuperar a partir da população resultante as células com tempo de vida indefenido produtoras de anticorpos de entre as células não produtoras de anticorpos mas com tempo de vida indefinido. Um meio popular para a selecção de células híbridas é o chamdo sistema de selecção HAT. Este sistema envolve a utilização da enzima hipoxantina-ganinafosforribosil-transferase (HGPRT). Esta enzima funciona na via de salvação de purinas em células de mamífero. Estas células são também capazes de sintetizar purinas de novo. Na maior parte das condições provavelmente ambas as vias funcionam até certo ponto. Se uma célula não possuir HGPRT, a via de salvação é bloqueada e as purinas devem ser produzidas a patir de materiais não purinas.

A droga 8-azaguanina é um antimetabolito que é cpaz de mascarar a purina guanina e substitui-la nalgumas das suas reacções normais. A azaguanina é incorporada no DNA, interferindo com o padrão de crescimento normal e conduzindo à morte celular. Uma vez que a azaguanina deve ser salvada, qualquer célula que não possua actividade HGPRT não pode utilizar azaguanina e crescerá na sua presença.

Um sistema selectivo que opera usando a mesma enzima mas em sentido oposto em que as células positivas para HGPRT são seleccionadas foi descrito por Littlefield (1964). Chama-se HAT e contem hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). A aminopterina é um antimetabolito que evita a síntese de novo das purinas e a metilação do desoxiuridilato para formar timidilato. A hipoxantina pode servir como uma purina salvável no caso da aminopterina bloquear a biossíntese de novo de purinasenquanto a timidina ultrapassa a necessidade da metilação do timidilato. Assim, na presença de aminopterina qualquer célula com actividade HGPRT positiva proliferará enquanto as células com actividade HGRP negativa morrerão.

Um sistema alternativo ao sistema HAT é a utilização do meio HMT em vez de HAT. HMT emprega aminopterina (metotrexato) em vez de aminopterina. Este método opera segundo os mesmos

príncipios mas o meio HMT é ligeiramente ménõs tóxico para os hibridomas em crescimento e portanto as células podem ser deixadas no meio durante um período de tempo mais longo.

No sistema híbrido usado para selecção de acordo com os presentes exemplos, as células de mieloma são resistentes à azaguanina e susceptíveis à aminopterina, ou seja, elas são HGPRT negativos. Assim, elas morrerão na presença de aminopterina. Através da fusão das células e seu crescimento em meio HATsem azaguanina (meio HT), as células fundidas com êxito são seleccionadas pois as células de mieloma que constituem a linha proliferante podem crescer apenas onde esteja presente actividade HGPRT e a sua actividade deve ser fornecida pela linha celular HGPRT positivas. A linha celular HGPRT positiva produtora de anticorpo não morrem neste meio. Elas osbrevivem durante algum tempo mas não proliferam.

Assim, pela fusão das células num meio HAT ou HMT, são produzidos sistemas em que as células de mieloma e as células produtoras de anticorpos podem crescer durante tempo suficiente para produzir células híbridas mas em que apenas as células híbridas podem sobreviver e proliferar. Após selecção cada um dos clones de hibridoma é então testado relativamente à sua capacidade para produzir o anticorpo particular com interesse.

presente invento proporciona linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais que reagem especificamente com pelo menos uma espécie do género Leptosphaeria mas não reagem com espécies fora do género. Numa realização, o anticorpo monoclonal reage especificamente com uma única espécie de Leptosphaeria (Septoria) nodorum. Ao longo da especificação o nome Leptosphaeria será usado indistintamente com o nome do seu

anamorfo ou fase assexuada; assim, um anticorpo que reage com L. nodorum também reage com a fase assexuada Septoria nodorum.

A disponibilidade destes monoclonais proporciona um meio de diagnóstico de infecções por Leptosphaeria em material vegetal. Assim, é proporcionado um método para o diagnóstico de tais infecções o qual se caracteriza pelo contacto de uma amostra vegetal suspeita de ter antigénios do patogénio com interesse com um anticorpo tendo especificidade para o patogénio e observação da presença ou ausência de uma reacção entre o anticorpo e o antigénio presente na amostra. Numa realização preferida, o ensaio é conduzido como uma sanduíche ou ensaio com dois anticorpos: um primeiro anticorpo que reage com o patogénio de interesse é colocado em contacto com a amostra vegetal e depois um segundo anticorpo que também reage com o patogénio de interesse é adicionado, para formar um complexo anticorpo-antigénio-anticorpo, se o antigénio estiver presente na amostra.

Relativamente a isto também são proporcionados kits para a detecção de Leptosphaeria os quais compreendem um anticorpo, de preferência imobilizado, que reage com a espécie de interesse e um anticorpo marcado de forma detectável que reage com a espécie de interesse. Pelo menos um dos anticorpos deverá ser um anticorpo monoclonal do presente invento.

A Figura 1 mostra uma comparação de sensibilidades rápidas em ensaios de cavidades múltiplas do Senl (004) em extractos de trigo saudáveis.

Preparação de anticorpos

Preparação de extractos de Leptosphaeria: O extracto de

Leptosphaerja que contem antigénio usado na produção de anticorpos monoclonais contra Leptosphaeria pode ser preparado a a partir de uma cultura de Leptosphaeria. Leptosphaeria pode ser cultivada em meio de cultura solidifcado com agar e/ou meio de cultura líquido exemplos dos quais incluem mas não estão limitados a Czapek Dox V-8, Malte de Levedura, Dextrose de Batata, Farinha de aveia. Numa realização preferida, usa-se de preferência Czapek Dox (Eyal et al., 1987). As culturas podem ser colhidas usando processos convencionais.

Leptosphaeria colhidos podem conhecidos. Numa realização abaixo, os extractos de

Os extractos dos fungos ser preparados usando processos específica como será descrito

Leptosphaeria podem ser obtidos por processos conhecidos tais como processamento da Leptosphaeria colhida através de um moinho Dyno ou de um Waring Blender ou através de sonicação, homogenização ou fricção.

Imunização; 0 programa para inoculação não é crítico e pode ser qualquer normalmente usado para este fim. Tais processos estão descritos por exemplo em Goding (1986) .

Um programa útil é um em gue a primeira imunização é dada intraperitonealmente com o antigénio combinado com um adjuvante adequado. As injecções de reforço podem então ser administradas com intervalos de duas semanas. Podem ser dadas duas ou mais injecções de reforço. Os animais são sangrados na cauda para determinar se o soro imune contem anticorpos específicos contra o antigénio de interesse. O animal é subsequentemente sacrificado e o baço removido para proporcionar uma fonte de linfócitos.

Fusão: Os processos de fusão para a criação de hibridomas são bem conhecidos e qualquer um dos processos conhecidos é útil para a produção de hibridomas produtores de monoclonais específicos para Leptosphaeria. 0 processo básico usado nas presentes amostras é uma modificação do desenvolvido por Kohler e Milstein (1975) e Hammerling (1977). Outras técnicas que ficaram recentemente disponíveis, tais como a técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor e Roder, 1983) e a técnica de hibridomas com EBV (Cole et al. 1985) que podem ser usadas para produzir anticorpos monoclonais humanos são consideradas dentro do âmbito do presente invento.

Numa realização, as células do baço (ou alternativamente linfócitos de sangue periférico) são isoladas a partir do animal imunizado e contado o número de células. As células T podem ser usadas como uma camada de suporte numa concentração de 10 milhões de células/10 ml de meio. Uma linha celular imortal adequada, de preferência uma linha celular de mieloma é seleccionada e adicionada aos linfócitos numa proporção de cerca de 4:1 linfócitosmieloma. Uma linha de células de mieloma útil é a linha NS1. À temperatura ambiente, adiciona-se PEG (polietilenoglicol) 1500 às células combinadas e depois dilui-se lentamente com DMEM. Após centrifugação, adiciona-se meio HAT pré-aquecido ao sedimento que é ressuspenso. A amostra é ainda diluída com meio HAT e amostras pequenas distribuídas pelas cavidades de uma placa de microtitulação. As placas são então colocadas em 9% CC>₂ com pelo menos 95% de humidade. As células são novamente alimentadas com meio HAT após 5 a 7 dias. Começam a aparecer grupos de células de hibridoma após cerca de 5 a 7 dias. Fizeram-se outras adições de meio HT.

Numa realização podem ser usados èxtractos de patogénio. Numa reealização específica o material de uma planta

-12infectada com o fungo pode ser usado num ensaio com dois anticorpos. Tal ensaio com dois anticorpos pode envolver a utilização de um anticorpo policlonal feito contra Leotosphaeria como anticorpo de captura, o material vegetal, um sobrenadante do anticorpo monoclonal e o conjugado anti-murganho-enzima.

Rastreio: Os hibridomas produtores de anticorpos contra Leptosphaeria foram identificados usando material de fungos preparado a partir da espécie particular com interesse num formato de ELISA. Numa realaização, os extractos de patogénio podem se usados. Numa realização específica o material de uma planta infectada com o fungo pode ser usado num ensaio com dois anticorpos. Tal ensaio com dois anticorpos pode envolver a utilização de um anticorpo policlonal feito contra Leptosphaeria como anticorpo de captura, o material vegetal, um sobrenadante de anticorpo monoclonal e conjugado anti-murganho-enzima. As cavidades que apresentaram respostas positivas na ELISA foram subclonadas para seleccionar estirpes puras de células de hibridoma. As linhas subclonadas foram novamente testadas quanto à especificidade da actividade do anticorpo contra os componentes fúngicos.

Para determinar o grau de especificidade dos anticorpos seleccionados, é desejável fazer o seu rastreio contra um painel de patogénios fúngicos que possam estar ou não relacionados com Leptosphaeria. Por exemplo, para se obter um anticorpo específico de L. (S) nodorum, os anticorpos seleccionados deverão ser testados contra outras espécies mais afastadas ou mesmo não relacionadas.

Exemplos de painéis usados com a presente finalidade estão apresentados nas Tabelas 1 e 3. É geralmente recomendado realizar os rastreios no formato de um só anticorpo ou com dois

-13anticorpos, pois certos anticorpos podem ser úteis num formato mas não noutro.

Caracterização de anticorpos: Uma série de anticorpos que estão inseridos no âmbito de uma ou mais das reivindicações do invento foram produzidos de acordo com os métodos descritos. Numa realização foram produzidos vários anticorpos monoclonais que reagem especificamente com l·. (S.) nodorum. Numa realização específica, o anticorpo é Senl5C6(ATCC HB 10185), um anticorpo de alta especificidade que pode ser usado num formato com dois anticorpos. Senl5C6 é também altamente reactivo com l·. nodorum. A única excepção é uma reacção positiva observada com a espécie S. avenae f. sp. triticea. Esta espécie nominal é virtualmente idêntica morfologicamente a L. (S.) nodorum e provoca sintomas semelhantes em trigo infectado. Assim, pensa-se que estas duas espécies sejam a mesma. Assim, o anticorpo produzido pelo hibridoma Senl5C6 é muito útil na identificação precisa e específica dos antigénios de L. nodorum. Este monoclonal é da subclasse imunoglobular IgG2a; no entanto, também foram preparados outros anticorpos semelhantes de outras subclasses imunoglobulares.

Se bem que os hibridomas e monoclonais que identificam L. nodorum representem uma realização preferida, o presente invento não lhes está limitado. Utilizando os métodos de imunização, fusão e selecção descritos, podem também ser feitos anticorpos monoclonais específicos da espécie, usando como imunogénio o extracto da espécie adequada. Por exemplo, monoclonais tendo especificidade contra as espécies L. korrae, L. maculans, 1. pratensis e L. sacchari também estão dentro do âmbito do invento.

Método e kit de diagnóstico

Como se mostrou atrás os patogénios em questão são capazes de provocar danos graves em plantas que sejam infectadas por eles e o diagnóstico precoce é pois altamente desejável. Os presentes anticorpos proporcionam um método pelo qual os patogénios podem ser detectados no material vegetal antes de quaisquer sintomas vísiveis da doença surgirem na planta.

Os anticorpos descritos atrás podem ser usados como reagentes básicos de uma série de diferentes imunoensaios para determinar a presença de uma espécie particular no material vegetal. Falando de um modo geral, os anticorpos podem ser empregues em qualquer tipo de imunoensaio, qualitativo ou quantitativo. Isto inclui ensaios com um único sítio e com dois sítios ou sanduíche, ensaios do tipo não competitivo assim como em ensaios de ligação competitiva tradicionais. Os anticorpos podem também ser usados num formato de ensaio com um sítio, por exemplo usando um imunoensaio de fluxo através do dispositivo ou métodos descritos infra.

Por facilidade de detecção e pela sua natureza quantitativa são particularmente preferidos os ensaios em sanduíche ou com dois anticorpos, dos quais existe uma série de variações, todas elas estando incluídas pelo presente invento.

Por exemplo num ensaio típico o anticorpo não marcado é imobilizado num substrato sólido e a amostra a ser testada é colocada em contacto com a molécula ligada após um período adequado de incubação, durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo binário anticorpo-antigénio. 0 material não ligado é removido por lavagem. Nesta altura, um segundo anticorpo, marcado com uma molécula repórter

capaz de induzir um sinal detectável, é então adicionado e incubado, deixando tempo suficiente para a formação de um complexo ternário anticorpo-antigénio-anticorpo. Qualquer material que não tenha reagido é removido por lavagem e a presença do antigénio é determinada pela observação de um sinal ou pode ser quantificada por comparação com uma amostra testemunha contendo quantidades conhecidas de antigénio. Variações do ensaio incluem o ensaio simultâneo, no qual tanto a amostra como o anticorpo são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado ou um ensaio reverso em que o anticorpo marcado e a amostra a ser testada são primeiro combinados, incubados e adicionados ao anticorpo não marcado ligado à superfície. Estas técnicas são bem conhecidas dos familiarizados com a área e serão facilmente imagináveis possibilidades de pequenas variações. Tal como aqui é usado o termo ensaio em sanduíche pretende englobar todas as variações da técnica básica de dois sítios.

Para os imunoensaios do presente invento, o único factor limitante é que pelo menos um anticorpo tenha a especificidade pretendida. Assim, são possíveis várias combinações. Por exemplo, um anticorpo pode ser policlonal e o outro monoclonal. Como alternativa um anticorpo pode ser um anticorpo geral o qual se liga ao patogénio com interesse e a a outros fungo, enquanto que o segundo anticorpo é específico para o patogénio com interesse. Também, ambos os anticorpos podem ser específicos para o patogénio com interesse.

Como um exemplo mais específico, num ensaio de sanduíche típico, um anticorpo geral de ligação a Leptosphaeria é ligado covalentemente ou passivamente a uma superfície sólida. A superfície sólida é geralmente poliacrilamida, nylon, polistireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser na forma de tubos, esferas, discos ou microplacas, ou

-16qualquer outra superfície adequada à realização do ensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos no campo. Após ligação, o complexo fase sólida-anticorpo é lavado na preparação para a amostra a testar. Uma pequena quantidade do extracto vegetal a ser testado é então adicionado ao complexo em fase sólida e incubada a 25°C durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação de qualquer Leptosphaeria presente ao anticorpo. 0 período de incubação variará, mas será geralmente na gama de aproximadamente 2 min a 16 horas. Após o período de incubação, a fase sólida com Leptosphaeria-anticorpo é lavada e seca e incubada com um segundo anticorpo específico para Leptosphaeria. 0 segundo anticorpo é ligado a uma molécula repórter, o sinal vísivel da qual é usado para indicar a ligação so segundo anticorpo a qualquer antigénio na amostra. 0 termo molécula repórter, como aqui é usado significa uma molécula que pela sua natureza química, proporciona um sinal analiticamente detectável que permite a detecção de anticorpo ligado a antigénio. A detecção deve ser pelo menos relativamente quantificável, para permitir a determinação da quantidade de antigénio na amostra. Isto pode ser calculado em termos absolutos, ou pode ser feito em comparação com um padrão (ou série de padrões) contendo um nível normal conhecido de antigénio.

As moléculas repórter mais vulgarmente usadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas contendo radionuclidos. No caso de um imunoensaio com uma enzima, uma enzima é conjugada com o segundo anticorpo, por vezes por meio de glutaraldeído ou periodato. Tal como será facilmente reconhecido, no entanto, existe uma grande variedade de técnicas de ligação diferentes as quais são bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Enzimas normalmente usadas incluem peroxidase de rábano silvestre, glucose-oxidase, β-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a serem usados com as enzimas

-17específicas são geralmente escolhidos para a produção, quando da hidrólise pela correspondente enzima de uma alteração de cor detectável. Por exemplo o p-nitrofenilfosfato é adequado para usar com conjugados de fosfatase alcalina; para conjugados com peroxidase são normalmente usados 1,2-fenilenodiamina ou toluidina. É também possível empregar substratos fluorogénicos, os quais dão um produto fluorescente em vez dos substratos cromogénicos referidos atrás. Em todos os casos, o anticorpo marcado com uma enzima específico do antigénio é adicionado ao complexo primeiro anticorpo-Lentosnhaeria, deixado ligar-se ao complexo, depois o excesso de reagente é removido por lavagem. Uma solução contendo o substrato adequado é então adicionada ao complexo terciário de anticorpo-antigénio-anticoro marcado. 0 substrato reage com a enzima ligada ao segundo anticorpo, dando um sinal visual qualitativo, o qual pode ser ainda quantificado, geralmente por espectrofotometria, para dar uma avaliação da quantidade de antigénio que está presente na amostra de soro.

Como alternativa, compostos fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina podem ser acoplados quimicamente a anticorpos sem alteração da sua capacidade de ligação. Quando activados por iluminação com luz de um comprimento de onda particular, o anticorpo marcado com fluorocromo absorve a energia luminosa, induzindo um estado de excitabilidade da molécula, seguido de emissão da luz num comprimento de onda característico. A emissão surge como uma cor característica detectável visualmente com um microscópio de luz. Como na EIA, o anticorpo específico de PIF marcado com uma marca fluorescente é deixado ligar ao complexo primeiro anticorpo-ferritina. Após lavagem do reagente não ligado, o restante complexo ternário é então exposto à luz de comprimento de onda adequado e a fluorescência observada indica a presença de interesse. As técnicas de imunofluorescência e EIA estão ambas muito bem estabelecidas e são particularmente

preferidas para o presente método. No entanto, outras moléculas repórter tais como radioisótopos, moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes podem também ser empregues. Será facilmente aparente para os familiarizados com a matéria, como variar o processo de forma a adaptã-lo à utilização necessária.

, Exemplos

Depósito de microorganismos: O hibridoma Senl5C6 foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland em 25 de Julho de 1989 e foi-lhe atribuído o número de acesso HB 10185.

Os exemplos que se seguem ilustram os métodos de preparação dos hibridomas e anticorpos do presente invento.

Exemplo 1: Preparação de antigénio

Um pedaço de agar de uma cultura viável de L, (S) nodorum foi invertido sobre agar C-D (Czapek-Dox): (Difco) ou placa de PDA (Potato Dextrose Agar) (Difco) e o pedaço de agar foi esfregado sobre a superfície. A placa foi incubada à temperatura ambiente e luz durante 5 a 7 dias.

Todas as colónias foram retiradas assepticamente da placa de agar e colocadas numa câmara estéril Omni-Mixer de 250 ml. 50 ml de meio de Czapek (Difco) estéril foi adicionado à câmara do Omni-Mixer e os fungos foram homogenizados a 6000 rpm durante 30 segundos.

Dez frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de solução de Czapek foram inoculados com 1 ml de homogenato de cultura cada um. Os frascos inoculados foram colocados num

agitador (alta velocidade entre 22 e 24°C com luz ambiente). Após dias, as culturas foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS.

As culturas de fungos foram transferidas para uma câmara de 150 ml de um DYNO-MILL tipo KDL contendo 240 ml de esferas de vidro sem chumbo de 0,50 mm [IMPANDEX]. A manta de arrefecimento da câmara foi previamente arrefecida para 8°C com água da torneira fria. 0 extracto foi triturado a 3000 rpm durante 5 minutos após o que o conteúdo da câmara foi transferido para tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugado a 13000 rpm numa centrífuga refrigerada Sorvall RC-5B num rotor SS-34. O sobrenadante dos fungos foi distribuído e congelado até ser usado. O teor em proteína total das amostras variou entre 0,1 e 1,0 mg de proteína/ml.

Exemplo 2: Imunização e fusão

Um murganho Balb/c foi imunizado intraperitonealmente com 0,2 ml de extracto de fungo do isolado Sen 1-001 em 0,2 ml de adjuvante completo de freund. 0 murganho recebeu uma injecção de reforço 14 dias mais tarde com o mesmo extracto de fungos em adjuvante incompleto de Freund. Um segundo reforço seguiu-se dentro de 12 dias. 0 murganho foi sangrado na veia da cauda 7 dias mais tarde e o soro testado quanto â presença de anticorpos específicos do imunogénio. O murganho foi sacrificado por deslocamento cervical no dia seguinte e o baço retirado para extracção de linfócitos. 0 baço foi colocado numa placa de petri estéril rejeitável sobre um écran estéril de 80 mesh, cortado com um bisturi e massajado com um êmbolo estéril de uma seringa de 3 cc. Durante este processo, o baço foi lavado várias vezes com DMEM. A suspensão de células foi transferida para um tubo de centrífuga estéril rejeitável de 50 ml. O écran e os restantes fragmentos de tecido foram lavados novamente com DMEM e as lavagens adicionadas

-20ao tubo. A suspensão de células foi centrifUgada a 2000 rpm durante 10 minutos (as centrifugações foram todas feitas à temperatura ambiente). O sobrenadante foi decantado e o sedimento

lavado com 4 ml de solução de lise de eritrócitos (0,83NH.C1, 4 ’

0,01M KHCO₃, 0,1 mM EDTA) ambiente. A reacção de lise durante 90 segundos à temperatura foi parada por diluição do conteúdo do tubo para 45 ml com DMEM. 0 conteúdo foi centrifugado novamente a 2000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado e o sedimento foi ressuspenso em 10 ml de DMEM. Uma amostra da suspensão celular foi guardada para contagem das células. O número total de células viáveis na suspensão é de 2,26 x 10 células.

As células de mieloma (P3NS1/1-Ag4-1) (NS1) adquiridas à American Type Culture Collection, ATCC #TIP-18) foram retiradas do meio de cultura por centrifugação num tubo de centrífuga estéril de a 2000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi decantado e o sedimento ressupenso em 10 ml de DMEM para contagem das células. 5,65 x 10 células de mieloma foram adicionadas à suspensão de células de baço. As células combinadas foram centrifugadas a 2000 rpm durante 10 minutos. Após centrifugação o sobrenadante foi decantado.

Adicionou-se ao sedimento 1 ml de PEG 1500 (1 ml) (Boehringer Mannheim Biochemicals, cat. #783-641) à temperatura ambiente. As células foram ressuspensas muito suavemente com uma piupeta de 2 ml e um pipetador automático. A suspensão de células foi diluida muito lentamente pela adição de 10 ml de DMEM gota a gota, ao longo de 10 minutos com agitação suave do tubo para manter as células em suspensão. A suspensão foi enão lentamente diluida para 45 ml com DMEM e centrifugada durante 10 minutos a 1500 rpm. O sobrenadante foi decantado, o sedimento lavado suavemente com 10 ml de DMEM e novamente centrifugado a 1500 rpm

durante 10 minutos. Após as lavagens das células fundidas, as células foram ressuspensas em meio HAT previamente aquecido contendo 0,5% Origin-HCF (#IG-50-0615 Fisher Scientific) e duas gotas da suspensão foram colocadas em cada uma de 60 cavidades de placas Primaria Microtest III (Falcon #3870) deixando vazia a fila de cavidades de fora. As cavidades de fora receberam 200 μΐ de DMEM contendo penicilina/estreptomicina e as placas foram colocadas numa câmara de C0₂·

As células foram novamente alimentadas após 7 dias com meio HAT/5% Origen-HCF. Os grupos de células de hibridomas

Γ começaram a aparecer após 5 a 7 dias. Adicionou-se mais meio sem

Vk-r amingstern ou Origen-HCF.

Exemplo 3: Despiste dos hibridomas

Extracto micelial de Senl-001 foi diluido para 5 /xg/ml em tampão carbonato (1,59 g/1 de Na₂CO₃, 2,93 g/1 NaH₂CO₃, pH 9,6) e 360 μΐ foi colocado em cada uma das cavidades da placa de microtitulação (Nunc #468667). Após uma incubação de 3 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão carbonato. Os sítios de ligação restantes nas placas foram bloqueados pela adição de 400 μΐ por cavidade de solução de leite em pó desnatado. Após 30 minutos, a solução de leite em pó desnatado foi retirada das placas, as placas foram secas sobre toalhas de papel e secas durante a noite numa câmara de convecção a 37°C (Precision, Modelo 4EM, #31574). 100 μΐ de sobrenadante foi colocado em cada uma das cavidades e incubado 10 minutos num agitador de placas (Flow, #541305). A solução residual foi rejeitada e as placas lavadas 5 vezes com tampão de lavagem (24,2 g/1 de Tris, 87,87 g/1 de NaCl, 0,1 g/1 de Thimerosal, 50 g/1

Tween-80, pH 7,87). A cada uma das cavidades adicionou-se então 100 μΐ de Conjugado de cabra-peroxidase anti-IgG de murganho KPL

-22(diluido a 1:1000 em 0,1% BSA-PBS (1/xg/l de BSA, 2,18 g/1 de NaH₂PO₄, 0,56 g/1 de NaH₂PC>₄, 8,76 g/1 NaCl, pH 7,2) e incubou-se 10 minutos num agitador. A restante solução foi rejeitada e as placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem. 100 jul de substrato ABTS (23 g/1 ácido cítrico, 0,5 ml/1 30% ^H2°2^z P^{H 4}'⁰' 15 mg/ml de ABTS; ABTS concentrado foi diluído a 1:25 em tampão de ácido cítrico) foi colocado em cada uma das cavidades e incubado 10 minutos num agitador. A reacção foi parada pela adição de 50 μΐ por cavidade de 1,5% NaF. A absorvância foi lida a 405 nm.

Encontrou-se uma série de hibridomas secretores de anticorpos que reagem com L. nodorum. Fez-se um rastreio de um só anticorpo com um painel expandido de isolados de L. nodorum para determinar a reactividade dos anticorpos com uma larga gama de diferentes isolados (Tabela 1).

-23Tabela 1; Rastreio por ELISA indirecta com um só anticorpo de seis anticorpos monoclonais feitos contra L. nodorum contra isolados de L. nodorum

Monoclonais contra L.	f S.) nodorum
Isolado	8C7	5C6	11E3	6F3	5C3	7E9
Média	0,503	0,578	0,623	0,237	0,237	0,455
Sen 1	0,426	0,575	0,150	0,194	0,085	0,233
Sen 2	0,527	0,193	0,355	0,239	0,108	0,255
Sen 4	0,350	0,702	0,452	0,223	0,128	0,266
Sen 6	0,087	0,086	0,070	0,182	0,029	0,059
Sen 7	0,179	0,233	0,411	0,839	0,019	0,072
Sen 8	0,738	0,979	0,627	0,804	0,214	0,404
Sen 9	0,888	1,264	0,726	0,377	0,571	0,836
Sen 10	0,391	0,349	0,619	0,368	0,192	0,361
Sen 11	1,396	2,000	0,499	0,582	0,536	0,873
Sen 14	0,037	0,025	0,017	0,295	0,013	0,023
Sen 16	0,000	0,000	0,080	0,423	0,000	0,000
Sen 17	0,044	0,073	0,041	0,212	0,037	0,044
Sen 31	0,339	0,291	0,104	0,250	0,119	0,496
Sen 32	0,348	0,591	0,015	0,493	0,155	0,402
Sen 33	0,190	0,118	0,111	0,473	0,159	0,171
Sen 34	0,801	1,005	0,305	0,669	0,576	0,934
Sen 41	0,456	0,451	0,052	0,327	0,225	0,541
Sen 42	0,430	0,544	0,066	0,423	0,243	0,548
Sen 44	0,433	0,768	0,293	0,893	0,267	0,580
Sen 45	2,000	1,310	0,275	0,000	1,064	2,000

Usando um ensaio de ELISA tipo sanduíche com dois anticorpos, seleccionaram-se anticorpos adequados por rastreios de reactividade cruzada contra èxtractos seleccionados de

-24Tabela 2:

Anticorpo patogénios. Microcavidades foram sensibilizadas usando o anticorpo monoclonal a 5 μg/ml em tampão carbonato, 100 μΐ por cavidade como anticorpo de captura. O processo de bloqueio foi realizado como descrito. A ligação do anticorpo monoclonal aos extractos de patogénio foi detectada usando conjugado de carneiro anti-Sen-HP (peroxidase de rábano silvestre). Estes resultados estão apresentados na Tabela 2.

Rastrei da reactividade cruzada precoce contra extractos de patogénios seleccionados

Extracto de Patogénios

Set3 Set3G Set4 Set4G Senl Ptrl Mfl Não sensi- Classe bilizado

Senl5C6	0,02	0,03	0,03	0,02	2,25	0,02	0,01	0,01	IgG2a
Senl7E9	0,00	0,01	0,02	0,00	0,34	0,01	0,00	0,01	igG1
Senl8C7	0,03	0,05	0,06	0,04	0,45	0,03	0,01	0,00	igG1

Set = Septoria tritici; Sen = S. nodorum; Ptr = Pyrenophora tritici repentis; Mfl = Mvcosphaerella fiiiensis

Os sobrenadantes dos anticorpos monoclonais seleccionados foram testados novamente contra um painel alargado de isolados de fungos relacionados e não relacionados numa ELISA indirecta. Os extractos de isolados são ligados a placas de microtitulação a 5 jug/ml. Os resultados deste rastreio estão apresentados na Tabela 3.

-25Tabela 3: Rastreio por ELISA indirecta dos sobrenadantes de anticorpos monoclonais contra L. (S.) nodorum contra um painel alargado de isolados de fungos relacionados e não relacionados.

Absorvância média (405 nm) ± desvio padrão

Espécie	Isolados	Sen 15C6	Senl8C7	SenlE3
Septoria nodorum	9	0,71±0,62	0,54±0,40	0,43±0,22
Alternaria spp	2	0,02±0,0	0,01±0,01	0,01±0,02
Aspercrillus spp	4	0,02±0,01	0,01±0,0	0,0
Bipolaris spp	5	0,01±0,02	0,01±0,01	0,0
Botrvtis spp	3	0,02±0,01	0,01±0,01	0,0
Choridium musae	1	0,03	0,0	0,0
Cladosporium spp	2	0,02±0,02	0,0	0,01±0,01
Colletotrichum
araminicola	2	0,0	0,0	0,01±0,01
Curvularia lunata	1	0,02	0,0	0,0
Diplodia aossvoina	1	0,0	0,0	0,0
Drechslera spp	2	0,0	0,0	0,0
Epicoccum nicfrum	1	0,03	0,02	0,01
Fusarium spp	4	0,0	0,0	0,02+0,03
Helminthosporium
sativum	4	0,03±0,03	0,02+0,04	0,03±0,04
Lambertella spp	1	0,0	0,03	0,0
Lanzia
luteo-virescens	1	0,05	0,0	0,0
Leptosphaeria korrae	3	0,023±0,03	0,01±0,01	0,01±0,01
Monilia spp	2	0,02±0,0	0,0	0,0
Mortierella spp	2	0,03+0,02	0,01±0,0	0,0
Mvriosclerothinia
dennisii	1	0,0	0,0	0,0
Penicillium spp	4	0,03±0,03	0,01±0,01	0,0
Phialophora
crraminicola	1	0,0	0,0	0,0
Pseudocercosporella
herpotrichoides	1	0,01	0,0	0,0
Pvrenophora
tritici-repentis	3	0,03±0,01	0,01±0,01	0,07±0,01
Pvthium spp	10	0,02±0,02	0,01±0,01	0,0
Rhizoctonia spp	10	0,01±0,01	0,0	0,0
Rhizopus stolonifer	2	0,0	0,01±0,01	0,0
Sclerotium spp	3	0,01±0,01	0,0	0,01±0,01
Septoria tritici	3	0,01±0,02	0,0	0,01+0,01
Stemphylium
vesicarium	2	0,0	0,0	0,0

-26Após vários rastreios, o anticorpo Senl5C6 foi seleccionado com base nos resultados de um ensaio tipo sanduíche com dois anticorpos. Senl5C6 foi purificado a partir do sobrenadante usando cromatografia de afinidade com Proteína A. As microcavidades foram sensibilizadas usando anticorpo a 5 /xg/ml em tampão carbonato, 100 μΐ por cavidade. O ensaio foi realizado contra o extracto de antigénio L. nodorum. material de folhas de trigo infectadas com L. nodorum. folhas de trigo saudáveis e tampão testemunha. Os resultados do ensaio com dois anticorpos estão apresentados na Tabela 4. Como anticorpo marcado usou-se conjugado de carneiro anti-S. nodorum-peroxidase de rábano silvestre.

Tabela 4:

Antigénio Anticorpo monoclonal

	Senl5C6	Senl7E9	Senl8C7
Senl-001
10 μg/ml	2,00+	2,00+	2,00+
1 ^g/ml	0,638	0,637	0,355
0,5/zg/ml	0,179	0,303	0,169
Folha infectada
com Senl
1:1*	1,489	0,576	0,332
1:10*	0,349	0,298	0,208
1:100*	0,147	0,268	0,152
Folha saudável
não diluída	0,102	0,243	0,179

*diluição de folhas de trigo infectadas numa solução de 0,1% BSA em tampão PBS

Estes resultados indicam que o anticorpo Senl5C6 pode ser usado em imunoensaios para detectar L. nodorum em extractos de antigénio assim como em folhas infectadas.

Exemplo 4: Monoclonal contra L. korrae”

Investigadores em Ohio State University descreveram anteriormente a produção de anticorpos monoclonais contra L. korrae (Shane e Nameth, 1988). Este anticorpo foi testado numa ELISA indirecta para determinar a reactividade cruzada contra um painel consistindo em três isolados de L. korrae e 21 isolados de outros fungos relacionados e não relacionados com Leptosphaeria (Tabela 5).

-28Tabela 5: Rastreio da reactividade cruzada numa ELISA indirecta de uma diluição de 1/16 de sobrenadante do anticorpo monoclonal contra L. korrae (LKc50) contra fungos relacionados e não relacionados com Leptosphaeria

Isolado	Código do Isolado	Número de isolados testados	Absorvância'
Leptosphaeria Korrae	Lk3, Lk6, Lk5	3	2,000+
Alternaria spp	Alsp2	1	1,562
Botrvtis cinerea	Bc2	1	0,087
Bipolaris sorokiniana	Bs2	1	0,045
Curvularia lunata	Cull	1	0,135
Drechslera aicfantea	Dgl	1	0,041
Epicoccum niarum	Enl	1	2,000+
Epicoccum spp	Espl	1	1,494

Helminthosporium

sativum	Hs3	1	0,093
Mortierella
epicrama	Mel	1	0,296
Pvthium
aphanidermatum	Pal, Pal5	2	0,466
P. oraminicola	Pg2	1	0,183
P. irreoulare	Pil	1	0,107
P. myriotylum	Pmy2	1	0,217
P. torulosum	Pt3	1	0,071
P. ultimum	Pu7	1	0,124
Septoria
nodorum	Senl, Sen2	2	0,059
S. nodorum	Sen3	1	1,518
Stemphvlium
vesicarium	Stvl, Stv2	2	0,368

Leitura de absorvância = Valor da absorvância da amostra - valor da absorvância do Tampão A

Os resultados mostram claramente que o outro anticorpo monoclonal conhecido contra uma espécie de Leptosphaeria dá uma forte reacção cruzada com fungos fora do género Leptosphaeria. Tal reactividade cruzada é particularmente desvantajosa com o fungos do género Epicoccum. Este último é um saprófita comum da

-29relva e pode causar problemas se se colher inadvertidamente relva com sintomas avançados. Assim, este anticorpo pode ser inadequado para fins de diagnóstico.

Exemplo 5: Ensaios no local

Os ensaios no local foram realizados em folhas isoladas usando almofadas abrasivas para ferir o material vegetal e foram colocadas em frascos contendo 2 ml de tampão de extracção e após agitação, filtradas através de um filtro de 0,02 μιη. Seis gotas do extracto filtrado foram colocadas num sistema adsorvente

1.x' revestido com o anticorpo de captura. Após adição sequenciada de duas gotas do anticorpo marcado com enzima, solução de enxaguamento e um substrato da enzima, o círculo do teste fica azul quando o antigénio de fungo está presente na amostra. A adição de duas gotas de uma solução de paragem pãra a reacção corada. A quantidade de antigénio presente pode ser medida através da medição da reflectância relativa presente em unidades X-Rite usando um medidor de X-Rite e/ou Agrimeter.

Fez-se uma comparação da sensibilidade entre o ensaio rápido (no local) e o ensaio em multicavidades para diluições do antigénio Senl em extractos de trigo saudável.

A avaliação dos ensaios no local foi também avaliado usando trigo infectado com S. nodorum (Tabelas 6 e 7). As variedades de trigo usadas foram Twain e Traveler, estão naturalmente infectadas com S. nodorum em canteiros de ensaio. As três folhasmais inferiores (plantas ainda na fase de rebento) de cada uma das seis plantas foram removidos e extraídas individualmente usando duas almofadas Extrak/2 ml de Tampão Z-5. Os extractos foram filtrados através de um filtro Anotop e testados nos kits de multicavidades S. nodorum e S. tritici 1990. As amostras que

-30reagem fortemente nos kits de multicavidades de S; nodorum foram também testados no kit de ensaio no local.

Tabela 6: Ensaio de trigo infectado com Septoria nodorum (c.v.

Twain) em kits de multicavidades com S. nodorum 1990 e em kits de ensaio no local com S. nodorum.

S. nodorum s. nodorum

Amostra	Folha	+	Absorvância 405 nm	Leitura' X-Rite
% Necrose	Picnídios
Twain 1	1	40	+	2,0+	53
	2	0 a 1	-	0,00	-
	3	0	-	0,00	-
Twain 2	1	50	+	2,0+	40
	2	0 a 1	-	0,00	-
	3	0	-	0,19	-
Twain 3	1	30	+	2,0+	56
	2	0 a 1	-	0,00	-
	3	0	-	0,19	-
Twain 4	1	40	+	2,0+	45
	2	0 a 1	-	0,00	-
	3	0	-	0,00	-
Twain 5	1	20	+	1,64	25
	2	0 a 1	-	0,34	8
	3	0	-	0,18	-
Twain 6	1	30	+	2,0+	46
	2	0 a 1	-	0,00	-
	3	0	-	0,00	-

a não testado

As folhas estão numeradas de 1 a 3 começando a partir do fundo da planta e contando no sentido ascendente.As absorvâncias foram calculadas usando a fórmula (Abs. amostra 405nm - Abs. Tampão Z-5 405 nm). O Tampão Z-5 dã uma absorvância de 0,332 no kit de S. nodorum. As absorvâncias para as testemunhas positivas de S. nodorum é de 0,829. As plantas na altura do ensaio estavam aproximadamente na fase de crescimento #24.

-32Tabela 7: Ensaios de trigo infectado com Septoria nodorum (c.v.

Traveler) no kit de S. nodorum 1990 e no kit de ensaio no local de S. nodorum 1990

	S. nodorum	s. nodorum
+	Absorvância	Leituraa
Folha % Necrose Picnídios	405 nm	X-Rite

Travelerl	1	50	+	2,0+	86
	2	10	-	0,51	-
	3	0	-	0,13	-
Traveler2	1	30	+	2,0+	48
	2	0 a 1	-	0,17	-
	3	0	-	0,00	-
Traveler3	1	30	+	2,0+	55
	2	0	-	0,00	-
	3	0	-	0,00	-
Traveler4	1	50	+	2,0+	68
	2	0 a 1	-	0,20	-
	3	0	-	0,24	-
Travelerõ	1	30	+	2,0+	65
	2	5	-	0,24	-
	3	0 a 5	-	0,04	-
Travelerõ	1	25	+	2,0+	31
	2	0	-	0,00	-
	3	0	-	0,00	-
Saudávell	1	0	-	0,00	1
(ND495)	2	0	-	0,00	0
	3	0	-	0,00	8

a nao testado

-33 —

As folhas estão numeradas de 1 a 3 começando a partir do fundo da planta e contando no sentido ascendente.As absorvâncias foram calculadas usando a fórmula (Abs. amostra 405nm - Abs. Tampão Z-5 405 nm). O Tampão Z-5 dá uma absorvância de 0,332 no kit de S. nodorum. As absorvâncias para as testemunhas positivas de S. nodorum é de 0,829. As plantas na altura do ensaio estavam aproximadamente na fase de crescimento #24.

Estes resultados indicam que o antigénio de S. nodorum pode ser detectado usando placas de multicavidades e um kit de ensaio no local. Portanto, S. nodorum pode ser facilmente detectado no campo.

invento aqui descrito e reivindicado não pretende estar limitado no seu âmbito pelas realizações específicas aqui descritas, uma vez que estas realizações se destinam à ilustração de vários aspectos do invento. Quaisquer realizações equivalentes destinam-se a ser inseridas no âmbito deste invento. De facto várias modificações do invento para além do aqui descrito e mostrado serão aparentes para os familiarizados com a matéria partindo da descrição anterior. Tais modificações destinam-se a cair dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Referências

Cole, S.P.C., Kozbor, D., Roder, J.C., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 27:77-96 (1985) ,

Eyal, Z., Scharen, A.L., Prescott, J.M., van Ginkel, M. (Hrsg.) The Septoria Diseases of

Wheat - Concepts and Methods of Disease Management, CIMMYT, México (1987) Farr, D.F., Bills, G.F., Chamuris, G.P. Rossman, A.Y., Fungi on Plant and Plant Products in the United States, APS Press, St Paul (1989)

Goding, J.W., Monoclonal Antibodies, Academic Press, London, (1986)

Hãmmerling, G.J., Eur. J. Immunol. 7:743-746 (1977)

Kõhler, G., Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975)

Kõhler, G., Milstein, C., Sei. Amer. 342:66-74 (1980)

Kozbor, D., Roder, J.C., Immunology Today 4:72-79 (1983)

Littlefield, J.W., Science 145:709 (1964)

Shane, W.W., Nameth, S.T., Phytopathology 78:1521 (1988)

Claims (14)

1. Reivindicações:

   I^a. - Linha celular de hibridoma, caracterizada por produzir um anticorpo monoclonal gue reage especificamente com pelo menos uma espécie de fungos do género Leptosphaeria mas que não reage com espécies fora do género.
2. 2^a. - Linha celular de hibridoma de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por o anticorpo reagir especificamente com uma única espécie de Leptosphaeria nodorum.
3. 3^a. - Linha celular de hibridoma de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por o anticorpo reagir especificamente com Leptosphaeria nodorum.
4. 4^a. - Linha celular de hibridoma de acordo com a Reivindicação 2, caracterizada por estar depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC HB 10185.
5. 5^a. - Anticorpo monoclonal, caracterizado por reagir especificamente com pelo menos uma espécie do género Leptosphaeria, mas não reagir com espécies fora do género.

   62. - Anticorpo de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por reagir especificamente com uma única espécie de Leptosphaeria.
6. 7^a. - Anticorpo de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por reagir especificamente com Leptosphaeria nodorum.
7. 8^a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por ser produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC HB 10185. - '
8. 9^a. - Método para a detecção da presença ou ausência de fungos do género Leptosphaeria numa amostra, caracterizado por compreender o contacto da amostra com um anticorpo monoclonal que

   I reage especificamente com pelo menos uma espécie do género

   Leptosphaeria. mas que não reage com espécies fora do género e a observação da presença ou ausência de uma reacção de ligação antigénio-anticorpo.

   H
9. 10^a. - Método de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por compreender o contacto da amostra com dois anticorpos, pelo menos um deles sendo um anticorpo monoclonal que reage especificamente com pelo menos uma espécie de Leptosphaeria. em que um anticorpo está imobilizado e o outro está marcado com uma molécula repórter.
10. 11-. - Método de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por um dos anticorpos ser um anticorpo policlonal.
11. 12 ^a. - Método de acordo com a Reivindicação 9,10 ou 11, caracterizado por o anticorpo monoclonal reagir especificamente com apenas uma espécie de Leptosphaeria.
12. 13^a. - Método de acordo com a Reivindicação 12, caracterizado por o anticorpo monoclonal reagir especificamente com Leptosphaeria nodorum.
13. 14â. - Método de acordo com a Reivindicação 13, caracterizado por o anticorpo ser produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC HB 10185.

    153. - Equipamento (kit) de diagnóstico, caracterizado por compreender um anticorpo ligado a um suporte sólido e um anticorpo marcado com uma molécula repórter, em que ambos os anticorpos são capazes de reagir com espécies de fungos do género Leptosphaeria mas não reagem com espécies fora deste género.
14. 16ã. - Equipamento de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por o equipamento ser é um equipamento de um único local.

    173. - Equipamento de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por um dos anticorpos ser um anticorpo policlonal.

    183. - Equipamento de acordo com a Reivindicação 15 ou 17, caracterizado por o anticorpo monoclonal reagir especificamente com apenas uma espécie de Leptosphaeria.

    193. - Equipamento de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por o anticorpo monoclonal reagir especificamente com Leptosphaeria nodorum.

    203. - Equipamento de acordo com a Reivindicação 19, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser produzido pela linha celular de hibridoma depositada na American Type Culture Collection com o número de acesso ATCC HB 10185.

    213. - Método para a preparação de uma linha celular de hibridoma que produza um anticorpo monoclonal que reaja especificamente com pelo menos uma espécie de fungos do género Leptosphaeria, caracterizado por compreender:

    (a) a imunização de um animal dador com um extracto de Leptosphaeria ;

    -38(b) o isolamento de células B imunocompetentes a partir do animal dador imunizado;

    (c) a fusão das células B com células de uma linha celular imortal; e (d) o despiste dos produtos de fusão e identificação dos que produzem anticorpos tendo especificidade para Leptosphaeria.

    22s. - Método para a preparação de um anticorpo monoclonal que reage especificamente com pelo menos uma espécie de Leptosphaeria, caracterizado por comprender a cultura de uma linha celular de hibridoma capaz de produzir tais anticorpos em condições que conduzem à produção de anticorpos e o isolamento por métodos convencionais dos anticorpos assim produzidos.