JPH02245196A - 抗トリコスポロン・バイゲリモノクローナル抗体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は感染症の診断薬等として有用な抗トリコスポロ
ン・バイゲリモノクローナル抗体及びその製造法に関す
る。

〔従来の技術およびその課題〕

トリコスポロン・バイゲリ　（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏ
ｎｂｅｉｇｅｌｉｉ）は、自然環境に広（分布し、通常
は土壌中に棲息する酵母様真菌であるが、時折、ヒトの
皮膚や口中にも正常フロラとして見られ、また古くから
砂上症の原因菌としても知られている。

この真菌は強力な殺細胞化学療法を行っている患者や臓
器移植のために免疫抑制療法を行っている患者への感染
が認められるが、平素は無害菌とされていることから日
和見感染の原因菌の一種と考えられている。また最近で
はこの真菌による閉面症、夏型過敏性肺炎も報告されて
おり、この真菌の感染症の診断の重要性が増大している
。

トリコスポロン・バイゲリ感染症の診断には、選択培地
でコロニーの発育を観察する微生物学的検査、および生
検材料もしくは剖検材料からの顕微鏡による病理組織学
的検査がある。

しかし、コロニーの発育を見る微生物学的検査において
は、培地上の菌の接種には熟練した技術を要し、またコ
ロニーの発育までに数日を要するなどの問題がある。一
方、病理組織学的検査においては、トリコスポロン・バ
イブリと同様酵母様真菌であるカンジダ菌種との区別が
難しく、診断を誤まるおそれがある。日和見感染におい
ては、トリコスポロン・バイブリと他の真菌との複合感
染がしばしば見られることから判断は特に困難である。

かかる事情から多くの病理学者、臨床医、臨床検査技師
等によりトリコスポロン・バイブリを簡便かつ高精度で
検出する方法が要望されている。

そこで本発明者らは先にトリコスポロン・バイブリに対
する抗体としてウサギ抗血清を作製し、これを利用した
トリコスポロン・バイブリの検出法を提供した。

しかしウサギ抗血清を用いてトリコスポロン・バイブリ
を検出する場合、抗血清中には非特異抗体が存在するた
め検出感度、精度が充分でなかった。従って、トリコス
ポロン・バイブリの検出のためには、測定の都度非特異
抗体の吸７収操作を必要とするなどの問題があった。ま
た抗血清はロットにより抗体価に差があり、測定結果を
定量的に判定できないという問題点があった。

従ってトリコスポロン・バイブリと特異的かつ鋭敏に反
応し、ロット差が小さく、容易に入手できるモノクロー
ナル抗体の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは前述の課題を解決すべく種々検討した結果
、トリコスポロン・バイブリで免疫した動物の脾細胞と
骨髄腫細胞とを細胞融合せしめて得られたハイブリドー
マを利用すれば、トリコスポロン・バイブリに特異的な
モノクローナル抗体が得られることを見出し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明はトリコスポロン・バイブリに対して
特異的な抗トリコスポロン・バイブリモノクローナル抗
体およびその製造法を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、例えばトリコスポロン
・バイブリで免疫した動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを細
胞融合せしめ、得られたハイブリドーマよりトリコスポ
ロン・バイブリに対して特異的な抗トリコスポロン・バ
イブリモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択し、該ハイブリドーマを培養もしくは動物の腹腔内
にて増殖せしめ、該培養液もしくは腹水より本発明モノ
クローナル抗体を採取することにより・製造される。

より詳しくは〔１）まず抗原であるトリコスポロン・バ
イブリを分離し、（２）トリコスポロン・バイブリで免
疫した動物の脾細胞を調製し、（３）別に骨髄腫細胞（
以下、ミエローマ細胞と略す）を調製し、（４）脾細胞
とミエローマ細胞とを細胞融合させ、（５）得られたハ
イブリドーマから目的とするモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを選択し、（６）該抗体産生ハイブリドー
マを適当な培地中で培養してその培養液から採取するか
または該抗体産生ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種
してその腹水から採取することにより製造される。次に
この各工程について説明する。

（１）トリコスポロン・バイブリの調製トリコスポロン
・バイブリとしては、広く土壌、水中に存在するもの、
人の皮膚や日中の正常フロラに見られるものあるいは砂
毛症、画面症、夏型過敏性肺炎等の感染患者の血液等か
ら採取される臨床分離株が挙げられる。臨床分離株とし
ては、例えばトリコスポロン・バイブリ肺炎患者の血液
等のトリコスポロン・バイブリ含有物からサブロー培地
等の選択培地を用いて選択分離培養したものをアルコー
ル等で処理して不活化した後食塩含有リン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）等で洗浄することにより分離したものが用いられ
る。

（２）トリコスポロン・バイブリで免疫された動物の脾
細胞の調製 トリコスポロン・バイブリで免疫された動物の脾細胞は
、調製したトリコスポロン・バイブリを必要に応じてア
ジュバントとともにマウスに数回投与して免疫し、その
肺臓を摘出することによって得られる。

動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、
ヒツジなどが例示される。免疫方法は、例えばマウスの
場合、まず約１〜３週問のマウスの皮下、腹腔内あるい
は静脈内等に必要に応じてフロイント・アジュバント、
ミョウバンおよび百日ぜき死菌体等から成るアジュバン
トとともにトリコスポロン・バイゲリ約１０３〜１００
［ｉ数／匹、好ましくは約１０４〜１０７菌数／匹、特
に好ましくは約１０５〜１０７菌数／匹を投与する。以
後、約１〜３週問おきにトリコスポロン・バイゲリを同
様に約１〜４回投与する。そして細胞融合を行う約２〜
５日前に静脈内にトリコスポロン・バイゲリ約１０３〜
１０８菌数／匹、好ましくは約１０４〜１０７菌数／匹
、特に好ましくは約１０５〜１０７菌数／匹を追加投与
する。この免疫後マウスのｌｌ１ｌ！臓を摘出しマウス
牌細胞を調製する。

（３）　　ミエローマ細胞の調製 細胞融合に使用するミエローマ細胞は特に限定されない
が、脾細胞の調製に用いた動物と同種の動物の細胞株が
好ましい。また用いるミエローマ細胞は、細胞融合の後
に未融合細胞と融合細胞を分離することを考慮して、特
定の薬剤抵抗性を有するものが好ましい。例えば、８−
アザグアニン耐性のミエローマ細胞を挙げるこ正ができ
る。具体例として、マウスミエローマ細胞Ｐ　３−　Ｎ
５１１−八ｇ４　−　１　（ＭＳ−１）　　　［Ｂｕｒ
、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６；５１１−５１９　
（１９７６）に記載］Ｐ３−Ｘ６３　−八ｇ８−Ｕｌ　
　　（Ｐ３Ｕ１）　　　［Ｃｕｒｒ。

ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
８１　；　１〜？　　（１９７Ｂ）に記載）　Ｘ６３−
Ａｇ８−６．５．３　（Ｘ６．５゜３）　　［Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　　１２３　：　１５４Ｂ−１５５０（１
９７９）に記載〕 ５Ｐ２１０−Ａｇｌ　４　（ＳＰ−２）　　［Ｎａｔｕ
ｒｅ２７６　：２６９〜２７０　　（１９８０）に記載
コなどの細胞が挙げられる。

（４）細胞融合 細胞融合は、センダイウィルス使用法、電気的融合法あ
るいはポリエチレングリコール法等常法に従って行うこ
とができる。

例えばポリエチレングリコール法は、トリコスポロン・
バイゲリ免疫牌細胞を含む溶液とミエローマ細胞とを含
む混合溶液を遠心分離した後、上清を捨て沈澱した細胞
にポリエチレングリコールを加えることにより行なわれ
る。

（５）モノクローナル抗体産生バイブリドーマの選択 細胞融合を終了した細胞をＨＡＴ培地などの選択培地を
用いてスクリーニングすることにより、まずハイブリド
ーマを選択する。次いで得られたハイブリドーマより免
疫螢光法などを用いて抗体産生ハイブリドーマを検索後
、さらに限界希釈法などによりクローニングを行い、ト
リコスポロン・バイゲリに対して特異的な抗トリコスポ
ロン・バイゲリモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を選択する。

（６）本発明モノクローナル抗体の調製上記の如くして
得られた抗体産生ハイブリドーマを適当な培地中で培養
し、その培養物、例えば培養上清から本発明モノクロー
ナル抗体が採取される。また動物の腹腔内に抗体産生ハ
イブリドーマを接種し約１０〜１４日後に腹水を採取し
、遠心分離などの操作により本発明モノクローナル抗体
が調製できる。また必要に応じて前記培養上清や腹水は
塩析、プロティンＡカラム、セファクリルＳ−２００カ
ラム、ゲルろ過などにより精製することもできる。

抗原として肺炎患者血液より分離したトリコスポロン・
バイゲリを用い、免疫動物としてマウスを用い、ミエロ
ーマ細胞としてＸ６３−Ａｇ８−６．５．３を用いて細
胞融合して得たモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
は、Ｋ−１６およびに−３０の２種類存在し、これらの
ハイブリドーマはそれぞれ本発明モノクローナル抗体を
産生ずる。なお、このハイブリドーマに−１６は工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０６２９号
（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０６２９）として寄託されている。

本発明のモノクローナル抗体は、トリコスボロン・バイ
ゲリに対して特異的であるため、通常の免疫学的測定法
により他の細菌や真菌と区別してトリコスポロン・バイ
ゲリを定量することができる。利用できる測定法として
は、間接螢光抗体法酵素抗体法、ラテックス等の支持体
による免疫凝集反応による方法、サンドウィッチ法によ
る酵素免疫測定法などが挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体を利用すれば、カンジダ菌
種などとの複合感染の場合でも、トリコスポロン・バイ
ゲリを簡便かつ高精度に検出することができる。従って
病理学、臨床検査等の分野において診断薬として極めて
有用である。

〔実施例〕

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが
、これらは単に例示の目的でかかげるものであって本発
明がこれらに限定されるものではない。

実施例１ （１）トリコスポロン・バイゲリの調製トリコスポロン
・バイゲリ肺炎患者の血液をザブロー培地を用いて選択
分離培養した。分離培養したものを１００％エタノール
で洗浄して不活化した後、濃度１０ｍＭのＰＢＳ　（ｐ
ｔｌ＝７．４）で洗浄してトリコスポロン・バイゲリを
含有する溶液を調製した（以下菌体液という）。この菌
体液中のトリコスポロン・バイゲリの濃度は１０４菌数
／μｌであった。

（２）脾細胞の調製 ４週令のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に一匹当り２
００μｌの完全フロインドアジュバント（ＤＩＦＣＯ社
、ミシガン、　１１．Ｓ、Ａ、）とともに菌体液２００
μｌを乳化液状にして注入した。２週間後、−匹当り２
００μβの不完全フロインドアジュバント（ＤＩＦＣＯ
社、ミシガン、Ｕ、Ｓ、へ、）とともに同様に免疫を行
った。２回目の免疫から２週間後、最終免疫として菌体
液を生理食塩水に懸濁したもの（菌濃度２Ｘ１０３菌数
／μＩｌ）を−匹当り５０μβ静脈および腹腔内注射し
た。

最終免疫から３日後、マウスの肺臓を摘出した。

マウスから摘出した肺臓は、ＲＰＭＩ　１６４０培地中
でほぐして、付着組織片などの混入が少ない細胞懸濁液
を調製した後、遠心分離（１，ＯＯＯｒｐｍ、　５分、
室温）して上清を除去した。さらに、ＲＰＭＩ　１６４
０培地２０ｍｊ！に再懸濁して脾細胞の浮遊液を調製し
た。

（３）ミエローマ細胞浮遊液の調製 マウスミエローマ細胞（ｘ６３−八ｇ８−６゜５．３）
を牛胎児血清（ハイクロン社）を２０％含むＲＰＭＩ　
１６４０培地にて増殖させ、脾細胞と同様にしてマウス
ミエローマ細胞の浮遊液を調製した。

（４）細胞融合およびモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの選択 （２）で得た脾細胞浮遊液（１×１０６個含有）と（３
）で得たマウスミエローマ細胞浮遊液（２Ｘ１０’個含
有）とを混合し、遠心分離した後、上清を除去した。

沈澱した細胞をよくほぐした後、３７℃で４５％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ　１５００　　（ベーリンガ
ー・マンハイム社、西ドイツ）０．４５ｍｌ２およびＲ
ＰＭＩ　１６４０培地０．５５　　ｍｊｌり　　１　　
ｎ＋ｊ！をゆっくり加えて撹拌した。つぎに３７℃でＲ
ＰＭＩ　１６４０培地４　　ｍｌ２を撹拌しながら加え
た。３分間静置後、さらに同培地２０　ｍｌを静かに加
えた。

遠心分離後、上滑を捨て３７℃、５０ｍｊｌ！のＨＡＴ
培地（２０ｍｊ！牛脂児血清、８０ｍβ　ＲＰＭ１１６
４０培地、５　ｍｇカナマイシン、６０ｍｇＬ−グルタ
ミン、０．１ｇ重炭酸水素ナトリウムからなる培養液に
１００μＭヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン
、１６μＭチミジンを加えた培地）に懸濁させ、この懸
濁液を９６穴培養プレートの多穴に１００μβ／穴ずつ
分注した。５％Ｃ０２インキユベ一ター中３７℃で７日
間培養後、さらに１００μｍ／穴のＨＡＴ培地を加えた
。培養開始から１４日後、多穴の上清１００μｌを採取
した後、多穴にＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリ
ンを除いた培地）１００μｌを加えた。

採取した上清と前記の菌体液を用いてアビジン・ビオチ
ン免疫螢光法によりトリコスポロン・バイゲリのみに特
異的に抗体反応を示す穴を選択した。

すなわち、前記の菌体液５μβをスライドグラス上へ塗
抹し３０分間風乾後、１００　　ｍｌの冷アセトンに浸
漬して１５分間固定してから前記培養上清１０μｌを滴
下した。一方コントロールとしては正常マウス血清１０
μβを滴下した。

室温で３０分間インキュベートした後、濃度１０ｍＭの
Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ＝７．４　）で洗浄し、１％ウシ血
清アルブミンＰＢＳで２０倍希釈したビオチン標識抗マ
ウスＩｇＧ　（カッベル社、ウエストチェスタ＋、　Ｕ
、Ｓ、八、）　　１０μβを滴下して１５分間室温で反
応させた。つぎに１０ｍＭ　ＰＢＳ　（ｐＨ＝７．４）
で１００倍に希釈されたＰＩＴＣ標識アビジン（タボ社
、カリフォルニア、［１，Ｓ、八、）　　１０μβを滴
下して、室温で１５分間反応させた。グリセロール緩衝
液封入剤を用いて、カバーグラスをのせ螢光顕微鏡で観
察した。３００個の穴のうち３個の穴の培養液上清がト
リコスポロン・バイプリのみに特異的に反応した。

選択された穴の細胞について、限界希釈法により３回の
クローニングを行ない抗トリコスポロン・バイプリモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマとして、２つのクロ
ーンを選択した。このバイプリドーマをそれぞれに−１
６およびに−３０と命名した。

（５）本発明モノクローナル抗体の調製７週令のマウス
（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に、上記各ハイブリドーマ２
×１０６個／匹を移植し１４日後にこのマウスの腹水を
採取し遠心分離で細胞成分を除去した上清を抗トリコス
ポロン・バイプリモノクローナル抗体としに＝１６から
得られたものをＡ、に−３０から得られたものをＢとし
た。

Ａ、Ｂのモノクローナル抗体のアイソタイプ。

サブクラスは、モノクローナルタイピングキット（マイ
ルスサイエンティフィク、インデイアナ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）を使い、オフタロニー免疫拡散法
によって表１の通り決定した。

以下余白 表　　１ 実施例２ 本発明で得られた腔トリコスポロン・バイプリモノクロ
ーナル抗体の性能を免疫螢光法および間接免疫ペルオキ
シダーゼで確認した。

〔免疫螢光法〕

さまざまな患者より分離した真菌を１００％エタノール
で処理して不活化した後、スライドグラス上へ塗抹し、
風乾後、アセトンで１５分間固定した。スライドグラス
上へモノクローナル抗体Ａ又はＢ　（１００μｇ／　ｍ
ｌ）　５０μｊ２を滴下した。

他のスライドへはコントロールとして正常マウス血清の
１００倍希釈液５０μβを滴下した。

室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し
、１％ウシ血清アルブミンＰＢＳで２０倍希釈したビオ
チン標識抗マウスＩｇＧ（カッベル社、ウェストチエス
ター、Ｕ、　Ｓ、八、）５０μｌを滴下して１５分間室
温で反応させた。つぎに、ＰＢＳで１００倍に希釈され
たＰＩＴＩＪ、ｌｉ識アビジン（タボ社。

カリフォルニア、　［１，Ｓ、Ａ、）’　５０μβを滴
下して室温で１５分間反応させた。グリセロール緩衝液
封入剤を用いてカバーグラスをのせ螢光顕微鏡で観察し
た。Ａは酵母型と菌糸型の両方に反応し、Ｂは菌糸型よ
りも酵母型により強く反応することが認められた。また
他の真菌との反応性の結果を表２に示す。

以下余白 表 〔間接免疫ペルオキシダーゼ法〕 さまざまな真菌に感染した患者のホルマリン固定パラフ
ィン包埋組織切片とモノクローナル抗体ＡまたはＢを反
応させ特異性を確δ忍した。

さまざまな真菌に感染した患者のホルマリン固定パラフ
ィン包埋組織切片をスライドグラス上にのせ、内因性ペ
ルオキシダーゼは、０．３％■２０２を含むメタノール
で２０分間処理することで阻止した。次いで、正常ヤギ
血清をＰＢＳで１００倍に希釈した溶液で室温３０分間
処理した。

その上にモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｊｉり５
０μβを滴下した。コントロールとして他のスライドグ
ラス上に正常マウス血清より精製したＩｇＧ　（１００
μｇ／　ｍｌ　５０μｒを滴下し室温で３０分間インキ
ュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。１％ウシ血清アル
ブミンＰＢＳで２５倍希釈されたペルオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウスイムノグロブリン（タコ゛社、カリフォル
ニア、Ｕ、Ｓ、八、）を５０μβを滴下し３０分間室温
で反応させた。

ＰＢＳで洗浄後、さらにＤＡＢ（３，３’−ジアミノベ
ンジジン）　・Ｈ２Ｏ２発色液に浸漬のうえ７分間反応
させ発色させた。グリセロール緩衝封入剤を用いてカバ
ーグラスをのせ、光学顕微鏡で観察した。Ａは壊死にお
ちいった組織切片を含む数種の組織切片中のすべてのト
リコスポロン・ノくイプリと反応した。一方Ｂは、トリ
コスポロン・ノくイプリと反応せずホルマリン固定パラ
フィン包埋組織切片には不向きであった。反応性の結果
を表３に示す。

表　　　　　３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トリコスポロン・バイゲリに対して特異的な抗トリ
   コスポロン・バイゲリモノクローナル抗体。 ２、トリコスポロン・バイゲリで免疫した動物の脾細胞
   と骨髄腫細胞とを細胞融合させて得られるハイブリドー
   マによって産生されるものである請求項１記載のモノク
   ローナル抗体。 ３、トリコスポロン・バイゲリで免疫した動物の脾細胞
   と骨髄腫細胞とを細胞融合せしめ、得られたハイブリド
   ーマよりトリコスポロン・バイゲリに対して特異的な抗
   トリコスポロン・バイゲリモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマを培養も
   しくは動物の腹腔内にて増殖せしめ、該培養液もしくは
   腹水より該モノクローナル抗体を採取することを特徴と
   するモノクローナル抗体の製造法。