JP2001078763A - 抗ジャガイモそうか病菌モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 - Google Patents
抗ジャガイモそうか病菌モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ジャガイモそうか病菌（ストレプトマイセス
・スキャビエス）に特異的に反応するモノクローナル抗
体と該抗体からなる免疫測定試薬の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス・スキャビエスの抗
原成分を動物に免疫して取得した抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマを作製する。こ
のハイブリドーマからストレプトマイセス・スキャビエ
スとの特異性、反応性を指標としてクローニングを行
い、抗ストレプトマイセス・スキャビエスモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイ
ブリドーマを培養してモノクローナル抗体を取得し、こ
の抗体からジャガイモそうか病菌の免疫測定試薬を製造
する。
・スキャビエス）に特異的に反応するモノクローナル抗
体と該抗体からなる免疫測定試薬の提供。 【解決手段】 ストレプトマイセス・スキャビエスの抗
原成分を動物に免疫して取得した抗体産生細胞とミエロ
ーマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマを作製する。こ
のハイブリドーマからストレプトマイセス・スキャビエ
スとの特異性、反応性を指標としてクローニングを行
い、抗ストレプトマイセス・スキャビエスモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイ
ブリドーマを培養してモノクローナル抗体を取得し、こ
の抗体からジャガイモそうか病菌の免疫測定試薬を製造
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ジャガイモそうか
病菌（ストレプトマイセス・スキャビエス;Streptomyce
s scabies ）と特異的に反応するモノクローナル抗体
（以下、抗S.scabies 抗体という。）、該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル
抗体を用いてなるそうか病菌の免疫測定試薬に関する。
病菌（ストレプトマイセス・スキャビエス;Streptomyce
s scabies ）と特異的に反応するモノクローナル抗体
（以下、抗S.scabies 抗体という。）、該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ及び該モノクローナル
抗体を用いてなるそうか病菌の免疫測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ジャガイモの重要病害としてそうか病が
知られている。病徴は主にジャガイモの表面に淡褐色か
ら灰褐色の「かさぶた」、「くぼみ」、「盛り上り」が
でき、生食や加工用ジャガイモでは発生すると商品価値
を失い、デンプン原料用ジャガイモでもデンプン価の低
下がつながる。この病原菌は放線菌類に属するストレプ
トマイセス・スキャビエス（Streptomycesscabies ：S.
scabies ）、ストレプトマイセス・アシディスキャビエ
ス（Streptomyces acidiscabies ：S.acidiscabies）、
ストレプトマイセス・ターギディスキャビエス（Strept
omyces turgidiscabies ：S.turgidiscabies）等であ
り、土壌中に存在していることが知られている。
知られている。病徴は主にジャガイモの表面に淡褐色か
ら灰褐色の「かさぶた」、「くぼみ」、「盛り上り」が
でき、生食や加工用ジャガイモでは発生すると商品価値
を失い、デンプン原料用ジャガイモでもデンプン価の低
下がつながる。この病原菌は放線菌類に属するストレプ
トマイセス・スキャビエス（Streptomycesscabies ：S.
scabies ）、ストレプトマイセス・アシディスキャビエ
ス（Streptomyces acidiscabies ：S.acidiscabies）、
ストレプトマイセス・ターギディスキャビエス（Strept
omyces turgidiscabies ：S.turgidiscabies）等であ
り、土壌中に存在していることが知られている。
【０００３】この病害への有効な農薬は無く、病害の拡
大防止のために種いもを消毒し、連作、過作を避け、土
壌ｐＨを下げることが行われている。そうか病は防除が
困難なジャガイモの病害の一つであるが、その原因とし
ては菌の同定、土壌中の菌量評価が困難なことがあげら
れる。よって、そうか病菌の土壌中での動態把握は、防
除対策のための基礎的な知見を得るための重要な項目と
なる。また、作付け前の土壌中のそうか病菌の菌量調査
は、防除対策を講じる上での重要な情報を与え、病気へ
の感染回避や低減につながると考えられる。
大防止のために種いもを消毒し、連作、過作を避け、土
壌ｐＨを下げることが行われている。そうか病は防除が
困難なジャガイモの病害の一つであるが、その原因とし
ては菌の同定、土壌中の菌量評価が困難なことがあげら
れる。よって、そうか病菌の土壌中での動態把握は、防
除対策のための基礎的な知見を得るための重要な項目と
なる。また、作付け前の土壌中のそうか病菌の菌量調査
は、防除対策を講じる上での重要な情報を与え、病気へ
の感染回避や低減につながると考えられる。
【０００４】しかし、従来の培養法によるそうか病菌の
測定法では土壌中には多種の細菌類、放線菌類が存在す
るため、そうか病菌を培養・同定する事が難しく、結果
を得るまでに多大な労力と時間を要していた。また、測
定法としては、例えばＰＣＲ法（日植病報 61：264 ，
1995．）、寄生性アクチノファージ法（日植病報 63：
255-256 ，1997．）が報告されているが、専門的な技
術、器具を必要とするため一般的ではなかった。抗血清
を用いた免疫測定法も報告されているが、そうか病菌以
外の非病原性放線菌類（Diastatochromogenes group ）
とも反応するため、精度の高い測定を行うことができな
かった（植物防疫 51（6 ）：258-262 ，1997．）。さ
らに、そうか病菌に対する種特異的なモノクローナル抗
体の作製は困難であるとの報告もなされていた（Microb
iology 140 ：2067-2076 ，1994．）。
測定法では土壌中には多種の細菌類、放線菌類が存在す
るため、そうか病菌を培養・同定する事が難しく、結果
を得るまでに多大な労力と時間を要していた。また、測
定法としては、例えばＰＣＲ法（日植病報 61：264 ，
1995．）、寄生性アクチノファージ法（日植病報 63：
255-256 ，1997．）が報告されているが、専門的な技
術、器具を必要とするため一般的ではなかった。抗血清
を用いた免疫測定法も報告されているが、そうか病菌以
外の非病原性放線菌類（Diastatochromogenes group ）
とも反応するため、精度の高い測定を行うことができな
かった（植物防疫 51（6 ）：258-262 ，1997．）。さ
らに、そうか病菌に対する種特異的なモノクローナル抗
体の作製は困難であるとの報告もなされていた（Microb
iology 140 ：2067-2076 ，1994．）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、ジャガイモそ
うか病の病原菌を簡便に測定するために、この病原菌と
選択的に反応する抗体が求められていた。
うか病の病原菌を簡便に測定するために、この病原菌と
選択的に反応する抗体が求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
行った結果、ジャガイモそうか病菌でも世界中に広く分
布する病原菌のS.scabies に特異的に反応する抗S.scab
ies 抗体を見出し本発明を完成するに至った。
行った結果、ジャガイモそうか病菌でも世界中に広く分
布する病原菌のS.scabies に特異的に反応する抗S.scab
ies 抗体を見出し本発明を完成するに至った。
【０００７】本発明の抗S.scabies 抗体は病原菌のS.sc
abies にのみ特異的に反応し、他の放線菌、細菌類とは
実質的に反応しないモノクローナル抗体である。
abies にのみ特異的に反応し、他の放線菌、細菌類とは
実質的に反応しないモノクローナル抗体である。
【０００８】本発明の抗S.scabies 抗体は、その抗体を
産生するハイブリドーマを製造し、この細胞を培養する
ことにより、その培養液から取得することができる。
産生するハイブリドーマを製造し、この細胞を培養する
ことにより、その培養液から取得することができる。
【０００９】本発明の抗S.scabies 抗体を製造するにた
めには、まずS.scabies を培養し、その抗原成分を免疫
原として動物に免疫を行う。S.scabies の抗原は、菌体
に由来する各種抗原であればよく、例えば Streptomyce
s scabies の胞子懸濁液、菌体破砕液等を単独又は混合
して用いることができる。
めには、まずS.scabies を培養し、その抗原成分を免疫
原として動物に免疫を行う。S.scabies の抗原は、菌体
に由来する各種抗原であればよく、例えば Streptomyce
s scabies の胞子懸濁液、菌体破砕液等を単独又は混合
して用いることができる。
【００１０】本発明のハイブリドーマは、まず上記方法
により作製した抗原を動物に免疫する。このとき抗原は
単独又はアジュバンドと共に動物に投与することが好ま
しい。免疫後、動物の抗体価の上昇を確認して血清を採
取するが、必要に応じて追加免疫をすることもできる。
抗体価が上昇した動物では脾臓を摘出し、脾臓細胞等の
抗体産生細胞と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞とを融合
剤の存在下に混合して、ハイブリドーマを作製すること
ができる。抗原を免疫する動物としては、例えばウサ
ギ、モルモット、マウス、ラット等を用いることができ
る。アジュバンドとしては完全フロインドアジュバン
ド、不完全フロインドアジュバンド、ミョウバン、百日
ぜき死菌体等を用いることができる。また、融合剤とし
てはポリエチレングリコール、センダイウイルス等を用
いることができる。
により作製した抗原を動物に免疫する。このとき抗原は
単独又はアジュバンドと共に動物に投与することが好ま
しい。免疫後、動物の抗体価の上昇を確認して血清を採
取するが、必要に応じて追加免疫をすることもできる。
抗体価が上昇した動物では脾臓を摘出し、脾臓細胞等の
抗体産生細胞と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞とを融合
剤の存在下に混合して、ハイブリドーマを作製すること
ができる。抗原を免疫する動物としては、例えばウサ
ギ、モルモット、マウス、ラット等を用いることができ
る。アジュバンドとしては完全フロインドアジュバン
ド、不完全フロインドアジュバンド、ミョウバン、百日
ぜき死菌体等を用いることができる。また、融合剤とし
てはポリエチレングリコール、センダイウイルス等を用
いることができる。
【００１１】前記ハイブリドーマは、選択培地（例えば
ＨＡＴ培地等）を用いたクローニング方法で選択し、更
に培養上清を酵素免疫測定法等の適当な免疫測定法で分
析することによって、目的とする抗S.scabies 抗体を産
生しているハイブリドーマのクローンを選択するもので
ある。ハイブリドーマから産生される抗体は、通常そう
か病菌を含む放線菌類、細菌類等と反応するものが数多
く取得される。そこで、目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマは、S.scabies との特異性、反応性を指標と
してクローニングを行い選択される。本発明の抗S.scab
ies 抗体を産生するハイブリドーマを作製する手法は、
公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイン (Natur
e;256,495 (1975))、シェーラー (Nature;285, 446(198
0))等の方法に従い行うことができる。クローニング方
法としては限界希釈法、軟寒天法、フィブリノーゲンゲ
ル法、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorte
r）を用いる方法等を挙げることができる。
ＨＡＴ培地等）を用いたクローニング方法で選択し、更
に培養上清を酵素免疫測定法等の適当な免疫測定法で分
析することによって、目的とする抗S.scabies 抗体を産
生しているハイブリドーマのクローンを選択するもので
ある。ハイブリドーマから産生される抗体は、通常そう
か病菌を含む放線菌類、細菌類等と反応するものが数多
く取得される。そこで、目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマは、S.scabies との特異性、反応性を指標と
してクローニングを行い選択される。本発明の抗S.scab
ies 抗体を産生するハイブリドーマを作製する手法は、
公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイン (Natur
e;256,495 (1975))、シェーラー (Nature;285, 446(198
0))等の方法に従い行うことができる。クローニング方
法としては限界希釈法、軟寒天法、フィブリノーゲンゲ
ル法、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorte
r）を用いる方法等を挙げることができる。
【００１２】前記の方法によって得られたハイブリドー
マから抗S.scabies 抗体を製造することができるが、例
えばマウスに本発明の抗S.scabies 抗体を産生するハイ
ブリドーマを投与して得られた腹水から目的のモノクロ
ーナル抗体を分離・精製することによって、本発明の抗
S.scabies 抗体を取得することができる。このとき、用
いるマウスによってはプリスタンをあらかじめ投与して
おくことが好ましい。また、抗S.scabies 抗体の分離精
製の手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲルロ過クロマトグラフィ−等を用いることができ
る。
マから抗S.scabies 抗体を製造することができるが、例
えばマウスに本発明の抗S.scabies 抗体を産生するハイ
ブリドーマを投与して得られた腹水から目的のモノクロ
ーナル抗体を分離・精製することによって、本発明の抗
S.scabies 抗体を取得することができる。このとき、用
いるマウスによってはプリスタンをあらかじめ投与して
おくことが好ましい。また、抗S.scabies 抗体の分離精
製の手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲルロ過クロマトグラフィ−等を用いることができ
る。
【００１３】また、本発明の抗S.scabies 抗体は、例え
ば、前記抗体を産生するハイブリドーマを培養した培養
上清から分離精製を行うことによって取得することがで
きる。抗体の分離精製は前記と同様の手法により行うこ
とができる。
ば、前記抗体を産生するハイブリドーマを培養した培養
上清から分離精製を行うことによって取得することがで
きる。抗体の分離精製は前記と同様の手法により行うこ
とができる。
【００１４】得られた本発明の抗S.scabies 抗体は、こ
の抗体によって周知の免疫測定試薬を製造し、検体中の
S.scabies の測定方法に用いることができる。この測定
方法は、試薬に用いた抗S.scabies 抗体と検体中のS.sc
abies とが免疫反応を行う測定方法であれば、周知のい
ずれの免疫測定方法でもであってもよい。免疫測定方法
としては、例えば凝集法、比濁法、標識免疫測定法等を
用いることができる。また、標識免疫測定法を行う場合
にはその標識物として酵素、蛍光物質、発光物質、放射
性物質等を挙げることができ、周知のサンドイッチ法、
競合法等の測定法により行うことができるが、これらに
限定されるものではない。
の抗体によって周知の免疫測定試薬を製造し、検体中の
S.scabies の測定方法に用いることができる。この測定
方法は、試薬に用いた抗S.scabies 抗体と検体中のS.sc
abies とが免疫反応を行う測定方法であれば、周知のい
ずれの免疫測定方法でもであってもよい。免疫測定方法
としては、例えば凝集法、比濁法、標識免疫測定法等を
用いることができる。また、標識免疫測定法を行う場合
にはその標識物として酵素、蛍光物質、発光物質、放射
性物質等を挙げることができ、周知のサンドイッチ法、
競合法等の測定法により行うことができるが、これらに
限定されるものではない。
【００１５】例えば、標識免疫測定法を用いて検体中の
S.scabies を測定する場合は、本発明により得られた抗
S.scabies 抗体を適当な不溶性担体に固定化して試薬を
製造する。不溶性担体としては、ラテックス粒子、ビー
ズ、各種磁性粒子、マイクロプレートのウエル等を用い
ることができる。また、抗S.scabies 抗体を不溶性担体
に固定化させる方法としては、物理吸着法又は化学結合
法を採用することができる。物理吸着法は、適当な緩衝
液中で前記担体と抗S.scabies 抗体とを反応させること
により行うものである。また、化学結合法は、例えばグ
ルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、
ピリジル・スルフィド法、公知の各種架橋剤を用いる方
法等により行うものである（例えば、「蛋白質核酸酵
素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８７）参照）。こ
の方法では抗S.scabies 抗体に存在する官能基を利用す
ることができるほか、抗体にチオール基、アミノ基、カ
ルボキシル基、水酸基等の官能基を導入した後、前記と
同様の反応により抗体を不溶性担体に固定化することも
可能である。
S.scabies を測定する場合は、本発明により得られた抗
S.scabies 抗体を適当な不溶性担体に固定化して試薬を
製造する。不溶性担体としては、ラテックス粒子、ビー
ズ、各種磁性粒子、マイクロプレートのウエル等を用い
ることができる。また、抗S.scabies 抗体を不溶性担体
に固定化させる方法としては、物理吸着法又は化学結合
法を採用することができる。物理吸着法は、適当な緩衝
液中で前記担体と抗S.scabies 抗体とを反応させること
により行うものである。また、化学結合法は、例えばグ
ルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、
ピリジル・スルフィド法、公知の各種架橋剤を用いる方
法等により行うものである（例えば、「蛋白質核酸酵
素」別冊３１号、３７〜４５頁（１９８７）参照）。こ
の方法では抗S.scabies 抗体に存在する官能基を利用す
ることができるほか、抗体にチオール基、アミノ基、カ
ルボキシル基、水酸基等の官能基を導入した後、前記と
同様の反応により抗体を不溶性担体に固定化することも
可能である。
【００１６】前記標識免疫測定試薬はS.scabies 測定検
体と反応させ、不溶性担体に結合した標識物質を測定す
ることにより検体中のそうか病菌が存在するか否かの判
定をすることができる。標識物質として酵素を用いる場
合には、酵素活性の測定に各種発色基質、蛍光基質、発
光基質等を用いることができる。
体と反応させ、不溶性担体に結合した標識物質を測定す
ることにより検体中のそうか病菌が存在するか否かの判
定をすることができる。標識物質として酵素を用いる場
合には、酵素活性の測定に各種発色基質、蛍光基質、発
光基質等を用いることができる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
する。
する。
【００１８】実施例１ モノクローナル抗体の作製 ジャガイモそうか病菌（Streptomyces scabies subsp.a
chromogenes ）をオートミール液体培地を用いて３７℃
の条件下で７日間振盪培養した。菌体は２〜８℃で１０
分間、8,000 ×ｇで遠心洗浄した。このペレットを100m
M リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（PBS ）に再懸濁
し、液体窒素で凍結後、乳鉢で磨砕した。この菌体磨砕
液（免疫原）に等量のフロインド不完全アジュバント
（DIFCO 社製）を加え完全に混合した後、Balb/cマウス
に２週間間隔で計４回免疫した。細胞融合の３日前にマ
ウス腹腔内に免疫原を注射し、PEG を用いてマウス脾細
胞とミエローマ細胞（P3U1）とを融合した。培養液には
HAT 選択培地を使用し、２週間後に培養上清を採取しス
クリーニングに供した。1 次スクリーニングには、免疫
原を抗原としたEnzyme Linked Immunosobent Assay（EL
ISA 法）を使用した。すなわち、免疫原をPBS で100 倍
に希釈し、マイクロプレートモジュール（Nunc社製）の
各ウエルに100 μl ずつ加え、４℃一晩インキュベート
し固相化した。次に、0.1 ％のTween 20umalbumin 300
μl を加え４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキン
グ液を除いた後、培養上清を100 μl 加え３７℃１時間
反応させた。PBS-Tween で十分に洗浄した後、PBS-Twee
n で2000倍希釈した酵素標識抗マウスIgs 抗体を各ウエ
ルに100 μl ずつ加え３７℃１時間反応させた。反応後
PBS-Tween で十分に洗浄し、２，２’−アジノビス−３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ABTS）を
各ウエルに100 μl ずつ加え、室温で30分間反応後、反
応停止液を各ウエルに100 μl ずつ加え415nm の波長で
発色レベルを測定した。陽性と判定された培養上清につ
いては、非病原性放線菌の菌体磨砕液を抗原としたELIS
A で２次スクリーニングを行い、最終的に非病原性放線
菌とは反応せず、Streptomyces scabiesに特異性の高い
抗体を産生するハイブリドーマ２株（7F11H10 ，78EH1
0）を得た。該ハイブリドーマ２株から得られたモノク
ローナル抗体（以下、モノクローナル抗体7F11H10 、78
EH10）のサブクラスは共にIgG1であった。本実施例によ
り得られたハイブリドーマ7F11H10 は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されその受託番号はＦＥＲＭ
Ｐ-１７５５０である。
chromogenes ）をオートミール液体培地を用いて３７℃
の条件下で７日間振盪培養した。菌体は２〜８℃で１０
分間、8,000 ×ｇで遠心洗浄した。このペレットを100m
M リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（PBS ）に再懸濁
し、液体窒素で凍結後、乳鉢で磨砕した。この菌体磨砕
液（免疫原）に等量のフロインド不完全アジュバント
（DIFCO 社製）を加え完全に混合した後、Balb/cマウス
に２週間間隔で計４回免疫した。細胞融合の３日前にマ
ウス腹腔内に免疫原を注射し、PEG を用いてマウス脾細
胞とミエローマ細胞（P3U1）とを融合した。培養液には
HAT 選択培地を使用し、２週間後に培養上清を採取しス
クリーニングに供した。1 次スクリーニングには、免疫
原を抗原としたEnzyme Linked Immunosobent Assay（EL
ISA 法）を使用した。すなわち、免疫原をPBS で100 倍
に希釈し、マイクロプレートモジュール（Nunc社製）の
各ウエルに100 μl ずつ加え、４℃一晩インキュベート
し固相化した。次に、0.1 ％のTween 20umalbumin 300
μl を加え４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキン
グ液を除いた後、培養上清を100 μl 加え３７℃１時間
反応させた。PBS-Tween で十分に洗浄した後、PBS-Twee
n で2000倍希釈した酵素標識抗マウスIgs 抗体を各ウエ
ルに100 μl ずつ加え３７℃１時間反応させた。反応後
PBS-Tween で十分に洗浄し、２，２’−アジノビス−３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ABTS）を
各ウエルに100 μl ずつ加え、室温で30分間反応後、反
応停止液を各ウエルに100 μl ずつ加え415nm の波長で
発色レベルを測定した。陽性と判定された培養上清につ
いては、非病原性放線菌の菌体磨砕液を抗原としたELIS
A で２次スクリーニングを行い、最終的に非病原性放線
菌とは反応せず、Streptomyces scabiesに特異性の高い
抗体を産生するハイブリドーマ２株（7F11H10 ，78EH1
0）を得た。該ハイブリドーマ２株から得られたモノク
ローナル抗体（以下、モノクローナル抗体7F11H10 、78
EH10）のサブクラスは共にIgG1であった。本実施例によ
り得られたハイブリドーマ7F11H10 は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されその受託番号はＦＥＲＭ
Ｐ-１７５５０である。
【００１９】実施例２ モノクローナル抗体の特異性の
検討１ Streptomyces scabies、Streptomyces scabies subsp.a
chromogenes 、他種ジャガイモそうか病病原菌株２種、
非病原菌株１４種、亀の甲症菌１種を用いてELISA 法に
よりモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10の特異性を確
認した。それぞれの菌株を実施例１と同様の方法で処理
し、抗原固相化プレートを作製した。各プレートのウェ
ルにモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10の培養上清を
100 μlずつ加え以降実施例１と同様の操作で両モノク
ローナル抗体の発色レベルを測定した。モノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10は共にStreptomyces scabies、St
reptomyces scabies subsp.achromogenes に対して陽性
の反応を示し、他種ジャガイモそうか病病原菌株、非病
原菌株とは反応しなかった。この結果を下記表１に示
す。この結果から、モノクローナル抗体7F11H10 、78EH
10はS. scabies特異的であることが確認された。
検討１ Streptomyces scabies、Streptomyces scabies subsp.a
chromogenes 、他種ジャガイモそうか病病原菌株２種、
非病原菌株１４種、亀の甲症菌１種を用いてELISA 法に
よりモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10の特異性を確
認した。それぞれの菌株を実施例１と同様の方法で処理
し、抗原固相化プレートを作製した。各プレートのウェ
ルにモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10の培養上清を
100 μlずつ加え以降実施例１と同様の操作で両モノク
ローナル抗体の発色レベルを測定した。モノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10は共にStreptomyces scabies、St
reptomyces scabies subsp.achromogenes に対して陽性
の反応を示し、他種ジャガイモそうか病病原菌株、非病
原菌株とは反応しなかった。この結果を下記表１に示
す。この結果から、モノクローナル抗体7F11H10 、78EH
10はS. scabies特異的であることが確認された。
【００２０】
【表１】
【００２１】実施例３ モノクローナル抗体の特異性の
検討２ 実際のジャガイモ栽培土壌から分離した放線菌（非病原
性菌）４３菌株を用いてELISA 法によりモノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10の特異性を確認した。それぞれの
菌株を実施例１と同様の方法で処理し、抗原固相化プレ
ートを作製した。各プレートのウェルにモノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10の培養上清を100μl ずつ加え以
降実施例１と同様の操作で両モノクローナル抗体の発色
レベルを測定した。４圃場から分離した非病原性菌４３
菌株に対して反応が見られなかった。この結果を下記表
２に示す。よってモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10
はS. scabies特異的であることが確認された。
検討２ 実際のジャガイモ栽培土壌から分離した放線菌（非病原
性菌）４３菌株を用いてELISA 法によりモノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10の特異性を確認した。それぞれの
菌株を実施例１と同様の方法で処理し、抗原固相化プレ
ートを作製した。各プレートのウェルにモノクローナル
抗体7F11H10 、78EH10の培養上清を100μl ずつ加え以
降実施例１と同様の操作で両モノクローナル抗体の発色
レベルを測定した。４圃場から分離した非病原性菌４３
菌株に対して反応が見られなかった。この結果を下記表
２に示す。よってモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10
はS. scabies特異的であることが確認された。
【００２２】
【表２】
【００２３】実施例４ モノクローナル抗体の反応性の
測定 S. scabies subsp.achromogenes SNS-39、S. scabies T
YPE strain（ATCC49173 ）の菌体破砕液を用いてウェス
タンブロッティング法によりモノクローナル抗体7F11H1
0 、78EH10の反応性を確認した。 sodium dodecyl sulf
ate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)は
ゲル濃度１５％で常法に従った。泳動後ニトロセルロー
ス膜（TOYO社製）に転写し、ブロックエース（大日本製
薬製）にて４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキン
グ液を除きPBS-Tween で洗浄後、各レーンごとに培養上
清を加え３７℃１時間反応させた。PBS-Tween で十分に
洗浄した後、ブロックエース（４倍希釈液）で8000倍に
希釈した酵素標識抗マウスIgG 抗体を３７℃１時間反応
させた。PBS-Tween で十分に洗浄後、ECL ウェスタンブ
ロッティング検出システム（アマシャム・ファルマシア
バイオテック製）を用いてＸ線フィルム（コダック社
製）に１分間露光しシグナルを検出した。
測定 S. scabies subsp.achromogenes SNS-39、S. scabies T
YPE strain（ATCC49173 ）の菌体破砕液を用いてウェス
タンブロッティング法によりモノクローナル抗体7F11H1
0 、78EH10の反応性を確認した。 sodium dodecyl sulf
ate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)は
ゲル濃度１５％で常法に従った。泳動後ニトロセルロー
ス膜（TOYO社製）に転写し、ブロックエース（大日本製
薬製）にて４℃一晩ブロッキングを行った。ブロッキン
グ液を除きPBS-Tween で洗浄後、各レーンごとに培養上
清を加え３７℃１時間反応させた。PBS-Tween で十分に
洗浄した後、ブロックエース（４倍希釈液）で8000倍に
希釈した酵素標識抗マウスIgG 抗体を３７℃１時間反応
させた。PBS-Tween で十分に洗浄後、ECL ウェスタンブ
ロッティング検出システム（アマシャム・ファルマシア
バイオテック製）を用いてＸ線フィルム（コダック社
製）に１分間露光しシグナルを検出した。
【００２４】モノクローナル抗体7F11H10 ではSNS-39菌
体破砕液で25〜40kd付近に1 本のバンドが、ATCC49173
株では２本のバンドが認められた。モノクローナル抗体
78EH10ではSNS-39菌体破砕液で25〜50kd付近に２本のバ
ンドが、ATCC49173 株では３本のバンドが認められた。
体破砕液で25〜40kd付近に1 本のバンドが、ATCC49173
株では２本のバンドが認められた。モノクローナル抗体
78EH10ではSNS-39菌体破砕液で25〜50kd付近に２本のバ
ンドが、ATCC49173 株では３本のバンドが認められた。
【００２５】実施例５ 土壌中のS.scabies の検出 実際のジャガイモそうか病発病土壌からのS.scabies の
検出を行った。そうか病の半選択培地であるSTR 培地を
用いて土壌希釈平板法により放線菌を分離した。出現し
たコロニー８００菌株をデンプン培地に植菌（単離）し
た。外観上菌層が灰白色の４０菌株を液体培地で培養
し、実施例１の如くELISA に供した。４０菌株中３菌株
がモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10により陽性を示
した。これら３菌株は病原因子であるThaxtomin A を産
生し、メラニン色素非産生、胞子鎖が螺旋状であること
からStreptomyces scabies subsp.achromogenes と同定
された。残りの37菌株はThaxtomin A 非産生であり非病
原性菌と判定された。よってモノクローナル抗体7F11H1
0 、78EH10は実際のジャガイモそうか病発病土壌からの
S.scabies の検出が可能であることが確認された。
検出を行った。そうか病の半選択培地であるSTR 培地を
用いて土壌希釈平板法により放線菌を分離した。出現し
たコロニー８００菌株をデンプン培地に植菌（単離）し
た。外観上菌層が灰白色の４０菌株を液体培地で培養
し、実施例１の如くELISA に供した。４０菌株中３菌株
がモノクローナル抗体7F11H10 、78EH10により陽性を示
した。これら３菌株は病原因子であるThaxtomin A を産
生し、メラニン色素非産生、胞子鎖が螺旋状であること
からStreptomyces scabies subsp.achromogenes と同定
された。残りの37菌株はThaxtomin A 非産生であり非病
原性菌と判定された。よってモノクローナル抗体7F11H1
0 、78EH10は実際のジャガイモそうか病発病土壌からの
S.scabies の検出が可能であることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】本発明により、ジャガイモそうか病菌の
中でも主要なS.scabies を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体が得られた。本発明のモノクローナル抗体から
製造された試薬は、病斑部菌体、培養菌体、土壌中菌体
等多岐にわたる検体中のS.scabies を選択的かつ高感度
に測定することができる。従って、本発明によって、菌
に汚染された土壌を避けて栽培を行うことができるため
に、商品価値を下げずに、効率よくジャガイモを収穫す
ることができる。また、土壌中の病原菌量と発病との関
連を明らかにすることが可能となり、薬剤や土壌改良資
材の評価のための菌量測定等、防除対策開発に関する基
礎的な知見を得るための重要な手段となりうる。
中でも主要なS.scabies を特異的に認識するモノクロー
ナル抗体が得られた。本発明のモノクローナル抗体から
製造された試薬は、病斑部菌体、培養菌体、土壌中菌体
等多岐にわたる検体中のS.scabies を選択的かつ高感度
に測定することができる。従って、本発明によって、菌
に汚染された土壌を避けて栽培を行うことができるため
に、商品価値を下げずに、効率よくジャガイモを収穫す
ることができる。また、土壌中の病原菌量と発病との関
連を明らかにすることが可能となり、薬剤や土壌改良資
材の評価のための菌量測定等、防除対策開発に関する基
礎的な知見を得るための重要な手段となりうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (5)
- 【請求項１】 ジャガイモそうか病菌（ストレプトマイ
セス・スキャビエス;Streptomyces scabies)と特異的に
反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 抗体がハイブリドーマ７Ｆ１１Ｈ１０又
は７８ＥＨ１０から産生される請求項１に記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 ハイブリドーマが７Ｆ１１Ｈ１０又は７
８ＥＨ１０である請求項３に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】 請求項１ないし２のいずれか１項に記載
のモノクローナル抗体を用いてなる、ジャガイモそうか
病菌の免疫測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25837199A JP2001078763A (ja) | 1999-09-13 | 1999-09-13 | 抗ジャガイモそうか病菌モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25837199A JP2001078763A (ja) | 1999-09-13 | 1999-09-13 | 抗ジャガイモそうか病菌モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001078763A true JP2001078763A (ja) | 2001-03-27 |
Family
ID=17319326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25837199A Pending JP2001078763A (ja) | 1999-09-13 | 1999-09-13 | 抗ジャガイモそうか病菌モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び該抗体を用いる免疫測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001078763A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016220603A (ja) * | 2015-05-29 | 2016-12-28 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ジャガイモ作物体の生育状態診断方法 |
-
1999
- 1999-09-13 JP JP25837199A patent/JP2001078763A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016220603A (ja) * | 2015-05-29 | 2016-12-28 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | ジャガイモ作物体の生育状態診断方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20060324 |