KR20030079382A - 소화 효소-지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및이의 이용 - Google Patents
소화 효소-지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및이의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및 이의 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 췌장에서 분비되는 소화효소인 리파제, 아밀라제, 트립신에 지방산을 결합시켜 단백질의 항원성을 높인 뒤 이를 동물에 수차례 면역 접종을 실시하여 여기서 생산 분리된 항체 및 이의 이용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체를 식사전이나 식사중에 섭취 할 경우에는 효소에 대한 항체의 중화작용에 의해 소화효소를 비경쟁적으로 저해함으로써 중성지질, 탄수화물, 단백질 등의 분해를 적절히 억제할 수 있어 소장내에서 지방산, 당, 아미노산의 흡수를 줄일 수 있으며, 그 결과 비만을 억제하고 혈액내 혈당을 제어할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및 이의 이용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 췌장에서 분비되는 소화효소인 리파제, 아밀라제, 트립신에 지방산을 결합시켜 단백질의 항원성을 높인 뒤 이를 동물에 수차례 면역 접종을 실시하여 여기서 생산 분리된 항체 및 이의 이용에 관한 것이다.
비만은 풍성한 식탁과 함께 스트레스가 많은 현대인에게 쉽게 찾아올 수 있는 질병의 일종으로 특히 체지방의 축적으로 인해 심장질환이나 당뇨병, 고혈압과 같은 각종 성인병이 유발될 수 있어 날이 갈수록 심각한 사회 문제가 되고 있다. 따라서 이를 저지, 치료하기 위해서 수 많은 다이어트 식품, 의약품, 화장품, 운동요법 심지어 아로마치료법이나 심리치료법까지 이용되고 있으나 아직까지 만족스러운 효과를 얻지 못하고 있는 상황이다.
그런데 우리가 음식물을 먹으면 구강내에서 아밀라제가 함유된 침이 분비되어 상당부분의 탄수화물이 분해되고 위에서는 펩신이 분비되어 일부분의 단백질들이 폴리 펩타이드 형태로 분해되게 된다. 또 간에서 쓸개즙이 분비되면서 췌장에서는 많은 양의 아밀라제, 리파제, 트립신, 키모트립신등이 분비되어 탄수화물, 지방, 단백질과 같은 영양성분들이 저분자 당이나 지방산, 폴리펩타이드의 형태로 분해되게 된다. 따라서 이러한 소화 효소들은 위에서 소장으로 넘어온 음식물들이 소장에서 분해되어 흡수되는데 매우 중요한 역할을 하게 되며 이러한 효소들을 적당한 방법으로 억제할 경우 섭취된 영양성분의 일부분이 소장에서 분해되는 것을억제할 수 있다. 이러한 원리를 이용하여 지금까지 여러종류의 소화 효소의 저해제를 이용한 비만 치료제가 개발되었는데 그 예로는 탄수화물 분해 효소인 글루코시다제의 저해제 (아카보즈; Scheen AJ, Clinical efficacy ofacarbosein diabetes mellitus: a critical review of controlled trials,Diabetes Metab1998 Sep;24(4):311-20, 미그리톨; Sels JP, Huijberts MS, Wolffenbuttel BH,Miglitol, a new alpha-glucosidase inhibitor,Expert Opin Pharmacother1999 Nov;1(1):149-56 )와 지방 분해 효소인 리파제의 저해제(오르리스타트; Ballinger A,Orlistatin the treatment of obesity.Expert Opin Pharmacother2000 May;1(4): 841-7, Tsuji M, Saito N, Inoue S, Inhibitors of absorption asanti-obesity drugs,Nippon Yakurigaku Zasshi2001 Nov;118(5): 340-6)등이 있다. 아카보즈는 소장 점막에서 분비되는 알파 글루코시다제의 저해제로써 장내 당질의 소화와 포도당의 흡수를 지연, 식후 고혈당을 방지할 수 있으며 불용성인 아카보즈와 달리 수용성인 미그리톨은 현재 임상중에 있다. 오르리스타트는 리파제의 저해제로써 위 및 췌장에서 분비되는 리파제의 활성 세린 부위에 공유결합하여 위 및 상부 소장의 관강내에서 치료 활성을 나타낸다. 즉, 불활성화 된 리파제는 트리글리세리드 형태의 식이성 지방을 흡수 가능한 유리지방산 및 모노글리세리드 형태로 가수분해를 할 수 없게 되어 지방의 흡수를 감소시킨다. 2년간 실시한 5건의 연구를 종합한 데이터를 보면, 저칼로리 식이와 병행하여 1년간 치료를 실시한 후에 체중이 10% 이상 감량된 환자의 비율은 오르리스타트 120mg 투여군이 20%이었던 반면에 플라시보 투여군에서는 5% 이었다고 한다.
그러나 이들 의약품을 복용할 경우 기대할 수 있는 체중 감량은 그리 크지 않은 것으로 알려져 있는데 이는 췌장에서 분비되는 효소들의 양이 매우 많을 뿐아니라 이들 약물이 소장에서 작용하는 효소들에게 경쟁적 저해라는 방법으로 역가를 억제 하기 때문이다. 즉 식사 후 효소의 기질에 해당하는 당이나 지방이 엄청나게 증가한 상황에서는 경쟁적 저해라는 방법으로는 소화 효소에 대한 이들 약물의 억제효과가 현저히 줄어들 수 밖에 없는 문제점이 있어 이에 대한 해결의 필요성이 지대한 실정이었다.
이에, 본 발명의 발명자는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해 리파제, 아밀라제, 트립신과 같은 소화 효소에 대한 항체를 제작하여 여러 소화효소에 대한 비경쟁적 저해반응을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 동물로부터 생산 분리된 항체를 제공하고자 하는데 있다.
또한, 본 발명은 소화에 관련된 효소들에 특이적으로 결합하여 이들의 활성을 억제하는 상기 항체를 추가적으로 제공한다.
또한, 본 발명은 혈액내 혈당을 제어할 수 있는 상기 항체를 제공한다.
그리고, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 동물 또는 식품을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
도 1은 닭의 혈청에서 측정한 리파제에 대한 소화효소-스테아린산 혹은 소화효소-팔미트산 복합체를 항원으로 하여 생산분리된 항체의 역가 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 계란의 난황에서 측정한 리파제에 대한 소화효소-스테아린산 혹은 소화효소-팔미트산 복합체를 항원으로 하여 생산분리된 항체의 역가 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 소화효소 역가감소에 대한 소화효소-팔미트산 복합체를 항원으로 하여 생산분리된 항체의 농도에 따른 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 체중변화에 대한 소화효소-팔미트산 복합체를 항원으로 하여 생산분리된 항체의 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 배설물내 지질, 당, 단백질의 농도 변화에 대한 소화효소-팔미트산 복합체를 항원으로 하여 생산분리된 항체의 영향을 나타낸 것이다.
본 발명은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및 이의 이용에 관한 것으로, 이에 대하여 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 본 발명은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 동물로부터 생산 분리된 항체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 여기서 소화효소는 췌장으로부터 추출된 리파제, 아밀라제, 트립신, 또는 키모트립신 중에서 선택된 1 종 이상을 말한다. 또한, 지방산은 부티르산, 미리스틴산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 콜린산, 디옥시콜린산, 글리코콜린산, 타우로콜린산 또는 아라키돈산 중에서 선택된 1 종 이상이며, 동물은 닭, 오리, 메추리, 타조와 같은 가금류 혹은 돼지, 소, 염소, 양과 같은 가축 중에서 선택된 1 종이다. 또한, 항체는 난황을 비롯한 상기 동물의 모유나 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
이를 보다 구체적으로 살펴보면, 항체를 제조하기 위하여 상기 동물의 췌장으로부터 분리한 각종 소화효소의 단일 또는 혼합물에 지방산을 결합시켜 소화효소-지방산 복합체를 제조한다. 그런 다음, 이들 복합체를 상기 동물에게 수차례에 걸쳐 면역접종하여 항체가 형성되게끔 한다. 이때, 지방산은 소화효소 단백질들의 항원성을 높혀주기 위해 결합하는 것으로, 이 지방산이 없으면 충분한 항원성이 확보되지 않아 항체 형성이 어렵게 된다. 마지막으로, 이렇게 하여 형성된 항체를 계란의 난황이나 우유, 혈액 등으로부터 통상적인 방법으로 분리하거나 또는 이를 직접 식품 등에 사용한다.
또한, 본 발명은 상기 항체가 소화에 관련된 효소들에 특이적으로 결합하여이들의 활성을 억제하는 것을 포함한다.
그리고, 본 발명은 상기 항체가 혈액내 혈당을 제어할 수 있는 것을 포함한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 동물 자체 또는 식품을 포함한다. 여기서, 식품이라 함은 항체가 첨가된 식품과 캅셀, 요구르트, 우유, 음료수등을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예: 소화효소-지방산 복합체를 항원으로 한 항체의 제조
돼지 췌장액으로 부터 분리한 리파제, 아밀라제, 트립신 혼합물(이하 효소 혼합물)에 표 1과 같이 4가지 형태의 지방산을 결합시켰다. 효소 혼합물에 스테아린산, 팔미트산, 올레인산 및 콜린산과 같은 지방산을 결합시키기 위하여 ECD(1-에틸-3-(3디메틸아미노프로필)카보디이미드)와 NHS(N-하이드록시석신이미드)를 이용하여 지방산의 카복실기와 단백질의 아미노기가 결합하여 아마이드 결합 형성하게 하였다. 먼저 0.1 M 지방산을 에탄올에 녹인후 이것을 유리 시험관에 넣고 증발시켜 필름을 형성시킨후 여기에 0.2 M EDC와 0.05M NHS를 첨가하여 상온에서 회전시키며 60분간 반응시킨다. 여기에 약 0.01M에 해당하는 효소 혼합물을 히피스 완충용액(pH 7.2)에 녹여 첨가한후 120분간 상온에서 회전시키며 반응시킨다. 반응이 끝나면 60% 황산암모늄을 첨가하여 단백질을 침전 회수하고 이것을 PBS 완충용액으로 투석하여 지방산이 결합된 단백질을 제조한다. 팔미트산의 경우 NHSP(팔미트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르)를 이용하여 단백질에 직접 결합시키는 방법도 이용하였다. 이 경우에는 0.1M NHSP와 0.02M DOC(디옥시 콜린산)을 0.01M 단백질 용액에 첨가한 후 상온에서 회전시키며 반응시켰다. 지방산이 결합된 효소 혼합물은 면역촉진제인 프로인트 완전 애쥬반트(CA)와 함께 혼합하여 계란을 낳을 수 있는 암닭에게 수차례 면역주사를 실시하여 항체를 생성시켰다. 이때 면역촉진제로 포스타티딜콜린, 콜레스테롤, 타우로콜린산이 7:2:1로 혼합된 리포좀을 사용하면 항체생산을 더욱 더 증가시킬 수 있었다.
실험예 1: 항체역가테스트
상기 실시예에서 제조한 소화효소-지방산 복합체를 항원으로하여 암닭에게 3회 면역접종을 실시한 후 2주가 경과한 닭의 혈청으로부터 리파제, 아밀라제, 트립신에 대한 항체의 역가를 측정하였고, 그 결과를 다음 표 1에 요약하여 나타내었다.
| 항원 | 효소 혼합물만의 경우 | 스테아린산 | 팔미트산 | 올레인산 | 콜린산 | 팔미트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(NHSP) |
| 리파제 | 0.08 | 0.36 | 0.44 | 0.29 | 0.38 | 0.34 |
| 아밀라제 | 0.06 | 0.29 | 0.28 | 0.30 | 0.29 | 0.23 |
| 트립신 | 0.09 | 0.23 | 0.20 | 0.28 | 0.21 | 0.27 |
효소 혼합물만을 항원으로 이용한 경우에는 3가지 효소에 대한 항체가 거의 생기지 않았으나 단백질을 여러가지 지방산으로 결합시킨후 이를 면역 주사하였을 때에는 각 효소에 대한 항체가 표 1과 같이 생성되었으며 특히 리파제와 아밀라제에 대한 항체의 역가가 트립신보다 높게 나타났다.
실험예 2: 항체의 역가 변화
팔미트산이 결합된 리파제, 아밀라제, 트립신을 항원으로 하여 실시예와 같이 면역접종을 실시하고 매회 2주가 경과했을 때 닭의 혈청에서 측정한 리파제에 대한 항체의 역가 변화를 측정하였다. 그리고, 그 결과를 도 1에 요약하여 나타내었다. 그 결과, 먼저 효소 혼합물 만을 면역 주사하였을 때는 3차 접종 후에도 리파제에 대한 항체가 거의 생성되지 않음을 알 수 있었다. 그러나 효소 혼합물을 스테아린산이나 팔미트산으로 결합시킨 후 면역주사를 한 경우에는 1차 접종 후부터 혈청내에 리파제에 대한 항체가 생성되기 시작하였고 2차 접종후 에는 매우 높은 항체가 형성되었다. 이때 혈액에 생성된 항체는 닭이 낳는 계란에도 그대로 전달되는데, 도 2는 면역접종을 실시 했을때 이 닭이 낳은 계란의 난황에서 생성된 항체(IgY)의 역가를 나타낸 것으로 도 1의 혈청과 유사한 형태로 리파제에 대한 난황 항체가 생성됨을 확인하였다.
실험예 3: 난황 항체(IgY) 농도에 따른 소화효소 역가 측정
실시예에서와 같은 방법으로 제조된 팔미트산이 결합된 효소 혼합물을 닭에게 3회 면역접종하여 생산한 난황 항체(IgY)를 리파제, 아밀라제, 트립신 효소 용액에 첨가한 뒤 이들 효소의 역가를 측정하여 IgY 농도 변화에 따른 효소의 역가 변화를 알아보았고, 그 결과를 도 3에 요약하여 나타내었다. 그 결과, 생산된 난황 항체를 0.5mg/ml의 농도로 첨가하였을 때 리파제는 약 50%, 아밀라제는 약 40% 그리고 트립신은 약 11%의 역가 감소를 나타내었다. 이는 상기 실시예와 같은 방법으로 생산된 난황 항체가 췌장 유래 소화 효소인 리파제, 아밀라제, 트립신의 저해제로 사용될 수 있음을 보여 주는 것이다.
실험예 4: 체중에 대한 난황항체 영향의 측정
돼지 췌장에서 분리한 소화효소를 실시예에서와 같은 방법으로 팔미트산에 결합시킨 후, 암닭에게 3회 면역접종하여 난황 항체를 생산하였다. 그리고 이 난황 항체를 특이 항체로 이용하여 일반사료와 함께 사막 쥐에게 체중 일그램당 0.2mg씩 매일 경구 투여하며 5주간 측정한 몸무게를 측정하였다. 그리고 비교 실험을 위하여 항체대신 물을 먹인 사막 쥐 그룹을 대조 그룹이라 하고 시중에서 구입한 계란에서 분리한 비특이 난황항체(nonspecific egg yolk antibody)를 체중 일그램당 0.2mg씩 먹인 그룹을 비특이 그룹, 그리고 특이 난황항체(specific eggyolk antibody)를 체중 일그램당 0.2mg씩 먹인 그룹을 특이 그룹으로 구분하여 그 결과를 다음 도4에 요약하여 나타내었다. 이때, 한 그룹당 4주령의 사막 쥐 5마리를 이용하였다. 그 결과, 대조 그룹과 비특이 그룹 사이의 몸무게에는 별다른 차이가 없었으나 특이 그룹에서는 약 7.3% 정도의 몸무게 감소효과가 나타났다. 이에,소장에서 분해되지 못한 영양성분은 배설물로 배출된다고 가정하여 사막쥐의 배설물에서 지방산, 당 및 단백질 양을 측정하였고 그 결과를 도 5에 요약하여 각각 나타내었다. 그 결과, 대조 그룹이나 비특이 그룹에 비해 특이 그룹의 배설물에서 지방산은 42%, 당은 41% 그리고 아미노산은 36% 씩 함량이 높았다. 이 결과로 보아 췌장의 소화 효소에 대한 저해효과를 가지고 있는 특이 난황 항체가 소장에서 음식물의 소화 및 흡수를 효과적으로 억제하여 지방산과 당 그리고 아미노산의 분해, 흡수를 상당부분 억제한다고 볼 수 있다.
이상에서와 같이, 본 발명은 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및 이의 이용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 항체를 식사전이나 식사중에 섭취 할 경우에는 효소에 대한 항체의 중화작용에 의해 소화효소를 비경쟁적으로 저해함으로써 중성지질, 탄수화물, 단백질 등의 분해를 적절히 억제할 수 있어 소장내에서 지방산, 당, 아미노산의 흡수를 줄일 수 있으며, 그 결과 비만을 억제하고 혈액내 혈당을 제어할 수 있는 효과가 있다.
Claims (11)
- 소화 효소 - 지방산 복합체를 항원으로하여 리포좀 애쥬반트를 사용하여 동물로부터 생산 분리된 항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 소화효소는 췌장으로부터 추출된 리파제, 아밀라제, 트립신, 및 키모트립신으로 이루어진 그룹 중 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 지방산은 부티르산, 미리스틴산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 콜린산, 디옥시콜린산, 글리코콜린산, 타우로로콜린산 및 아라키돈산으로 이루어진 그룹에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 콜린산, 디옥시콜린산, 글리코콜린산, 타우로콜린산으로 이루어진 그룹에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 닭, 오리, 메추리, 타조와 같은 가금류와 돼지, 소, 염소, 및 양과 같은 가축으로 이루어진 그룹중에서 선택된 1 종인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 난황을 비롯한 상기 제 5 항의 동물의 모유 혹은 혈액으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 항체.
- 소화에 관련된 효소들에 특이적으로 결합하여 이들의 활성을 억제하는 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 항체.
- 혈액내 혈당을 제어할 수 있는 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항의 항체.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 동물 또는 식품.
- 제 9 항에 있어서, 상기 식품은 캅셀, 요구르트, 우유, 음료수인 것을 특징으로 하는 식품.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법.
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