JPH06133794A - ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 - Google Patents
ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法Info
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- JPH06133794A JPH06133794A JP4287942A JP28794292A JPH06133794A JP H06133794 A JPH06133794 A JP H06133794A JP 4287942 A JP4287942 A JP 4287942A JP 28794292 A JP28794292 A JP 28794292A JP H06133794 A JPH06133794 A JP H06133794A
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- hybridoma
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒラメインターフェロンで免疫された哺乳動
物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得ら
れるハイブリドーマを用いてヒラメインターフェロンと
反応するモノクローナル抗体を生産する。 【効果】 ヒラメインターフェロンに対して特異性を示
すモノクローナル抗体を提供できる。
物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得ら
れるハイブリドーマを用いてヒラメインターフェロンと
反応するモノクローナル抗体を生産する。 【効果】 ヒラメインターフェロンに対して特異性を示
すモノクローナル抗体を提供できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒラメインターフェロ
ンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造する
ためのハイブリドーマ及び方法に関するものである。
ンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造する
ためのハイブリドーマ及び方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】これまでのところ、魚病の発見及びその
診断には、魚病の外観、原因生物の分離、分離生物の理
化学的性状検査が行われているが、これらには数週間も
の時間が要求される。
診断には、魚病の外観、原因生物の分離、分離生物の理
化学的性状検査が行われているが、これらには数週間も
の時間が要求される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】魚類免疫機構の中でも
重要な役割を担っているインターフェロン（以下「ＩＦ
Ｎ」という。）の検出が、簡便な魚病の診断法の開発の
ために要望されている。即ち、本発明は、簡便な魚病の
診断に有用な、ヒラメＩＦＮに対するモノクローナル抗
体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方
法を提供することを目的とする。
重要な役割を担っているインターフェロン（以下「ＩＦ
Ｎ」という。）の検出が、簡便な魚病の診断法の開発の
ために要望されている。即ち、本発明は、簡便な魚病の
診断に有用な、ヒラメＩＦＮに対するモノクローナル抗
体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方
法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本願発明の第一は、ヒラ
メＩＦＮで免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の
骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマによっ
て生産され、ヒラメＩＦＮと反応するが、ヒトγ−ＩＦ
Ｎ及びマウスＩＦＮとは反応せず、 IgG又は IgMのクラ
スに属するモノクローナル抗体であり、本願発明の第二
は、ヒラメＩＦＮで免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺
乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られ、前記モノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマであり、本願発明
の第三は、前記ハイブリドーマを培養し、前記モノクロ
ーナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル
抗体の製造法である。
メＩＦＮで免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の
骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマによっ
て生産され、ヒラメＩＦＮと反応するが、ヒトγ−ＩＦ
Ｎ及びマウスＩＦＮとは反応せず、 IgG又は IgMのクラ
スに属するモノクローナル抗体であり、本願発明の第二
は、ヒラメＩＦＮで免疫された哺乳動物の免疫細胞と哺
乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られ、前記モノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマであり、本願発明
の第三は、前記ハイブリドーマを培養し、前記モノクロ
ーナル抗体を採取することを特徴とするモノクローナル
抗体の製造法である。
【０００５】本発明のモノクローナル抗体は、ヒラメＩ
ＦＮを免疫抗原として免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺
乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドー
マを培養して該モノクローナル抗体を産生せしめ、該モ
ノクローナル抗体を採取することにより得られる。上述
の哺乳動物の免疫細胞は、免疫抗原としてヒラメＩＦＮ
を用いて通常の方法により哺乳動物を免疫することによ
り調製される。ここで用いる哺乳動物としては特に制限
はないが、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラ
ット等が使用される。免疫方法も一般的方法によって行
われ、例えば、ヒラメＩＦＮをリン酸緩衝生理食塩水(P
BS)等の緩衝液で適当な濃度に希釈し、フロイントのア
ジュバントとの懸濁液とし、皮下注射によって動物に投
与する。初回免疫の２〜５週間後に追加免疫を行い、こ
れを２〜数回繰り返す。免疫細胞としては、最終免疫の
約３日後に摘出した脾臓細胞から取り出したリンパ球を
使用するのが好ましい。また、上記のごとくして得られ
る免疫細胞と融合される他方の親細胞としての骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）としては既知の細胞株、例えばマ
ウス由来のNS-O、NS-1、SP-2/O、P3-U1、FO、S194等や
ラット由来のR210等が挙げられる。なお、この際の免疫
細胞と骨髄腫細胞は、同一種の動物からのものが望まし
く、特にマウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞が実用上有
利である。
ＦＮを免疫抗原として免疫した哺乳動物の免疫細胞と哺
乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドー
マを培養して該モノクローナル抗体を産生せしめ、該モ
ノクローナル抗体を採取することにより得られる。上述
の哺乳動物の免疫細胞は、免疫抗原としてヒラメＩＦＮ
を用いて通常の方法により哺乳動物を免疫することによ
り調製される。ここで用いる哺乳動物としては特に制限
はないが、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、一般的にはマウス、ラ
ット等が使用される。免疫方法も一般的方法によって行
われ、例えば、ヒラメＩＦＮをリン酸緩衝生理食塩水(P
BS)等の緩衝液で適当な濃度に希釈し、フロイントのア
ジュバントとの懸濁液とし、皮下注射によって動物に投
与する。初回免疫の２〜５週間後に追加免疫を行い、こ
れを２〜数回繰り返す。免疫細胞としては、最終免疫の
約３日後に摘出した脾臓細胞から取り出したリンパ球を
使用するのが好ましい。また、上記のごとくして得られ
る免疫細胞と融合される他方の親細胞としての骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）としては既知の細胞株、例えばマ
ウス由来のNS-O、NS-1、SP-2/O、P3-U1、FO、S194等や
ラット由来のR210等が挙げられる。なお、この際の免疫
細胞と骨髄腫細胞は、同一種の動物からのものが望まし
く、特にマウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞が実用上有
利である。
【０００６】前記免疫細胞と骨髄腫細胞との融合反応
は、基本的には公知の方法、例えばOi及びHerzenbergの
方法 (Selected Methods in Cellular Immunology, 351
-371,W. H. Freeman & Co., USA press, 1980) 等に準
じて行うことができる。より具体的には、前記融合反応
は、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行
われる。ここで融合促進剤としては、通常用いられてい
るもの、例えばポリエチレングリコール(PEG) 、センダ
イウイルス(HVJ) 等が使用され、更に融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド(DMSO)等の補助剤を添加使
用することもできる。また、電気パルスによる方法(J.
Vienken & U. Zimmermann, FEBS Letters,137, 11-13(1
982))を使用してもよい。免疫細胞と骨髄腫細胞との使
用比は通常の方法と変わりがなく、例えば骨髄腫細胞に
対し免疫細胞を約１〜10倍の割合で用いればよい。前記
融合時の培地としては、例えば前記骨髄腫細胞株の増殖
に使用されるような RPMI-1640培地、MEM 培地、 E-RDF
培地、その他この種の細胞培養に使用される通常の各種
培地を利用でき、通常は牛胎児血清(FCS) 等の血液補液
を除いておくことが好ましい。融合は、前記免疫細胞と
骨髄腫細胞との所定量を前記培地中でよく混合し、予め
37℃に加温した PEG、例えば平均分子量 1,000〜6,000
程度のものを、通常培地に約30〜60％(w/v) の濃度で加
えて混合することにより行われる。
は、基本的には公知の方法、例えばOi及びHerzenbergの
方法 (Selected Methods in Cellular Immunology, 351
-371,W. H. Freeman & Co., USA press, 1980) 等に準
じて行うことができる。より具体的には、前記融合反応
は、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行
われる。ここで融合促進剤としては、通常用いられてい
るもの、例えばポリエチレングリコール(PEG) 、センダ
イウイルス(HVJ) 等が使用され、更に融合効率を高める
ためにジメチルスルホキシド(DMSO)等の補助剤を添加使
用することもできる。また、電気パルスによる方法(J.
Vienken & U. Zimmermann, FEBS Letters,137, 11-13(1
982))を使用してもよい。免疫細胞と骨髄腫細胞との使
用比は通常の方法と変わりがなく、例えば骨髄腫細胞に
対し免疫細胞を約１〜10倍の割合で用いればよい。前記
融合時の培地としては、例えば前記骨髄腫細胞株の増殖
に使用されるような RPMI-1640培地、MEM 培地、 E-RDF
培地、その他この種の細胞培養に使用される通常の各種
培地を利用でき、通常は牛胎児血清(FCS) 等の血液補液
を除いておくことが好ましい。融合は、前記免疫細胞と
骨髄腫細胞との所定量を前記培地中でよく混合し、予め
37℃に加温した PEG、例えば平均分子量 1,000〜6,000
程度のものを、通常培地に約30〜60％(w/v) の濃度で加
えて混合することにより行われる。
【０００７】所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の分離
は、通常の選択用培地、例えばHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより
行われる。かくして得られるハイブリドーマは、通常の
限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び
単一クローン化が行われる。目的とする抗体産生ハイブ
リドーマの検索は、例えば間接免疫蛍光法、酵素結合免
疫吸着検定法(ELISA法）、中和反応法、沈降反応法、補
体結合反応法、凝集反応法、オクタロニー(Ouchterlon
y) 法、放射線免疫検定法(RIA法) 等の一般に抗体の検
出に用いられている種々の方法によって行われる。
は、通常の選択用培地、例えばHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地で培養することにより
行われる。かくして得られるハイブリドーマは、通常の
限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株の検索及び
単一クローン化が行われる。目的とする抗体産生ハイブ
リドーマの検索は、例えば間接免疫蛍光法、酵素結合免
疫吸着検定法(ELISA法）、中和反応法、沈降反応法、補
体結合反応法、凝集反応法、オクタロニー(Ouchterlon
y) 法、放射線免疫検定法(RIA法) 等の一般に抗体の検
出に用いられている種々の方法によって行われる。
【０００８】前記のごとくして得られる本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培地で
継代培養ができ、また、液体窒素中で容易に長期間保存
が可能である。前記の特定ハイブリドーマから、本発明
のモノクローナル抗体を製造する方法としては、前記ハ
イブリドーマを常法に従って、例えば、２×105 細胞/m
l になるよう10％ウシ胎児血清(FCS) 添加 E-RDF培地
（村上浩紀ら，日農化誌，58, 575(1984))に懸濁後、35
〜38℃の５％CO2 インキュベーター内で培養し、その培
養上清から所望抗体を分離する方法、或は前記ハイブリ
ドーマをこれと適合性のある哺乳動物に移植して増殖さ
せ、その腹水や血清より所望抗体を分離する方法等が採
用される。このようにして得られる本発明のモノクロー
ナル抗体の精製は、塩析、アフィニティーカラムやDEAE
カラムを用いるクロマトグラフィー等により行うことが
できる。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培地で
継代培養ができ、また、液体窒素中で容易に長期間保存
が可能である。前記の特定ハイブリドーマから、本発明
のモノクローナル抗体を製造する方法としては、前記ハ
イブリドーマを常法に従って、例えば、２×105 細胞/m
l になるよう10％ウシ胎児血清(FCS) 添加 E-RDF培地
（村上浩紀ら，日農化誌，58, 575(1984))に懸濁後、35
〜38℃の５％CO2 インキュベーター内で培養し、その培
養上清から所望抗体を分離する方法、或は前記ハイブリ
ドーマをこれと適合性のある哺乳動物に移植して増殖さ
せ、その腹水や血清より所望抗体を分離する方法等が採
用される。このようにして得られる本発明のモノクロー
ナル抗体の精製は、塩析、アフィニティーカラムやDEAE
カラムを用いるクロマトグラフィー等により行うことが
できる。
【０００９】本発明のモノクローナル抗体のクラスとし
ては IgG及び IgMが好ましく、中でも IgG1 の抗体は特
異性に優れかつ抗体価が高いことから実用上有利であ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的検索
法・測定法は生体内外のヒラメＩＦＮの解析に有用であ
る。本発明のモノクローナル抗体を免疫学的検索法・測
定法に用いる際には、直接法、拮抗阻害法、サンドウィ
ッチ法、サンドウィッチによる拮抗阻害法などが用いら
れるが、生体試料又はモノクローナル抗体を担体に固定
化しておくのが望ましく、固定化の方法は公知の方法を
採用でき、担体としては固相担体の、例えばポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロン、ポリ
アセテート、ポリアセタール、ラテックス等を用いたボ
ール、ビーズ、ギア、マイクロプレート等が好ましく使
用される。
ては IgG及び IgMが好ましく、中でも IgG1 の抗体は特
異性に優れかつ抗体価が高いことから実用上有利であ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的検索
法・測定法は生体内外のヒラメＩＦＮの解析に有用であ
る。本発明のモノクローナル抗体を免疫学的検索法・測
定法に用いる際には、直接法、拮抗阻害法、サンドウィ
ッチ法、サンドウィッチによる拮抗阻害法などが用いら
れるが、生体試料又はモノクローナル抗体を担体に固定
化しておくのが望ましく、固定化の方法は公知の方法を
採用でき、担体としては固相担体の、例えばポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロン、ポリ
アセテート、ポリアセタール、ラテックス等を用いたボ
ール、ビーズ、ギア、マイクロプレート等が好ましく使
用される。
【００１０】また、モノクローナル抗体は標識化して用
いられるが、その方法や手段は何等限定されるものでは
なく、公知の方法や手段、例えば、放射性物質又は酵素
もしくは蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体又
はブドウ球菌蛋白質Ａとの２次反応により測定すること
ができる。標識剤としては、酵素を用いる方法（ＥＩ
Ａ）ではホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が、放
射性物質を用いる方法（ＲＩＡ）では 125Ｉ、 3Ｈ等
が、蛍光物質を用いる方法（ＦＩＡ）ではイソチオシア
ン酸フルオレセイン等が通常使用されるが、その標識剤
の活性が検知できるものであれば、その他のものであっ
てもよい。
いられるが、その方法や手段は何等限定されるものでは
なく、公知の方法や手段、例えば、放射性物質又は酵素
もしくは蛍光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体又
はブドウ球菌蛋白質Ａとの２次反応により測定すること
ができる。標識剤としては、酵素を用いる方法（ＥＩ
Ａ）ではホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等が、放
射性物質を用いる方法（ＲＩＡ）では 125Ｉ、 3Ｈ等
が、蛍光物質を用いる方法（ＦＩＡ）ではイソチオシア
ン酸フルオレセイン等が通常使用されるが、その標識剤
の活性が検知できるものであれば、その他のものであっ
てもよい。
【００１１】標識剤が酵素である場合には、その活性を
測定するために基質が用いられる。基質としては、例え
ばホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として
２，２'-アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸］アンモニウム酸 (ABTS)-H2O2、Ｏ−フェニレン
ジアミン−H2O2、４−アミノアンチピリン−H2O2等が、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてβ−Ｄ−ガラク
トピラノシド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド等が挙げられる。測定のためには、これら
の試薬以外にも溶解剤、反応停止剤等の公知の試薬が使
用される。
測定するために基質が用いられる。基質としては、例え
ばホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として
２，２'-アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスル
ホン酸］アンモニウム酸 (ABTS)-H2O2、Ｏ−フェニレン
ジアミン−H2O2、４−アミノアンチピリン−H2O2等が、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてβ−Ｄ−ガラク
トピラノシド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド等が挙げられる。測定のためには、これら
の試薬以外にも溶解剤、反応停止剤等の公知の試薬が使
用される。
【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、生体成分
のヒラメＩＦＮのイムノブロッティング法による検出法
にも利用することができる。イムノブロットは公知の方
法で行い、手法材料に何等限定を受けるものではない。
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的検索法は
具体的に生体成分をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセル
ロースを始めとする公知の膜に電気的又は毛細管現象を
利用して転写し、以下モノクローナル抗体を用いた公知
の免疫化学的検索法によって、膜上のヒラメＩＦＮを検
出せしめ、病性変化の可能性の有無、病状の進行度の判
定に用いることができる。
のヒラメＩＦＮのイムノブロッティング法による検出法
にも利用することができる。イムノブロットは公知の方
法で行い、手法材料に何等限定を受けるものではない。
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫学的検索法は
具体的に生体成分をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセル
ロースを始めとする公知の膜に電気的又は毛細管現象を
利用して転写し、以下モノクローナル抗体を用いた公知
の免疫化学的検索法によって、膜上のヒラメＩＦＮを検
出せしめ、病性変化の可能性の有無、病状の進行度の判
定に用いることができる。
【００１３】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に詳
細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるもの
ではない。 （実施例１） （１）ヒラメＩＦＮの培養細胞を用いての生産 組換え型ヒラメＩＦＮ産生細胞ＢＨＫ Ａ９（微工研菌
寄第１３０７２号） (特願平4-206776号明細書参照) を
８×105 細胞/ml の密度で１Ｌ培養した。培養の条件は
37℃、５％ＣＯ2 条件下で２日であった。 （２）培養細胞中で生産されたヒラメＩＦＮの精製 ヒラメＩＦＮの精製は Tamaiらの方法 (特願平4-206776
号明細書) を用いた。純度の検定は、12％アクリルアミ
ドの分離ゲルを用いて行った。泳動後、ゲル上の蛋白質
はクマーシーブルー R250 染色することにより、検出し
た。 （３）マウスの抗原感作 ヒラメＩＦＮをSTE-緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、 1
mM EDTA、100mM NaCl) で希釈し、第１回免疫として40
μg のヒラメＩＦＮ蛋白質を含む溶液0.5ml を同量のフ
ロイント完全アジュバンドと混合し、BALB/c系マウス
(６週令、オス)の腹腔内に注射した。第１回免疫から２
週間おきに同量のヒラメＩＦＮ蛋白質をアジュバンドを
用いずに腹腔内注射し、計３回の免疫を行った。免疫中
の血中抗体価は、マウスの眼けい静脈から血液を採取
し、得られた血液中の特異抗体量をELISA法によって測
定した。この場合、抗原として精製ヒラメＩＦＮを用
い、２次抗体には2,000 倍希釈のペルオキシダーゼ標識
−抗マウス IgG又は IgMを用いてそれぞれの抗体価を測
定し、対照として非免疫マウス血清を用いた。最終免疫
後の特異抗体価は約２倍に上昇していた。
細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるもの
ではない。 （実施例１） （１）ヒラメＩＦＮの培養細胞を用いての生産 組換え型ヒラメＩＦＮ産生細胞ＢＨＫ Ａ９（微工研菌
寄第１３０７２号） (特願平4-206776号明細書参照) を
８×105 細胞/ml の密度で１Ｌ培養した。培養の条件は
37℃、５％ＣＯ2 条件下で２日であった。 （２）培養細胞中で生産されたヒラメＩＦＮの精製 ヒラメＩＦＮの精製は Tamaiらの方法 (特願平4-206776
号明細書) を用いた。純度の検定は、12％アクリルアミ
ドの分離ゲルを用いて行った。泳動後、ゲル上の蛋白質
はクマーシーブルー R250 染色することにより、検出し
た。 （３）マウスの抗原感作 ヒラメＩＦＮをSTE-緩衝液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)、 1
mM EDTA、100mM NaCl) で希釈し、第１回免疫として40
μg のヒラメＩＦＮ蛋白質を含む溶液0.5ml を同量のフ
ロイント完全アジュバンドと混合し、BALB/c系マウス
(６週令、オス)の腹腔内に注射した。第１回免疫から２
週間おきに同量のヒラメＩＦＮ蛋白質をアジュバンドを
用いずに腹腔内注射し、計３回の免疫を行った。免疫中
の血中抗体価は、マウスの眼けい静脈から血液を採取
し、得られた血液中の特異抗体量をELISA法によって測
定した。この場合、抗原として精製ヒラメＩＦＮを用
い、２次抗体には2,000 倍希釈のペルオキシダーゼ標識
−抗マウス IgG又は IgMを用いてそれぞれの抗体価を測
定し、対照として非免疫マウス血清を用いた。最終免疫
後の特異抗体価は約２倍に上昇していた。
【００１４】次いで、50mM炭酸ナトリウム緩衝液 (pH9.
6)で適宜に希釈した抗原を96穴マイクロプレート１穴当
り 100μl 添加した。37℃で２時間抗原をコーティング
した後、0.05％ Tween20を添加したリン酸緩衝液 (以下
「T-PBS 」という。) で３回洗浄し、0.２％のゼラチン
を添加した PBSで37℃、１時間ブロッキングした。 T-P
BSで３回洗浄後、上清を１穴当り50μl 添加し、２次抗
体として2,000 倍希釈のペルオキシダーゼ標識−抗マウ
ス IgG又は IgMを１穴当り 100μl 添加した後に37℃で
１時間反応させた。
6)で適宜に希釈した抗原を96穴マイクロプレート１穴当
り 100μl 添加した。37℃で２時間抗原をコーティング
した後、0.05％ Tween20を添加したリン酸緩衝液 (以下
「T-PBS 」という。) で３回洗浄し、0.２％のゼラチン
を添加した PBSで37℃、１時間ブロッキングした。 T-P
BSで３回洗浄後、上清を１穴当り50μl 添加し、２次抗
体として2,000 倍希釈のペルオキシダーゼ標識−抗マウ
ス IgG又は IgMを１穴当り 100μl 添加した後に37℃で
１時間反応させた。
【００１５】更に、これを T-PBSで３回洗浄後、 0.006
％H2O2−0.2mM クエン酸緩衝液(pH4.0) 中で0.03mg/ml
のABTSを各穴に 100μl ずつ添加し、37℃で15分間発色
させ、405nm で吸光度を測定した。 （４）細胞融合 マウス骨髄腫細胞 P3-X 63-Ag. 8. U1 (P3U1) は10％ F
CSを添加したE-RDF 培地 (村上浩紀ら，日農化誌，58,
575(1984))を用いて37℃で培養した。
％H2O2−0.2mM クエン酸緩衝液(pH4.0) 中で0.03mg/ml
のABTSを各穴に 100μl ずつ添加し、37℃で15分間発色
させ、405nm で吸光度を測定した。 （４）細胞融合 マウス骨髄腫細胞 P3-X 63-Ag. 8. U1 (P3U1) は10％ F
CSを添加したE-RDF 培地 (村上浩紀ら，日農化誌，58,
575(1984))を用いて37℃で培養した。
【００１６】最終免疫から４日後のマウスの脾臓から１
〜２×108 細胞/ml となるようリンパ球を集め、２×10
7 細胞/ml のマウス骨髄腫細胞P3U1と10：1 の割合で混
合し、 PEG (分子量1,000 、和光純薬) により細胞融合
させた。次いで、融合細胞を15％ FCS添加E-RDF 培地に
懸濁後、１穴当り 100μl ずつ10枚の96穴マイクロプレ
ート (Falcon社) に分注し、37℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーターで１日培養した。培養２日目から HAT培地 (ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地) で培養
し、２日ごとに HAT培地を交換しながら20日間同条件で
培養した。 （５）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニング及び無血清培養 500μg/mlの精製ヒラメＩＦＮをコーティングした96穴
マイクロプレート (Nunc社) に、20日間培養した各穴中
のハイブリドーマ上清液を50μl ずつ添加し、ELISA 法
によりモノクローナル抗体 (MAb)産生の有無を調べた。
特異抗体を産生していることが確かめられたハイブリド
ーマは、限界希釈法により２回クローニングし、抗体産
生用ハイブリドーマ株とした。これらのハイブリドーマ
はいずれも無血清培地 (ITES-E-RDF) で継代可能であっ
た。この無血清培地中の全蛋白質量の約30％がハイブリ
ドーマによって産生された抗体であった。
〜２×108 細胞/ml となるようリンパ球を集め、２×10
7 細胞/ml のマウス骨髄腫細胞P3U1と10：1 の割合で混
合し、 PEG (分子量1,000 、和光純薬) により細胞融合
させた。次いで、融合細胞を15％ FCS添加E-RDF 培地に
懸濁後、１穴当り 100μl ずつ10枚の96穴マイクロプレ
ート (Falcon社) に分注し、37℃、５％ＣＯ2 インキュ
ベーターで１日培養した。培養２日目から HAT培地 (ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地) で培養
し、２日ごとに HAT培地を交換しながら20日間同条件で
培養した。 （５）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ
ーニング及び無血清培養 500μg/mlの精製ヒラメＩＦＮをコーティングした96穴
マイクロプレート (Nunc社) に、20日間培養した各穴中
のハイブリドーマ上清液を50μl ずつ添加し、ELISA 法
によりモノクローナル抗体 (MAb)産生の有無を調べた。
特異抗体を産生していることが確かめられたハイブリド
ーマは、限界希釈法により２回クローニングし、抗体産
生用ハイブリドーマ株とした。これらのハイブリドーマ
はいずれも無血清培地 (ITES-E-RDF) で継代可能であっ
た。この無血清培地中の全蛋白質量の約30％がハイブリ
ドーマによって産生された抗体であった。
【００１７】以上のようにして、IgG 抗体、ＦＩＧ−４
と３種のIgM 抗体、ＦＩＭ−１、ＦＩＭ−３及びＦＩＭ
−５の４種のモノクローナル抗体が得られた。 （６） IgGサブクラス及び軽鎖のタイピング 抗原に対するマウスモノクローナル抗体 (IgG 及び Ig
M) の軽鎖のタイピング及び IgGのサブクラスはタイピ
ングキット (Tago社) を用いて、 ELISA法により決定し
た。その結果、軽鎖はすべてκ鎖であることが判明し
た。なお、クラス、サブクラスについては表１に示して
ある。
と３種のIgM 抗体、ＦＩＭ−１、ＦＩＭ−３及びＦＩＭ
−５の４種のモノクローナル抗体が得られた。 （６） IgGサブクラス及び軽鎖のタイピング 抗原に対するマウスモノクローナル抗体 (IgG 及び Ig
M) の軽鎖のタイピング及び IgGのサブクラスはタイピ
ングキット (Tago社) を用いて、 ELISA法により決定し
た。その結果、軽鎖はすべてκ鎖であることが判明し
た。なお、クラス、サブクラスについては表１に示して
ある。
【００１８】
【表１】 （７）モノクローナル抗体の特異性試験 モノクローナル抗体の特異性は、抗体量を一定にして、
0.04μg 〜５μg 蛋白質／mlの範囲で逐次２倍段階希釈
した精製ヒラメＩＦＮ(fIFN)とコントロールとしてマウ
ス由来のＩＦＮ(mIFN)及びヒトγ−ＩＦＮ(IFNγ) を用
いて ELISA法を行うことによって確認した (図１) 。図
１に示すように、本発明のモノクローナル抗体はヒラメ
由来のＩＦＮにのみ反応し、他のＩＦＮとは全く反応を
示さなかった。 （８）モノクローナル抗体と反応する抗原の検出 電気泳動により得られたゲル上のヒラメＩＦＮ蛋白質を
Towbinらの方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76,
4350(1979)) に従ってニトロセルロース膜に転写後、
ニトロセルロース膜を 0.2％のゼラチン添加した PBSで
振とうしながら室温で２時間反応させた。次いで、 T-P
BSで２回洗浄後、モノクローナル抗体を加え、室温で２
時間反応させた。反応後、 T-PBSで２回洗浄した。洗浄
後、ニトロセルロース膜にプロテインＡゴールド、増感
剤 (イミュンブロットアッセイキット、 Bio-Rad社) に
より発色させ、モノクローナル抗体の認識するヒラメＩ
ＦＮを検出した (図２) 。
0.04μg 〜５μg 蛋白質／mlの範囲で逐次２倍段階希釈
した精製ヒラメＩＦＮ(fIFN)とコントロールとしてマウ
ス由来のＩＦＮ(mIFN)及びヒトγ−ＩＦＮ(IFNγ) を用
いて ELISA法を行うことによって確認した (図１) 。図
１に示すように、本発明のモノクローナル抗体はヒラメ
由来のＩＦＮにのみ反応し、他のＩＦＮとは全く反応を
示さなかった。 （８）モノクローナル抗体と反応する抗原の検出 電気泳動により得られたゲル上のヒラメＩＦＮ蛋白質を
Towbinらの方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76,
4350(1979)) に従ってニトロセルロース膜に転写後、
ニトロセルロース膜を 0.2％のゼラチン添加した PBSで
振とうしながら室温で２時間反応させた。次いで、 T-P
BSで２回洗浄後、モノクローナル抗体を加え、室温で２
時間反応させた。反応後、 T-PBSで２回洗浄した。洗浄
後、ニトロセルロース膜にプロテインＡゴールド、増感
剤 (イミュンブロットアッセイキット、 Bio-Rad社) に
より発色させ、モノクローナル抗体の認識するヒラメＩ
ＦＮを検出した (図２) 。
【００１９】前記ハイブリドーマのうち、モノクローナ
ル抗体ＦＩＧ−４を生産するハイブリドーマ (hybridom
a) FIG-4 は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第13218号として寄託されている。
ル抗体ＦＩＧ−４を生産するハイブリドーマ (hybridom
a) FIG-4 は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第13218号として寄託されている。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、ヒラメＩＦＮに対して
特異性を示すモノクローナル抗体を提供することができ
る。
特異性を示すモノクローナル抗体を提供することができ
る。
【図１】本発明のモノクローナル抗体の哺乳動物ＩＦＮ
に対する特異性を示す図である。
に対する特異性を示す図である。
【図２】本発明のモノクローナル抗体により認識される
ヒラメＩＦＮを示す図である。
ヒラメＩＦＮを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 白畑 実隆 福岡県粕屋郡古賀町大字久保16．12−388 ６棟15号 (72)発明者 村上 浩紀 福岡県福岡市東区名島４−16−16
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒラメインターフェロンで免疫された哺
乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して
得られるハイブリドーマによって生産され、ヒラメイン
ターフェロンと反応するが、ヒトγ−インターフェロン
及びマウスインターフェロンとは反応せず、 IgG又は I
gMのクラスに属するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ヒラメインターフェロンで免疫された哺
乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して
得られ、請求項１記載のモノクローナル抗体を生産する
ハイブリドーマ。 - 【請求項３】 請求項２記載のハイブリドーマを培養
し、請求項１記載のモノクローナル抗体を採取すること
を特徴とするモノクローナル抗体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287942A JPH06133794A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4287942A JPH06133794A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06133794A true JPH06133794A (ja) | 1994-05-17 |
Family
ID=17723735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4287942A Pending JPH06133794A (ja) | 1992-10-26 | 1992-10-26 | ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06133794A (ja) |
-
1992
- 1992-10-26 JP JP4287942A patent/JPH06133794A/ja active Pending
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