JPH03123864A

JPH03123864A - クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法

Info

Publication number: JPH03123864A
Application number: JP26213689A
Authority: JP
Inventors: Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-10-09
Filing date: 1989-10-09
Publication date: 1991-05-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ（以下ＣＡＴと略称する）に特異的な抗体を利
用した試料中のＣＡＴ測定方法に関するものである。

（従来の技術）ＣＡＴは、抗生物質クロラムフェニコールの１位もしく
は３位またはその両方の水酸基をアセチル化する酵素で
あり、クロラムフェニコール耐性の微生物から見出ださ
れた。アセチルクロラムフェニコールはリボゾームへ結
合することができないため、ポリペプチドの伸長を阻害
するというクロラムフェニコールの機能を消失している
。ＣＡＴの構造遺伝子はＲ因子と呼ばれるプラスミド（
染色体外因子）で担われている。今日ではＣＡＴの活性
測定は、単離されたＣＡＴの遺伝子の機能を調べる方法
として広く用いられている。

単離された遺伝子の機能を調べる方法として、その遺伝
子を含むＤＮＡを培養細胞に導入して発現させる方法が
ある。導入された遺伝子の機能はその遺伝子の機能に基
づいて発現される蛋白質の活性を測定することにより調
べることができる。

もちろん、この方法は、目的の遺伝子により発現される
蛋白質の活性Ａ１１ｌ定が容易に行える場合に限られる
。例えば、インターフェロン遺伝子の場合には、その培
養細胞の産物によるウィルス増殖の抑制の程度で調べる
ことができる。

しかし、目的の遺伝子の発現調節に関与するプロモータ
ーやエンハンサ−のイン・ビボ（ｉｎｖｉｖｏ）での活
性をΔＩｌｊ定することにより、導入遺伝子の発現を検
出することがより一般的である。

即ち、プロモーターの下流にＣＡＴ遺伝子のコード領域
をつなぎ、転写・翻訳されてくるＣＡＴの酵素活性を測
定することにより、導入した遺伝子の転写活性を評価す
ることができる。本方法は、転写されたＲＮＡを直接測
定するものではないが、簡単で効率が良いことから広く
用いられている。

ＣＡＴ遺伝子（エヌ・アルドン（Ｎ。

Ａｌｔｏｎ）とデイ・バブネク（Ｄ。

Ｖａｐｎｅｋ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２８２
巻、８６４ページ、１９７９年）を持つベクターを細胞
内に導入することにより、細胞抽出液中における翻訳さ
れたＣＡＴの酵素活性を測定することができる。

ベクターの構成としてはゴーマンらにより開発されたｐ
ｓＶ２ｃａｔやｐｓＶＯｃａｔが用いられている（シー
・エム・ゴーマン（Ｃ，Ｍ。

Ｇｏ　ｒｍａ　ｎ）ら、モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Ｍｏ　１．　　Ｃｅ　１１゜Ｂｉｏ
ｌ、）第２巻、１０４４ページ、１９８２年）、ｐＳＶ
２ｃａ　ｔはｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性領域およ
び複製起点、ＳＶ４０の初期プロモーター領域、ＣＡＴ
遺伝子、ＳＶ４０のスモールｔイントロンおよび初期領
域ポリアデニン付着部位からなる。このポリアデニン付
着部位中のＢａｍＨ１部位やＥｃｏＲ１部位に外来遺伝
子（プロモーターおよび構造遺伝子）を挿入することに
より、５Ｖ４０ｏｒｉにより増幅される発現ベクターと
して使用することができる。一方、ｐｓＶＯｃａｔはｐ
ＳＶ２ｃａｔのＳＶ４０プロモーター領域を完全に削り
とることにより作製される。これのＨｉｎｄＩＩＩ部位
に測定したい遺伝子のプロモーター領域を挿入した場合
には、ＣＡＴの測定を行うことにより、導入した遺伝子
の転写活性を直接的に評価できる。

サトウらは、遺伝子のポリアデニン付着部位より下流で
転写を調節しているＤＮＡ領域、特に、転写終結に関与
する領域を検索・同定するために研究対象である遺伝子
の３′断片をｐＳＣＡＴ１０プラスミドのＣＡＴ遺伝子
とＳＶ４０のポリアデニン領域の間に挿入したシステム
を作製した（ケイ・サトウ（Ｋ、５ａｔｏ）ら、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、）第６巻、１０３２ページ、１９
８６年）。

このように培養細胞へ導入された遺伝子の機能を、ＣＡ
Ｔ遺伝子の発現を通して評価することができる。

ＣＡＴの測定は、従来、その酵素活性を測定することに
より行われてきた。ＣＡＴの酵素活性測定法としては、
例えば以下のような方法が知られている。

（１）”Ｃ−クロラムフェニコールを基質とし、反応に
より生成するアセチルクロラムフェニコールをシリカ・
ゲルの薄層クロマトグラフィーで分離し、オートラジオ
グラフィーで検出する方法（シー・エム・ゴーマン（Ｃ
，Ｍ。

Ｇｏｒｍａｎ）ら、モレキュラー−アンド争セルラー・
バイオロジー（Ｍｏ　１．　　Ｃｅ　１１゜Ｂ　ｉ　ｏ
　１．）第２巻、１０４４ページ、１９８２年）。

（２）（１）の反応において、もう一方の反応生成物で
あるコエンザイムＡ（ＣｏＡ）を５，５−ジチオビス・
ニトロ安息香酸（５，５−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ− ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄ）で発色させ比
色定量する方法。

（３）非放射性クロラムフェニコールを基質として、反
応生成物を高速液体クロマトグラフィーで分離し、２８
０ｎｍの吸光度で定量する方法（ケイ・サトウ（Ｋ、５
ａｔｏ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）第６巻、１０
３２ページ、１９８６年）。

（４）非放射性クロラムフェニコールと、アセチル基が
放射性ラベルされたアセチルＣｏＡ、例えば、［アセチ
ル−１１４０コアセチルＣｏＡまたは［アセチル−３）
１］アセチルＣｏＡを用いると、反応生成物は放射性の
アセチルクロラムフェニコールとなる。この放射性アセ
チルクロラムフェニコールを直接抽出し、液体シンチレ
ータ−で定量する方法（ジエイ・アール・ニューマン（
Ｊ、Ｒ，Ｎｅｕｍａｎｎ）ら、バイオチクニークズ（Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）第５巻、４４４ページ、１
９８７年）。

これらの方法は、いずれも培養細胞の抽出液中にあるＣ
ＡＴの酵素活性を測定することにより、導入された遺伝
子の発現の程度を評価するものである。

これらの方法には以下のような問題点がある。

ＣＡＴの酵素活性は、３７℃、ｐＨ７，８（，０，１Ｍ
）リス塩酸緩衝液）において、１分間に、ｌｎｍｏｌｅ
のアセチル化クロラムフェニコールを生成するとき、１
単位と定義される。基質のアセチル化の程度（アセチル
化クロラムフェニコールの生成量）はアセチル化の程度
が小さいとき（５０％以下）には、ＣＡＴの酵素活性と
直線的な関係にあるが、アセチル化の程度が大きくなる
と、直線的関係から外れ、酵素活性に対して飽和曲線を
描く。また、アセチル化の程度は酵素反応の時間ととも
に増大するが、これが直線的に増大するのは、反応の初
期であり、反応時間の経過にともない直線性からはずれ
て飽和曲線を描く。

このことは、クロラムフェニコールのアセチル化の程度
からＣＡＴの酵素活性を正確に求めることが困難である
ことを示唆する。

またＣＡＴは細胞内に存在し、その酵素活性を測定する
ためには、界面活性剤や凍結融解、あるいは、超音波を
用いて細胞を破壊し、細胞抽出液を調製する必要がある
。これらの処理により、酵素蛋白質の変性や失活がおこ
ることが一般的に認められている。しかも、その程度が
処理方法によりまちまちであることを考えると、細胞抽
出液中でａＰ１定されたＣＡＴの酵素活性は、細胞内で
発現されたＣＡＴの蛋白質量を表しているとは考えにく
　　い　。

さらに培養細胞中で外来遺伝子により発現されたポリペ
プチドは、細胞内プロテアーゼにより分解を受けやすい
と考えられる。この点において６、ＣＡＴの酵素活性を
４Ｐｊ定することにより、遺伝子の発現により生成した
ポリペプチド鎖の全量を定量することは困難である。

培養細胞中に導入されたベクターに担われたＣＡＴ遺伝
子が転写・翻訳をへて、ポリペプチド鎖として発現され
たとしても、このような外来遺伝子により発現されたポ
リペプチド鎖が、ＣＡＴの酵素活性を持った蛋白質の形
に正しく「おりたたまれるＪ　　（ｆｏｌｄｉｎｇ）と
いう保証がない。

すなわち、個々のポリペプチド鎖は、不完全におりたた
まれて不完全な酵素活性しか示さないかもしれないし、
あるいは、全（酵素活性を示しえないような形におりた
たまれてしまっているかもしれない。ＣＡＴが細胞から
の抽出過程において、たとえ変性・失活を受けないとし
ても、その酵素活性がＣＡＴ遺伝子の発現と相関するた
めには、発現された全てのポリペプチド鎖は完全な形に
おりたたまれ、完全な酵素活性を発揮しなければならな
い。この条件を満足することは極めて困難であり、ＣＡ
Ｔの酵素活性の測定から、ＣＡＴ遺伝子の発現を評価す
ることには一定の限界がある。

従来の方法はＣＡＴの酵素活性を主にラジオアイソトー
プを用いて測定しようとするものであり、酵素活性の測
定によりＣＡＴ遺伝子の発現の評価を行おうとするもの
である。ＣＡＴの酵素活性の測定は、ＣＡＴ遺伝子発現
の産物であるポリペプチド鎖を直接的に定量するもので
ない。従って従来の方法により、ＣＡＴ遺伝子の発現の
評価をし、さらに培養細胞へ導入された遺伝子の機能を
評価することは基本的に不可能であった。

（発明が解決しようとする課題）培養細胞に導入された外来遺伝子の情報（デオキシリボ
ヌクレオチドの鎖）はｍＲＮＡの形（リボヌクレオチド
の鎖）に転写され、このｍＲＮＡに写された情報はポリ
ペプチドの形（アミノ酸の鎖）に翻訳される。ポリペプ
チドはそれ自体、非酵素的なプロセスを経て、熱力学的
に安定な構造におりたたまれ（ｆｏｌｄｉｎｇ）、機能
を持つ蛋白質となる。遺伝子情報の発現という場合には
、ポリペプチドの生成までを指すのが一般的である。

特定の遺伝子の機能を調べるためには、この遺伝子ＤＮ
ＡからｍＲＮＡへの転写活性を測定するのが最も直接的
である。しかしながら、ｍＲＮＡは不安定であり、測定
上の困難を伴うことから、実際的には、遺伝子の転写・
翻訳、および、ポリペプチド鎖の正しいおりたたまれ方
の最終的な結果である蛋白質を、その機能（活性）を指
標として測定しているのが実状である。導入された遺伝
子の機能は、ＣＡＴ遺伝子を用いて、その最終産物であ
るＣＡＴの酵素活性を測定することにより評価されてい
る。しかし、以上で詳述したように、この評価方法には
多くの困難な点がある。

本発明の目的は、ＣＡＴ遺伝子の翻訳の産物であるＣＡ
Ｔ自体をポリペプチドとして定量することにより、酵素
活性ａＦＩ定に伴う困難を回避し、より直接的に遺伝子
機能を評価する方法を提供することである。さらに本発
明の目的は、ＣＡＴに特異的な抗体を用いることによっ
て従来の方法よりも簡便な操作で安全にかつ短時間に、
高感度にＣＡＴを免疫学的に測定する方法を提供するこ
とにある。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、本発
明に到達した。即ち本発明は、クロラムフェニコール−
アセチルトランスフェラーゼを特異的に認識する抗体を
用いることを特徴とする試料中のクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼの測定方法である。

以下その詳細について説明する。

本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法（ジー・ケーラー（Ｇ、Ｋ　
　ｈｌｅｒ）とシー・ミルスティン（Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ）、　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、４
９５ページ、１９７５年）に準じて製造することができ
る。

抗ＣＡＴポリクローナル抗体はＣＡＴを免疫した動物か
ら抗血清を採取することにより得ることができる。動物
としては一般的にウサギ、モルモット、ヒツジ、マウス
、ラット、ニワトリ、ヤギ。

ウシ、ウマなどが用いられる。公知の方法により目的の
抗血清を調製することができる（例えば、松橋ら著、「
免疫学実験入門」　学会出版センタ１９８１年−日本生
化学金偏、純生化学実験講座　第５巻　「免疫生化学研
究法」　東京化学同人、１９８６年）。

これらのＣＡＴを特異的に認識する抗体を使って、試料
中のＣＡＴを定量的に測定できる免疫学的測定方法が可
能となった。例えば、サンドイッチ法、競合法等をあげ
ることができる。サンドイツチ法の場合、試料、試薬の
添加順序には特に限定はない。

本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する場合、
その方法は公知の方法を採用でき、固相としては例えば
、ポリスチレン、ポリエチレン。

ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子
、ラテックス、アガロース、セルロース。

ポリメタアクリレートなどが使用される。

また抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら限定さ
れるものでなく、公知（７）−ｉ法により標識化および
検出することができる。標識として酵素を用いる場合、
標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ウレア
ーゼ、カタラーゼ。

β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる。放射性物
質を標識として用いる場合は、３Ｈ１＋２５１１または
　１３１１等が、また蛍光物質を標識として使用する場
合には、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンチ
オシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート等
が常法によりモノクローナル抗体に結合される。しかし
ながら、標識物質は上記物質に何ら限定されるべきもの
ではない。

測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤１反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。

一方ＣＡＴは、クロラムフェニコールに耐性の微生物か
ら調製できる。例えば、（１）Ｒ因子を有する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、（２）
クロラムフェニコール・プラスミドを持っているスタフ
ィロコッカス・オーレウス（Ｓ。

ａｕｒｅｕｓ）　　、（３）ＣＡＴ耐性のプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ　　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）、（４）ＣＡＴ耐性の
アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を列記できる。これらの微生物からのＣＡＴの精製法は
公知である。例えば、ダブりニー・ブイ・ショウ（Ｗ、
　Ｖ、　Ｓ　ｈ　ａ　ｗ）のメソッズ・イン・エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）第４３巻、７３７−７５５ページ、１９７５年）に
記載の方法で精製することができる。

ところで培養細胞へ遺伝子を導入する際に用いるベクタ
ーには、大腸菌のＲ因子由来のＣＡＴ遺伝子が組み込ま
れている。従って、培養細胞へ導入された遺伝子の機能
をＣＡＴ遺伝子の発現を通して評価することができ、Ｃ
ＡＴ遺伝子の発現は本発明法によって評価することがで
きる。

（発明の効果）以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のＣＡＴｉａ度は、約１〜２００ｎｇ／ｍｌの範
囲内で測定することができる。必要な試料液の量は例え
ば約２０μλであり、即ち約０．０２〜４ｎｇのＣＡＴ
の定量が可能である。

（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。

更に詳細に説明すると、ＣＡＴの酵素活性測定に基づ〈
従来のＣＡＴ測定法では、コントロールとして０，０１
〜０．５単位のＣＡＴを用いる。これは０．０８〜０．
４ｎｇに相当する。

従って本発明の方法では、０．００２５〜５．０単位の
ＣＡＴの酵素活性を定量できることになる。

（３）免疫学的測定法を用いると、ＣＡＴのポリペプチ
ド鎖が酵素活性を示す形に正しくおりたたまれた状態で
あっても、あるいは、おりたたまれていない状態であっ
ても、さらには、プロテアーゼ消化により一部切断され
断片化した状態であっても、ｍＲＮＡから翻訳されたポ
リペプチドを定量することが可能である。

（実施例）以下に本発明の詳細な実施例を説明する。本発明の内容
は以下に記述する実施例により何ら限定されるものでは
ない。

実施例１（Ａ）ＣＡＴの調製前記のショウの方法に従い、ＣＡＴ耐性の大腸菌からＣ
ＡＴを精製した。本ＣＡＴ標品は電気泳動において均一
であり、蛋白質１ｍｇ当たりの酵素活性（比活性）は１
２５０００単位であった。

本ＣＡＴ標品を免疫に用いる抗原および免疫測定法に用
いる標準物質とした。

（Ｂ）抗原感作動物細胞の調製Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス（♀）をＣＡＴで免疫し
た。

免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュバント
とＣＡＴＩＯ〜１００μｇ／匹とを乳化させた試料１０
０μ！を投与することにより行った。

２週間後に追加免疫としてＣＡＴ　１０〜１００μｇ／
匹をフロイントの不完全アジュバントとを乳化させたち
の１００μｌをマウス腹腔に投与した。１週間後に、最
終免疫としてＣＡＴＩＯ〜１００μｇ／匹をリン酸緩衝
化生理食塩水（０，８５％ＮａＣＪ！を含有する０、０
１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２：以下ＰＢＳと略称する
）に溶解したちの１００μｌを腹腔内に投与した。

３日後この処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。

１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣ３と省略する）を
含むダルベツコモディファイドイーグル培地（以下、Ｄ
　Ｍ　Ｅ　Ｍとする）１０ｍＪ！を注射器で吸い取り２
７ゲージの注射針をつけた。肺臓を水冷しておいたデイ
ツシュに入れ、注射針で数か新式をあけた。注射針を差
し込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出
液をナイロンメツシュで濾過したのち、遠心チューブに
入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離して上澄をす
てた。細胞ベレット中の赤血球を０．１５Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液（１ｍＭエチレンジアミン−４酢酸−２ナト
リウム塩（以下ＥＤＴＡと略称する）を含む０．０１Ｍ
炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、さら
に細胞ベレットをＤＭＥＭで２回同様に遠心洗浄して肺
細胞とした。

（Ｃ）骨髄腫細胞の調製骨髄腫細胞としてはＢａＪｂ／ｃマウス由来の８−アザ
グアニン耐性株として、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（以下Ｓ
　Ｐ　２１０と略称する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ　／　ｍ　１の８
−アザグアニン、１５％ＦＣＳを含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで
培養し、その後細胞融合日まで１５％ＦＣＳを含むＤＭ
ＥＭを使用した。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌的
１：　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍで１１００Ｏｒｐで１０分間遠心
洗浄を２回繰り返し調製した。

（Ｄ）細胞融合上記（Ｂ）項で調製した肺臓細胞と上記（Ｃ）項で調製
した骨髄腫細胞を５：１の割合で混合遠心（１０００ｒ
ｐｍ、１０分）し、細胞ペレットを集めた。遠心チュー
ブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広げた。

その中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ　（ＭＥＲ
Ｋ社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤＭＥ
Ｍ溶液０．５ｍｉを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、遠心チューブを回転しながら、３７℃に加温
しておいたＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍを、３０秒間に１ｍｌの割合
で１０回加えた。ついで、Ｆｅ２（２ｍりをゆっくりと
入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心した。細胞ペレッ
トを１５％ＦＣ３とｌＸｌ０−’Ｍヒポキサンチン、４
　Ｘ　１０−７Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０−５Ｍ
チミジンを含むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と略称する
）で２回遠心洗浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）した。

この培養液を９６ウエル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３
０４２）に５Ｘ１０’細胞個／ウェルになるように２０
０μにずつ分注した。３日目ごとにＨＡＴ培地を１００
μに／ウェルずつ交換する。３週間後からは、１　×１
０−’Ｍヒポキサンチン。

１．６Ｘ１０−５Ｍチミジンと１５％ＦＣ８を含むＤＭ
ＥＭを用いて培地交換を行った。

（Ｅ）ハイブリドーマの選択９６ウエル・プレートに細胞コロニーが認められる１０
日目頃から酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗ＣＡＴ
抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエル・イムノプレート平底（インターメッド社製
）に、ＣＡＴ２μｇ／ｍＪ！を５０ｕｌｌ／ウェル分注
し、３７℃で１．５時間静置した。ウェルに残っている
溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツイーン（Ｔｗｅ　
ｅ　ｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔと略称す
る）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（
以下ＢＳＡと略称する）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３０
０μｌを各ウェルに加えて、３７℃で１．５時間ブロッ
キング処理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を１０
０μｌずつ分注し３７℃で１．５時間静置した。これら
のウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、ペルオキ
シダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン・
ラボラトリ−社製）４０００倍希釈を５０μｊ／ウエル
ずつ分注し、３７℃で１．５時間静置した。ＰＢＳ−Ｔ
溶液で３回洗浄後、基質溶液（１，２％　２．２−アジ
ノジー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモ
ニウム塩および０．０１％過酸化水素（Ｈ２０２）を含
有する０、１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ５，１）を各ウェ
ルに１００μに添加した。

３０分間室温で放置し、０．２Ｍシュウ酸溶液を１００
μオを加えて酵素反応を停止させた。

４１５ｎｍでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗ＣＡＴ抗体を産生ずるハイブリドーマが存在
することがわかった。以上のようにして、抗体価の強い
抗体産生ハイブリドーマを取得した。

（Ｆ）コンデショニング・メデウムの調製２６ゲージの
注射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておいた０、
３４Ｍサッカロース溶液を吸い取った。Ｂａ１ｂ／ｃマ
ウス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液
を注入した。

注入後５分間以内に左側腹部に１８ゲージの注射針をつ
け水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷
冷しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１
１０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清
を廃棄し、細胞ペレットに１５％ＦＣ８−ＤＭＥＭを加
え攪拌しプッシュに入れた。３７℃、５％炭酸ガス−９
５％空気雰囲気、９５％湿度で一晩培養した。培養上清
を集め、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ）で
濾過し、これをコンデショニング・メデウムとした。

（Ｇ）クローニング抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｅ）項で作製したコ
ンデショニング・メデウム１ｍｋを含むＨＡＴ培地培地
２０奢Ｊ意した。クローニングしようとするハイブリド
ーマ細胞が各ウェル１；１個になるように上記培養液を
用いて細胞懸濁液を調製し、ウェル当たり２００μλず
つ、９６ウエル・プレート（Ｆａｉｃｏｎ＃３０４２）
に分注した。培養後、１０日目前から細胞コロニが認め
られるウェルについて、上記（Ｅ）項に記載した固相酵
素免疫測定法に準じて抗ＣＡＴ抗体産生ハイブリドーマ
を選択し、さらに再度クローニングを繰り返しモノクロ
ーン化したハイブリドーマを樹立した。最終的に２１株
のハイブリドーマを獲得した。

（Ｈ）抗ＣＡＴ抗体の精製Ｂａｊ！ｂ／ｃマウス（♂）（６〜１０週令）の腹腔に
ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）を０．５ｍＪ２／匹投与した。

２週間後、上記（Ｇ）項で得られた抗ＣＡＴ抗体産土ハ
イブリドーマ株をマウス腹腔内に６株について２Ｘ１０
６細胞個／匹移植した。１０日目前後に生成した腹水を
、１８ゲージの注射針を腹腔に差し込み、１／２０量の
０．２Ｍ　　ＥＤＴＡをいれた遠心チューブに滴下させ
た。遠心チューブを４００Ｏｒ　ｐｍで１０分間遠心し
、上清を集めた。採取した上清から、５０９６硫酸アン
モニウム沈殿分画法により、免疫グロブリン画分を粗精
製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液に
透析後、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル・ク
ロマトグラフィーを行い、抗ＣＡＴ抗体を精製した。メ
ルカプトエタノールによる還元条件下での１２％５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動において、分子量約５，
０万の１本の重鎮（Ｈ鎖）と分子量約２，７万の１本の
軽鎖（Ｌ鎖）の２本のバンドになったことを確認して、
抗体力（均一にまで精製されたことを判断した。

以上の方法により、ＣＡＴを特異的に認識する複数種の
モノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体の結合定数
は、１０７〜１０１１〜１−１の範囲内であった。

（１）抗ＣＡＴ抗体の固定化未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル争ヌンク
プレート、インターメ・ソド社製）の各ウェルに０，１
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３μ
ｇ／ｍＪのマウス由来の抗ＣＡＴモノクローナル抗体（
名称ａとする。実施例（Ｈ）で得られたもの）の溶液２
００μぶを加えて、４℃で一夜インキユベートした。次
１こ、各ウェルの溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄
した後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３０
０μｋを各ウェルに加えて、４℃でプロ・ツキング処理
しそのまま保存した。

１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略称す
る）標識抗体の調製０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶液（５ｍｇ／ｍ、ｉりに１％１−フルオロ
−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液を０．　
１ｍＡ加え、室温にて１時間反応させた。その溶液に０
．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１．０ｍ、ｅを添加し３
０分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０．
１６Ｍのエチレングリコール１．　　Ｏｒｒ＋Ｊ！を加
えて除去した後、０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）で透析した。次に、マウス由来の抗ＣＡＴモ
ノクローナル抗体（名称すとする。実施例（Ｈ）で得ら
れたもので、モノクローナル抗体ａとは異なる部位を認
識するもの）５ｍｇを加えて５〜６時間反応させた。水
素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加して４℃中で一夜放
置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除
去するため、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で
一夜攪拌しながら透析した。上記反応物をＴＳＫゲルＧ
−３０００ＳＷ　（東ソー株式会社製、商品名）を用い
て高速液体クロマトグラフィーにて精製し、ＨＲＰ標識
抗体とした。

（Ｋ）試料中のＣＡＴの定量本実施例中の（１）で記述した方法で作製したマイクロ
タイタープレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗
浄した後、ＣＡＴを含む標準試料を各ウェルにそれぞれ
２０μｌ加えた。つぎに本実施例（Ｊ）で得たＨ　ＲＰ
標識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００
μｌずつ添加した。そのまま室温で３時間インキュベー
トした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した
。それに、１．２％　２．２−アジノジ＝（３−エチル
ベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩及び０．０
１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各ウェルに
２００μｍ添加し、室温で３０分間酵素反応させた後、
２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μに加えて酵素反応を
停止させた。

上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー（東ソー株式会社製、
ＰｖＩ　Ｐ　Ｒ−Ａ　４、商品名）で測定した結果を表
１に示す。試料中のＣＡＴは約１〜２００ｎｇ／ｍＪ！
の範囲で定量できることが確認された。用いた試料液の
量は２０μ！であり、約０．０２〜４ｎｇのＣＡＴの定
量が可能であることが示された。

表１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料中のクロラムフェニコール・アセチルトラン
スフェラーゼを測定する方法において、クロラムフェニ
コール・アセチルトランスフェラーゼを特異的に認識す
る抗体を用いることを特徴とする試料中のクロラムフェ
ニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法。
（２）クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼを認識する抗体で、Ａ：固定化されている第１抗体及びＢ：第１抗体とは異なる抗原部位を少なくとも認識し、
かつ標識剤で標識されている第２抗体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。
（３）抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第１項または第２項記載の方法。（４）抗体がポリクロ
ーナル抗体である特許請求の範囲第１項または第２項記
載の方法。（５）培養細胞へ導入された遺伝子の転写活
性の測定に使用することを特徴とする特許請求範囲第１
項ないし第４項いずれかの項に記載の方法。