JPH03123864A - クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法 - Google Patents
クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフ
ェラーゼ(以下CATと略称する)に特異的な抗体を利
用した試料中のCAT測定方法に関するものである。
ェラーゼ(以下CATと略称する)に特異的な抗体を利
用した試料中のCAT測定方法に関するものである。
(従来の技術)
CATは、抗生物質クロラムフェニコールの1位もしく
は3位またはその両方の水酸基をアセチル化する酵素で
あり、クロラムフェニコール耐性の微生物から見出ださ
れた。アセチルクロラムフェニコールはリボゾームへ結
合することができないため、ポリペプチドの伸長を阻害
するというクロラムフェニコールの機能を消失している
。CATの構造遺伝子はR因子と呼ばれるプラスミド(
染色体外因子)で担われている。今日ではCATの活性
測定は、単離されたCATの遺伝子の機能を調べる方法
として広く用いられている。
は3位またはその両方の水酸基をアセチル化する酵素で
あり、クロラムフェニコール耐性の微生物から見出ださ
れた。アセチルクロラムフェニコールはリボゾームへ結
合することができないため、ポリペプチドの伸長を阻害
するというクロラムフェニコールの機能を消失している
。CATの構造遺伝子はR因子と呼ばれるプラスミド(
染色体外因子)で担われている。今日ではCATの活性
測定は、単離されたCATの遺伝子の機能を調べる方法
として広く用いられている。
単離された遺伝子の機能を調べる方法として、その遺伝
子を含むDNAを培養細胞に導入して発現させる方法が
ある。導入された遺伝子の機能はその遺伝子の機能に基
づいて発現される蛋白質の活性を測定することにより調
べることができる。
子を含むDNAを培養細胞に導入して発現させる方法が
ある。導入された遺伝子の機能はその遺伝子の機能に基
づいて発現される蛋白質の活性を測定することにより調
べることができる。
もちろん、この方法は、目的の遺伝子により発現される
蛋白質の活性A11l定が容易に行える場合に限られる
。例えば、インターフェロン遺伝子の場合には、その培
養細胞の産物によるウィルス増殖の抑制の程度で調べる
ことができる。
蛋白質の活性A11l定が容易に行える場合に限られる
。例えば、インターフェロン遺伝子の場合には、その培
養細胞の産物によるウィルス増殖の抑制の程度で調べる
ことができる。
しかし、目的の遺伝子の発現調節に関与するプロモータ
ーやエンハンサ−のイン・ビボ(invivo)での活
性をΔIlj定することにより、導入遺伝子の発現を検
出することがより一般的である。
ーやエンハンサ−のイン・ビボ(invivo)での活
性をΔIlj定することにより、導入遺伝子の発現を検
出することがより一般的である。
即ち、プロモーターの下流にCAT遺伝子のコード領域
をつなぎ、転写・翻訳されてくるCATの酵素活性を測
定することにより、導入した遺伝子の転写活性を評価す
ることができる。本方法は、転写されたRNAを直接測
定するものではないが、簡単で効率が良いことから広く
用いられている。
をつなぎ、転写・翻訳されてくるCATの酵素活性を測
定することにより、導入した遺伝子の転写活性を評価す
ることができる。本方法は、転写されたRNAを直接測
定するものではないが、簡単で効率が良いことから広く
用いられている。
CAT遺伝子(エヌ・アルドン(N。
Alton)とデイ・バブネク(D。
Vapnek)、ネイチャー(Nature)第282
巻、864ページ、1979年)を持つベクターを細胞
内に導入することにより、細胞抽出液中における翻訳さ
れたCATの酵素活性を測定することができる。
巻、864ページ、1979年)を持つベクターを細胞
内に導入することにより、細胞抽出液中における翻訳さ
れたCATの酵素活性を測定することができる。
ベクターの構成としてはゴーマンらにより開発されたp
sV2catやpsVOcatが用いられている(シー
・エム・ゴーマン(C,M。
sV2catやpsVOcatが用いられている(シー
・エム・ゴーマン(C,M。
Go rma n)ら、モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー(Mo 1. Ce 11゜Bio
l、)第2巻、1044ページ、1982年)、pSV
2ca tはpBR322のアンピシリン耐性領域およ
び複製起点、SV40の初期プロモーター領域、CAT
遺伝子、SV40のスモールtイントロンおよび初期領
域ポリアデニン付着部位からなる。このポリアデニン付
着部位中のBamH1部位やEcoR1部位に外来遺伝
子(プロモーターおよび構造遺伝子)を挿入することに
より、5V40oriにより増幅される発現ベクターと
して使用することができる。一方、psVOcatはp
SV2catのSV40プロモーター領域を完全に削り
とることにより作製される。これのHindIII部位
に測定したい遺伝子のプロモーター領域を挿入した場合
には、CATの測定を行うことにより、導入した遺伝子
の転写活性を直接的に評価できる。
ー・バイオロジー(Mo 1. Ce 11゜Bio
l、)第2巻、1044ページ、1982年)、pSV
2ca tはpBR322のアンピシリン耐性領域およ
び複製起点、SV40の初期プロモーター領域、CAT
遺伝子、SV40のスモールtイントロンおよび初期領
域ポリアデニン付着部位からなる。このポリアデニン付
着部位中のBamH1部位やEcoR1部位に外来遺伝
子(プロモーターおよび構造遺伝子)を挿入することに
より、5V40oriにより増幅される発現ベクターと
して使用することができる。一方、psVOcatはp
SV2catのSV40プロモーター領域を完全に削り
とることにより作製される。これのHindIII部位
に測定したい遺伝子のプロモーター領域を挿入した場合
には、CATの測定を行うことにより、導入した遺伝子
の転写活性を直接的に評価できる。
サトウらは、遺伝子のポリアデニン付着部位より下流で
転写を調節しているDNA領域、特に、転写終結に関与
する領域を検索・同定するために研究対象である遺伝子
の3′断片をpSCAT10プラスミドのCAT遺伝子
とSV40のポリアデニン領域の間に挿入したシステム
を作製した(ケイ・サトウ(K、5ato)ら、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol。
転写を調節しているDNA領域、特に、転写終結に関与
する領域を検索・同定するために研究対象である遺伝子
の3′断片をpSCAT10プラスミドのCAT遺伝子
とSV40のポリアデニン領域の間に挿入したシステム
を作製した(ケイ・サトウ(K、5ato)ら、モレキ
ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol。
Ce1l、Biol、)第6巻、1032ページ、19
86年)。
86年)。
このように培養細胞へ導入された遺伝子の機能を、CA
T遺伝子の発現を通して評価することができる。
T遺伝子の発現を通して評価することができる。
CATの測定は、従来、その酵素活性を測定することに
より行われてきた。CATの酵素活性測定法としては、
例えば以下のような方法が知られている。
より行われてきた。CATの酵素活性測定法としては、
例えば以下のような方法が知られている。
(1)”C−クロラムフェニコールを基質とし、反応に
より生成するアセチルクロラムフェニコールをシリカ・
ゲルの薄層クロマトグラフィーで分離し、オートラジオ
グラフィーで検出する方法(シー・エム・ゴーマン(C
,M。
より生成するアセチルクロラムフェニコールをシリカ・
ゲルの薄層クロマトグラフィーで分離し、オートラジオ
グラフィーで検出する方法(シー・エム・ゴーマン(C
,M。
Gorman)ら、モレキュラー−アンド争セルラー・
バイオロジー(Mo 1. Ce 11゜B i o
1.)第2巻、1044ページ、1982年)。
バイオロジー(Mo 1. Ce 11゜B i o
1.)第2巻、1044ページ、1982年)。
(2)(1)の反応において、もう一方の反応生成物で
あるコエンザイムA(CoA)を5,5−ジチオビス・
ニトロ安息香酸(5,5−dithiobis− nitrobenzoic acid)で発色させ比
色定量する方法。
あるコエンザイムA(CoA)を5,5−ジチオビス・
ニトロ安息香酸(5,5−dithiobis− nitrobenzoic acid)で発色させ比
色定量する方法。
(3)非放射性クロラムフェニコールを基質として、反
応生成物を高速液体クロマトグラフィーで分離し、28
0nmの吸光度で定量する方法(ケイ・サトウ(K、5
ato)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mo1.Ce11.Biol、)第6巻、10
32ページ、1986年)。
応生成物を高速液体クロマトグラフィーで分離し、28
0nmの吸光度で定量する方法(ケイ・サトウ(K、5
ato)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mo1.Ce11.Biol、)第6巻、10
32ページ、1986年)。
(4)非放射性クロラムフェニコールと、アセチル基が
放射性ラベルされたアセチルCoA、例えば、[アセチ
ル−1140コアセチルCoAまたは[アセチル−3)
1]アセチルCoAを用いると、反応生成物は放射性の
アセチルクロラムフェニコールとなる。この放射性アセ
チルクロラムフェニコールを直接抽出し、液体シンチレ
ータ−で定量する方法(ジエイ・アール・ニューマン(
J、R,Neumann)ら、バイオチクニークズ(B
ioTechniques)第5巻、444ページ、1
987年)。
放射性ラベルされたアセチルCoA、例えば、[アセチ
ル−1140コアセチルCoAまたは[アセチル−3)
1]アセチルCoAを用いると、反応生成物は放射性の
アセチルクロラムフェニコールとなる。この放射性アセ
チルクロラムフェニコールを直接抽出し、液体シンチレ
ータ−で定量する方法(ジエイ・アール・ニューマン(
J、R,Neumann)ら、バイオチクニークズ(B
ioTechniques)第5巻、444ページ、1
987年)。
これらの方法は、いずれも培養細胞の抽出液中にあるC
ATの酵素活性を測定することにより、導入された遺伝
子の発現の程度を評価するものである。
ATの酵素活性を測定することにより、導入された遺伝
子の発現の程度を評価するものである。
これらの方法には以下のような問題点がある。
CATの酵素活性は、37℃、pH7,8(,0,1M
)リス塩酸緩衝液)において、1分間に、lnmole
のアセチル化クロラムフェニコールを生成するとき、1
単位と定義される。基質のアセチル化の程度(アセチル
化クロラムフェニコールの生成量)はアセチル化の程度
が小さいとき(50%以下)には、CATの酵素活性と
直線的な関係にあるが、アセチル化の程度が大きくなる
と、直線的関係から外れ、酵素活性に対して飽和曲線を
描く。また、アセチル化の程度は酵素反応の時間ととも
に増大するが、これが直線的に増大するのは、反応の初
期であり、反応時間の経過にともない直線性からはずれ
て飽和曲線を描く。
)リス塩酸緩衝液)において、1分間に、lnmole
のアセチル化クロラムフェニコールを生成するとき、1
単位と定義される。基質のアセチル化の程度(アセチル
化クロラムフェニコールの生成量)はアセチル化の程度
が小さいとき(50%以下)には、CATの酵素活性と
直線的な関係にあるが、アセチル化の程度が大きくなる
と、直線的関係から外れ、酵素活性に対して飽和曲線を
描く。また、アセチル化の程度は酵素反応の時間ととも
に増大するが、これが直線的に増大するのは、反応の初
期であり、反応時間の経過にともない直線性からはずれ
て飽和曲線を描く。
このことは、クロラムフェニコールのアセチル化の程度
からCATの酵素活性を正確に求めることが困難である
ことを示唆する。
からCATの酵素活性を正確に求めることが困難である
ことを示唆する。
またCATは細胞内に存在し、その酵素活性を測定する
ためには、界面活性剤や凍結融解、あるいは、超音波を
用いて細胞を破壊し、細胞抽出液を調製する必要がある
。これらの処理により、酵素蛋白質の変性や失活がおこ
ることが一般的に認められている。しかも、その程度が
処理方法によりまちまちであることを考えると、細胞抽
出液中でaP1定されたCATの酵素活性は、細胞内で
発現されたCATの蛋白質量を表しているとは考えにく
い 。
ためには、界面活性剤や凍結融解、あるいは、超音波を
用いて細胞を破壊し、細胞抽出液を調製する必要がある
。これらの処理により、酵素蛋白質の変性や失活がおこ
ることが一般的に認められている。しかも、その程度が
処理方法によりまちまちであることを考えると、細胞抽
出液中でaP1定されたCATの酵素活性は、細胞内で
発現されたCATの蛋白質量を表しているとは考えにく
い 。
さらに培養細胞中で外来遺伝子により発現されたポリペ
プチドは、細胞内プロテアーゼにより分解を受けやすい
と考えられる。この点において6、CATの酵素活性を
4Pj定することにより、遺伝子の発現により生成した
ポリペプチド鎖の全量を定量することは困難である。
プチドは、細胞内プロテアーゼにより分解を受けやすい
と考えられる。この点において6、CATの酵素活性を
4Pj定することにより、遺伝子の発現により生成した
ポリペプチド鎖の全量を定量することは困難である。
培養細胞中に導入されたベクターに担われたCAT遺伝
子が転写・翻訳をへて、ポリペプチド鎖として発現され
たとしても、このような外来遺伝子により発現されたポ
リペプチド鎖が、CATの酵素活性を持った蛋白質の形
に正しく「おりたたまれるJ (folding)と
いう保証がない。
子が転写・翻訳をへて、ポリペプチド鎖として発現され
たとしても、このような外来遺伝子により発現されたポ
リペプチド鎖が、CATの酵素活性を持った蛋白質の形
に正しく「おりたたまれるJ (folding)と
いう保証がない。
すなわち、個々のポリペプチド鎖は、不完全におりたた
まれて不完全な酵素活性しか示さないかもしれないし、
あるいは、全(酵素活性を示しえないような形におりた
たまれてしまっているかもしれない。CATが細胞から
の抽出過程において、たとえ変性・失活を受けないとし
ても、その酵素活性がCAT遺伝子の発現と相関するた
めには、発現された全てのポリペプチド鎖は完全な形に
おりたたまれ、完全な酵素活性を発揮しなければならな
い。この条件を満足することは極めて困難であり、CA
Tの酵素活性の測定から、CAT遺伝子の発現を評価す
ることには一定の限界がある。
まれて不完全な酵素活性しか示さないかもしれないし、
あるいは、全(酵素活性を示しえないような形におりた
たまれてしまっているかもしれない。CATが細胞から
の抽出過程において、たとえ変性・失活を受けないとし
ても、その酵素活性がCAT遺伝子の発現と相関するた
めには、発現された全てのポリペプチド鎖は完全な形に
おりたたまれ、完全な酵素活性を発揮しなければならな
い。この条件を満足することは極めて困難であり、CA
Tの酵素活性の測定から、CAT遺伝子の発現を評価す
ることには一定の限界がある。
従来の方法はCATの酵素活性を主にラジオアイソトー
プを用いて測定しようとするものであり、酵素活性の測
定によりCAT遺伝子の発現の評価を行おうとするもの
である。CATの酵素活性の測定は、CAT遺伝子発現
の産物であるポリペプチド鎖を直接的に定量するもので
ない。従って従来の方法により、CAT遺伝子の発現の
評価をし、さらに培養細胞へ導入された遺伝子の機能を
評価することは基本的に不可能であった。
プを用いて測定しようとするものであり、酵素活性の測
定によりCAT遺伝子の発現の評価を行おうとするもの
である。CATの酵素活性の測定は、CAT遺伝子発現
の産物であるポリペプチド鎖を直接的に定量するもので
ない。従って従来の方法により、CAT遺伝子の発現の
評価をし、さらに培養細胞へ導入された遺伝子の機能を
評価することは基本的に不可能であった。
(発明が解決しようとする課題)
培養細胞に導入された外来遺伝子の情報(デオキシリボ
ヌクレオチドの鎖)はmRNAの形(リボヌクレオチド
の鎖)に転写され、このmRNAに写された情報はポリ
ペプチドの形(アミノ酸の鎖)に翻訳される。ポリペプ
チドはそれ自体、非酵素的なプロセスを経て、熱力学的
に安定な構造におりたたまれ(folding)、機能
を持つ蛋白質となる。遺伝子情報の発現という場合には
、ポリペプチドの生成までを指すのが一般的である。
ヌクレオチドの鎖)はmRNAの形(リボヌクレオチド
の鎖)に転写され、このmRNAに写された情報はポリ
ペプチドの形(アミノ酸の鎖)に翻訳される。ポリペプ
チドはそれ自体、非酵素的なプロセスを経て、熱力学的
に安定な構造におりたたまれ(folding)、機能
を持つ蛋白質となる。遺伝子情報の発現という場合には
、ポリペプチドの生成までを指すのが一般的である。
特定の遺伝子の機能を調べるためには、この遺伝子DN
AからmRNAへの転写活性を測定するのが最も直接的
である。しかしながら、mRNAは不安定であり、測定
上の困難を伴うことから、実際的には、遺伝子の転写・
翻訳、および、ポリペプチド鎖の正しいおりたたまれ方
の最終的な結果である蛋白質を、その機能(活性)を指
標として測定しているのが実状である。導入された遺伝
子の機能は、CAT遺伝子を用いて、その最終産物であ
るCATの酵素活性を測定することにより評価されてい
る。しかし、以上で詳述したように、この評価方法には
多くの困難な点がある。
AからmRNAへの転写活性を測定するのが最も直接的
である。しかしながら、mRNAは不安定であり、測定
上の困難を伴うことから、実際的には、遺伝子の転写・
翻訳、および、ポリペプチド鎖の正しいおりたたまれ方
の最終的な結果である蛋白質を、その機能(活性)を指
標として測定しているのが実状である。導入された遺伝
子の機能は、CAT遺伝子を用いて、その最終産物であ
るCATの酵素活性を測定することにより評価されてい
る。しかし、以上で詳述したように、この評価方法には
多くの困難な点がある。
本発明の目的は、CAT遺伝子の翻訳の産物であるCA
T自体をポリペプチドとして定量することにより、酵素
活性aFI定に伴う困難を回避し、より直接的に遺伝子
機能を評価する方法を提供することである。さらに本発
明の目的は、CATに特異的な抗体を用いることによっ
て従来の方法よりも簡便な操作で安全にかつ短時間に、
高感度にCATを免疫学的に測定する方法を提供するこ
とにある。
T自体をポリペプチドとして定量することにより、酵素
活性aFI定に伴う困難を回避し、より直接的に遺伝子
機能を評価する方法を提供することである。さらに本発
明の目的は、CATに特異的な抗体を用いることによっ
て従来の方法よりも簡便な操作で安全にかつ短時間に、
高感度にCATを免疫学的に測定する方法を提供するこ
とにある。
(課題を解決するための手段)
本発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、本発
明に到達した。即ち本発明は、クロラムフェニコール−
アセチルトランスフェラーゼを特異的に認識する抗体を
用いることを特徴とする試料中のクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼの測定方法である。
明に到達した。即ち本発明は、クロラムフェニコール−
アセチルトランスフェラーゼを特異的に認識する抗体を
用いることを特徴とする試料中のクロラムフェニコール
・アセチルトランスフェラーゼの測定方法である。
以下その詳細について説明する。
本発明方法において、用いられるモノクローナル抗体は
、それ自体公知である方法(ジー・ケーラー(G、K
hler)とシー・ミルスティン(C,Milste
in)、 ネイチャー(Nature)第256巻、4
95ページ、1975年)に準じて製造することができ
る。
、それ自体公知である方法(ジー・ケーラー(G、K
hler)とシー・ミルスティン(C,Milste
in)、 ネイチャー(Nature)第256巻、4
95ページ、1975年)に準じて製造することができ
る。
抗CATポリクローナル抗体はCATを免疫した動物か
ら抗血清を採取することにより得ることができる。動物
としては一般的にウサギ、モルモット、ヒツジ、マウス
、ラット、ニワトリ、ヤギ。
ら抗血清を採取することにより得ることができる。動物
としては一般的にウサギ、モルモット、ヒツジ、マウス
、ラット、ニワトリ、ヤギ。
ウシ、ウマなどが用いられる。公知の方法により目的の
抗血清を調製することができる(例えば、松橋ら著、「
免疫学実験入門」 学会出版センタ1981年−日本生
化学金偏、純生化学実験講座 第5巻 「免疫生化学研
究法」 東京化学同人、1986年)。
抗血清を調製することができる(例えば、松橋ら著、「
免疫学実験入門」 学会出版センタ1981年−日本生
化学金偏、純生化学実験講座 第5巻 「免疫生化学研
究法」 東京化学同人、1986年)。
これらのCATを特異的に認識する抗体を使って、試料
中のCATを定量的に測定できる免疫学的測定方法が可
能となった。例えば、サンドイッチ法、競合法等をあげ
ることができる。サンドイツチ法の場合、試料、試薬の
添加順序には特に限定はない。
中のCATを定量的に測定できる免疫学的測定方法が可
能となった。例えば、サンドイッチ法、競合法等をあげ
ることができる。サンドイツチ法の場合、試料、試薬の
添加順序には特に限定はない。
本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する場合、
その方法は公知の方法を採用でき、固相としては例えば
、ポリスチレン、ポリエチレン。
その方法は公知の方法を採用でき、固相としては例えば
、ポリスチレン、ポリエチレン。
ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファロース粒子
、ラテックス、アガロース、セルロース。
、ラテックス、アガロース、セルロース。
ポリメタアクリレートなどが使用される。
また抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら限定さ
れるものでなく、公知(7)−i法により標識化および
検出することができる。標識として酵素を用いる場合、
標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−D−
ガラクトシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ウレア
ーゼ、カタラーゼ。
れるものでなく、公知(7)−i法により標識化および
検出することができる。標識として酵素を用いる場合、
標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、β−D−
ガラクトシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、ウレア
ーゼ、カタラーゼ。
β−グルクロニダーゼなどの酵素が使われる。放射性物
質を標識として用いる場合は、3H1+2511または
1311等が、また蛍光物質を標識として使用する場
合には、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンチ
オシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート等
が常法によりモノクローナル抗体に結合される。しかし
ながら、標識物質は上記物質に何ら限定されるべきもの
ではない。
質を標識として用いる場合は、3H1+2511または
1311等が、また蛍光物質を標識として使用する場
合には、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンチ
オシアネート、テトラローダミンイソチオシアネート等
が常法によりモノクローナル抗体に結合される。しかし
ながら、標識物質は上記物質に何ら限定されるべきもの
ではない。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤1反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
解剤、緩衝剤、洗浄剤1反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
一方CATは、クロラムフェニコールに耐性の微生物か
ら調製できる。例えば、 (1)R因子を有する大腸菌(E、coli)、(2)
クロラムフェニコール・プラスミドを持っているスタフ
ィロコッカス・オーレウス(S。
ら調製できる。例えば、 (1)R因子を有する大腸菌(E、coli)、(2)
クロラムフェニコール・プラスミドを持っているスタフ
ィロコッカス・オーレウス(S。
aureus) 、
(3)CAT耐性のプロテウス・ミラビリス(Prot
eus m1rabilis)、(4)CAT耐性の
アグロバクテリウム・ツメファシェンス(Agroba
cteriumtumefaciens) を列記できる。これらの微生物からのCATの精製法は
公知である。例えば、ダブりニー・ブイ・ショウ(W、
V、 S h a w)のメソッズ・イン・エンザイ
モロジ−(Methods inEnzymolog
y)第43巻、737−755ページ、1975年)に
記載の方法で精製することができる。
eus m1rabilis)、(4)CAT耐性の
アグロバクテリウム・ツメファシェンス(Agroba
cteriumtumefaciens) を列記できる。これらの微生物からのCATの精製法は
公知である。例えば、ダブりニー・ブイ・ショウ(W、
V、 S h a w)のメソッズ・イン・エンザイ
モロジ−(Methods inEnzymolog
y)第43巻、737−755ページ、1975年)に
記載の方法で精製することができる。
ところで培養細胞へ遺伝子を導入する際に用いるベクタ
ーには、大腸菌のR因子由来のCAT遺伝子が組み込ま
れている。従って、培養細胞へ導入された遺伝子の機能
をCAT遺伝子の発現を通して評価することができ、C
AT遺伝子の発現は本発明法によって評価することがで
きる。
ーには、大腸菌のR因子由来のCAT遺伝子が組み込ま
れている。従って、培養細胞へ導入された遺伝子の機能
をCAT遺伝子の発現を通して評価することができ、C
AT遺伝子の発現は本発明法によって評価することがで
きる。
(発明の効果)
以上の説明から明らかなように本発明によれば、(1)
試料中のCATia度は、約1〜200ng/mlの範
囲内で測定することができる。必要な試料液の量は例え
ば約20μλであり、即ち約0.02〜4ngのCAT
の定量が可能である。
試料中のCATia度は、約1〜200ng/mlの範
囲内で測定することができる。必要な試料液の量は例え
ば約20μλであり、即ち約0.02〜4ngのCAT
の定量が可能である。
(2)従来法に比べて極めて簡便な操作で短時間に、か
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。
つ感度よく多数の検体の測定が可能である。
更に詳細に説明すると、CATの酵素活性測定に基づ〈
従来のCAT測定法では、コントロールとして0,01
〜0.5単位のCATを用いる。これは0.08〜0.
4ngに相当する。
従来のCAT測定法では、コントロールとして0,01
〜0.5単位のCATを用いる。これは0.08〜0.
4ngに相当する。
従って本発明の方法では、0.0025〜5.0単位の
CATの酵素活性を定量できることになる。
CATの酵素活性を定量できることになる。
(3)免疫学的測定法を用いると、CATのポリペプチ
ド鎖が酵素活性を示す形に正しくおりたたまれた状態で
あっても、あるいは、おりたたまれていない状態であっ
ても、さらには、プロテアーゼ消化により一部切断され
断片化した状態であっても、mRNAから翻訳されたポ
リペプチドを定量することが可能である。
ド鎖が酵素活性を示す形に正しくおりたたまれた状態で
あっても、あるいは、おりたたまれていない状態であっ
ても、さらには、プロテアーゼ消化により一部切断され
断片化した状態であっても、mRNAから翻訳されたポ
リペプチドを定量することが可能である。
(実施例)
以下に本発明の詳細な実施例を説明する。本発明の内容
は以下に記述する実施例により何ら限定されるものでは
ない。
は以下に記述する実施例により何ら限定されるものでは
ない。
実施例1
(A)CATの調製
前記のショウの方法に従い、CAT耐性の大腸菌からC
ATを精製した。本CAT標品は電気泳動において均一
であり、蛋白質1mg当たりの酵素活性(比活性)は1
25000単位であった。
ATを精製した。本CAT標品は電気泳動において均一
であり、蛋白質1mg当たりの酵素活性(比活性)は1
25000単位であった。
本CAT標品を免疫に用いる抗原および免疫測定法に用
いる標準物質とした。
いる標準物質とした。
(B)抗原感作動物細胞の調製
B a l b / cマウス(♀)をCATで免疫し
た。
た。
免疫は、マウスの腹腔にフロイントの完全アジュバント
とCATIO〜100μg/匹とを乳化させた試料10
0μ!を投与することにより行った。
とCATIO〜100μg/匹とを乳化させた試料10
0μ!を投与することにより行った。
2週間後に追加免疫としてCAT 10〜100μg/
匹をフロイントの不完全アジュバントとを乳化させたち
の100μlをマウス腹腔に投与した。1週間後に、最
終免疫としてCATIO〜100μg/匹をリン酸緩衝
化生理食塩水(0,85%NaCJ!を含有する0、0
1%リン酸緩衝液、pH7,2:以下PBSと略称する
)に溶解したちの100μlを腹腔内に投与した。
匹をフロイントの不完全アジュバントとを乳化させたち
の100μlをマウス腹腔に投与した。1週間後に、最
終免疫としてCATIO〜100μg/匹をリン酸緩衝
化生理食塩水(0,85%NaCJ!を含有する0、0
1%リン酸緩衝液、pH7,2:以下PBSと略称する
)に溶解したちの100μlを腹腔内に投与した。
3日後この処置マウスの肺臓を無菌的に取出した。
15%子牛脂児血清(以下15%FC3と省略する)を
含むダルベツコモディファイドイーグル培地(以下、D
M E Mとする)10mJ!を注射器で吸い取り2
7ゲージの注射針をつけた。肺臓を水冷しておいたデイ
ツシュに入れ、注射針で数か新式をあけた。注射針を差
し込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出
液をナイロンメツシュで濾過したのち、遠心チューブに
入れ、11000rpで10分間遠心分離して上澄をす
てた。細胞ベレット中の赤血球を0.15M塩化アンモ
ニウム溶液(1mMエチレンジアミン−4酢酸−2ナト
リウム塩(以下EDTAと略称する)を含む0.01M
炭酸緩衝液、pH7,2)で溶血させ遠心分離し、さら
に細胞ベレットをDMEMで2回同様に遠心洗浄して肺
細胞とした。
含むダルベツコモディファイドイーグル培地(以下、D
M E Mとする)10mJ!を注射器で吸い取り2
7ゲージの注射針をつけた。肺臓を水冷しておいたデイ
ツシュに入れ、注射針で数か新式をあけた。注射針を差
し込み還流し肺臓細胞をデイツシュに流出させた。流出
液をナイロンメツシュで濾過したのち、遠心チューブに
入れ、11000rpで10分間遠心分離して上澄をす
てた。細胞ベレット中の赤血球を0.15M塩化アンモ
ニウム溶液(1mMエチレンジアミン−4酢酸−2ナト
リウム塩(以下EDTAと略称する)を含む0.01M
炭酸緩衝液、pH7,2)で溶血させ遠心分離し、さら
に細胞ベレットをDMEMで2回同様に遠心洗浄して肺
細胞とした。
(C)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としてはBaJb/cマウス由来の8−アザ
グアニン耐性株として、SP210−Ag14(以下S
P 210と略称する)を使用した。
グアニン耐性株として、SP210−Ag14(以下S
P 210と略称する)を使用した。
細胞融合を行う1週間前まで20μg / m 1の8
−アザグアニン、15%FCSを含むD M E Mで
培養し、その後細胞融合日まで15%FCSを含むDM
EMを使用した。細胞融合直前に、5P210は無菌的
1: D M E Mで1100Orpで10分間遠心
洗浄を2回繰り返し調製した。
−アザグアニン、15%FCSを含むD M E Mで
培養し、その後細胞融合日まで15%FCSを含むDM
EMを使用した。細胞融合直前に、5P210は無菌的
1: D M E Mで1100Orpで10分間遠心
洗浄を2回繰り返し調製した。
(D)細胞融合
上記(B)項で調製した肺臓細胞と上記(C)項で調製
した骨髄腫細胞を5:1の割合で混合遠心(1000r
pm、10分)し、細胞ペレットを集めた。遠心チュー
ブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広げた。
した骨髄腫細胞を5:1の割合で混合遠心(1000r
pm、10分)し、細胞ペレットを集めた。遠心チュー
ブを軽くたたいて細胞ペレットを壁面にうずく広げた。
その中に37℃に暖めておいた50%PEG (MER
K社製ポリエチレングリコール4000)を含むDME
M溶液0.5miを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。1分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、遠心チューブを回転しながら、37℃に加温
しておいたD M E Mを、30秒間に1mlの割合
で10回加えた。ついで、Fe2(2mりをゆっくりと
入れ、11000rpで10分間遠心した。細胞ペレッ
トを15%FC3とlXl0−’Mヒポキサンチン、4
X 10−7Mアミノプテリン、1.6X10−5M
チミジンを含むDMEM (以下HAT培地と略称する
)で2回遠心洗浄(1000rpm、10分間)した。
K社製ポリエチレングリコール4000)を含むDME
M溶液0.5miを遠心チューブを回しながら少しずつ
滴下した。1分間ゆっくりと遠心チューブを回転させ混
合した後、遠心チューブを回転しながら、37℃に加温
しておいたD M E Mを、30秒間に1mlの割合
で10回加えた。ついで、Fe2(2mりをゆっくりと
入れ、11000rpで10分間遠心した。細胞ペレッ
トを15%FC3とlXl0−’Mヒポキサンチン、4
X 10−7Mアミノプテリン、1.6X10−5M
チミジンを含むDMEM (以下HAT培地と略称する
)で2回遠心洗浄(1000rpm、10分間)した。
この培養液を96ウエル・プレート(Falcon#3
042)に5X10’細胞個/ウェルになるように20
0μにずつ分注した。3日目ごとにHAT培地を100
μに/ウェルずつ交換する。3週間後からは、1 ×1
0−’Mヒポキサンチン。
042)に5X10’細胞個/ウェルになるように20
0μにずつ分注した。3日目ごとにHAT培地を100
μに/ウェルずつ交換する。3週間後からは、1 ×1
0−’Mヒポキサンチン。
1.6X10−5Mチミジンと15%FC8を含むDM
EMを用いて培地交換を行った。
EMを用いて培地交換を行った。
(E)ハイブリドーマの選択
96ウエル・プレートに細胞コロニーが認められる10
日目頃から酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗CAT
抗体が存在するかどうか調べた。
日目頃から酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗CAT
抗体が存在するかどうか調べた。
96ウエル・イムノプレート平底(インターメッド社製
)に、CAT2μg/mJ!を50ull/ウェル分注
し、37℃で1.5時間静置した。ウェルに残っている
溶液を除去し、PBSに0.04%ツイーン(Twe
e n)−20を含んだ溶液(以下PBS−Tと略称す
る)で3回洗浄した後、0.1%ウシ血清アルブミン(
以下BSAと略称する)を溶解したPBS−T溶液30
0μlを各ウェルに加えて、37℃で1.5時間ブロッ
キング処理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を10
0μlずつ分注し37℃で1.5時間静置した。これら
のウェルをPBS−T溶液で3回洗浄した後、ペルオキ
シダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体(ジャクソン・
ラボラトリ−社製)4000倍希釈を50μj/ウエル
ずつ分注し、37℃で1.5時間静置した。PBS−T
溶液で3回洗浄後、基質溶液(1,2% 2.2−アジ
ノジー(3−エチルベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモ
ニウム塩および0.01%過酸化水素(H202)を含
有する0、1Mクエン酸緩衝液、pH5,1)を各ウェ
ルに100μに添加した。
)に、CAT2μg/mJ!を50ull/ウェル分注
し、37℃で1.5時間静置した。ウェルに残っている
溶液を除去し、PBSに0.04%ツイーン(Twe
e n)−20を含んだ溶液(以下PBS−Tと略称す
る)で3回洗浄した後、0.1%ウシ血清アルブミン(
以下BSAと略称する)を溶解したPBS−T溶液30
0μlを各ウェルに加えて、37℃で1.5時間ブロッ
キング処理した。つぎに各ウェルに上記培養上清を10
0μlずつ分注し37℃で1.5時間静置した。これら
のウェルをPBS−T溶液で3回洗浄した後、ペルオキ
シダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体(ジャクソン・
ラボラトリ−社製)4000倍希釈を50μj/ウエル
ずつ分注し、37℃で1.5時間静置した。PBS−T
溶液で3回洗浄後、基質溶液(1,2% 2.2−アジ
ノジー(3−エチルベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモ
ニウム塩および0.01%過酸化水素(H202)を含
有する0、1Mクエン酸緩衝液、pH5,1)を各ウェ
ルに100μに添加した。
30分間室温で放置し、0.2Mシュウ酸溶液を100
μオを加えて酵素反応を停止させた。
μオを加えて酵素反応を停止させた。
415nmでの吸光度を測定し、酵素活性が認められた
ウェルに抗CAT抗体を産生ずるハイブリドーマが存在
することがわかった。以上のようにして、抗体価の強い
抗体産生ハイブリドーマを取得した。
ウェルに抗CAT抗体を産生ずるハイブリドーマが存在
することがわかった。以上のようにして、抗体価の強い
抗体産生ハイブリドーマを取得した。
(F)コンデショニング・メデウムの調製26ゲージの
注射針をつけた注射器に10m1の冷蔵しておいた0、
34Mサッカロース溶液を吸い取った。Ba1b/cマ
ウス(♂)をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液
を注入した。
注射針をつけた注射器に10m1の冷蔵しておいた0、
34Mサッカロース溶液を吸い取った。Ba1b/cマ
ウス(♂)をを椎脱臼させ、無菌的に腹腔内に上記溶液
を注入した。
注入後5分間以内に左側腹部に18ゲージの注射針をつ
け水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷
冷しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、1
1000rpで5分間遠心分離した。遠心分離後、上清
を廃棄し、細胞ペレットに15%FC8−DMEMを加
え攪拌しプッシュに入れた。37℃、5%炭酸ガス−9
5%空気雰囲気、95%湿度で一晩培養した。培養上清
を集め、メンブレンフィルター(孔径0.22μm)で
濾過し、これをコンデショニング・メデウムとした。
け水冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。氷
冷しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、1
1000rpで5分間遠心分離した。遠心分離後、上清
を廃棄し、細胞ペレットに15%FC8−DMEMを加
え攪拌しプッシュに入れた。37℃、5%炭酸ガス−9
5%空気雰囲気、95%湿度で一晩培養した。培養上清
を集め、メンブレンフィルター(孔径0.22μm)で
濾過し、これをコンデショニング・メデウムとした。
(G)クローニング
抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記(E)項で作製したコ
ンデショニング・メデウム1mkを含むHAT培地培地
20奢J意した。クローニングしようとするハイブリド
ーマ細胞が各ウェル1;1個になるように上記培養液を
用いて細胞懸濁液を調製し、ウェル当たり200μλず
つ、96ウエル・プレート(Faicon#3042)
に分注した。培養後、10日目前から細胞コロニが認め
られるウェルについて、上記(E)項に記載した固相酵
素免疫測定法に準じて抗CAT抗体産生ハイブリドーマ
を選択し、さらに再度クローニングを繰り返しモノクロ
ーン化したハイブリドーマを樹立した。最終的に21株
のハイブリドーマを獲得した。
用いて単一クローンにした。上記(E)項で作製したコ
ンデショニング・メデウム1mkを含むHAT培地培地
20奢J意した。クローニングしようとするハイブリド
ーマ細胞が各ウェル1;1個になるように上記培養液を
用いて細胞懸濁液を調製し、ウェル当たり200μλず
つ、96ウエル・プレート(Faicon#3042)
に分注した。培養後、10日目前から細胞コロニが認め
られるウェルについて、上記(E)項に記載した固相酵
素免疫測定法に準じて抗CAT抗体産生ハイブリドーマ
を選択し、さらに再度クローニングを繰り返しモノクロ
ーン化したハイブリドーマを樹立した。最終的に21株
のハイブリドーマを獲得した。
(H)抗CAT抗体の精製
Baj!b/cマウス(♂)(6〜10週令)の腹腔に
ブリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン)を0.5mJ2/匹投与した。
ブリスタン(2,6,10,14−テトラメチルペンタ
デカン)を0.5mJ2/匹投与した。
2週間後、上記(G)項で得られた抗CAT抗体産土ハ
イブリドーマ株をマウス腹腔内に6株について2X10
6細胞個/匹移植した。10日目前後に生成した腹水を
、18ゲージの注射針を腹腔に差し込み、1/20量の
0.2M EDTAをいれた遠心チューブに滴下させ
た。遠心チューブを400Or pmで10分間遠心し
、上清を集めた。採取した上清から、5096硫酸アン
モニウム沈殿分画法により、免疫グロブリン画分を粗精
製し、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS溶液に
透析後、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル・ク
ロマトグラフィーを行い、抗CAT抗体を精製した。メ
ルカプトエタノールによる還元条件下での12%5DS
−ポリアクリルアミド電気泳動において、分子量約5,
0万の1本の重鎮(H鎖)と分子量約2,7万の1本の
軽鎖(L鎖)の2本のバンドになったことを確認して、
抗体力(均一にまで精製されたことを判断した。
イブリドーマ株をマウス腹腔内に6株について2X10
6細胞個/匹移植した。10日目前後に生成した腹水を
、18ゲージの注射針を腹腔に差し込み、1/20量の
0.2M EDTAをいれた遠心チューブに滴下させ
た。遠心チューブを400Or pmで10分間遠心し
、上清を集めた。採取した上清から、5096硫酸アン
モニウム沈殿分画法により、免疫グロブリン画分を粗精
製し、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS溶液に
透析後、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル・ク
ロマトグラフィーを行い、抗CAT抗体を精製した。メ
ルカプトエタノールによる還元条件下での12%5DS
−ポリアクリルアミド電気泳動において、分子量約5,
0万の1本の重鎮(H鎖)と分子量約2,7万の1本の
軽鎖(L鎖)の2本のバンドになったことを確認して、
抗体力(均一にまで精製されたことを判断した。
以上の方法により、CATを特異的に認識する複数種の
モノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体の結合定数
は、107〜1011〜1−1の範囲内であった。
モノクローナル抗体を得た。それぞれの抗体の結合定数
は、107〜1011〜1−1の範囲内であった。
(1)抗CAT抗体の固定化
未処理マイクロタイタープレート(96ウエル争ヌンク
プレート、インターメ・ソド社製)の各ウェルに0,1
M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,6)に溶解した3μ
g/mJのマウス由来の抗CATモノクローナル抗体(
名称aとする。実施例(H)で得られたもの)の溶液2
00μぶを加えて、4℃で一夜インキユベートした。次
1こ、各ウェルの溶液を除去し、PBS−Tで3回洗浄
した後、0.1%BSAを溶解したPBS−T溶液30
0μkを各ウェルに加えて、4℃でプロ・ツキング処理
しそのまま保存した。
プレート、インターメ・ソド社製)の各ウェルに0,1
M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,6)に溶解した3μ
g/mJのマウス由来の抗CATモノクローナル抗体(
名称aとする。実施例(H)で得られたもの)の溶液2
00μぶを加えて、4℃で一夜インキユベートした。次
1こ、各ウェルの溶液を除去し、PBS−Tで3回洗浄
した後、0.1%BSAを溶解したPBS−T溶液30
0μkを各ウェルに加えて、4℃でプロ・ツキング処理
しそのまま保存した。
1)西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下HRPと略称す
る)標識抗体の調製 0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8,1)に溶解
したHRP溶液(5mg/m、iりに1%1−フルオロ
−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液を0.
1mA加え、室温にて1時間反応させた。その溶液に0
.06M過ヨウ素酸ナトリウム1.0m、eを添加し3
0分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを0.
16Mのエチレングリコール1. Orr+J!を加
えて除去した後、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(p
H9,5)で透析した。次に、マウス由来の抗CATモ
ノクローナル抗体(名称すとする。実施例(H)で得ら
れたもので、モノクローナル抗体aとは異なる部位を認
識するもの)5mgを加えて5〜6時間反応させた。水
素化ホウ素ナトリウム5mgを添加して4℃中で一夜放
置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除
去するため、0.85%塩化ナトリウムを含む10mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7,1)に対して4℃で
一夜攪拌しながら透析した。上記反応物をTSKゲルG
−3000SW (東ソー株式会社製、商品名)を用い
て高速液体クロマトグラフィーにて精製し、HRP標識
抗体とした。
る)標識抗体の調製 0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8,1)に溶解
したHRP溶液(5mg/m、iりに1%1−フルオロ
−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液を0.
1mA加え、室温にて1時間反応させた。その溶液に0
.06M過ヨウ素酸ナトリウム1.0m、eを添加し3
0分反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを0.
16Mのエチレングリコール1. Orr+J!を加
えて除去した後、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(p
H9,5)で透析した。次に、マウス由来の抗CATモ
ノクローナル抗体(名称すとする。実施例(H)で得ら
れたもので、モノクローナル抗体aとは異なる部位を認
識するもの)5mgを加えて5〜6時間反応させた。水
素化ホウ素ナトリウム5mgを添加して4℃中で一夜放
置した。この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除
去するため、0.85%塩化ナトリウムを含む10mM
リン酸ナトリウム緩衝液(pH7,1)に対して4℃で
一夜攪拌しながら透析した。上記反応物をTSKゲルG
−3000SW (東ソー株式会社製、商品名)を用い
て高速液体クロマトグラフィーにて精製し、HRP標識
抗体とした。
(K)試料中のCATの定量
本実施例中の(1)で記述した方法で作製したマイクロ
タイタープレートを室温にもどし、PBS−T溶液で洗
浄した後、CATを含む標準試料を各ウェルにそれぞれ
20μl加えた。つぎに本実施例(J)で得たH RP
標識抗体をPBS−T溶液で希釈し、各ウェルに200
μlずつ添加した。そのまま室温で3時間インキュベー
トした後、溶液を除去しPBS−T溶液で3回洗浄した
。それに、1.2% 2.2−アジノジ=(3−エチル
ベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩及び0.0
1%過酸化水素(H2O2)を含有する0、1Mクエン
酸緩衝液(pH4,1)から成る基質溶液を各ウェルに
200μm添加し、室温で30分間酵素反応させた後、
200mMシュウ酸溶液を100μに加えて酵素反応を
停止させた。
タイタープレートを室温にもどし、PBS−T溶液で洗
浄した後、CATを含む標準試料を各ウェルにそれぞれ
20μl加えた。つぎに本実施例(J)で得たH RP
標識抗体をPBS−T溶液で希釈し、各ウェルに200
μlずつ添加した。そのまま室温で3時間インキュベー
トした後、溶液を除去しPBS−T溶液で3回洗浄した
。それに、1.2% 2.2−アジノジ=(3−エチル
ベンズチアゾリン硫酸)−ジアンモニウム塩及び0.0
1%過酸化水素(H2O2)を含有する0、1Mクエン
酸緩衝液(pH4,1)から成る基質溶液を各ウェルに
200μm添加し、室温で30分間酵素反応させた後、
200mMシュウ酸溶液を100μに加えて酵素反応を
停止させた。
上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長415nm、対照波長492nmの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー(東ソー株式会社製、
PvI P R−A 4、商品名)で測定した結果を表
1に示す。試料中のCATは約1〜200ng/mJ!
の範囲で定量できることが確認された。用いた試料液の
量は20μ!であり、約0.02〜4ngのCATの定
量が可能であることが示された。
長415nm、対照波長492nmの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー(東ソー株式会社製、
PvI P R−A 4、商品名)で測定した結果を表
1に示す。試料中のCATは約1〜200ng/mJ!
の範囲で定量できることが確認された。用いた試料液の
量は20μ!であり、約0.02〜4ngのCATの定
量が可能であることが示された。
表1
Claims (3)
- (1)試料中のクロラムフェニコール・アセチルトラン
スフェラーゼを測定する方法において、クロラムフェニ
コール・アセチルトランスフェラーゼを特異的に認識す
る抗体を用いることを特徴とする試料中のクロラムフェ
ニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法。 - (2)クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラ
ーゼを認識する抗体で、 A:固定化されている第1抗体 及び B:第1抗体とは異なる抗原部位を少なくとも認識し、
かつ標識剤で標識されている第2抗体 を用いることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の
方法。 - (3)抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第1項または第2項記載の方法。(4)抗体がポリクロ
ーナル抗体である特許請求の範囲第1項または第2項記
載の方法。(5)培養細胞へ導入された遺伝子の転写活
性の測定に使用することを特徴とする特許請求範囲第1
項ないし第4項いずれかの項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26213689A JPH03123864A (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26213689A JPH03123864A (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03123864A true JPH03123864A (ja) | 1991-05-27 |
Family
ID=17371556
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26213689A Pending JPH03123864A (ja) | 1989-10-09 | 1989-10-09 | クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03123864A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0656422A1 (en) * | 1993-11-05 | 1995-06-07 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Cat assay |
-
1989
- 1989-10-09 JP JP26213689A patent/JPH03123864A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0656422A1 (en) * | 1993-11-05 | 1995-06-07 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Cat assay |
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