JPS62242856A - 測定用液体単一試薬 - Google Patents
測定用液体単一試薬Info
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[発明の背景コ
l1発明の分野
生物学的活性物質の簡単かつ迅速で正確な定性的および
定量的測定法は絶えず′要望されている。
定量的測定法は絶えず′要望されている。
例えば非熟練技術者でも実施し得る方法が必要とされて
いる。さらに便利さ、信頼性および簡単さが要望されて
いる。臨床研究室においてら、操作および試薬を用いる
必要性が可能な限り少なくてすむこれまでより簡単な測
定法に対する要望が増加している。
いる。さらに便利さ、信頼性および簡単さが要望されて
いる。臨床研究室においてら、操作および試薬を用いる
必要性が可能な限り少なくてすむこれまでより簡単な測
定法に対する要望が増加している。
通常イムノアッセイでは1種を越える試薬を用いる。大
抵の場合、試薬は互いに接触反応を起こす成分を含有す
るため測定実施萌に液体媒質中で試薬を合わせることは
できない。1種またはそれ以上の試薬を放出する手段が
提供されるようなときまでは試薬が互いに反応するのを
防いだ状態のまま液体形態として活性材料を合わせる方
法の発見が望まれる。一般にイムノアッセイにおいて試
薬はリガントおよびそれに相補的なレセプターから成る
特異的結合対の構成員であり、sbpの一つをシグナル
発生系の一員で標識する。互いに相補的な特異的結合対
は普通接触反応する。したがって、そのような試薬は一
般に測定実施直面まで個々に貯蔵される。
抵の場合、試薬は互いに接触反応を起こす成分を含有す
るため測定実施萌に液体媒質中で試薬を合わせることは
できない。1種またはそれ以上の試薬を放出する手段が
提供されるようなときまでは試薬が互いに反応するのを
防いだ状態のまま液体形態として活性材料を合わせる方
法の発見が望まれる。一般にイムノアッセイにおいて試
薬はリガントおよびそれに相補的なレセプターから成る
特異的結合対の構成員であり、sbpの一つをシグナル
発生系の一員で標識する。互いに相補的な特異的結合対
は普通接触反応する。したがって、そのような試薬は一
般に測定実施直面まで個々に貯蔵される。
単一試薬中で相互反応性薬剤を合わせる特許技術の1つ
は、液体試料または希釈剤を加えるまで反応が起こらな
いように試薬を乾燥状態で調製するものである。しかし
ながら、測定方法は乾燥試薬により、何らかの制限を強
要される。均一な混合を達成し、水分取り込みを避ける
ことが関心事となる。さらに、機が熟す前の反応は避け
られなければならない。乾燥試薬は高価であり、それら
の製造および品質管理はむずかしい。例えば、試料およ
び希釈剤を同時に加え、激しく振ることにより、反応が
著しく進行してしまう前に粉末を確実に完全溶解させる
ことが一般的に必要である。
は、液体試料または希釈剤を加えるまで反応が起こらな
いように試薬を乾燥状態で調製するものである。しかし
ながら、測定方法は乾燥試薬により、何らかの制限を強
要される。均一な混合を達成し、水分取り込みを避ける
ことが関心事となる。さらに、機が熟す前の反応は避け
られなければならない。乾燥試薬は高価であり、それら
の製造および品質管理はむずかしい。例えば、試料およ
び希釈剤を同時に加え、激しく振ることにより、反応が
著しく進行してしまう前に粉末を確実に完全溶解させる
ことが一般的に必要である。
さらに、特別の処理装置が必要とされる。
したがって、2つまたはそれ以上の特異的結合成分を液
体単一試薬中で合わせる、試料中のアナライト(A n
alyte)の新規測定方法の開発が望まれる。そのよ
うな試薬により乾燥試薬を混合および浸盪する必要性が
除かれ、そして試料および希釈剤を同時に加える必要も
なくなる。単一液体試薬により、測定遂行に必要とされ
る時間および特殊技術はこれまでより少なくてすむ。
体単一試薬中で合わせる、試料中のアナライト(A n
alyte)の新規測定方法の開発が望まれる。そのよ
うな試薬により乾燥試薬を混合および浸盪する必要性が
除かれ、そして試料および希釈剤を同時に加える必要も
なくなる。単一液体試薬により、測定遂行に必要とされ
る時間および特殊技術はこれまでより少なくてすむ。
2、関連技術の記載
リッチフィールド等、「ハイ・センシティブ・イムノア
ッセイズ・ベイスト・オン・ユース・オン・リボソーム
ズ・ウィズアウト・コンブレメントj(High 5
ensitive Immunoassays B
a5edon Use Of Liposome
s without Complement) I
Jクリニカル・ケミストリーJ(CIin、 Chem
、)30巻、1441−1445頁(1984年)]は
、共有結合したハプテン−細胞溶解素コンジュゲートを
用いて小胞を包括酵素により溶解させるリボソームベー
スのイムノアッセイを記載している。米国特許第385
0578号、第4483921号および第448392
9号は、抗原または抗体が脂質小胞の表面に結合してい
る免疫反応性リボソーム試薬を開示している。脂質小胞
の様々な製造方法が知られている。例えば、米国特許第
4485054号参照。米国特許第4311712号は
凍結乾燥リボソーム混合物の製造方法を開示している。
ッセイズ・ベイスト・オン・ユース・オン・リボソーム
ズ・ウィズアウト・コンブレメントj(High 5
ensitive Immunoassays B
a5edon Use Of Liposome
s without Complement) I
Jクリニカル・ケミストリーJ(CIin、 Chem
、)30巻、1441−1445頁(1984年)]は
、共有結合したハプテン−細胞溶解素コンジュゲートを
用いて小胞を包括酵素により溶解させるリボソームベー
スのイムノアッセイを記載している。米国特許第385
0578号、第4483921号および第448392
9号は、抗原または抗体が脂質小胞の表面に結合してい
る免疫反応性リボソーム試薬を開示している。脂質小胞
の様々な製造方法が知られている。例えば、米国特許第
4485054号参照。米国特許第4311712号は
凍結乾燥リボソーム混合物の製造方法を開示している。
[発明の要約コ
この発明は、リガントおよびそれに相補的なレセプター
から成る特異的結合対(sbp)の一員であるアナライ
トの含有が疑われる試料中の、アナライトの存否の測定
を目的とする方法および組成物を提供する。この方法は
、互いに相補的なsbp成分を単一液体媒質中に含み、
sbp成分をそれに相補的なsbp成分と一時的に結合
不可能にする材料に少なくとも1つのsbp成分が可逆
的に封じ込められている組成物を用いて行なわれる。封
じ込める材料は合成または天然担体である。sbp成分
の少なくと61つがシグナル発生系の一員と結合してい
る。一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込みを解
除する手段を適当な時点で液体媒質と合わ仕ろ。化学的
または物理的手段またはそれらの組合わせを用いて一時
的に封じ込められたsbp成1%t%上シ+−二zフ、
?−aZ7Tb〜−−f−M士ントi−七?書、プシな
述の乙のを含有する試薬を適当なオーダーで合わせ、試
料中のアナライトの量に応じて発生されたシグナルを測
定する。
から成る特異的結合対(sbp)の一員であるアナライ
トの含有が疑われる試料中の、アナライトの存否の測定
を目的とする方法および組成物を提供する。この方法は
、互いに相補的なsbp成分を単一液体媒質中に含み、
sbp成分をそれに相補的なsbp成分と一時的に結合
不可能にする材料に少なくとも1つのsbp成分が可逆
的に封じ込められている組成物を用いて行なわれる。封
じ込める材料は合成または天然担体である。sbp成分
の少なくと61つがシグナル発生系の一員と結合してい
る。一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込みを解
除する手段を適当な時点で液体媒質と合わ仕ろ。化学的
または物理的手段またはそれらの組合わせを用いて一時
的に封じ込められたsbp成1%t%上シ+−二zフ、
?−aZ7Tb〜−−f−M士ントi−七?書、プシな
述の乙のを含有する試薬を適当なオーダーで合わせ、試
料中のアナライトの量に応じて発生されたシグナルを測
定する。
この発明の方法は、単−液体試薬中に通常相互反応する
sbp成分を供給する方法を提供する。少なくとも1つ
のsbp成分が一時的に封じ込められているため、単一
液体試薬を製造現場において測定前の量で製造し、ユー
ザーに送り、そして将来の使用に備えて貯蔵することが
でき、個々の試薬を測定または混合する必要はない。
sbp成分を供給する方法を提供する。少なくとも1つ
のsbp成分が一時的に封じ込められているため、単一
液体試薬を製造現場において測定前の量で製造し、ユー
ザーに送り、そして将来の使用に備えて貯蔵することが
でき、個々の試薬を測定または混合する必要はない。
この方法は、スピンイムノアッセイ、FIA。
EM I T(エンザイム・マルチブライド・イムノア
ッセイ・テクニック)、ELISA(エンザイム・リン
クド・イムノソルベント・アッセイ)、RIA(ラジオ
イムノアッセイ)およびケミルミネッセント・イムノア
ッセイを含む様々なイムノアッセイ技術で特に有用であ
る。またこの方法は、sbp成分の一つが粒子上に存在
しない粒子凝集イムノアッセイにおいても有用である。
ッセイ・テクニック)、ELISA(エンザイム・リン
クド・イムノソルベント・アッセイ)、RIA(ラジオ
イムノアッセイ)およびケミルミネッセント・イムノア
ッセイを含む様々なイムノアッセイ技術で特に有用であ
る。またこの方法は、sbp成分の一つが粒子上に存在
しない粒子凝集イムノアッセイにおいても有用である。
単一液体試薬を含有するキットも測定での使用に供され
る。また一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込み
を解除する手段および補助薬剤乙キット中に与えられ得
る。
る。また一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込み
を解除する手段および補助薬剤乙キット中に与えられ得
る。
[実施態様の記載]
この発明は、一時的に試薬間の反応を遅らせる様式で特
異的結合試薬を単−液体培地中で合わせる方法に関する
。この方法は、−試薬を一時的に他の試薬と非反応性に
する手段として前記試薬を封入した後、包括された材料
を指定された時間に特異的に放出することを含む。封入
された試薬および他の試薬(単数また複数)が液体媒質
に存在する。この発明は、前記液体媒質を利用してアナ
ライトの含有が疑われる試料中の広範な種類のアナライ
トを測定するための高感度で正確で単純化された測定方
法を提供する。
異的結合試薬を単−液体培地中で合わせる方法に関する
。この方法は、−試薬を一時的に他の試薬と非反応性に
する手段として前記試薬を封入した後、包括された材料
を指定された時間に特異的に放出することを含む。封入
された試薬および他の試薬(単数また複数)が液体媒質
に存在する。この発明は、前記液体媒質を利用してアナ
ライトの含有が疑われる試料中の広範な種類のアナライ
トを測定するための高感度で正確で単純化された測定方
法を提供する。
主要発明にしたがうと、リガントおよびそれに相補的な
レセプターから成る特異的結合対(sbp)の一員であ
るアナライトの存否を決定するための測定方法および組
成物が提供される。アナライトの含有が疑われろ試料を
、単一液体媒質中に(1)少なくとも1つの、封じ込め
られたsbp成分をそれに相補的なsbp成分と一時的
に結合不可能する材料に可逆的に封じ込められたsbp
成分および(2)前記の相補的sbp成分を含有する組
成物と合わせる。sbp成分の少なくとも1つはシグナ
ル発生系の一員と結合している。シグナル発生系の他の
成分らまた単一液体媒質に存在し得る。場合により、シ
グナル発生系のこれらの追加的成分をさらにsbp成分
と封入する。別法として、シグナル発生系の追加的成分
は別の媒質中に存在し得る。
レセプターから成る特異的結合対(sbp)の一員であ
るアナライトの存否を決定するための測定方法および組
成物が提供される。アナライトの含有が疑われろ試料を
、単一液体媒質中に(1)少なくとも1つの、封じ込め
られたsbp成分をそれに相補的なsbp成分と一時的
に結合不可能する材料に可逆的に封じ込められたsbp
成分および(2)前記の相補的sbp成分を含有する組
成物と合わせる。sbp成分の少なくとも1つはシグナ
ル発生系の一員と結合している。シグナル発生系の他の
成分らまた単一液体媒質に存在し得る。場合により、シ
グナル発生系のこれらの追加的成分をさらにsbp成分
と封入する。別法として、シグナル発生系の追加的成分
は別の媒質中に存在し得る。
この発明の具体的実施態様をさらに詳細に述べろ前に、
用語の説明を行なう。
用語の説明を行なう。
アナライト・・・測定すべき化合物または組成物であり
、また関心の対象となる物質である。これは通常特異的
結合対(sbp)の一員であり、−価または多価のリガ
ントであることができ、通常抗原性またはハプテン性で
あり、単一化合物であるかまたは少なくと61つの共通
エピトープ部または決定基をもつ複数の化合物である。
、また関心の対象となる物質である。これは通常特異的
結合対(sbp)の一員であり、−価または多価のリガ
ントであることができ、通常抗原性またはハプテン性で
あり、単一化合物であるかまたは少なくと61つの共通
エピトープ部または決定基をもつ複数の化合物である。
多価リガント・アナライトは、通常ポリ(アミノ酸)す
なわちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸、およ
びこれらの組合わせである。このような組合わ仕には、
細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核
、細胞膜等が含まれる。
なわちポリペプチドおよび蛋白質、多糖類、核酸、およ
びこれらの組合わせである。このような組合わ仕には、
細菌、ウィルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核
、細胞膜等が含まれる。
アナライトの詳細な性質は、数多くの例と共に米国特許
第4299916号(リドマン等)特に16−23欄に
記載されている。
第4299916号(リドマン等)特に16−23欄に
記載されている。
多くの場合、この発明で用いるポリエピトープ性リガン
ト・アナライトは、分子量少なくとも約5000、通常
少なくとも約10000である。
ト・アナライトは、分子量少なくとも約5000、通常
少なくとも約10000である。
ポリ(アミノ酸)類の中では、関心のあるポリ(アミノ
酸は一般に分子量約5000−5000000であり、
通常約20000〜1oOooooである。関心のある
ホルモン類では、分子mは約5000〜60000の分
子m範囲内にある。
酸は一般に分子量約5000−5000000であり、
通常約20000〜1oOooooである。関心のある
ホルモン類では、分子mは約5000〜60000の分
子m範囲内にある。
広範囲の蛋白質が、同様な構造的特徴を有する蛋白質、
特定の生物学的機能を有する蛋白質、特定の微生物特に
病原性微生物に関連する蛋白質等として含まれる。
特定の生物学的機能を有する蛋白質、特定の微生物特に
病原性微生物に関連する蛋白質等として含まれる。
モノエピトープ性すカンド・アナライトは、一般に分子
量約1OO−2000、・通常125−1000である
。関心のあるアナライトには、医薬、中間代謝物、殺虫
剤、汚染物等が含まれる。関心のある医薬としては、ア
ルカロイド性のものが含まれる。アルカロイドの中には
、モルヒネ、コディン、ヘロイン、デキストロメトルフ
ァン、それらの誘導体および代謝物を含むモルヒネアル
カロイド、コカイン、ペンゾイルエルゴニン、それらの
誘導体および代謝物を含むコカインアルカロイド、リセ
ルグ酸ジエチルアミドを含む麦角アルカロイド、ステロ
イドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キナゾ
リンアルカロイド、イソキノリンアルカロイド、キニン
およびキニジンを含むキノリンアルカロイド、ジテルペ
ンアルカロイド、それらの誘導体および代謝物がある。
量約1OO−2000、・通常125−1000である
。関心のあるアナライトには、医薬、中間代謝物、殺虫
剤、汚染物等が含まれる。関心のある医薬としては、ア
ルカロイド性のものが含まれる。アルカロイドの中には
、モルヒネ、コディン、ヘロイン、デキストロメトルフ
ァン、それらの誘導体および代謝物を含むモルヒネアル
カロイド、コカイン、ペンゾイルエルゴニン、それらの
誘導体および代謝物を含むコカインアルカロイド、リセ
ルグ酸ジエチルアミドを含む麦角アルカロイド、ステロ
イドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キナゾ
リンアルカロイド、イソキノリンアルカロイド、キニン
およびキニジンを含むキノリンアルカロイド、ジテルペ
ンアルカロイド、それらの誘導体および代謝物がある。
医薬の別の群には、エストロゲン、エストゲン、アンド
ロゲン、アドレノコルチコステロイド、胆汁酸、強心配
糖体およびアグリコン(ジゴキシンおよびジゴキシゲニ
ンを含む)、サポニンおよびサポゲニン、それらの誘導
体および代謝物を含むステロイド類かある。また、ノエ
ヂルスヂルベストロールのようなステロイド様物質も含
まれる。
ロゲン、アドレノコルチコステロイド、胆汁酸、強心配
糖体およびアグリコン(ジゴキシンおよびジゴキシゲニ
ンを含む)、サポニンおよびサポゲニン、それらの誘導
体および代謝物を含むステロイド類かある。また、ノエ
ヂルスヂルベストロールのようなステロイド様物質も含
まれる。
医薬の別のJtfには、パルピッレート、例えばフエノ
バルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダ
ントニン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれら
の代謝物を含む5−6員ラクタムがある。
バルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダ
ントニン、プリミドン、エトスクシミド、およびそれら
の代謝物を含む5−6員ラクタムがある。
医薬の別の群には、アンフェタミン、カテコールアミン
(エフェドリンを含む)、L−ドーパ、エピネフリン、
ナルセイン、パバベリン、およびそれらの代謝物を含む
アミノアルキルベンゼン類がある。
(エフェドリンを含む)、L−ドーパ、エピネフリン、
ナルセイン、パバベリン、およびそれらの代謝物を含む
アミノアルキルベンゼン類がある。
医薬の別の群には、オキサゼパム、クロルプロマジン、
テグレトール、イミプラミン、それらの誘導体および代
謝物を含むベンズヘテロ環(ヘテロ環はアゼピン、ジア
ゼピン、フェノチアジンであり得ろ)がある。
テグレトール、イミプラミン、それらの誘導体および代
謝物を含むベンズヘテロ環(ヘテロ環はアゼピン、ジア
ゼピン、フェノチアジンであり得ろ)がある。
医薬の別の群には、テオフィリン、カフェイン、それら
の代謝物および誘導体を含むプリン類があ医薬の別の群
には、カナピノニルおよびテトラビドロ力ナビノールを
含むマリフアナ由来物質がある。
の代謝物および誘導体を含むプリン類があ医薬の別の群
には、カナピノニルおよびテトラビドロ力ナビノールを
含むマリフアナ由来物質がある。
医薬の別の群には、ASB(例えばBet)、C1DS
ESK、葉酸、チアミンを含むビタミンがある。
ESK、葉酸、チアミンを含むビタミンがある。
医薬の別の群には、ヒドロキシ化および不飽和の度合い
と位置でことなるプロスタグランジン類がある。
と位置でことなるプロスタグランジン類がある。
医薬の別の群には、ペニシリン、クロロマイセチン、ア
クヂノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、
それらの代謝物および誘導体を含む抗生物質がある。
クヂノマイセチン、テトラサイクリン、テラマイシン、
それらの代謝物および誘導体を含む抗生物質がある。
医薬の別の群には、ATPlNADSFMN。
アデノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジン(そ
れらは適当な糖および燐置換基を有し得る)を含むヌク
レオシドおよびヌクレオチドがある。
れらは適当な糖および燐置換基を有し得る)を含むヌク
レオシドおよびヌクレオチドがある。
医薬の別の群には、メサトン、メプロバメート、ルトリ
プチリン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプ
ロ力インアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン
、パルプロ酸、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン剤、抗
コリン作用薬(例えばアトロピン)、それらの代謝物お
よび誘導体を含む種々の個別医薬がある。
プチリン、リドカイン、プロカインアミド、アセチルプ
ロ力インアミド、プロプラノロール、グリセオフルビン
、パルプロ酸、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン剤、抗
コリン作用薬(例えばアトロピン)、それらの代謝物お
よび誘導体を含む種々の個別医薬がある。
疾病状態に関連する代謝物には、スペルミン、ガラクト
ース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリン1型が
含まれる。
ース、フェニルピルビン酸、およびポルフィリン1型が
含まれる。
医薬の別の群には、ゲンタマイシン、カナマイシン、ト
ブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシ
ド類がある。
ブラマイシンおよびアミカシンのようなアミノグリコシ
ド類がある。
関心のある殺虫剤には、ポリハロゲン化ビフェニル、燐
酸エステル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハ
ロゲン化スルフェンアミド、それらの代謝物および誘導
体がある。
酸エステル、チオホスフェート、カルバメート、ポリハ
ロゲン化スルフェンアミド、それらの代謝物および誘導
体がある。
レセプター・アナライトの場合11分子量は一般に10
000−2X10’の範囲、通常10000−10”で
ある。免疫グロブリン類、IgA。
000−2X10’の範囲、通常10000−10”で
ある。免疫グロブリン類、IgA。
IgG−1gEおよびIrMの場合、分子機は一般に約
160000−約108の間で変化する。酵素は通常分
子量範囲的1000’O−1000000である。天然
レセプターは広範囲で変化し、一般に少なくとも分子量
約25000であり、108またはそれ以上の分子量で
もあり得、アビジン、DNA、RNA、チロキシン結合
グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランス
コルチン等のような物質を含む。
160000−約108の間で変化する。酵素は通常分
子量範囲的1000’O−1000000である。天然
レセプターは広範囲で変化し、一般に少なくとも分子量
約25000であり、108またはそれ以上の分子量で
もあり得、アビジン、DNA、RNA、チロキシン結合
グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、トランス
コルチン等のような物質を含む。
リガント類似体またはアナライト類似体・・・レセプタ
ーに対して類似のリガントまたはアナライトと競合し得
る修飾リガントまたはリガント代用物または修飾アナラ
イトまたはアナライト代用物であり、修飾はリガント類
似体またはアナライト類似体を他の分子に結合する手段
を供給するものである。リガント類似体またはアナライ
ト類似体は、通常、リガント類似体またはアナライト類
似体をハブ(hub)または標識に結びつける結合で1
個の水素を置換すること以外の点でリガントまたはアナ
ライトと異なっているが、これは必らずしも必要ではな
い。リガント代用物またはアナライト代用物の語は、リ
ガントまたはアナライトに対して相補的なレセプターに
特異的に結合する能力を有する化合物を意味する。すな
わち、リガント代用物およびアナライト代用物は、リガ
ントまたはアナライトと類似の仕方でレセプターと結合
ずろことができる。代用物(surrogate)は、
例えば、リガントまたはアナライトに対する抗体のイデ
ィオタイプを指向する抗体である。
ーに対して類似のリガントまたはアナライトと競合し得
る修飾リガントまたはリガント代用物または修飾アナラ
イトまたはアナライト代用物であり、修飾はリガント類
似体またはアナライト類似体を他の分子に結合する手段
を供給するものである。リガント類似体またはアナライ
ト類似体は、通常、リガント類似体またはアナライト類
似体をハブ(hub)または標識に結びつける結合で1
個の水素を置換すること以外の点でリガントまたはアナ
ライトと異なっているが、これは必らずしも必要ではな
い。リガント代用物またはアナライト代用物の語は、リ
ガントまたはアナライトに対して相補的なレセプターに
特異的に結合する能力を有する化合物を意味する。すな
わち、リガント代用物およびアナライト代用物は、リガ
ントまたはアナライトと類似の仕方でレセプターと結合
ずろことができる。代用物(surrogate)は、
例えば、リガントまたはアナライトに対する抗体のイデ
ィオタイプを指向する抗体である。
ポリ(リガント類似体)・・・通常ハブ(hub)核に
対して、互いに共有結合した複数個のリガント類似体で
ある。ハブ核は、多官能性物質で、普通ポリマー性であ
り、通常複数個の官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、
メルカプト、エチレン基等を結合部位として有する。ハ
ブ核は水溶性でも非水溶性でもよいが、水溶性が好まし
く、通常分子m9なくとも約30000であり、分子量
1000万またはそれ以上であり得る。ハブ核の例には
、多糖類、ポリペプチド(蛋白質を含む)、核酸、アニ
オン交換樹脂等が含まれる。非水溶性ノ\ブ核はまた、
容器壁(例えばガラスまたはプラスチック)、ガラスピ
ーズ、付加および綜合重合体、セファデックスおよびア
ガロースビーズ等を含むことができる。
対して、互いに共有結合した複数個のリガント類似体で
ある。ハブ核は、多官能性物質で、普通ポリマー性であ
り、通常複数個の官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、
メルカプト、エチレン基等を結合部位として有する。ハ
ブ核は水溶性でも非水溶性でもよいが、水溶性が好まし
く、通常分子m9なくとも約30000であり、分子量
1000万またはそれ以上であり得る。ハブ核の例には
、多糖類、ポリペプチド(蛋白質を含む)、核酸、アニ
オン交換樹脂等が含まれる。非水溶性ノ\ブ核はまた、
容器壁(例えばガラスまたはプラスチック)、ガラスピ
ーズ、付加および綜合重合体、セファデックスおよびア
ガロースビーズ等を含むことができる。
特異的結合対の構成員(rsbp構成員」)・・・他方
の分子と特異的に結合し、それ故に該分子に固有の空間
的および極性的構成と相補的であると規定される表面上
の区域またはくぼみを有する異なった二つの分子のうち
一つ。特異的結合対の要素はリガントと受容体(アンチ
リガント)として表すこ。
の分子と特異的に結合し、それ故に該分子に固有の空間
的および極性的構成と相補的であると規定される表面上
の区域またはくぼみを有する異なった二つの分子のうち
一つ。特異的結合対の要素はリガントと受容体(アンチ
リガント)として表すこ。
とができる。これらは通常、抗原−抗体のような免疫学
的対の要素である。なお、ビオチン−アビジン、ホルモ
ン−ホルモン受容体、核酸2本鎖分子、IgG−プロテ
ィンA、DNA−DNA、DNA−RNA等のような他
の特異的結合対の要素は免疫学的対ではないけれども発
明に含まれる。
的対の要素である。なお、ビオチン−アビジン、ホルモ
ン−ホルモン受容体、核酸2本鎖分子、IgG−プロテ
ィンA、DNA−DNA、DNA−RNA等のような他
の特異的結合対の要素は免疫学的対ではないけれども発
明に含まれる。
リガント・・・レセプターが天然に存在し、もしくはこ
れを作成することができる任意の有機化合物。
れを作成することができる任意の有機化合物。
レセプター(「アンチリガント」)・・・ある分子ピッ
ク部位または決定部位を認識し得る任意の化合物または
組成物。具体的なレセプターの例を挙げれば、例えばチ
ロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Fab断片、レ
クチン類、核酸類等を挙げることができる。
ク部位または決定部位を認識し得る任意の化合物または
組成物。具体的なレセプターの例を挙げれば、例えばチ
ロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Fab断片、レ
クチン類、核酸類等を挙げることができる。
標識・・・標識は、シグナル発生系の構成員であり、s
bp成分とコンジュゲートしている。標識は、同位元素
であってもなくてもよいが、通常非同位元素であり、酵
素のような触媒、蛍光剤、染料または化学発光剤のよう
なりロモーゲン、放射性物質、粒子等である。
bp成分とコンジュゲートしている。標識は、同位元素
であってもなくてもよいが、通常非同位元素であり、酵
素のような触媒、蛍光剤、染料または化学発光剤のよう
なりロモーゲン、放射性物質、粒子等である。
シグナル発生系・・・シグナル発生系は1またはそれ以
上の構成要素を有し、少なくともその1要素は標識であ
る。シグナル発生系は、試料中のアナライトの存在また
はその量と比例した信号を発生ずる。シグナル発生系は
、測定し得る信号の発生に要するすべての試薬を含んで
いる。シグナル発生系の少なくとも一成分は、sbp構
成員の少なくとも一員と結合する。シグナル発生系の他
の光体化合物、hlt因子、阻害物質、スカベンジャー
、金属イオン、およびングナル発生物質の結合に必要な
特異的結合をする物質等を含むことができる。
上の構成要素を有し、少なくともその1要素は標識であ
る。シグナル発生系は、試料中のアナライトの存在また
はその量と比例した信号を発生ずる。シグナル発生系は
、測定し得る信号の発生に要するすべての試薬を含んで
いる。シグナル発生系の少なくとも一成分は、sbp構
成員の少なくとも一員と結合する。シグナル発生系の他
の光体化合物、hlt因子、阻害物質、スカベンジャー
、金属イオン、およびングナル発生物質の結合に必要な
特異的結合をする物質等を含むことができる。
また、シグナル発生系の他の要素は、補酵素、酵素生産
物と反応する物質、他の酵素および触媒等である。シグ
ナル発生系は、外的手段、好ましくは放射能、粒子の凝
集度の測定または電磁放射の使用のような手段により、
好ましくは視覚的な計測によって検出し得る信号を提供
する。多くの場合、シグナル発生系には発色性の基質お
よび酵素(発色性の基質は酵素反応によって紫外部また
は可視部領域の光を吸収する染料へと変換ずろ)、りん
、発蛍光剤または化学発光剤が含まれる。
物と反応する物質、他の酵素および触媒等である。シグ
ナル発生系は、外的手段、好ましくは放射能、粒子の凝
集度の測定または電磁放射の使用のような手段により、
好ましくは視覚的な計測によって検出し得る信号を提供
する。多くの場合、シグナル発生系には発色性の基質お
よび酵素(発色性の基質は酵素反応によって紫外部また
は可視部領域の光を吸収する染料へと変換ずろ)、りん
、発蛍光剤または化学発光剤が含まれる。
シグナル発生系は、少なくとも1個の触媒(通常、酵素
)と少なくとも1個の基質とを含むことができるが、ま
た2個またはそれ以上の酵素と複数個の基質とを含むこ
とができ、さらに!酵素の基質が他の酵素の生産物であ
ることから成る酵素の組合わせを含むことができる。シ
グナル発生系の作動により、試料中のポリオリゴヌクレ
オチド量と関係する検出可能な信号を提供する生産物を
生成することかできる。
)と少なくとも1個の基質とを含むことができるが、ま
た2個またはそれ以上の酵素と複数個の基質とを含むこ
とができ、さらに!酵素の基質が他の酵素の生産物であ
ることから成る酵素の組合わせを含むことができる。シ
グナル発生系の作動により、試料中のポリオリゴヌクレ
オチド量と関係する検出可能な信号を提供する生産物を
生成することかできる。
シグナル発生系に宵用な多数の酵素および補酵素が米国
特許第4275149号(第19〜23欄)および米国
特許第4318980号(第10〜14欄)に示されて
いる。多数の酵素の組合わ仕が米国特許第427514
9号(第23〜484111)に提供されており、該組
合わせはこの発明に利用し得ろことが判明した。
特許第4275149号(第19〜23欄)および米国
特許第4318980号(第10〜14欄)に示されて
いる。多数の酵素の組合わ仕が米国特許第427514
9号(第23〜484111)に提供されており、該組
合わせはこの発明に利用し得ろことが判明した。
とくに興味深いのは、過酸化水素の産生、および色素前
駆物質を酸化して色素に変える過酸化水素の利用を行う
酵素類である。特殊な組合わせとしては、過酸化水素を
利用して色素前駆物質を酸化する酵素、即ち、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、または
ミクロペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ類を
組合わせた糖類酸化酵素(例えばブドー糖酸化酵素およ
びガラクトース酸化酵素等)またはウリカーゼやキサン
ヂン酸化酵素のような複素環酸化酵素等を挙げることが
できる。その他の酵素の組合わせについては、前記した
特許に示されている。1個の酵素を標識として使用した
ときは、その他の酵素を組合わせて使用することができ
、そのような酵素としては加水分解酵素、転移酵素およ
び酸化還元酵素が使用され、好ましくはアルカリホスフ
ァターゼおよびβ−ガラクトシダーゼのような加水分解
酵素が使用される。別法として、蛍ルシフェラーゼおよ
び細菌ルシフェラーゼのような発光酵素類を使用するこ
とができる。
駆物質を酸化して色素に変える過酸化水素の利用を行う
酵素類である。特殊な組合わせとしては、過酸化水素を
利用して色素前駆物質を酸化する酵素、即ち、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、または
ミクロペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ類を
組合わせた糖類酸化酵素(例えばブドー糖酸化酵素およ
びガラクトース酸化酵素等)またはウリカーゼやキサン
ヂン酸化酵素のような複素環酸化酵素等を挙げることが
できる。その他の酵素の組合わせについては、前記した
特許に示されている。1個の酵素を標識として使用した
ときは、その他の酵素を組合わせて使用することができ
、そのような酵素としては加水分解酵素、転移酵素およ
び酸化還元酵素が使用され、好ましくはアルカリホスフ
ァターゼおよびβ−ガラクトシダーゼのような加水分解
酵素が使用される。別法として、蛍ルシフェラーゼおよ
び細菌ルシフェラーゼのような発光酵素類を使用するこ
とができる。
使用可能な補酵素類を例示すれば、NAD CH)、N
ADP [:1−1〕、ピリドキサール燐酸、FAD(
H) 、FNM (1−1〕等を挙げることができる。
ADP [:1−1〕、ピリドキサール燐酸、FAD(
H) 、FNM (1−1〕等を挙げることができる。
通常、代謝回転に含まれる補酵素であれば使用すること
ができる(とくに、米国特許第4318980号を参照
)。
ができる(とくに、米国特許第4318980号を参照
)。
酵素反応の生産物は、通常、染料または蛍光剤である。
多数の蛍光剤の例が米国特許第4275149号に提供
されている(第30〜31欄)。
されている(第30〜31欄)。
補助材料・・・・この発明による測定には、多くの補助
材料がよく使用される。例えば、バッファーは普通に媒
質に使用されるし、また測定媒質および測定成分の安定
剤も普通に使用される。これらの添加剤のほかに、アル
ブミンのような別の蛋白質、界面活性剤、とくに非イオ
ン界面活性剤、結合促進剤(例えばポリアルキレングリ
コール)等が用いられる。
材料がよく使用される。例えば、バッファーは普通に媒
質に使用されるし、また測定媒質および測定成分の安定
剤も普通に使用される。これらの添加剤のほかに、アル
ブミンのような別の蛋白質、界面活性剤、とくに非イオ
ン界面活性剤、結合促進剤(例えばポリアルキレングリ
コール)等が用いられる。
sbp成分を可逆的に封じ込める材料・・・sbp成分
を一時的に封じ込めることにより封じ込められたsbp
成分がそれに相補的なsbp成分と結合するのを防ぐこ
とができる材料ならどれでも使用することができろ。例
えば、sbp成分が互いに接近するのを阻止すれば結合
を防ぐことができる。封じ込みは可逆的でなければなら
ない。材料は普通細かく分割されているため液体媒質に
けん濁され得、封じ込められたsbp成分を急速に放出
させることができる。粒子は球形または不規則な形状で
あり得、普通10ni〜500μ、さらに一般的には2
0nm〜2μ、多くの場合1100n〜!μの平均直径
を有する。材料は液体媒質と化学反応を起こさず不溶性
であり、通常は水性緩衝液であり、そして混和しない、
液体、液晶、固体、ゲルなどから成る。
を一時的に封じ込めることにより封じ込められたsbp
成分がそれに相補的なsbp成分と結合するのを防ぐこ
とができる材料ならどれでも使用することができろ。例
えば、sbp成分が互いに接近するのを阻止すれば結合
を防ぐことができる。封じ込みは可逆的でなければなら
ない。材料は普通細かく分割されているため液体媒質に
けん濁され得、封じ込められたsbp成分を急速に放出
させることができる。粒子は球形または不規則な形状で
あり得、普通10ni〜500μ、さらに一般的には2
0nm〜2μ、多くの場合1100n〜!μの平均直径
を有する。材料は液体媒質と化学反応を起こさず不溶性
であり、通常は水性緩衝液であり、そして混和しない、
液体、液晶、固体、ゲルなどから成る。
ただし「混和しない」は、封じ込められたsbp成分の
貯蔵条件下では混和しないが、測定条件下では必ずしも
そうでないらのてする。材料の例には、リボソーム、人
工細胞、小胞、ゲル例えばゼラチンおよびアガロース、
天然細胞膜例えば赤血球ゴースト、ポリマー化ビーズな
どがある。
貯蔵条件下では混和しないが、測定条件下では必ずしも
そうでないらのてする。材料の例には、リボソーム、人
工細胞、小胞、ゲル例えばゼラチンおよびアガロース、
天然細胞膜例えば赤血球ゴースト、ポリマー化ビーズな
どがある。
リボソームは、はぼ球形の微小胞である。リボソームの
外殻は、ある容量の水または水溶液を内包するリン脂質
二重層(2分子層)で構成される。
外殻は、ある容量の水または水溶液を内包するリン脂質
二重層(2分子層)で構成される。
複数の二重層を有するリボソームはマルチラメラ小胞と
呼ばれる。単一の二重層を宵するリボソームはユニラメ
ラ小胞と呼ばれる。二重層は、相捕的sbpの拡散に対
する不浸透性障壁としての役割を果たす。二重層のリン
脂質は、全体的または部分的に通常荷電状態の極性頭部
基および普通2個またはそれ以上の炭化水素直鎖からな
る疎水性部分を有する他の両親媒性(amphiphy
lic)化合物と置き換えることができる。リン脂質代
用物の例には、ジセチルホスフエート、ジアルコキシプ
ロピル71;スフエート類(ただし、アルキル基は12
〜20個の炭素原子から成る直鎖を汀する)、N−(2
,3−ジー(9−(Z)−オクタデセニルオキシ))−
プロパー1−イル−N、N、N−トリメチルアンモニウ
ムクロリド、スフィンゴミエリン、カルシオリピンなど
がある。
呼ばれる。単一の二重層を宵するリボソームはユニラメ
ラ小胞と呼ばれる。二重層は、相捕的sbpの拡散に対
する不浸透性障壁としての役割を果たす。二重層のリン
脂質は、全体的または部分的に通常荷電状態の極性頭部
基および普通2個またはそれ以上の炭化水素直鎖からな
る疎水性部分を有する他の両親媒性(amphiphy
lic)化合物と置き換えることができる。リン脂質代
用物の例には、ジセチルホスフエート、ジアルコキシプ
ロピル71;スフエート類(ただし、アルキル基は12
〜20個の炭素原子から成る直鎖を汀する)、N−(2
,3−ジー(9−(Z)−オクタデセニルオキシ))−
プロパー1−イル−N、N、N−トリメチルアンモニウ
ムクロリド、スフィンゴミエリン、カルシオリピンなど
がある。
この発明で用いられるリボソームは、sbp成分を収容
することができなければならない。一般的に、リボソー
ムは少なくとも約20nm〜2μ、普通的100100
nμ、好ましくは約200〜600nmである。好まし
いリボソームは、同じ大きさのもので容易に分散して非
常にゆっくりと沈殿する均一なけん濁液をもたらし、実
質量のsbp成分の封入または均一な残存に充分な大き
さのものである。過去の方法と対比すると、この発明の
リボソームは、脂質小胞の外部表面にsbp成分が実質
的に存在しないように形成される。
することができなければならない。一般的に、リボソー
ムは少なくとも約20nm〜2μ、普通的100100
nμ、好ましくは約200〜600nmである。好まし
いリボソームは、同じ大きさのもので容易に分散して非
常にゆっくりと沈殿する均一なけん濁液をもたらし、実
質量のsbp成分の封入または均一な残存に充分な大き
さのものである。過去の方法と対比すると、この発明の
リボソームは、脂質小胞の外部表面にsbp成分が実質
的に存在しないように形成される。
リボソームは、水溶液中における乾燥リン脂質またはリ
ン脂質代用物の水和および機緘的分散により製造され得
る。こうして製造されたリボソームは様々な寸法、組成
および性質を有する。機械的に分散されたリボソームの
不均一性および不調和性を低減する方法は音波処理によ
るものである。
ン脂質代用物の水和および機緘的分散により製造され得
る。こうして製造されたリボソームは様々な寸法、組成
および性質を有する。機械的に分散されたリボソームの
不均一性および不調和性を低減する方法は音波処理によ
るものである。
そのような方法は平均リボソームサイズを減少させる。
別法として、リボソーム製造中最終段階として押し出し
法を用いることができる。米国特許第4529561号
は、リボソームに圧力を加えて一律孔サイズの膜から押
し出すことによりサイズの均一性を改良する方法を開示
している。
法を用いることができる。米国特許第4529561号
は、リボソームに圧力を加えて一律孔サイズの膜から押
し出すことによりサイズの均一性を改良する方法を開示
している。
この発明のリン脂質は、レシチンを含む天然の膜に見出
されるリン脂質もしくはリン脂質混合物、またはモノエ
ステルとしてリン酸エステルが存在し得る飽和もしくは
不飽和の12−炭素もしくは24−炭素直鎖脂肪酸の合
成グリセリルリン酸、ジエステル酸、または極性アルコ
ール例えばエタノールアミン、コリン、イノシトール、
セリン、グリセリンなどのエステルとして存在し得る。
されるリン脂質もしくはリン脂質混合物、またはモノエ
ステルとしてリン酸エステルが存在し得る飽和もしくは
不飽和の12−炭素もしくは24−炭素直鎖脂肪酸の合
成グリセリルリン酸、ジエステル酸、または極性アルコ
ール例えばエタノールアミン、コリン、イノシトール、
セリン、グリセリンなどのエステルとして存在し得る。
特に好ましいリン脂質には、L−α−パルミトイルオレ
オイルホエファチジルコリン(POPC)、バルミトイ
ルオレオイルホスファチジルグリセリン(POPG)、
L−α−ジオしオイルホスファチジルグリセリンおよび
L−α−(ジオレオイル)−ホスファチジルエタノール
アミンがある。
オイルホエファチジルコリン(POPC)、バルミトイ
ルオレオイルホスファチジルグリセリン(POPG)、
L−α−ジオしオイルホスファチジルグリセリンおよび
L−α−(ジオレオイル)−ホスファチジルエタノール
アミンがある。
またリボソームは、コレステロールおよびその誘導体お
よび様々な両親媒性化合物を二重層に含み得ろ。
よび様々な両親媒性化合物を二重層に含み得ろ。
この発明による好ましいリボソームの例は、20206
5〜97重量%、POP03〜30重塁%およびコ重塁
子ロール0〜30重量%で構成されたものである。特に
好ましい具体例の場合、リボソームの組成はPOP06
7〜76%、POP03〜4%およびコレステロール2
0〜30%である。
5〜97重量%、POP03〜30重塁%およびコ重塁
子ロール0〜30重量%で構成されたものである。特に
好ましい具体例の場合、リボソームの組成はPOP06
7〜76%、POP03〜4%およびコレステロール2
0〜30%である。
前述のように、リボソームは様々な方法で製造され得る
。方法の一例は、クロロホルム溶液にリン脂質を合わせ
、次いで窒素気流下クロロホルムを除去するものである
。残存する痕跡量の溶媒は例えば高度減圧により除去さ
れ得る。次いでリン脂質を凍結可能な溶媒例えばt−ブ
タノールまたはシクロヘキサンにゆっくり混合しながら
溶かし、次いて溶液を凍結乾燥する。sbp成分の封入
に使用するまで生成した粉末を乾燥および冷却状態に保
つ。
。方法の一例は、クロロホルム溶液にリン脂質を合わせ
、次いで窒素気流下クロロホルムを除去するものである
。残存する痕跡量の溶媒は例えば高度減圧により除去さ
れ得る。次いでリン脂質を凍結可能な溶媒例えばt−ブ
タノールまたはシクロヘキサンにゆっくり混合しながら
溶かし、次いて溶液を凍結乾燥する。sbp成分の封入
に使用するまで生成した粉末を乾燥および冷却状態に保
つ。
封入されるべき材料を緩衝液に溶かす。緩衝液の例には
、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩
衝液、バルピタール緩衝液などがある。この発明の場合
、使用される特定の緩衝液は厳密ではないが、個々の封
入においである緩衝液が別の緩衝液より好ましいことは
あり得る。
、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩
衝液、バルピタール緩衝液などがある。この発明の場合
、使用される特定の緩衝液は厳密ではないが、個々の封
入においである緩衝液が別の緩衝液より好ましいことは
あり得る。
リボソームけん濁液は、脂質粉末を封入されるべき材料
と混合することにより製造され得る。次いでけん濁液を
緩衝液で希釈し、徐々に孔を小さくした一連のフィルタ
ーにより濾過する。例えば、1.0μ、0.6μ、0.
4μおよび0.2μ。フィルターのいずれか1つおよび
特に孔が最小のフィルターにより繰返し濾過するのが望
ましい。リボソームは例えばセファクリル(Sepha
cryl)S −1000のカラムによるゲル濾過によ
り精製され得る。カラムを緩衝液で溶離し、リボソーム
を集めることができる。
と混合することにより製造され得る。次いでけん濁液を
緩衝液で希釈し、徐々に孔を小さくした一連のフィルタ
ーにより濾過する。例えば、1.0μ、0.6μ、0.
4μおよび0.2μ。フィルターのいずれか1つおよび
特に孔が最小のフィルターにより繰返し濾過するのが望
ましい。リボソームは例えばセファクリル(Sepha
cryl)S −1000のカラムによるゲル濾過によ
り精製され得る。カラムを緩衝液で溶離し、リボソーム
を集めることができる。
好ましい具体例において、可逆的に封じ込められたsb
p成分の少なくとも1つをシグナル発生系の−Ωと結合
させろ。そのような場合、可逆的に封し込められた成分
は例えば酵素およびハプテンのコンジュゲートであり得
、相補的成分は、これらまた、可逆的に封じ込められ得
ろかまたは遊離し得るが、例えばハプテンに対する抗体
であり得、そして封じ込める材料は例えばリボソームで
あり得る。封じ込められた物質が酵素およびハプテンの
コンジュゲートであるそれらの場合において、封入され
た物質は所望により酵素に対する安定剤を含14 L得
る。酵素を封入する一利点は、別法として安定剤が測定
遂行に不利な影響を与え得るバルク(bulk)溶液に
おいて行なう場合よりかなり高濃度で安定剤が封入され
た物質に含まれ得ることである。すなわら、封入するこ
とにより、バルク溶液の組成に関して例えば粘稠度、イ
オン強度、p Hおよび酵素阻害剤濃度の限界が存在す
る場合にバルク溶液の場合より大きな酵素安定性を達成
する機会がもたらされる。
p成分の少なくとも1つをシグナル発生系の−Ωと結合
させろ。そのような場合、可逆的に封し込められた成分
は例えば酵素およびハプテンのコンジュゲートであり得
、相補的成分は、これらまた、可逆的に封じ込められ得
ろかまたは遊離し得るが、例えばハプテンに対する抗体
であり得、そして封じ込める材料は例えばリボソームで
あり得る。封じ込められた物質が酵素およびハプテンの
コンジュゲートであるそれらの場合において、封入され
た物質は所望により酵素に対する安定剤を含14 L得
る。酵素を封入する一利点は、別法として安定剤が測定
遂行に不利な影響を与え得るバルク(bulk)溶液に
おいて行なう場合よりかなり高濃度で安定剤が封入され
た物質に含まれ得ることである。すなわら、封入するこ
とにより、バルク溶液の組成に関して例えば粘稠度、イ
オン強度、p Hおよび酵素阻害剤濃度の限界が存在す
る場合にバルク溶液の場合より大きな酵素安定性を達成
する機会がもたらされる。
別法として、可逆的に封じ込められた成分は非標識sb
p成分、例えば抗体であり得、モして相補的成分は標識
例えば酵素およびsbp成分例えばハプテンのコンジュ
ゲートであり得る。
p成分、例えば抗体であり得、モして相補的成分は標識
例えば酵素およびsbp成分例えばハプテンのコンジュ
ゲートであり得る。
sbp成分を可逆的に封じ込める材料が赤血球ゴースト
である場合、sbp成分は例えば[メソッド・イン・エ
ンザイモロジーJ(Method in Enzymo
l。
である場合、sbp成分は例えば[メソッド・イン・エ
ンザイモロジーJ(Method in Enzymo
l。
gy)第31巻、フライシェルおよびパッカー編、17
2〜」80頁、アカデミツク・プレス(1974年)に
記載された公知技術にしたがい細胞中に封入され得る。
2〜」80頁、アカデミツク・プレス(1974年)に
記載された公知技術にしたがい細胞中に封入され得る。
またこの発明の範囲には、封じ込められたsbp成分が
同じ液体媒質に存在する場合1個より多いsbp成分を
可逆的に封じ込めることも含まれる。
同じ液体媒質に存在する場合1個より多いsbp成分を
可逆的に封じ込めることも含まれる。
封じ込み解除手段・・・sbp成分が可逆的に封じ込ま
れるとは、それを相補的sbpと同じ液体培地中に貯蔵
する場合の条件下ではこれら2つのsbp成分は反応で
きないが、封じ込みを解除する手段を加えることにより
sbp成分はそれに相補的なsbp成的に妨害しない条
件で一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込みを解
除することができる天然らしくは合成、有機らしくは無
機の化学的化合物、組成物もしくは材料、または物理的
手段またはそれらの組み合わけ、または酵素方法または
溶菌蛋白質材料はいずれら用いられ得る。封じ込み解除
手段は、可逆的にsbp成分を封じ込めるのに使用され
た材料により異なる。
れるとは、それを相補的sbpと同じ液体培地中に貯蔵
する場合の条件下ではこれら2つのsbp成分は反応で
きないが、封じ込みを解除する手段を加えることにより
sbp成分はそれに相補的なsbp成的に妨害しない条
件で一時的に封じ込められたsbp成分の封じ込みを解
除することができる天然らしくは合成、有機らしくは無
機の化学的化合物、組成物もしくは材料、または物理的
手段またはそれらの組み合わけ、または酵素方法または
溶菌蛋白質材料はいずれら用いられ得る。封じ込み解除
手段は、可逆的にsbp成分を封じ込めるのに使用され
た材料により異なる。
リボソームおよび細胞膜内の封じ込みを解除する化学的
化合物、組成物または材料の例には、トリトン(TRI
TON)、デオキシコール酸ナトリウム、オクヂルグル
コシド、ドデシル硫酸ナトリウムなどを含むデタージエ
ントがある。リン脂質リボソームおよび細胞膜による封
じ込みは、ポリペプチド類例えばメリチン、酵素類例え
ばホスホリパーゼ、多電荷金属イオン例えばCu″″+
およびMg″“により解除され得る。細胞膜は浸透圧シ
ョックにより中身を放出する。リボソーム、細胞膜およ
びゲルは音波処理によるかまたは温度変化、普通は加執
lこ、ヒり巾B−桑故出1−71 /′l−アルギン酸
カルシウムはEDTAのようにカルシウムイオンをキレ
ート化する薬剤により溶解されるゲルを形成する。前記
の材料およびそれらの製法または単離は当技術分野にお
いてよく知られており、多くは市販されている。
化合物、組成物または材料の例には、トリトン(TRI
TON)、デオキシコール酸ナトリウム、オクヂルグル
コシド、ドデシル硫酸ナトリウムなどを含むデタージエ
ントがある。リン脂質リボソームおよび細胞膜による封
じ込みは、ポリペプチド類例えばメリチン、酵素類例え
ばホスホリパーゼ、多電荷金属イオン例えばCu″″+
およびMg″“により解除され得る。細胞膜は浸透圧シ
ョックにより中身を放出する。リボソーム、細胞膜およ
びゲルは音波処理によるかまたは温度変化、普通は加執
lこ、ヒり巾B−桑故出1−71 /′l−アルギン酸
カルシウムはEDTAのようにカルシウムイオンをキレ
ート化する薬剤により溶解されるゲルを形成する。前記
の材料およびそれらの製法または単離は当技術分野にお
いてよく知られており、多くは市販されている。
封じ込みを解除する物理的手段の例には、凍結および解
凍を含む温度変化、音波処理および浸透圧ショックがあ
る。
凍を含む温度変化、音波処理および浸透圧ショックがあ
る。
既に述べたように、この発明は単一液体試薬およびその
測定における用途を包含する。測定はホモジニアスまた
はヘテロノニアスであり得、触媒性、発色性、放射性な
どである標識を用い得る。
測定における用途を包含する。測定はホモジニアスまた
はヘテロノニアスであり得、触媒性、発色性、放射性な
どである標識を用い得る。
この発明の単一液体試薬は米国特許第3817837号
に記載された方法に有用である。この試薬を使用できる
他の方法には、マジオによる[エンザイム・イムノアッ
セイJ(E nzyme−1mmunoassay)シ
ー・アール・シー・プレス社、ポカ・レイトン・フロツ
ク(1980年)並びに米国特許第3690834号、
第3791932号、第3850578号、第3853
987号、第3867517号、第3901654号、
第3935074号、第3984533号、第3996
345号および第4098876号に記載された方法が
あるが、これらは例を示したのであり限定しているので
はない。
に記載された方法に有用である。この試薬を使用できる
他の方法には、マジオによる[エンザイム・イムノアッ
セイJ(E nzyme−1mmunoassay)シ
ー・アール・シー・プレス社、ポカ・レイトン・フロツ
ク(1980年)並びに米国特許第3690834号、
第3791932号、第3850578号、第3853
987号、第3867517号、第3901654号、
第3935074号、第3984533号、第3996
345号および第4098876号に記載された方法が
あるが、これらは例を示したのであり限定しているので
はない。
この発明の方法は総じて、アナライトの含有が疑われる
試料を(1)sbp成分をそれに相補的なsbp成分と
一時的に結合不可能にする材料に可逆的に封じ込まれた
少なくとも1つのsbp成分および(2)相補的sbp
成分を含む単一液体培地と合イつせることを含む。sb
p成分の少なくとも1つはシグナル発生系の一員と結合
している。可逆的1ど封じ込まれた物質は例えば酵素−
薬剤コンジュゲートのような標識されたsbp成分であ
ることが多い。そのような場合、封じ込まれていないs
bp成分は例えば薬剤に対する抗体のように相捕的sb
p成分である。可逆的に封じ込まれたsbp成分を封入
ずろ物質か透過を妨げるため、相補的sbp成分は封じ
込まれた成分と反応することはできない。
試料を(1)sbp成分をそれに相補的なsbp成分と
一時的に結合不可能にする材料に可逆的に封じ込まれた
少なくとも1つのsbp成分および(2)相補的sbp
成分を含む単一液体培地と合イつせることを含む。sb
p成分の少なくとも1つはシグナル発生系の一員と結合
している。可逆的1ど封じ込まれた物質は例えば酵素−
薬剤コンジュゲートのような標識されたsbp成分であ
ることが多い。そのような場合、封じ込まれていないs
bp成分は例えば薬剤に対する抗体のように相捕的sb
p成分である。可逆的に封じ込まれたsbp成分を封入
ずろ物質か透過を妨げるため、相補的sbp成分は封じ
込まれた成分と反応することはできない。
この測定方法を実施するには、アナライトの含有が疑わ
れる試料の予定された量を測定する。試料の量は一般に
アナライトに関して正確で高感度の測定結果を与えるべ
く選ばれる。一般的に、生理学的液体中の多くの薬剤の
容量は、約1.0〜500μQ、通常約5〜100μg
の範囲である。
れる試料の予定された量を測定する。試料の量は一般に
アナライトに関して正確で高感度の測定結果を与えるべ
く選ばれる。一般的に、生理学的液体中の多くの薬剤の
容量は、約1.0〜500μQ、通常約5〜100μg
の範囲である。
試料の性質および最初の容量次第で、試料は適当な容量
の蒸留水または脱イオン水または緩衝液により希釈され
得る。通常、試料をこの発明の液体試薬組成物と合わせ
、続いて封じ込み解除手段を与える。用いられる液体試
薬の量は、試料成分からの非特異的妨害を避けるのに必
要な試料の希釈量、アナライトの濃度範囲および考慮す
べき要因、例えば正確な液体測定および分光光度計によ
る測定における最適容量により異なる。普通、液体試薬
の量は5μQ〜3 mQ、多くの場合25μQ−1mQ
である。合わせたものの最終容量は、約5μe〜3 m
Q、普通的50〜500μQである。重連のように、シ
グナル発生系の少なくとも一成分はsbp成分の1つと
結合している。この方法の場合、培に含み得るが、これ
らは最初封じ込まれた物質とは離れて存在するかまたは
その内部に存在するかまたはその両方の場合であり得る
。シグナル発生系の様々な成分の濃度は興味の対象であ
るアナライトの濃度範囲により変化する。
の蒸留水または脱イオン水または緩衝液により希釈され
得る。通常、試料をこの発明の液体試薬組成物と合わせ
、続いて封じ込み解除手段を与える。用いられる液体試
薬の量は、試料成分からの非特異的妨害を避けるのに必
要な試料の希釈量、アナライトの濃度範囲および考慮す
べき要因、例えば正確な液体測定および分光光度計によ
る測定における最適容量により異なる。普通、液体試薬
の量は5μQ〜3 mQ、多くの場合25μQ−1mQ
である。合わせたものの最終容量は、約5μe〜3 m
Q、普通的50〜500μQである。重連のように、シ
グナル発生系の少なくとも一成分はsbp成分の1つと
結合している。この方法の場合、培に含み得るが、これ
らは最初封じ込まれた物質とは離れて存在するかまたは
その内部に存在するかまたはその両方の場合であり得る
。シグナル発生系の様々な成分の濃度は興味の対象であ
るアナライトの濃度範囲により変化する。
使用される封じ込み解除手段の量は、sbp成分を可逆
的に封じ込める材料の性質および量、放出手段の性質お
よび所望の放出速度により異なる。
的に封じ込める材料の性質および量、放出手段の性質お
よび所望の放出速度により異なる。
化学的放出剤またはそれらの組合わせを用いる場合、薬
剤(単数または複数)の濃度は所望の時間内で封じ込ま
れたsbp成分の実質的または完全な放出をもたらすの
に充分なものでなくてはならない。
剤(単数または複数)の濃度は所望の時間内で封じ込ま
れたsbp成分の実質的または完全な放出をもたらすの
に充分なものでなくてはならない。
一般に、5分未満、好ましくは1分未満、さらに好まし
くは15秒未満で完全に放出させるのが好都合である。
くは15秒未満で完全に放出させるのが好都合である。
多くの場合、本質的に封じ込み解除手段を与えた瞬間放
出か起こる。
出か起こる。
封じ込み解除手段としてデタージェントを使用する場合
、デタージェントのmおよび組成は、経験的に、放出さ
れるsbp成分の量を最大限とし、たは蛋白質試薬を用
いる場合、これらの試薬のコストおよび有用性はこれら
の試薬をどの程度使用できるかを決定する際の重要な要
素である。一般に、使用される前記試薬が多くなると、
放出プロセスら速く完全になる。これらおよび他の封じ
込み解除手段を用いる場合、試薬の量(化学的手段の場
合)およびプロセスの大きさく物理的手段の場合)に関
して、測定要素または測定結果に対する不利な影響を避
けるために制限を設ける必要がある。sbp成分を封入
状態から放出後sbp成分およびそれに相補的な成分に
対する損傷を最小限にするかまたは避けるために対人材
料およびsbp成分の性質に応じて放出剤(単数または
複数)を選択することが重要である。
、デタージェントのmおよび組成は、経験的に、放出さ
れるsbp成分の量を最大限とし、たは蛋白質試薬を用
いる場合、これらの試薬のコストおよび有用性はこれら
の試薬をどの程度使用できるかを決定する際の重要な要
素である。一般に、使用される前記試薬が多くなると、
放出プロセスら速く完全になる。これらおよび他の封じ
込み解除手段を用いる場合、試薬の量(化学的手段の場
合)およびプロセスの大きさく物理的手段の場合)に関
して、測定要素または測定結果に対する不利な影響を避
けるために制限を設ける必要がある。sbp成分を封入
状態から放出後sbp成分およびそれに相補的な成分に
対する損傷を最小限にするかまたは避けるために対人材
料およびsbp成分の性質に応じて放出剤(単数または
複数)を選択することが重要である。
アナライトを含有する試料を液体媒質と合わせ、封じ込
まれたsbp成分の封じ込み解除手段を与えた後、結合
が生じるのに充分な時間液体媒質を放置する。通常、こ
の時間は少なくとも約5秒〜約30分およびさらに一般
的には約10秒〜5分を要する。次に、検出可能なシグ
ナルの初回読み取りを行なう。通常、混合の約30秒〜
60分後さらに(vi回の)読み取りを行なう。
まれたsbp成分の封じ込み解除手段を与えた後、結合
が生じるのに充分な時間液体媒質を放置する。通常、こ
の時間は少なくとも約5秒〜約30分およびさらに一般
的には約10秒〜5分を要する。次に、検出可能なシグ
ナルの初回読み取りを行なう。通常、混合の約30秒〜
60分後さらに(vi回の)読み取りを行なう。
通常この方法を行なう場合の温度は中温であり、普通こ
の方法を行なっている間は温度を一定に保つ。一般的に
、この方法における温度は、約0〜50℃、さらに普通
は約15〜40℃の範囲である。sbp成分の封入解除
後には、sbp成分およびそれに相F+Ii的なsbp
成分の結合を促す温度が選ばれる。また、一般に測定を
行なう場合の温度は中温であり、普通一定温度を保つ。
の方法を行なっている間は温度を一定に保つ。一般的に
、この方法における温度は、約0〜50℃、さらに普通
は約15〜40℃の範囲である。sbp成分の封入解除
後には、sbp成分およびそれに相F+Ii的なsbp
成分の結合を促す温度が選ばれる。また、一般に測定を
行なう場合の温度は中温であり、普通一定温度を保つ。
一般に測定温度は約lO〜50°C1さらに普通は15
〜40℃の範囲である。
〜40℃の範囲である。
この方法を行なう場合、媒質のpHは普通的5〜10、
および好ましくは約6〜9の範囲である。
および好ましくは約6〜9の範囲である。
pHは、封じ込みの逆転を防ぎ、試薬の安定性を制御し
、貯蔵中の望ましくない反応を防ぐように選択される。
、貯蔵中の望ましくない反応を防ぐように選択される。
媒質のpHが測定の実施に適していない場合、解除手段
を加える前またはそれと同時に適当な緩衝液を媒質に加
えて測定に適したpHに調節する。様々な緩衝液を用い
ることにより所望のpHを達成し、測定中モのpHを維
持することができる。この発明の場合使用される特定の
緩衝液は厳密ではないが、個々の測定において、ある緩
衝液が別の緩衝液よりも好ましいことはあり得る。緩衝
液の例には、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液
、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液などがある。
を加える前またはそれと同時に適当な緩衝液を媒質に加
えて測定に適したpHに調節する。様々な緩衝液を用い
ることにより所望のpHを達成し、測定中モのpHを維
持することができる。この発明の場合使用される特定の
緩衝液は厳密ではないが、個々の測定において、ある緩
衝液が別の緩衝液よりも好ましいことはあり得る。緩衝
液の例には、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液
、トリス緩衝液、バルビタール緩衝液などがある。
アナライトの測定を行なうのに加えて、通常1種または
それ以上の検量線による測定を行なうのが望ましく、そ
の際様々な濃度において単一の値または複数の値を得、
アナライト濃度対観察値をグラフに示すことにより標準
曲線が得られる。検量線およびアナライト測定が実質的
に類似の周囲条件下で行なわれている限り、特別の温度
制御は要求されない。
それ以上の検量線による測定を行なうのが望ましく、そ
の際様々な濃度において単一の値または複数の値を得、
アナライト濃度対観察値をグラフに示すことにより標準
曲線が得られる。検量線およびアナライト測定が実質的
に類似の周囲条件下で行なわれている限り、特別の温度
制御は要求されない。
この方法は、sbp成分およびそれに相補的な成分の両
方を含有し、そのうち少なくとも1つがシグナル発生系
と結合している単一液体試料を供給する手段を提供する
ことによるオートメーション化された測定方法に特に有
利である。この発明により、測定を行なう前に別々の試
薬を測mおよび混合して正確な比率にしたり、固体試薬
を再構成することが不必要となった。
方を含有し、そのうち少なくとも1つがシグナル発生系
と結合している単一液体試料を供給する手段を提供する
ことによるオートメーション化された測定方法に特に有
利である。この発明により、測定を行なう前に別々の試
薬を測mおよび混合して正確な比率にしたり、固体試薬
を再構成することが不必要となった。
この発明の単一液体試薬を用いた測定実施方法の例が米
国特許第3817837号に開示されている。可逆的に
封じ込まれた物質は酵素−ハプテンコンジュゲート、例
えばグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−テオフ
ィリンであり得る。
国特許第3817837号に開示されている。可逆的に
封じ込まれた物質は酵素−ハプテンコンジュゲート、例
えばグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−テオフ
ィリンであり得る。
相補的成分は、非封入状態であり、アナライトに対する
抗体、例えば抗テオフィリンであり得、そして対人材料
はリボソームであり得る。単一製剤およびアナライトを
合わせる。
抗体、例えば抗テオフィリンであり得、そして対人材料
はリボソームであり得る。単一製剤およびアナライトを
合わせる。
そのような方法において、測定プロトコルは酵素コンツ
ユゲートの封じ込みを解除する手段を用いろことにより
開始される。すなわち、デタージェント例えばトリトン
(TR[TON)X−100またはデオキシコール酸ナ
トリウム、またはポリペプチド、例えばメリチンが液体
媒質に加えられ得る。別法として、物理的手段、例えば
温度変化、音波処理または浸透圧ショックが使用され得
る。
ユゲートの封じ込みを解除する手段を用いろことにより
開始される。すなわち、デタージェント例えばトリトン
(TR[TON)X−100またはデオキシコール酸ナ
トリウム、またはポリペプチド、例えばメリチンが液体
媒質に加えられ得る。別法として、物理的手段、例えば
温度変化、音波処理または浸透圧ショックが使用され得
る。
リボソームに封入された酵素−ハプテンコンジュゲート
および抗体を含有する単一液体製剤の一時的な封じ込み
を解除し、そしてこれに加えるシグナル発生系試薬、例
えば酵素基質があればこれらを加えた後、測定媒質の酵
素活性を測定し、媒質におけるアナライト濃度との関連
を調べる。酵素−ハプテンコンジュゲートおよびアナラ
イトは抗体に対し拮抗する。酵素−ハプテンコンジュゲ
ートが抗体と結合すると酵素活性は変化、すなわち゛普
通は低減または抑制されるため、溶液の酵素活性は測定
媒質中に存在するアナライトの量に直接関係する。好ま
しくは、酵素および酵素基質は、基質または最終生成物
が紫外線または可視領域らしくは蛍光剤の光を吸収する
ように選択されろ。
および抗体を含有する単一液体製剤の一時的な封じ込み
を解除し、そしてこれに加えるシグナル発生系試薬、例
えば酵素基質があればこれらを加えた後、測定媒質の酵
素活性を測定し、媒質におけるアナライト濃度との関連
を調べる。酵素−ハプテンコンジュゲートおよびアナラ
イトは抗体に対し拮抗する。酵素−ハプテンコンジュゲ
ートが抗体と結合すると酵素活性は変化、すなわち゛普
通は低減または抑制されるため、溶液の酵素活性は測定
媒質中に存在するアナライトの量に直接関係する。好ま
しくは、酵素および酵素基質は、基質または最終生成物
が紫外線または可視領域らしくは蛍光剤の光を吸収する
ように選択されろ。
したがって、アナライト含有水溶液中でこの発明の単一
試験用液体試薬の封じ込みを解除すると、光の吸収また
は放射を測定することによりアナライト濃度を測定する
ことができる。
試験用液体試薬の封じ込みを解除すると、光の吸収また
は放射を測定することによりアナライト濃度を測定する
ことができる。
さらにこの発明は、液体媒質中に(a)sbp成分をそ
れに相補的なsbp成分と一時的に結合不可能にずろ材
料中に可逆的に封じ込まれた少なくとも1つのsbp成
分および(b)相補的sbp成分を含有する組成物を含
む。sbp成分の少なくとも1つはシグナル発生系の一
員と結合している。好ましい具体例において、可逆的に
封じ込まれたsbp成分の少なくとも1つがシグナル発
生系の少なくとも1つの成分と結合している。別法とし
て、相補的sbp成分がシグナル発生系の一員と結合し
得る。
れに相補的なsbp成分と一時的に結合不可能にずろ材
料中に可逆的に封じ込まれた少なくとも1つのsbp成
分および(b)相補的sbp成分を含有する組成物を含
む。sbp成分の少なくとも1つはシグナル発生系の一
員と結合している。好ましい具体例において、可逆的に
封じ込まれたsbp成分の少なくとも1つがシグナル発
生系の少なくとも1つの成分と結合している。別法とし
て、相補的sbp成分がシグナル発生系の一員と結合し
得る。
対人材料の組成は広範に変化し得る。好ましくは対人材
料はリボソームである。リボソームの成分は好ましくは
レシチンを含有する天然膜に見出されるリン脂質または
リン脂質混合物、またはリン酸エステルがモノエステル
として存在し得る飽和らしくは不飽和の炭素数12〜2
4の直鎖状脂肪酸の合成グリセリルリン酸ジエステル類
、まlこは極性アルコール例えばエタノールアミン、コ
リン、イノシトール、セリン、グリセリンなどのエステ
ルとして存在するものである。特に好ましいリン脂質な
は、L−α−バルミトイルオレオイルホスファチジルコ
リン(POPC)、L−α−バルミトイルオレオイルホ
スファチジルグリセリン(POPG)、L−α−ジオレ
オイルニホスファチジルグリセリンおよびL−α−(ジ
オレオイル)ホスファチジルエタノールアミンがある。
料はリボソームである。リボソームの成分は好ましくは
レシチンを含有する天然膜に見出されるリン脂質または
リン脂質混合物、またはリン酸エステルがモノエステル
として存在し得る飽和らしくは不飽和の炭素数12〜2
4の直鎖状脂肪酸の合成グリセリルリン酸ジエステル類
、まlこは極性アルコール例えばエタノールアミン、コ
リン、イノシトール、セリン、グリセリンなどのエステ
ルとして存在するものである。特に好ましいリン脂質な
は、L−α−バルミトイルオレオイルホスファチジルコ
リン(POPC)、L−α−バルミトイルオレオイルホ
スファチジルグリセリン(POPG)、L−α−ジオレ
オイルニホスファチジルグリセリンおよびL−α−(ジ
オレオイル)ホスファチジルエタノールアミンがある。
またリン脂質代用物ら用いられ得る。普通荷電状態の極
性頭部基および普通2個またはそれ以上の直鎖状炭化水
素から成る疎水性部分を有する他の両親媒性化合物も用
いられ得る。リン脂質代用物の例には、ジセチルホスフ
エート、アルキル基が12〜20個の炭素原子を含む直
鎖を有するジアルコキシプロピルホスフェート類、DO
TMA、スフィンゴミエリン、カルシオリピンなどがあ
る。また脂質物質はコレステロールおよびその誘導体を
含有し得る。
性頭部基および普通2個またはそれ以上の直鎖状炭化水
素から成る疎水性部分を有する他の両親媒性化合物も用
いられ得る。リン脂質代用物の例には、ジセチルホスフ
エート、アルキル基が12〜20個の炭素原子を含む直
鎖を有するジアルコキシプロピルホスフェート類、DO
TMA、スフィンゴミエリン、カルシオリピンなどがあ
る。また脂質物質はコレステロールおよびその誘導体を
含有し得る。
好ましい具体例において、リボソームの組成は、POP
C67〜97%、POPG3〜30%およびコレステロ
ールO〜30%である。そのようなリボソームの例はP
OP067%、POP04%およびコレステロール29
%から成るものである。
C67〜97%、POPG3〜30%およびコレステロ
ールO〜30%である。そのようなリボソームの例はP
OP067%、POP04%およびコレステロール29
%から成るものである。
別の例は、POPC70%およびPOPG30%である
。さらに別の例は、POPC76%、POPG4%およ
びコレステロール20%である。
。さらに別の例は、POPC76%、POPG4%およ
びコレステロール20%である。
この発明の一興体例において、可逆的に封じ込まれた成
分は酵素およびハプテンのコンジュゲートであり、相補
的成分はハプテンに対する抗体であり、そして対人材料
はリボソームである。さらにそのような組成物は、安定
剤、酵素基質を含むシグナル発生系の他の成分を含み得
る。そのような場合、可逆的に封じ込まれた成分はグル
コース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−テオフィリンで
あり相補的成分は抗テオフィリンであり得る。
分は酵素およびハプテンのコンジュゲートであり、相補
的成分はハプテンに対する抗体であり、そして対人材料
はリボソームである。さらにそのような組成物は、安定
剤、酵素基質を含むシグナル発生系の他の成分を含み得
る。そのような場合、可逆的に封じ込まれた成分はグル
コース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−テオフィリンで
あり相補的成分は抗テオフィリンであり得る。
別法としては、可逆的に封じ込まれた成分は抗体であり
、相補的成分は酵素およびハプテンのコンジュゲートで
あり、そして対人材料はリボソームである。
、相補的成分は酵素およびハプテンのコンジュゲートで
あり、そして対人材料はリボソームである。
便宜上、測定用試薬発生系アナライトの測定に用いろ予
定量でパッケージに組まれたキットで提供され得る。キ
ットは(a)sbp成分をそれに相補的なsbp成分と
一時的に結合不可能にする材料に可逆的に封じ込まれた
少なくとも1つのsbp成分および(b)相捕的sbp
成分を含何口得る。sbp成分の少なくとも1つはシグ
ナル発生系の一員と結合している。またキットは試料中
のアナライトの量に応じてシグナルを発生する試薬ら含
有し得る。さらに、キットは封じ込まれたsbp成分の
封じ込みを解除する薬剤を含有し得る。相補薬剤は必要
に応じて含有され得る。
定量でパッケージに組まれたキットで提供され得る。キ
ットは(a)sbp成分をそれに相補的なsbp成分と
一時的に結合不可能にする材料に可逆的に封じ込まれた
少なくとも1つのsbp成分および(b)相捕的sbp
成分を含何口得る。sbp成分の少なくとも1つはシグ
ナル発生系の一員と結合している。またキットは試料中
のアナライトの量に応じてシグナルを発生する試薬ら含
有し得る。さらに、キットは封じ込まれたsbp成分の
封じ込みを解除する薬剤を含有し得る。相補薬剤は必要
に応じて含有され得る。
[実施例]
以下の実施例は説明を目的とするものであって限定を目
的とするものではない。
的とするものではない。
特記しない限り温度はすべて摂氏である。特記しない限
りパーセントおよび部はそれぞれ重重パーセントおよび
重量部であるが、ただし液体混合物の場合は容量に関ず
ろものである。
りパーセントおよび部はそれぞれ重重パーセントおよび
重量部であるが、ただし液体混合物の場合は容量に関ず
ろものである。
次の省略形を用いる。
06 P D H・・・グルコース−6−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、POPC・・・バルミトイルオレオイルホ
スファチジルコリン、POPG・・・バルミトイルオレ
オイルホスファチジルグリセリン、RSA・・・ウサギ
血清アルブミン、BSA・・・ウシ血清アルブミン、G
6P・・・グルコース−6−ホスフェート、NAt)・
・ニコチンアミドアデニンノヌクレオチド、トリトン・
・・トリトン(Triton)X −100、「緩衝液
」・・・0055モルトリス−CLpH8,0,05%
アジ化ナトリウム含有、IEu=0.003Δ 4 n
m 実施例1 リボソームの特性および製造 酵素および酵素−ハプテンコンジュゲートを封入前にり
1M97m(lに濃縮した。抗体は希釈せずに用いた。
ロゲナーゼ、POPC・・・バルミトイルオレオイルホ
スファチジルコリン、POPG・・・バルミトイルオレ
オイルホスファチジルグリセリン、RSA・・・ウサギ
血清アルブミン、BSA・・・ウシ血清アルブミン、G
6P・・・グルコース−6−ホスフェート、NAt)・
・ニコチンアミドアデニンノヌクレオチド、トリトン・
・・トリトン(Triton)X −100、「緩衝液
」・・・0055モルトリス−CLpH8,0,05%
アジ化ナトリウム含有、IEu=0.003Δ 4 n
m 実施例1 リボソームの特性および製造 酵素および酵素−ハプテンコンジュゲートを封入前にり
1M97m(lに濃縮した。抗体は希釈せずに用いた。
封入前にすべての蛋白質を「緩衝液」に対して透析した
。
。
脂質とクロロホルム溶液をカラスびんに入れた。
穏やかな窒素気流下クロロホルムを除去した。4時間以
上かけて痕跡量の溶媒を高度誠圧下除去した。次に、脂
質を3019/+1112の濃度でt−ブタノールに6
0°で静かに撹拌しながら溶かした。ブタノール溶液を
凍結乾燥すると、大きなけば立った粉末が得られ、これ
を使用時まで乾燥および冷却(−20℃)状態に保った
。
上かけて痕跡量の溶媒を高度誠圧下除去した。次に、脂
質を3019/+1112の濃度でt−ブタノールに6
0°で静かに撹拌しながら溶かした。ブタノール溶液を
凍結乾燥すると、大きなけば立った粉末が得られ、これ
を使用時まで乾燥および冷却(−20℃)状態に保った
。
方法1
蛋白質溶液(リン脂質100a+y当たりl m12)
を周囲温度で脂質に加え、ポルテックスにより混合した
。蛋白質の2倍容量の緩衝液を加え、再びけん濁液をポ
ルテックス混合することにより、未けん濁の脂質または
塊を含まない濃厚なミルク状のリボソームけん濁液を得
た。次にけん濁液を緩衝液で希釈して最初の蛋白質容量
の20倍にした。4で20分間15Krl)IIIの遠
心分離によりリボソームを集めた。上清を吸引除去し、
非封入蛋白質測定のために確保しておいた。遠心分離の
直後にリボソーム沈殿物ペレットを上清から分離した。
を周囲温度で脂質に加え、ポルテックスにより混合した
。蛋白質の2倍容量の緩衝液を加え、再びけん濁液をポ
ルテックス混合することにより、未けん濁の脂質または
塊を含まない濃厚なミルク状のリボソームけん濁液を得
た。次にけん濁液を緩衝液で希釈して最初の蛋白質容量
の20倍にした。4で20分間15Krl)IIIの遠
心分離によりリボソームを集めた。上清を吸引除去し、
非封入蛋白質測定のために確保しておいた。遠心分離の
直後にリボソーム沈殿物ペレットを上清から分離した。
リボソームを最初の蛋白質容量の20倍容量の緩衝液で
2回洗浄した。次いでリボソームを振盪することにより
再けん澗した。リボソームを遠心分離により再沈殿し、
上清を除去した。洗浄されたリボソームを最初の蛋白質
の20倍容量にけん濁した。
2回洗浄した。次いでリボソームを振盪することにより
再けん澗した。リボソームを遠心分離により再沈殿し、
上清を除去した。洗浄されたリボソームを最初の蛋白質
の20倍容量にけん濁した。
方法2
蛋白質を「緩衝液J(pl−17)溶かした。脂質粉末
および蛋白質をポルテックス混合することによりリボソ
ームけん濁液を製造した。未精製けん濁液を1倍容量の
「緩衝液」で希釈し、徐々に孔を小さくした一連のヌク
レオボア(Nucleopore)ポリカーボネートフ
ィルター(1,0μ、0.6μ、0.4μおよび0.2
μ)で濾過した。0.2μのフィルターによる濾過を3
回繰返した。膜を手動シリンジに付着させて濾過を行な
った。直径13n+n+のフィルターを使用した。濾過
を行なっている間、リボソームの光散乱特性は、減少し
た大きさを反映しながら可視的に変化し最後に、セブア
クリル(Sephacryl)S −1000の30X
1.5cn+カラムによるゲル濾過により小さいリボソ
ームを精製した。
および蛋白質をポルテックス混合することによりリボソ
ームけん濁液を製造した。未精製けん濁液を1倍容量の
「緩衝液」で希釈し、徐々に孔を小さくした一連のヌク
レオボア(Nucleopore)ポリカーボネートフ
ィルター(1,0μ、0.6μ、0.4μおよび0.2
μ)で濾過した。0.2μのフィルターによる濾過を3
回繰返した。膜を手動シリンジに付着させて濾過を行な
った。直径13n+n+のフィルターを使用した。濾過
を行なっている間、リボソームの光散乱特性は、減少し
た大きさを反映しながら可視的に変化し最後に、セブア
クリル(Sephacryl)S −1000の30X
1.5cn+カラムによるゲル濾過により小さいリボソ
ームを精製した。
30m(/時の割合でカラムを「緩衝液」により溶離し
、1mσのフラクションを集めた。リボソームは非封入
蛋白質のピークに先行する長いトレイリングエツジを有
する非対称ピークとして現われた。
、1mσのフラクションを集めた。リボソームは非封入
蛋白質のピークに先行する長いトレイリングエツジを有
する非対称ピークとして現われた。
トリトンX−100を使用および使用せずにフラクショ
ンを測定した。非封入蛋白質を全部排除するだめにリボ
ソームをプールした。
ンを測定した。非封入蛋白質を全部排除するだめにリボ
ソームをプールした。
方法2の重要な特徴は、膜濾°過を非希釈蛋白質の存在
下で行なう結果、リボソーム破壊としての封入された蛋
白質の純喪失がないことである。
下で行なう結果、リボソーム破壊としての封入された蛋
白質の純喪失がないことである。
方法lにしたがいリボソームにテオフィリン−06P
D Hコンツユゲートを封入すると酵素活性は次のよう
になった。
D Hコンツユゲートを封入すると酵素活性は次のよう
になった。
インプット活
性の%
未精製リボソーム調製液 98,7リボソー
ムに封入されたちの 28.4封入されていない
もの 70.1リポソ一ム精製後回収され
たもの (封入されたもの十非封入のもの) 98.5%リ
ボソームにおける酵素潜伏 99%リボソーム製
造を行なったことによる活性の喪失は非常に小さかった
。はとんど全部の酵素が精製リボソームおよび最初のリ
ボソーム上清に回収された。活性の約3分の1が非漏出
リボソームに封入された。他の酵素コンジュゲートによ
る結果ら同様であった。
ムに封入されたちの 28.4封入されていない
もの 70.1リポソ一ム精製後回収され
たもの (封入されたもの十非封入のもの) 98.5%リ
ボソームにおける酵素潜伏 99%リボソーム製
造を行なったことによる活性の喪失は非常に小さかった
。はとんど全部の酵素が精製リボソームおよび最初のリ
ボソーム上清に回収された。活性の約3分の1が非漏出
リボソームに封入された。他の酵素コンジュゲートによ
る結果ら同様であった。
方法1は06 P D l(−ハプテンコンジュゲート
および抗体の両方に適用可能である。それを用いて天然
06 P D Hおよびそのジゴキシン、テオフィリン
、キニジンおよびチロキンンコンジュゲートを封入する
と匹敵する程度の封入および潜伏を示した。ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体並びに酵素および抗体(
抗酵素)の複合体らまた共に封入された。
および抗体の両方に適用可能である。それを用いて天然
06 P D Hおよびそのジゴキシン、テオフィリン
、キニジンおよびチロキンンコンジュゲートを封入する
と匹敵する程度の封入および潜伏を示した。ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体並びに酵素および抗体(
抗酵素)の複合体らまた共に封入された。
実施例2
酵素活性測定
面記方法1にしたがいテオフィリン−6P D Hをリ
ボソーム(POPC67%、POPG4%、コレステロ
ール29%)に封入し、「緩衝液」にけん澗した(25
111g(脂質)/mσ)。基質として緩衝液(ptし
L7)中にG6P(0,13モル)、NAD(0゜08
モル)およびRS A(20tx9/mQを調製した。
ボソーム(POPC67%、POPG4%、コレステロ
ール29%)に封入し、「緩衝液」にけん澗した(25
111g(脂質)/mσ)。基質として緩衝液(ptし
L7)中にG6P(0,13モル)、NAD(0゜08
モル)およびRS A(20tx9/mQを調製した。
封入された酵素(50μQ)および基質(50μQ)を
0 、8 mQの緩衝液と混合したがトリトン(5%)
を加えた場合と加えない場合の両方を行なった。30°
におけるΔA 34゜を、その温度に達した時点から始
めて30秒間にわたり温度調整されたセルにおいて記録
した。トリトンが存在しない場合リボソーム含有酵素は
本質的に活性を示さなかった(1%未満)。トリトンが
存在する場合、封入された酵素のほとんどは30秒以内
に放出された。
0 、8 mQの緩衝液と混合したがトリトン(5%)
を加えた場合と加えない場合の両方を行なった。30°
におけるΔA 34゜を、その温度に達した時点から始
めて30秒間にわたり温度調整されたセルにおいて記録
した。トリトンが存在しない場合リボソーム含有酵素は
本質的に活性を示さなかった(1%未満)。トリトンが
存在する場合、封入された酵素のほとんどは30秒以内
に放出された。
実施例3
単一液体試薬として封入されたジゴキシン−G6PDH
を用いた測定 面記実施例1で製造されたリボソーム組成物をジゴキシ
ン測定に用いた。この測定では次の試薬を使用した。
を用いた測定 面記実施例1で製造されたリボソーム組成物をジゴキシ
ン測定に用いた。この測定では次の試薬を使用した。
第1表
試薬 :リボソーム(POPC70%、POPG30%
)に封入されたジゴキシン−06PDH(0,49m?
(脂質)/mc)、応答に最適化された抗ジゴキシン、
0.+3モルG6P、R3A(20u/m12)、緩衝
液中 希釈剤二〇、5%トリトン、4ミリモルNAD、5ミリ
モルN a N s、0.005%チメロザール、pH
4,4 プロトコル:50μQの試薬を希釈型中に移し、R9A
を含有する( l rtt9/ m12)m衝液200
μσと共ニ1mσクローン(Croan%商標)カップ
中に投入した。50μgアリコートの試料を吸引し、ク
ローンカップ中700μQの希釈剤に分散させた。試料
添加直後、試料全体をフローセル中に吸引し、30℃で
30秒間にわたって読み取りを行なった。結果をEMI
T測定単位(Eu)で第2表に記録する。
)に封入されたジゴキシン−06PDH(0,49m?
(脂質)/mc)、応答に最適化された抗ジゴキシン、
0.+3モルG6P、R3A(20u/m12)、緩衝
液中 希釈剤二〇、5%トリトン、4ミリモルNAD、5ミリ
モルN a N s、0.005%チメロザール、pH
4,4 プロトコル:50μQの試薬を希釈型中に移し、R9A
を含有する( l rtt9/ m12)m衝液200
μσと共ニ1mσクローン(Croan%商標)カップ
中に投入した。50μgアリコートの試料を吸引し、ク
ローンカップ中700μQの希釈剤に分散させた。試料
添加直後、試料全体をフローセル中に吸引し、30℃で
30秒間にわたって読み取りを行なった。結果をEMI
T測定単位(Eu)で第2表に記録する。
第2表
ジゴキシン(μg/ n+Q) 二試薬 単一試薬
0.083 410 4030.166
456 4400.333 51
8 5110.666 603 58
41.33 645 6282.66
678 6535.33
713 −10.65
717 665充分な抗ジゴキンン抗体が存在
したため、ジゴキシン−06PDHの46%阻害をもた
らしたがトリトンを加えるまで阻害は起こらなかった。
0.083 410 4030.166
456 4400.333 51
8 5110.666 603 58
41.33 645 6282.66
678 6535.33
713 −10.65
717 665充分な抗ジゴキンン抗体が存在
したため、ジゴキシン−06PDHの46%阻害をもた
らしたがトリトンを加えるまで阻害は起こらなかった。
実施例4
2種の異なる液体試薬を用いた比較測定単一液体試薬を
用いた測定との比較として異なる液体試薬中部封入酵素
コンジュゲートおよび抗体を用いて測定を行なった。試
薬の量および測定の最終容量を、実施例3で記載された
単一試薬測定の場合と同一となるように準備した。
用いた測定との比較として異なる液体試薬中部封入酵素
コンジュゲートおよび抗体を用いて測定を行なった。試
薬の量および測定の最終容量を、実施例3で記載された
単一試薬測定の場合と同一となるように準備した。
測定には次の試薬を使用した。
第3表
試薬A:ジゴキシンーG6PDH(1度測定により前記
実施例3の場合と同じ割合(すなわち抗ジゴキシンが存
在しないとき)とした)、0.■3モルG6P、R9A
(20H/m12)、緩衝液中。
実施例3の場合と同じ割合(すなわち抗ジゴキシンが存
在しないとき)とした)、0.■3モルG6P、R9A
(20H/m12)、緩衝液中。
試薬B:抗ンゴキノン(濃度測定により前記実施例3の
場合と同じ最終量とした)、 0.13モル06P、BSA(20ffg/mf2)、
緩衝液中。
場合と同じ最終量とした)、 0.13モル06P、BSA(20ffg/mf2)、
緩衝液中。
プロトコル: 50μQの試薬Aを希釈器に移し、BS
Aを含有する(la9/m12)緩衝液100μQにク
ローン(Croan、商標)カップ中でけん澗した。5
0μQアリコー トの試料をRSA含有(li9/mσ)緩衝液100μ
Qで希釈し、クローン(Cr。
Aを含有する(la9/m12)緩衝液100μQにク
ローン(Croan、商標)カップ中でけん澗した。5
0μQアリコー トの試料をRSA含有(li9/mσ)緩衝液100μ
Qで希釈し、クローン(Cr。
an、商標)カップに加えた。25μQの試薬Bを希釈
器に移し、700μQの 緩衝液と共にクローン(Croan、商標)カップ中に
投入した。その直後、試料 を面記実施例3と同様に測定した。結 果をEMIT測定単位で第2表に記録 する。
器に移し、700μQの 緩衝液と共にクローン(Croan、商標)カップ中に
投入した。その直後、試料 を面記実施例3と同様に測定した。結 果をEMIT測定単位で第2表に記録 する。
実施例5
単一液体試薬として封入されたテオフィリン−G G
P D I−Iを用いた測定 テオフィリン−G6PDHをリボソーム(POP076
%、POPG4%およびコレステロール20%)に封入
し、テオフィリン測定に用いた。
P D I−Iを用いた測定 テオフィリン−G6PDHをリボソーム(POP076
%、POPG4%およびコレステロール20%)に封入
し、テオフィリン測定に用いた。
測定には次の試薬を用いた。
第4表
試薬 :リボソーム(POP076%、POPG4%、
コレステロール20%)に封入されたテオフィリン−G
6PDH10,86μQ/mσモノクローナル抗テオフ
ィリン、3.0ミリモルNAD、およびBSA(2my
/mff)、緩衝液中。
コレステロール20%)に封入されたテオフィリン−G
6PDH10,86μQ/mσモノクローナル抗テオフ
ィリン、3.0ミリモルNAD、およびBSA(2my
/mff)、緩衝液中。
希釈剤: 2.5%トリトン、2%デオキシコール酸ナ
トリウム、3ミリモルG6P、1JI9/m(28SA
、50ミリモルN a N 3゜プロトコル:0.3m
Qの試薬をクローン(Croan。
トリウム、3ミリモルG6P、1JI9/m(28SA
、50ミリモルN a N 3゜プロトコル:0.3m
Qの試薬をクローン(Croan。
商標)カップ中に投入した。8.3μQの血清試料を希
釈器に移し、0 、6 m12の希釈剤と共にクローン
(Croan、商標)カップに投入した。
釈器に移し、0 、6 m12の希釈剤と共にクローン
(Croan、商標)カップに投入した。
ル中に吸引し、30”で酵素活性を測定した(15秒遅
れ、30秒読み取り)。結果をEMIT測定単位で第5
表に記録する。
れ、30秒読み取り)。結果をEMIT測定単位で第5
表に記録する。
第5表
テオフィリン(μg/m(り 単一試薬(EV)
2.5356 実施例6 封入された抗G6PDHおよび遊離抗G6PD!]を用
いた測定 抗G G P D 1.1をリボソームに封入した。リ
ボソームの組成はL−α−ジオレオイルレシチン(70
%)およびL−α−ジオレオイルホスファチジルグリセ
リン(30%)であった。
2.5356 実施例6 封入された抗G6PDHおよび遊離抗G6PD!]を用
いた測定 抗G G P D 1.1をリボソームに封入した。リ
ボソームの組成はL−α−ジオレオイルレシチン(70
%)およびL−α−ジオレオイルホスファチジルグリセ
リン(30%)であった。
笛Am
酵素 :G6PDH1RSA含有緩衝液(l mg/
mQ)に溶解。
mQ)に溶解。
封入された抗体:抗G6PDH,リボソーム170%L
−α−(ジオレオイル)レシチンおよび30%L−α−
ジオしオイルホ スファチジルグリセリン)中、ISA 含有緩衝液(ly、g/m&)にけん濁。
−α−(ジオレオイル)レシチンおよび30%L−α−
ジオしオイルホ スファチジルグリセリン)中、ISA 含有緩衝液(ly、g/m&)にけん濁。
遊離抗体:抗G 6 P D H%R5A含有緩衝液(
lxg/mのにけん濁。
lxg/mのにけん濁。
基質 :0.13モル06P、0.08モルNADお
よびRS A(2Q ttt9/m(2)、緩衝液(p
t−r 4 .7 )中。
よびRS A(2Q ttt9/m(2)、緩衝液(p
t−r 4 .7 )中。
プロトコル= 50μaの酵素(270ng)を50μ
gの遊離または封入された抗体およびR 8A含有緩衝液(1m9/m(1) 0 、6 m(l
と5%トリトンを使用するかまたは使用 せずに混合した。周囲温度で1時間後 50μQの基質を0 、3 mQの緩衝液と共に加えた
。前記実施例2と同様に測定 結果を読み取り、結果をEMIT測定 単位(EV)で第7表に記録する。
gの遊離または封入された抗体およびR 8A含有緩衝液(1m9/m(1) 0 、6 m(l
と5%トリトンを使用するかまたは使用 せずに混合した。周囲温度で1時間後 50μQの基質を0 、3 mQの緩衝液と共に加えた
。前記実施例2と同様に測定 結果を読み取り、結果をEMIT測定 単位(EV)で第7表に記録する。
第7表
抗体 トリトン EMIT単位 阻害%無
無 542 0無
有 544 0J離I 熾
238 56遊離2 、有
245 55封入2 無 51
0 6封入2 有 233
571 ) 7 nQ非希釈γ−グロブリンフラクシ
ョン。
無 542 0無
有 544 0J離I 熾
238 56遊離2 、有
245 55封入2 無 51
0 6封入2 有 233
571 ) 7 nQ非希釈γ−グロブリンフラクシ
ョン。
2)9.3μQ脂質。
データが示すように、封入された抗体は同量の非封入抗
体よりも酵素の阻害率がかなり低かった。
体よりも酵素の阻害率がかなり低かった。
封入された抗体を放出するために加えられたトリトンは
、酵素活性または抗体による酵素阻害程度に影響を与え
なかった。封入された抗体を酵素と混合すると、トリト
ンを加えた場合短い測定時間に57%の阻害をもたらし
たが、トリトンを加えなかった場合1時間で6%の阻害
しかもたらさなかった。
、酵素活性または抗体による酵素阻害程度に影響を与え
なかった。封入された抗体を酵素と混合すると、トリト
ンを加えた場合短い測定時間に57%の阻害をもたらし
たが、トリトンを加えなかった場合1時間で6%の阻害
しかもたらさなかった。
実施例7
代わりの放出剤
テオフィリン−〇 6 P D Hをリボソーム(p。
PC58%、POPG25%およびコレステロール■7
%)に封入し、511g(脂質)/+n+2の濃度で緩
衝液にけん祠した。
%)に封入し、511g(脂質)/+n+2の濃度で緩
衝液にけん祠した。
第9表
添加物 処理 回復後 非封入 放出後の活性
の酵素 % 活性% 活性 RSA(45凍結/ my/m(1> 解凍 923432緩衝液
中 水 +0010 8
− 音波処理 953331 トリトン 100 0 100封入
されたテオフィリン−G6PDH1mQを添加物と混合
し、第9表に示す処理に付した。その/m12) 0
、9 mQで希釈した。希釈された試料50μaアリコ
ートを2%トリトンを使用または使用せずに実施例4と
同様に測定した。次いで処理後回復された酵素活性フラ
クションおよび非封入フラクションを計算し、第9表に
示す。
の酵素 % 活性% 活性 RSA(45凍結/ my/m(1> 解凍 923432緩衝液
中 水 +0010 8
− 音波処理 953331 トリトン 100 0 100封入
されたテオフィリン−G6PDH1mQを添加物と混合
し、第9表に示す処理に付した。その/m12) 0
、9 mQで希釈した。希釈された試料50μaアリコ
ートを2%トリトンを使用または使用せずに実施例4と
同様に測定した。次いで処理後回復された酵素活性フラ
クションおよび非封入フラクションを計算し、第9表に
示す。
この発明は、広範な種類のアナライトの測定試験を迅速
で簡単なものにし得る組成物を提供する。
で簡単なものにし得る組成物を提供する。
単一液体試薬は高度の信頼性および正確性を提供し、ま
た非熟練者および/または訓練中の者でも容易に使用で
きるものである。粉末を再構成する必要がなく、また様
々な試薬を混合して正確な比率を達成する必要もない。
た非熟練者および/または訓練中の者でも容易に使用で
きるものである。粉末を再構成する必要がなく、また様
々な試薬を混合して正確な比率を達成する必要もない。
常用の装置を用いることができ、2種の試験例えば対照
および試料に関する試験を同時に行なうことができるた
め2種の測定媒質条件は同一となる。
および試料に関する試験を同時に行なうことができるた
め2種の測定媒質条件は同一となる。
理解を明確なものにするため前記発明を実例をあげなが
らある程度詳細に記載したが、特許請求の範囲内である
程度変更および修正が行なえることは明らかである。
らある程度詳細に記載したが、特許請求の範囲内である
程度変更および修正が行なえることは明らかである。
Claims (17)
- (1)アナライトがリガントおよびそれに相補的なレセ
プターから成る特異的結合対(sbp成分)の一員であ
り、試料中のアナライトの量に応じて検出可能なシグナ
ルを提供するシグナル発生系が使用される、アナライト
の含有が疑われる試料中のアナライトの測定方法であっ
て、 (a)単一液体媒質中に(1)sbp成分をそれに相補
的なsbp成分との結合を一時的に不可能にする材料に
可逆的に封じ込められた少なくとも1つのsbp成分お
よび(2)前記の相補的sbp成分を含み、前記sbp
成分の少なくとも1つがシグナル発生系の一員と結合し
ている組成物と、アナライトの含有が疑われる試料を合
わせ、そして (b)前記材料から前記sbp成分の封じ込みを解除す
る手段を提供し、そして (c)試料中のアナライトの量に応じて発生されたシグ
ナルを測定する 段階を含んで成る方法。 - (2)前記シグナル発生系の成分が、酵素、補酵素、蛍
光剤、染料、基質、化学発光剤およびコファクターから
なる群から選ばれ、好ましくは前記酵素がグルコース−
6−リン酸デヒドロゲナーゼである、特許請求の範囲第
1項記載の方法。 - (3)前記アナライトが抗原および抗体からなる群から
選ばれる、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (4)前記アナライトが、薬剤、蛋白質、ポリペプチド
、核酸および多糖類からなる群から選ばれ、好ましくは
前記薬剤がテオフィリン、チロキシンおよびジゴキシン
からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第1項記載の
方法。 - (5)前記材料が天然材料、好ましくは赤血球ゴースト
または合成材料、好ましくはリボソームである、特許請
求の範囲第1項記載の方法。 - (6)sbp成分の封じ込みを解除する手段が、デター
ジェント、ポリペプチド、有機溶媒および補体から成る
群から選ばれる化学的手段、または温度変化、音波処理
および浸透圧ショックから成る群から選ばれる物理的手
段、または化学的手段および物理的手段の組み合わせで
ある、特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (7)前記の可逆的に封じ込められた成分が酵素および
ハプテンのコンジュゲートであり、前記相補的成分が前
記ハプテンに対する抗体であり、前記材料がリボソーム
であり、好ましくは前記の可逆的に封じ込められた成分
がグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ−テオフィ
リンであり、前記の封じ込められていない成分が抗チオ
フィリンであり、前記材料がリボソームである、特許請
求の範囲第1項記載の方法。 - (8)前記リボソームがパルミトイルオレオイルホスフ
ァチジルコリン、パルミトイルホスファチジルグリセロ
ールおよびコレステロールを成分とする、特許請求の範
囲第7項記載の方法。 - (9)リガントおよびそれに相補的なレセプターから成
る特異的結合対(sbp成分)の一員であるアナライト
の測定を行なうための組成物であって、 (a)sbp成分とそれに相補的なsbp成分との結合
を一時的に不可能にする材料に可逆的に封じ込められた
少なくとも1つのsbp成分、および (b)前記の相補的sbp成分を液体媒質中に含み、前
記sbp成分の少なくとも一つがシグナル発生系の一員
と結合している組成物。 - (10)特許請求の範囲第9項記載の組成物から液体を
濃縮除去することにより得られた固体を含有する組成物
。 - (11)アナライトが抗体および抗原から成る群から選
ばれる、特許請求の範囲第9項記載の組成物。 - (12)シグナル発生系の前記成分が、酵素、補酵素、
蛍光剤、染料、基質、化学発光剤およびコファクターか
ら成る群から選ばれ、好ましくは前記酵素がグルコース
−6−リン酸デヒドロゲナーゼである、特許請求の範囲
第9項記載の組成物。 - (13)前記材料が天然材料、好ましくは赤血球ゴース
ト、または合成材料、好ましくはリボソームである、特
許請求の範囲第9項記載の組成物。 - (14)前記の可逆的に封じ込められた成分が酵素およ
びハプテンのコンジュゲートであり、前記の相補的成分
が前記ハプテンに対する抗体であり、そして前記材料が
リボソームであり、好ましくは前記の可逆的に封じ込め
られた成分がグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
−テオフィリンであり、前記の相補的成分が抗チオフィ
リンであり、そして前記材料がリボソームである、特許
請求の範囲第9項記載の組成物。 - (15)リボソームがパルミトイルオレオイルホスファ
チジルコリン、パルミトイルホスファチジルグリセロー
ルおよびコレステロールを成分とする、特許請求の範囲
第14項記載の組成物。 - (16)アナライトの含有が疑われる試料中のアナライ
ト測定用キットであって、 (a)特許請求の範囲第9項記載の組成物および (b)封じ込められたsbp成分の封じ込みを解除する
試薬 を組合わせて成るキット。 - (17)アナライトがリガントおよびそれに相補的なレ
セプターから成る特異的結合対(sbp成分)の一員で
あり、試料中のアナライトの量に応じて検出可能なシグ
ナルを提供するシグナル発生系が使用される、アナライ
トの含有が疑われる試料中のアナライトの測定方法にお
いて、単一液体媒質中に(1)sbp成分とそれに相補
的なsbp成分との結合を一時的に不可能にする材料に
可逆的に封じ込められた少なくとも1つのsbp成分お
よび(2)前記の相補的sbp成分を含有し、前記sb
p成分の少なくとも1つがシグナル発生系の一員と結合
している組成物を前記測定に試薬として用いることを含
む改良。
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