JPH02290555A - 免疫測定法及びそれに用いる試液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、抗原抗体反応により活性化された補体のマイ
クロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法の改良法、
及びそれに用いられる安定化された、且つ自動分析装置
に適用可能な測定試液に関する． ［発明の背景］ 免疫測定法は抗原抗体反応を利用した測定法で、例えば
体液中の微量成分を特異的に測定する方法の１つとして
広く用いられている． 現在一般によく利用されている免疫測定法としては、例
えばラジオイムノアッセイ法（Ｒ　Ｉ　Ａ法）やエンザ
イムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）等が挙げられる．こ
れらの方法は検体中の微量成分を定量的に測定し得る方
法ではあるが、夫々問題点も有している．即ち，ＲＩＡ
法に於いては、放射性同位元素を使用しなければならな
いことから、特別な設備が必要である点、及び廃棄物の
処理が問題となる点等の問題点が，また．ＥＩＡ法に於
いては、測定に比較的時間を要する点、及び自動分析機
への応用が難しい点等の問題点が夫々挙げられる． そこで，最近では、これらの問題点を有さない免疫測定
法として、抗原抗体反応により活性化された補体が有す
るマイクロカプセルの溶解作用を利用した測定法が提案
され注目を浴びている．この方法の代表的なものとして
は，例えば測定対象物を表面に固定化し内部に標識物質
（例えば酵素等）を保持したｎ質膜小胞（リポソーム）
等のマイクロカプセル（以下，標識マイクロカプセルと
略記する．）を用いる方法（以下、補体免疫測定法と略
記する．）が挙げられる（特開昭５６−１３２５８４号
公報）　．　；：　ｆ）　方法ｉ．ｔ　．検体、！ｌＡ
ｗｔマイクロカプセル及び測定対象物に対する抗体を混
合して抗原抗体反応を行わせた後、補体を添加すると，
標識マイクロカプセルの表面上に形成された抗原抗体複
合物により活性化された袖体がマイクロカプセルの瓜を
溶解して，標識マイクロカプセル中のａＸ物質を放出さ
せ、その量から検体中の測定対象物量を測定するという
方法である．この補体免疫測定法は，抗原抗体反応を利
用した方法であるところから微量の副定対象物を特異的
に測定し得るのみならず、均一反応系中で一連の反応を
行えるため、従来法であるＲＩＡ法やＥＩＡ法に比咬し
て、簡便に且つ短時間に測定を実施し得る点から注目を
集めている測定方法である．しかしながら、この方法は
、自動分析装置への適用には問題があり，特に現在自動
分析装置の主流となっている２試液系への適用に難があ
り、そのような報告は皆無に近い．この原因は，この方
法に用いられる試薬類（標識マイクロカプセル、測定対
象物に対する抗体及び補体）を２つの試液中に適当に紐
み合わせて保存した場合、その安定性に問題があるため
である． 即ち、この方法に於いて用いられる主な試薬類３種を２
つの試液に分けて保存しようとした場合、以下の３つの
組み合わせが考えられる．ａ）・補体と！！４！Ｉ！マ
イクロカプセルとの混合溶液・抗体溶液 ｂ）・神体と抗体との混合溶液 ・Ｂｔｌｔマイクロカプセル溶液 Ｃ》・！ｓ識マイクロカプセルと抗体との混合溶液・補
体溶液 しかしながら，上記の何れの紐み合わせて試液をａＩｉ
ｔ，たとしても保存時の安定性が悪く実用的ではない．
例えばａ》の組み合わせの場合、試液に共存するｅ４識
マイクロカプセルと補体の相互作用により補体が不活性
化され、免疫応答が徐々に低下してくるし、ｂ》の組み
合わせの場合、測定対象物が薬物等のように動物由来の
神体溶液中に混入してくる恐れのないものの場合にはあ
る程度安定性は認められるものの、測定対象物がホルモ
ンや癌マーカー等補体溶液中に存在する可能性の高いも
のの場合には、補体と抗体との混合溶液中で抗原抗体反
応及び補体の不活性化が起こるためその試液の安定性が
悪くなる．また．　ｃ）の組み合わせの場合，標識マイ
クロカプセル上に固定化された訪１定対象物（抗原）と
抗体とが先に反応してしまうため測定感度が低下すると
言う現象が起きてしまう．従って、現在のところ補体免
疫測定法に用いる試液は、測定対象物によっては３試液
系とせざるを得ない場合が多く，自動分析装置への適用
が可能な、２試液系の補体免疫測定用試液の出現が強く
望まれていた． ［発明の目的］ 本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、保存
時の安定性が良好で且つ自動分析装置への適用が可能な
、２試液系の補体免疫測定法及びこれに用いる側定試液
を提供することをその目的とする． ［発明の構成コ 本発明は、■抗原抗体反応により活性化された補体のマ
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫ｉｌ１定法に於
いて、沼定対象物に対する抗体として，標識マイクロカ
プセルとは異なる性質を有するマイクロカプセル内に保
持された抗体を用いることを特徴とする免疫澗定法、■
抗原抗体反応により活性化された補体のマイクロカプセ
ル溶解作用を利用した免疫測定法に用いられる測定用試
液に於いて、標識マイクロカプセル，及び該マイクロカ
プセルの膜とは異なった性質を有し、且つ抗体を内部に
保持したマイクロカプセルを含む第１液と、補体を含む
第２液とからなることを特徴とする免疫測定法試液、並
びに■抗原抗体反応により活性化された補体のマイクロ
カプセル溶解作用を利用した免疫画定法に於いて、ｉ）
測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保持し
たマイクロカプセル、及び該マイクロカプセルの膜とは
異なった性質を有し、且つ抗体を内部に保持したマイク
ロカプセルを含む第１液と，泗定対象物を含む試料及び
界面活性剤とを反応させるｍ１工程と、ｉｉ）第１工程
で得られる反応液と、補体な含む第２液とを反応させる
第２工程と、を含むことを特徴とする免疫測定法の発明
である． 即ち、本発明者らは、自動分析装置への適用が可能な、
補体免疫測定法を見出すべく鋭意研究の途上、種々の細
胞膜溶解作用を有する物質（以下，膜溶解剤と略記する
．）のマイクロカプセルに対する溶解性が，マイクロカ
プセル膜の構成成分及びその調製法により種々異なって
くることを見出し、この点に着目して更に研究を重ねた
結果、補体免疫測定法に於いて用いられる抗体を，特定
の膜溶解剤、即ち界面活性剤に対して標識マイクロカプ
セルよりも溶解され易いマイクロカプセル内に保持させ
て用いれば，保存時の安定性が良好で且つ自動分析装置
に利用し得る２試液系の補体免疫測定法を組み立てるこ
とができることを見出し，本発明を完成するに至った．
即ち，本発明の測定試液は第１液が４！１識マイクロカ
プセルと抗体を内部に保持していることを特徴とするマ
イクロカプセル（以下，カプセル化抗体と略記する．）
を含んでなり，第２液は補体を含んでなる．本発明の測
定法に於いて特定の膜溶解剤として用いられる界面活性
剤としては、カプセル化抗体の膜成分は溶解するが、ｗ
識マイクロカプセルの膜成分は溶解しないものであって
，洞定に影響のないものであれば特に限定されることな
く挙げられるが，具体的には、例えばボリオキシエチレ
ンセチルエーテル，ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル等のポリオキシェチレンアルキルエーテル類，例えば
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリ
オキシェチレンアルキルフェニルエーテル類，例えばボ
リオキシエチレンソルビタンモノオレエート，ポリオキ
シェチレンソルビタンモノバルミテート，ポリオキシエ
チレンソルビタンモノステアレート，ポリオキシェチレ
ンソルビタントリオレート等のポリオキシェチレンアル
キルエステル類、例えばオクタノイルーＮ−メチルグル
カミド，ノナノイルーＮ−メチルグルカミド，デカノイ
ルーＮ−メチルグルカミド等のメチルグルカミド誘導体
，例えばｎ−オクチルーβ−Ｄ−グルコシド等のアルキ
ルＮ誘導体等の非イオン界面活性剤、例えばドデシル硫
酸ナトリウム（５０５）、ラウリルベンゼンスルホン酸
，デオキシコール酸，コール酸，トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンドデシルサルフエイト（Ｔｒｉｓ　
ＤＳ）等のア二オン界面活性剤，例えばオクタデシルア
ミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩，ステアリルア
ミン酢酸塩，ラウリルアミン酢酸塩，ラウリルジエタノ
ールアミン＃酸塩等のアルキルアミン塩，例えば塩化オ
クタデシルトリメチルアンモニウム，塩化ドデシルトリ
メチルアンモニウム，塩化セチルトリメチルアンモニウ
ム，臭化セチルトリメチルアンモニウム，塩化ラウリル
トリメチルアンモニウム，メチル硫酸アリルトリメチル
アンモニウム，塩化ペンザルコニウム，塩化テトラデシ
ルジメチルベンジルアンモニウム，＠化オクタデシルジ
メチルベンジルアンモニウム，塩化ラウリルジメチルベ
ンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、例えば
塩化ラウリルピリジニウム，塩化ステアリルアミドメチ
ルビリジニウム等のアルキルビリジニウム塩等のカチオ
ン界面活性剤、３−［（３−コラミドアミドプロビル）
ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネイト、３
−［（３−コラミドアミドブロビル）ジメチルアンモニ
オ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネイト等の
両性界面活性剤，サボニン（大豆由来），ジギトニン等
の天然の界面活性剤等の界面活性剤が挙げられる．また
，これらの使用濃度としては、カプセル化抗体のマイク
ロカプセル膜を溶解し，標識マイクロカプセルの膜は溶
解しない範囲であれば特に限定されることなく選択でき
るが、通常は測定時の濃度として通常０．０１〜２Ｖ／
Ｖ％．好ましくは０．１〜Ｉ　Ｖ／Ｖ％となるように適
宜選択して用いられる． 尚、リポソーム等のマイクロカプセルの膜溶解剤として
通常用いられている補体、ポリミキシンＢ，メリチン等
は、本発明の目的に使用することはできない．その理由
については明らかではないが，例えば以下のようなこと
が考えられる．即ち，補体等の膜溶解剤によるリポソー
ム膜の溶解作用は、リポソーム自体の閘造を完全に破壊
するというようなものではなく，単に膜の一部に穴をあ
ける程度のものであると考えられる．従って，分子量の
小さな物質（例えば蛍光物質，酵素の基質等）はその穴
を通じてリポソーム内外を自由に出入りできるが、抗体
のような分子量の大きな物質はその穴を通過することは
できずリポソーム内部に保持されたままとなる．それ故
，これらの膜溶解剤を界面活性剤の代りに用いても、本
発明の目的を達成することはできない． 本発明の測定法に用いられるカプセル化抗体のマイクロ
カプセルとしては、標識マイクロカプセルと比較して界
面活性剤に対してより溶解され易いものであれば特に限
定することなく挙げられるが，調製の容易さ等からその
ような性質を有するリポソームがより好ましいものとし
て挙げられる．このようなリポソームのｍｓ方法として
は，従来から知られているボルテツクスイング法，超音
波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法（ＲＥＶ法），エ
タノール注入法，エーテル注入法，プレーベジクル（Ｐ
ｒｅ−Ｖａｓｉｃｌｅ）法，フレンチプレスエクストル
ージョン（Ｐｒｅｎｃｂ　Ｐｒｅｓｓ　ＥｘＬ；ｒｕｓ
ｉｏｎ）法，　Ｃａ””融合法，アニーリング（Ａｎｎ
ｅａｌｉｎｇ）法，凍結融解融合法，凍結乾燥法，　Ｖ
／Ｏ／Ｗエマルジョン法等の方法や、最近．　Ｓ．Ｍ．
Ｇｒｕｎｅｒら［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２４．
　２８３３（１９８５）］により報告されたＳｔａｂｌ
ｅ　Ｐｌｕｒｉｌａｍｏｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅ法（
ＳＰＬＶ法）、本発明者の１部らによって報告されたり
ボゴリサッカライドを膜構成成分の１部とする方法（特
開昭６３−１０７７４２号公報）等の方法が挙げられる
が，特に、例えば界面活性剤除去法，ソニケイション法
等の単一層膜リポソームをＩＮＩＩ！し得る方法が好ま
しいものとして挙げられる．　また，その主たる膜構成
成分としては、通常のリポソームの調製に於いて膜素材
として用いられている天然レシチン（例えば，卵黄レシ
チン，大豆レシチン等）やジパルミトイルフオスファチ
ジルコリン（ＤＰＰＣ）　，ジミリストイルフオスファ
チジルコリン（ＤＨＰＣ）　，ジステア口イルフオスフ
ァチジルコリン（ＤＳＰＣ）　，ジオレオイルフォスフ
ァチジルコリン（ＤＯＩ’Ｓ）　，ジミリストイルフオ
スファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）　，ジノ《
ルミトイルフォスファチジルグリセロール（ＤＰＩ’Ｇ
）　，ジミリストイルフォスファチジン酸（ＤＭＰＡ）
　，卵黄フォスファチジルグリセロール等のリン脂質の
１種又は２８以上，或はこれらとコレステロール類との
混合系、或はこれらに更にリポボリサッカライド等を組
み合わせたもの等が全て挙げられるが、特に、例えば卵
黄レシチン等の低いＴｃを有する脂質類、ホスファチジ
ルエタノールアミンや酸性Ｊｕｔ等のヘキサゴナル相を
とり易い脂質類等が好ましいものとして挙げられる． 本発明に係るカプセル化抗体に於いて，マイクロカプセ
ル内に保持させる抗体としては，測定対象物に対する抗
体であれば何れにてもよく特に限定されない．即ち、常
法，例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株
）学会出版センター１９８１４等に記載の方法に準じて
，馬、牛，羊、兎，山羊、ラット、マウス等の動物に測
定対象物を免疫して作製されるポリクローナル性抗体で
も、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（Ｇ．　
Ｋ６ｈＪａｒ　　ａｎｄ　　Ｃ．　　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ
；　　Ｎａｔｕｒｅ，　　２５旦，４９５，１９７５）
により確立された細胞融合法に従い，マウスの属瘍ライ
ンからの細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの牌
細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生ずる
単クローン性抗体でも何れにてもよく，これらを単独で
或はこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である．
また、これら抗体は、要すればペプシン，パパイン等の
酵素を用いて消化してＦ　（ａｂ’）２，Ｆ　ａｂ’，
或はＦａｂとして使用してもよいことは言うまでもない
．本発明に係るカプセル化抗体の調製法を，界面活性剤
除去法によるリポソームの調製の場合を例にとり挙げて
以下に詳しく説明する． 即ち、先ず前記した如きリン脂質及びコレステロール類
を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム，エーテル類
，アルコール類等）に溶解し，減圧下で濃縮乾固後，デ
シケーター中で充分減圧乾燥する．次いで、作製された
脂質フイルムに界面活性剤水溶液（２０〜１００ｍＭ）
を加えて，これを均一に分散させる．ここで使用する界
面活性剤としては，例えば、従来からよくこの分野に於
いて用いられているコール酸，ポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル，オクチルグルコシド等が挙げら
れるが、望ましくは、オクチルグルコシドの様な臨界ミ
セル濃度（ＣＭＣ）の高い界面活性剤が良い．次に、要
すればリボボリサッカライド類を粉末のまま，或は溶液
として加え、更に所望する抗体を含む溶液（通常、０．
１〜２０ｍκＡｂ／ｍｌ．好ましくは１〜１０ＢＡｂ／
ｍｌの溶液）を加えて充分に攪拌混合する。この後、直
ちに界面活性剤を除去するのが最も望ましいが、その方
法としては透析法，ゲル渡過法，樹脂吸着法等，自体公
知の方法が挙げられる．処理条件は時間として１時間乃
至１昼夜で，温度はリポソームの膜構成成分等により若
干異なるが、０〜７０℃位の範囲で適宜選択して行えば
よい．特に、界面活性剤を除去する方法として，Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（ファルマシア社商品名）を用い
るゲル櫨過や遠心分離等の操作により行えば、遊離の抗
体等も同時に除去できるので有利である．かくして得ら
れたリポソームは限外濾過等により所定の濃度に濃縮し
て使用、又は保存される．リポソームのサイズの均一化
に関しては，ｗＩ用されているボリカーボネート膜を用
いる方法も良いが、ゲル濾過法［例えばＳａｐｈａｃｒ
ｙｌ　Ｓ−１０００　（フ７／Ｌ／マシア社商品名）を
使用］で行うのも効果的である． 界面活性剤除去法以外の方法で本発明に係るカプセル化
抗体をｔｌ！ＩＩ！する場合についても、同様に、自体
公知の或はその他のリポソームａｍ法に準じてこれを行
えば良い． 本発明の肥定法に於いて用いられる標識マイクロカプセ
ルとしては、カプセル化抗体と比較して界面活性剤に対
してより溶解され難いものであれば特に限定することな
く挙げられるが、通常は調製の容易さ等からそのような
性質を有するリポソームが選択される．そのようなリポ
ソームの調製法としては、先にカプセル化抗体のところ
で列挙した自体公知のリポソームの調製法が全て挙げら
れ，また、膜構成成分としては同様にカプセル化抗体の
ところで挙げた自体公知の膜素材が全て挙げられるが、
特に、ＤＰＰＣやｏｓｐｃ等の高い相転移温度−でＴｃ
）を有する脂質を膜構成成分として、ＳＰＬＶ法，ＲＥ
Ｖ法等の多１！層膜リポソームを調製し得る方法により
作製したものは他と比べて界面活性剤による溶解を受け
難いのでより望ましい．このようにして標識物質を内部
に保持したリポソームを調製し、この表面に常法、例え
ば水溶性仮白質等を固定化する場合には架橋法，脂質活
性化法，リボボリサッカライドを用いる特開昭６３−１
０７７４２号公報に記載の方法等、或は低分子ハプテン
等を固定化する場合にはこれを予め脂質誘導体としてお
いてリポソームに組み込む方法等により測定対象物を固
定化すれば本発明に係る標識マイクロカプセルが容易に
得られる．標識マイクロカプセル内に保持される標識物
質としては，補体免疫測定法に於いて通常用いられる検
出可能な標識物質であれば何れにてもよく特に限定され
ることなく挙げられるが，例えばアルカリホスファター
ゼ，グルコースー６−リン酸脱水素酵素，β−ガラクト
シダーゼ等の酵素類，例えばカルボキシフルオレセイン
等の蛍光物質類、例えばアルセナゾＩＩＩ，　４−（２
−ピリジルアゾ）レゾルシノール，　２−（５−ブロモ
ー２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピルーＮ〜スル
ホプロピルアミノ）フェノールナトリウム塩等の色素類
、例えばルミノール，ビス（２，４．６〜トリクロロフ
ェニル）オキザレート，Ｎ−メチルアクリジニウムエス
テル等の発光物質類，例えば２，２，６．６−テトラ．
メチルビペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）等に代
表されるスピンラベル化剤類等が代表的なものとして挙
げられる． 本発明の測定法に於いて用いられる補体としては，例え
ばヒト，モルモット，馬，羊等の動物の血液から得られ
たものを常法に従って適宜精製したもの等、この分野で
通常用いられる補体が何れも例外なく挙げられる． これら本発明の測定法に於いて用いられる試薬類或いは
必要に応じて添加される各狸防腐剤等の濃度範囲等は自
体公知の補体免疫測定用試液に於いて通常用いられる濃
度範囲等を適宜選択して用いることで足りる． 本発明の測定法に於いて用いられる緩衝剤としては、例
えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，グッド
（Ｇｏｏｄ）　ｔベロ，ナール等の緩衝剤が挙げられる
が、特にこれらに限定されるものではない． 本発明の測定法に用いられる本発明の沼定用試液は，以
下のような２液の形態をとることを特徴とする． １ｉ１液：カプセル化抗体，標識マイクロカプセル，要
すれば緩衝剤，標識物質としての機能を発現させるのに
必要な物質（例えば，補酵素、酵素の基質等）、防腐剤
等を含有． 第２液：捕体，要すれば基質，補酵素，緩衝剤、防腐剤
等を含有． 本発明の測定用試液のＰＩ｛は、ｍ１液は通常６〜９の
ｗｉ皿，好ましくは７〜８の［囲から、Ｗ２液は通常６
〜９の範囲、好ましくは７〜８の範囲から適宜選択され
．ｐＨのｉ１１ｍは例えば上記した如き緩街剤を用いて
なされる． 本発明の測定用試液を用いた本発明の測定法を実施する
には、例えば以下の如く行えばよい．即ち，先ず、カプ
セル化抗体の膜成分は溶解するが、標識マイクロカプセ
ルの膜成分は溶解しない界面活性剤を測定対象物を含む
試料と共に第１液に添加して抗体を放出させ，次いでこ
れに補体を含む第２液を作用させた後、常法に従って測
定を行えばよく、澗定方法そのものは自体公知の補体免
疫測定法のそれに従って行うことで足りる．更に具体的
に述べれば、先ず、測定対象物を含む試料と適当な界面
活性剤とを混合して測定用の検体とする．この検体と上
記第１液とを適宜混合し、通常２０〜５０’Ｃ、好まし
くは２５〜４０’Ｃで，５分間乃至１時間反応させる．
次いでこの反応液に上記第２液を適宜混合し，更に通常
２０〜５０”Ｃ，好ましくは２５〜４０℃で，５分間乃
至１時間反応させる．その後，標識マイクロカプセルよ
り遊離されてきた！：Ａ！ＩＩＩ！物質量をその標識物
質の性質に応じた自体公知の測定法により測定する．こ
こで得られた標識物質量を、濃度既知の測定対象物を含
む試料を数種用いて同様の操作を行うことにより予め作
成した、測定対象物濃度と標識マイクロカプセルより遊
離されてくる標識物質量との関係を表わす検量線に当て
はめることにより試料中の測定対象物濃度を測定する． 尚、上記の操作に於いて、第１液及び第２液を検体と反
応させる順序は変更してはならない．また，検体と第１
液とを混合した後は一定時間反応させなければならない
．何故ならば、第１液と第２液との順番を逆にして添加
して反応させた場合，或は第１液と第２液とを殆ど同時
に添加して反応させた場合には，ＩＩｌ！Ｉ定対象物の
測定が事実上不可能となるからである． 標識物質量を測定する方法としては，例えば標識物質が
酵素の場合には、例えば「酵素免疫洞定法、蛋白質核酸
酵素別冊Ｎｏ．３１．北川常廣・南原利夫・辻章夫・石
川栄治編集，５１〜６３頁、共立出版（株）　．　１９
８７年９月ｌＯ日発行」等に記載された方法に準じて該
Ｉ！ｊｓｒｉａ＃ＩＪ質の測定を行えばよく、’６４２
物質が蛍光物質の場合には、例えば「図説蛍光抗体，川
生明著、ｆｉ１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８
３４等に記載されて方法に準じて該ｅｉ識物質の澗定を
行えばよく，標識物質が発光性物質の場合には、例えば
「酵素免疫測定法、煩白貿核酸酵素別冊Ｎｏ．３１、北
川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集，２５２〜２
６３頁、共立出版（株）　，　１９８７年９月１０日発
行」等に記載された方法に準じて該標識物質の洞定を行
えばよく、また，標識物質がスピンラベル化剤としての
性質を有する物質の場合には，例えば「酵素免疫測定法
、蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１、北川常廣・南原利夫
・辻章夫・石川栄治編集、２６４〜２７１頁，共立出版
（株）　．　１９８７年９月１０日発行』等に記載され
た方法に準じて該標識物質の測定を行えばよい．本発明
の澗定法により測定可能な測定対象物としては、何らか
の方法によりそれに対する抗体を作製し得るもの或は生
体内で生じる抗体であれば特に限定することなく挙げら
れるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液中に
含まれる蛋白質，脂質、ホルモン，薬剤，特定物質に対
する抗体等が代表的なものとして挙げられる．更に具体
的には、例えば、α−フェトブロティン（ＡＦＰ），　
ＣＡ１９−９，前立腺特異抗原（ＰＳＡ）　，癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）等の癌マーカー、例えばインシュリン，
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　，チロキシン（
Ｔ４），　トリョードサイロニン（Ｔ３）　，プロラク
チン，甲状線刺激ホルモン（ＴＩＩＳ）等のホルモン、
例えばジゴキシン，フエニトイン，モルヒネ，ニコチン
等の薬物、例えば抗トキソプラズマ抗体等の抗体等が挙
げられる． 以下に実施例を挙げ，本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらにより何ら限定されるものではない． ［実施例コ 参考例１．カプセル化抗体の調製 卵黄レシチンの２０膿κクロロホルム溶液２ｍｌとコレ
ステロールの２０ｍκクロロホルム溶液２ｍｌとを丸底
フラスコに入れて混合した後、ロータリーエバボレータ
ーにより溶媒留去し，次いで約２時間デシケーター中で
真空乾燥を行って、脂質の薄膜をフラスコ壁面に作製さ
せた．これに２００ｍＭ　ｎ−オクチルグルコシド水溶
液（リポボリサツカライドを６．６Ｂ／ａｌ含有）　０
．６＋＊ｌ及び０．０１Ｍ　Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピベラジンーＮ′−２−エタンスルホンＩＩＣヘペス）
緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、ボルテックスミキサーで
均一になるまで攪拌した．次いで，抗ヒトＴ４血清（　
Ｓ　ｍｇＡｂ／ａｌ）０．３ｍｌを加え，更に攪拌を行
った．これを透析チューブに入れ、０．０１Ｍヘペス緩
田液（ｐＨ７．４）で１時間透析した後，リポソーム懸
濁液を超遠心分１ｔ！！　（３５．０００ｒｐｍ，４０
ｍｉｎ．　Ｘ　５　）により精製し、得られたべレフト
を０．０１κヘペス緩街液（ｐＨ７．４）　５　ｍｌに
懸濁して、カプセル化抗Ｔ４抗体を得た． 実施例１．ヒトＴ４の測定 （検体） 所定濃度のヒトＴ４を含む０．１％牛血清アルブミン溶
液５０μ１と前処理剤（２．７％ポリオキシエチレン（
１０）オクチルフエニルエーテル含有の０．１６Ｎ　Ｎ
ａＯｉｌ溶液）１５０μ１とを混合したものを検体とし
た．（試液） 第１液（Ｒｌ）： Ｔ４標識リポソーム（グルコース−６−リン酸脱水素酵
素含有）　　　　１１μｍｏｌ／■１（コレステロール
量として） 参考例１で得たカプセル化抗Ｔ４抗体 ２μｍｏｌ／ｍｌ （コレステロール量として） 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
）　　　　　　　　３．２６／ｍｌｉｎ　　５０ａＭ　
３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスル
ホン酸ａ田液（ｐＨ７．４）第２液（Ｒ２）： 補体（モルモット新鮮血清）　　０．２５ｍｌ／ｍｌグ
ルコース−６−リン酸（Ｇ−８−Ｐ）　　８．５ｍｇ／
ｍｌｉｎ　　５０ｍＭ　｝リス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンｖｌ街液（ＰＨ７．４） （操作法） 検体２０μ１に、Ｒ１２００μ１を添加し，３７℃で５
分間加温した後、Ｒ２１００μ１を添加し、更に３７℃
で５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度変化を測定した．
（結果） 得られた検量線を，第１図に示す．尚，第１図の検量線
は，横軸の各Ｔ４濃度Ｃμｇ７ｄｌ》に対して得られた
吸光度（ＯＤ３４８ｂｌ，，）を縦軸に沿ってプロット
した点を結んだものである． 第１図から明らかな如く、本発明の補体免疫測定用試液
を用いた本発明の補体免疫測定法により良好な検量線が
得られることが判る． また，検体として，バイオランド社のコントロール血清
！，■及び■の各５０μｌに上記の前処理剤１５０μｌ
を加えたものをを用いた以外は、上記と同じ試液を用い
、同様の操作法によりＴ４の測定を行い，上記で得られ
た検量線から各コントロール血清中のＴ４値を求めた． 結果を表１に示す． 表１ （操作法） 検体２０μ１に、Ｒ１Ｂ００μ１を添加し、３７℃で５
分間加温した後．　Ｒ２　３００μ１を添加し，更に３
７℃で５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度変化を測定し
た．（結果） 測定結果を表２に示す． 表２ 表１の結果から明らかな如く、本発明の方法により良好
な測定結果が得られることが判る．実施例２．試液の安
定性試験 （検体） Ｔ４ｉ１：１度０，１０及び２５μ区／ｄｌを含む０．
１％牛血清アルプミン溶液５０μ１と前処理液（実施例
１と同じ．　）　ｔＳＯμｌとを混合したものを検体と
した．（試液） Ｒ１：実施例１と同様に調製したものを１５℃で所定日
数保存したものをＲ１とした． 表２の結果から明らかな如く、本発明の測定用Ｒ２：実
施例１と同じ． 試液は良好な安定性を有していることが判る．尚．表に
は示してはいないが、本発明のカプセル化抗体の代りに
通常の抗体溶液を用いて調製したものをＲ１としてＴ４
の測定を行った場合には、Ｔ４濃度０、１０及び２５μ
ｇ／ｄｉの何れの検体を用いても得られる測定値（ＯＤ
３４ｏｍＪに差は見られず、実用性がないことは明らか
であった． 実施例３．血清中のヒトＴ４の測定 （検体） ２５人分の新鮮ヒト血清の各々５０μｌに前処理剤（２
．７％ボリオキシエチレン（１０）オクチルフエニルエ
ーテル含有の０．１６Ｎ　Ｎａ０１１溶液）　１５０μ
ｌを混合したものを検体とした． （試液） Ｒ１：実施例１と同じ． Ｒ２：実施例１と同じ． （操作法） 実施例１と同じ． 比較例１．血清中のヒトＴ４の測定 実施例３で使用した２５人分の新鮮ヒト血潰を試料とし
，市版のＴ４測定用試薬（アマレツクスＴ４、アマーシ
ャム社製。）を使用して、Ｔ４の測定を行った。尚、操
作は現品説明書に記截の標鵡操作法に従った。

実施例３及び比較例１により得られた測定Ｗに基づいて
作成した相関図をＷ２図に示す。

尚、実施例３及び比鮫例１により得られた測定値を統計
処理して得られた結果を以下に示す．・相関係数　γ＝
　０．９８０６ ・回帰直線弐　Ｙ　＝　１　．０５７　Ｘ　−　０．７
５Ｙ：実施例３により得られた測定値。

Ｘ：比較例１により得られた測定値． 以上の結果から明らかな如く，本ｆｆｌＴ　ｉｌ明の８
１１１定方法により得られたＴ４の測定値は、従来法に
より得られるそれと良好な相関を示すことが判る。

［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は，＃？規な試薬形態の測定用
試液を用いる改良された補体免疫測定法を提供するもの
であり、本発明の測定法によれば、従来の方法では問題
のあった自動分析装置への応用が可能となった点に顕著
な効果を奏するものであり，斯業に貢献するところ大な
る発明である．

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於いて得られたＴ４の検量線を示
したものである． 第２図は、実施例３及び比較例１により得られた測定値
に基づいて作成された相関図を示す．ｆ３１図 特許出願人　和光純薬工業株式会社 Ｔ 濃 度 （μｇ／ｄｉ）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原抗体反応により活性化された補体のマイクロ
   カプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於いて、測定
   対象物に対する抗体として、測定対象物を膜表面に固定
   化し内部に標識物質を保持したマイクロカプセルとは異
   なる性質を有するマイクロカプセル内に保持された抗体
   を用いることを特徴とする免疫測定法。
2. （２）抗体を内部に保持したマイクロカプセルがリポソ
   ームである請求項１に記載の免疫測定法。
3. （３）抗体を内部に保持したマイクロカプセルが界面活
   性剤除去法により調製されたリポソームである請求項２
   に記載の免疫測定法。
4. （４）抗原抗体反応により活性化された補体のマイクロ
   カプセル溶解作用を利用した免疫側定法に用いられる測
   定用試液に於いて、測定対象物を膜表面に固定化し内部
   に標識物質を保持したマイクロカプセル、及び該マイク
   ロカプセルの膜とは異なつた性質を有し、且つ抗体を内
   部に保持したマイクロカプセルを含む第１液と、補体を
   含む第２液とからなることを特徴とする免疫測定用試液
   。
5. （５）抗体を内部に保持したマイクロカプセルがリポソ
   ームである請求項４に記載の免疫測定用試液。
6. （６）抗体を内部に保持したマイクロカプセルが界面活
   性剤除去法により調製されたリポソームである請求項５
   に記載の免疫測定用試液。
7. （７）抗原抗体反応により活性化された補体のマイクロ
   カプセル溶解作用を利用した免疫側定法に於いて、 ｉ）測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保
   持したマイクロカプセル、及び該マイクロカプセルの膜
   とは異なつた性質を有し、且つ抗体を内部に保持したマ
   イクロカプセルを含む第１液と、測定対象物を含む試料
   及び界面活性剤とを反応させる第１工程と、 ｉｉ）第１工程で得られる反応液と、補体を含む第２液
   とを反応させる第２工程と、 を含むことを特徴とする免疫側定法。
8. （８）抗体を内部に保持したマイクロカプセルがリポソ
   ームである請求項７に記載の免疫測定法。
9. （９）抗体を内部に保持したマイクロカプセルが界面活
   性剤除去法により調製されたリポソームである請求項８
   に記載の免疫測定法。