JPH06218272A - リポソーム膜の安定化方法及びそれを利用したハプテン測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、予め膜表面上にハプテンを固定化し
たリポソームに該ハプテンに対する抗体を反応させるこ
とを特徴とする、リポソーム膜安定化方法、並びに該安
定化方法を利用したハプテンの定量方法である。 【効果】本発明は、予めリポソーム膜上に固定されたハ
プテンとそれに対する抗体との反応を利用したリポソー
ム膜の新しい安定化方法を提供するものであり、しかも
その安定化の程度は共存する抗体の量に対応するという
特徴を有しているため、この膜安定化作用を利用するこ
とにより種々のハプテンの定量が可能となるという顕著
な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大な
る発明である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポソーム膜の新しい
膜安定化方法と、該安定化方法を利用したハプテンの新
規定量方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】免疫測定法は、抗原抗体反応を利用した
測定法であり、例えば体液中に存在する、例えばタンパ
ク質，ホルモン，活性ペプチド，オータコイド，腫瘍マ
ーカー，免疫グロブリン等の生体成分、例えばジゴキシ
ン，フェニトイン，フェノバルビタール等の薬剤等の微
量成分を特異的に測定する方法の１つとして広く用いら
れている。

【０００３】現在一般によく利用されている免疫測定法
としては、例えばラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）
やエンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）等が挙げら
れる。これらの方法は検体中の微量成分を定量的に測定
し得る方法ではあるが、夫々問題点も有している。即
ち、ＲＩＡ法に於いては、放射性同位元素を使用しなけ
ればならないことから、特別な設備が必要である点、及
び廃棄物の処理が問題となる点等の問題点が、また、Ｅ
ＩＡ法に於いては、測定に比較的時間を要する点、及び
自動分析機への応用が難しい点等の問題点が夫々挙げら
れる。

【０００４】そこで、最近では、これらの問題点を有さ
ない免疫測定法として、リポソームを用いる免疫活性測
定法（以下、リポソーム免疫測定法と略記する。）が提
案され注目を浴びている。この方法の代表的なものとし
ては、特開昭56-132564号公報に記載の方法が挙げられ
る。この方法は、測定対象物を表面に固定化し内部に標
識物質（例えば酵素等）を保持したリポソーム、検体、
及び測定対象物に対する抗体を混合して抗原抗体反応を
行わせた後、補体を添加すると、該リポソームの表面上
に形成された抗原抗体複合物により活性化された補体が
該リポソーム膜を溶解して、該リポソーム中の標識物質
を遊出させ、その量から検体中の測定対象物量を測定す
るという方法である。この補体を用いたリポソーム免疫
測定法（以下、補体免疫測定法と略記する。）は、ＲＩ
Ａ法やＥＩＡ法の上記問題点を有さず、且つ均一反応系
中で一連の反応を行えるため、簡便に且つ短時間に測定
を実施し得る点から注目を集めている測定方法である。

【０００５】しかしながら、補体免疫測定法では、補体
自体が不安定な物質であるため測定用試薬の安定性に問
題があることや、測定用試薬と非特異的に反応して補体
を活性化しリポソームの一部を破壊して標識物質を遊出
させてしまうような作用を有する物質が試料中に存在し
て測定誤差が生じる等の問題があるところから、補体以
外のリポソーム膜溶解活性を有する物質（以下、膜溶解
剤と略記する）を使用するリポソーム免疫測定法が、次
いで開発された。

【０００６】即ち、リッチフィールドらにより報告され
たミツバチ毒の主要成分であるメリチンに代表される膜
溶解剤を用いた方法がそれである。この方法は、メリチ
ン分子と測定対象物との複合体を調製し、この複合体が
測定対象物に対する抗体と結合するとメリチンの膜溶解
活性が失われることを利用して、メリチン−測定対象物
複合体と遊離の測定対象物とを、該抗体と競合的に反応
させた後、残存するメリチンのリポソーム膜溶解活性を
測定することにより、測定対象物を定量する方法である
（W.J.Litchfieldら，Clin.Chem.,30巻,1441頁,198
4）。しかしながら、この方法も、メリチンの入手が難
しいことや、メリチンを高濃度に使用しなければ充分な
リポソーム膜溶解活性が得られないこと等の問題点があ
り、必ずしも実用的な方法とは言えない。

【０００７】

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、新しいリポソーム膜安定化方法と、この膜
安定化方法を利用した、補体を用いる方法に代わる新し
いハプテンの定量方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、予め膜表面上にハプテンを固
定化したリポソームに該ハプテンに対する抗体を反応さ
せることを特徴とする、リポソーム膜安定化方法、並び
に測定対象のハプテンを含む試料と、予め膜表面上に測
定対象のハプテンを固定化し且つ内部に標識物質を保持
したリポソームと、該ハプテンに対する抗体とを反応さ
せた後に、更に膜溶解剤を反応させ、次いで該リポソー
ム膜の膜溶解剤に対する安定性の増加の程度を測定し、
その増加の程度から試料中のハプテンを定量することを
特徴とする、ハプテンの定量方法、の発明である。

【０００９】即ち、本発明者らは、補体を用いる方法に
代わる、リポソームを使用する新しい測定方法を見出す
べく鋭意研究の途上、予め膜表面上にハプテンを固定化
したリポソーム（以下、ハプテンリポソームと略記す
る。）に、該ハプテンに対する抗体を反応させることに
より該リポソーム膜の膜溶解剤に対する抵抗性が増加す
ること、言い換えれば、該反応によりリポソーム膜の膜
溶解剤に対する安定性が増加すること、更にはこの膜安
定化方法と内部に標識物質を保持したハプテンリポソー
ムとを利用することによりハプテンの定量を行い得るこ
とを見出し本発明を完成させるに至った。

【００１０】本発明に係るハプテンとは、分子量１万以
下の低分子化合物の内で、それ自身単独では抗原性を有
しないが、例えば蛋白質、多糖類の如き抗原性を有する
高分子化合物と結合させると抗原性を示す物質を言う。
より具体的には、例えば血漿、血清、尿、髄液等の生体
体液中に含まれる、例えばサイロキシン（T₄），トリヨ
ードサイロニン（T₃）等の生理活性成分及びその代謝産
物、例えばジゴキシン，フェニトイン，モルヒネ，ニコ
チン，フェノバルビタール等の生体に投与された薬物及
びその代謝産物が好ましく挙げられる。

【００１１】また、本発明に係るハプテンリポソームと
しては、リポソームの膜表面上にハプテンが固定化され
たものであれば特に限定することなく挙げられるが、そ
のようなハプテンリポソームの製法としては例えば架橋
法，脂質活性化法等の常法によりリポソーム膜表面にハ
プテンを固定化する方法、或は予めハプテンを共有結合
させた脂質（以下、ハプテン結合脂質と略記する。）を
用いてリポソームを調製することによりハプテンをリポ
ソーム膜に組み込む方法（特開昭62-501800号公報）等
が挙げられ、中でもハプテン結合脂質を用いてリポソー
ムを調製することによりハプテンをリポソーム膜に組み
込む方法がより好ましく挙げられる。

【００１２】本発明で用いられる、内部に標識物質を保
持したハプテンリポソーム（以下、標識ハプテンリポソ
ームと略記する。）としては、上記した如くして得られ
るハプテンリポソームの内部に標識物質を保持させたも
のであれば何れにてもよい。

【００１３】本発明で用いられるリポソームそのものの
調製方法としては、従来から知られているボルテックス
イング法，超音波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法
（ＲＥＶ法），エタノール注入法，エーテル注入法，プ
レ-ベジクル(Pre-Vesicle)法，フレンチプレスエクスト
ルージョン(French Press Extrusion)法，Ｃa²⁺融合
法，アニーリング(Annealing)法，凍結融解融合法，凍
結乾燥法，W/O/Wエマルジョン法等の方法や、比較的新
しいものとして、S.M.Grunerら［Biochemistry, 24,283
3(1985)］により報告された Stable Plurilamellar Ves
icle 法（ＳＰＬＶ法）、本発明者の一部らによって報
告されたリポポリサッカライドを膜構成成分の一部とす
る方法（特開昭63-107742号公報）等の方法が全て挙げ
られる。また、その主たる膜構成成分としては、通常の
リポソームの調製に於いて膜素材として用いられている
天然レシチン（例えば、卵黄レシチン，大豆レシチン
等）やジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC)，
ジミリストイルフォスファチジルコリン(DMPC)，ジステ
アロイルフォスファチジルコリン(DSPC)，ジオレオイル
フォスファチジルコリン(DOPS)，ジパルミトイルホスフ
ァチジルエタノールアミン(DPPE)，ジミリストイルフォ
スファチジルエタノールアミン(DMPE)，ジパルミトイル
フォスファチジルグリセロール(DPPG)，ジミリストイル
フォスファチジン酸(DMPA)，卵黄フォスファチジルグリ
セロール等のリン脂質、或はガングリオシド糖脂質，ス
フィンゴ糖脂質，グリセロ糖脂質等の糖脂質等の１種又
は２種以上、或はこれらとコレステロール類との混合
系、或はこれらに更にリポポリサッカライド等を組み合
わせたもの等が全て挙げられる。

【００１４】本発明に係るハプテンリポソーム（或は標
識ハプテンリポソーム）の調製法を、ハプテン結合脂質
を原料の１つとして用いて界面活性剤除去法により調製
する場合を例に取り上げて以下に詳しく説明する。即
ち、先ず例えば前記公知文献（特開昭62-501800号公
報）に記載された方法に準じて調製されたハプテン結合
脂質とコレステロール類とを適当な有機溶媒（例えば、
クロロホルム，エーテル類，アルコール類等）に溶解
し、減圧下で濃縮乾固後、デシケーター中で充分減圧乾
燥する。次いで、作製された脂質フィルムに界面活性剤
水溶液(20〜100mM）を加えて、これを均一に分散させ
る。ここで使用する界面活性剤としては、例えば、従来
からこの分野に於いてよく用いられているコール酸，ポ
リオキシエチレンオクチルフェニルエーテル，オクチル
グルコシド等が挙げられるが、望ましくは、オクチルグ
ルコシドの様な臨界ミセル濃度(CMC)の高い界面活性剤
が良い。次に、要すればリポポリサッカライド類を粉末
のまま、或は溶液として加え、更に要すれば適当な標識
物質を含む溶液を加えて充分に攪拌混合する。この後、
直ちに界面活性剤を除去するのが最も望ましいが、その
方法としては透析法，ゲル濾過法，樹脂吸着法等、自体
公知の方法が挙げられる。処理条件は時間として１時間
乃至１昼夜で、温度はリポソームの膜構成成分等により
若干異なるが、０〜70℃位の範囲で適宜選択して行えば
よい。特に、界面活性剤を除去する方法として、Sephar
ose 4B（ファルマシア社商品名）を用いるゲル濾過や遠
心分離等の操作により行えば、遊離の標識物質等も同時
に除去できるので有利である。かくして得られたハプテ
ンリポソーム（或は標識ハプテンリポソーム）は限外濾
過等により所定の濃度に濃縮して使用、又は保存され
る。ハプテンリポソーム（或は標識ハプテンリポソー
ム）のサイズの均一化に関しては、繁用されているポリ
カーボネート膜を用いる方法で良いが、ゲル濾過法［例
えば Sephacryl S-1000（ファルマシア社商品名）を使
用］で行うのも効果的である。

【００１５】界面活性剤除去法以外の方法で本発明に係
るハプテンリポソーム（或は標識ハプテンリポソーム）
を調製する場合についても、同様に、自体公知の或はそ
の他のリポソーム調製法に準じてこれを行えば良い。

【００１６】標識ハプテンリポソーム内に保持される標
識物質としては、補体免疫測定法に於いて通常用いられ
る、リポソーム外に遊出した際に検出可能な標識物質で
あれば何れにてもよく特に限定されることなく挙げられ
るが、例えばアルカリホスファターゼ，グルコース-6-
リン酸脱水素酵素，β-ガラクトシダーゼ等の酵素類、
例えば4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド、
p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、4-メチルウンベリ
フェリルフォスフェート、グルコース-6-リン酸等の酵
素の基質、例えばカルボキシフルオレセイン、フルオレ
セインイソチオシアネート、フルオレセインイソシアネ
ート、テトラローダミンイソチオシアネート、5-ジメチ
ルアミノ-1-ナフタレンスルフォニルクロリド等の蛍光
物質類、例えばアルセナゾIII，4-(2-ピリジルアゾ)レ
ゾルシノール，2-(5-ブロモ-2-ピリジルアゾ)-5-(N-プ
ロピル-N-スルホプロピルアミノ)フェノールナトリウム
塩等の色素類、例えばルミノール，イソルミノール，ル
シフェリン，エオシンＹ，オーラミンＯ，ビス(2,4,6-
トリクロロフェニル)オキザレート，N-メチルアクリジ
ニウムエステル等の発光物質類、例えば2,2,6,6-テトラ
メチルピペリジン-1-オキシル(TEMPO)等に代表されるス
ピンラベル化剤類等が代表的なものとして挙げられる。
また、リポソームに保持される標識物質の量は標識物質
の種類により異なり特に限定されないが、例えば標識物
質がグルコース-6-リン酸脱水素酵素の場合を例にとる
と、リポソーム調製時に使用される標識物質を含む溶液
として通常1000〜5000U/ml、好ましくは2000〜3000U/ml
の濃度の酵素溶液を用いればよい。

【００１７】本発明に於ける天然起源の膜溶解剤として
は、例えばメリチン，ストレプトリシンＯ，ポリミキシ
ンＢのような蛋白質（或はポリペプチド）、例えばサポ
ニン，ジギトニンのようなグリコシド、及び例えばアン
ホテリシンＢ，フィリピン，ナイスタチンなどのポリエ
ン抗生物質のようなマクロライド等が好ましく挙げられ
る。

【００１８】本発明に於ける合成膜溶解剤としては、例
えばポリオキシエチレンセチルエーテル，ポリオキシエ
チレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル類、例えばポリオキシエチレンオクチルフェ
ニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニル
エーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレエート，ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミ
テート，ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレー
ト，ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポ
リオキシエチレンアルキルエステル類、例えばオクタノ
イル-N-メチルグルカミド，ノナノイル-N-メチルグルカ
ミド，デカノイル-N-メチルグ ルカミド等のメチルグル
カミド誘導体、例えばn-オクチル-β-D-グルコシド等の
アルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤、例えばドデ
シル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリルベンゼンスルホン
酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタンドデシルサルフェイト(Tris DS)
等のアニオン界面活性剤、例えばオクタデシルアミン酢
酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩，ステアリルアミン酢
酸塩，ラウリルアミン酢酸塩，ラウリルジエタノールア
ミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化オクタデ
シルトリメチルアンモニウム，塩化ドデシルトリメチル
アンモニウム，塩化セチルトリメチルアンモニウム，臭
化セチルトリメチルアンモニウム，メチル硫酸アリルト
リメチルアンモニウム，塩化ベンザルコニウム，塩化テ
トラデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化オクタ
デシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化ラウリルジ
メチルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム
塩、例えば塩化ラウリルピリジニウム，塩化ステアリル
アミドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩
等のカチオン界面活性剤、3-[(3-コラミドアミドプロピ
ル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネイト、3-
[(3-コラミドアミドプロピ ル)ジメチルアンモニオ]-2-
ヒドロキシ-1-プロパンスルホネイト等の両性界面活性
剤等の界面活性剤、例えばビス(3-カルボシキプロパノ
イル)-トリトリチル-β-シクロデキストリン等のシクロ
デキストリン誘導体等が好ましく挙げられる。

【００１９】本発明に於いて用いられるハプテンリポソ
ーム（或は標識ハプテンリポソーム）の使用量を最終反
応液中の濃度で示すと、該リポソームに含有されるリン
脂質量として通常1〜500nmol/ml、好ましくは5〜100nmo
l/mlである。

【００２０】本発明の膜安定化方法は、例えば以下の如
くして容易に実施し得る。即ち、ハプテンリポソーム
（或は標識ハプテンリポソーム）を含有する溶液に、該
リポソーム上に固定化されたハプテンに対する抗体を添
加して反応を行わせることにより、該リポソーム膜の膜
溶解剤対する安定性は添加した抗体量に応じて増加す
る。

【００２１】尚、このとき添加する抗体量としては、ハ
プテンリポソーム（或は標識ハプテンリポソーム）膜上
のハプテンと反応して該リポソーム膜の膜溶解剤に対す
る安定性を増加させ得る量であれば特に限定されない
が、例えば該リポソーム膜に含有されるハプテン量（モ
ル）に対して、通常0.5〜５倍量、好ましくは１〜３倍
量の範囲から適宜選択される。

【００２２】本発明の膜安定化方法を利用することによ
り種々のハプテンの定量を効果的に行うことができる。
この定量方法について、以下に詳細に述べる。 〈定量方法〉 （試液） ・膜表面上に測定対象のハプテンを固定化した標識ハプ
テンリポソーム ・上記測定対象のハプテンに対する抗体 ・膜溶解剤 （原理及び操作方法）上記ハプテンに対する抗体を含む
溶液に、測定対象のハプテンを含む試料と標識ハプテン
リポソームとを添加して反応させると、該抗体と試料中
の該ハプテン、或は該抗体と該リポソーム膜表面上に固
定化された該ハプテンとにより抗原抗体反応が競合的に
起こる。従って、ここで膜溶解剤を含有する溶液を添加
すると、試料中の該ハプテン量が多ければ該リポソーム
膜表面上に固定化される抗体量は少なくなるのでリポソ
ーム膜が安定化される割合が低下して、該リポソームに
保持された標識物質の遊出量が増加する現象が起こる
し、試料中の該ハプテン量が少なければこれと反対に標
識物質の遊出量が減少するという現象が起こる。従っ
て、上記の反応の結果遊出された標識物質量をその性質
に応じた方法により測定し、得られた測定値を、予め既
知の該ハプテン溶液を試料として同様に反応を行って作
成した該ハプテン濃度と遊出される標識物質量との関係
を表わす検量線に当てはめれば、試料中の該ハプテン量
を測定することが可能となる。

【００２３】尚、上記定量方法を実施するために用いら
れる測定用試液としては、例えば以下の如き３試液の組
合せが好ましく挙げられる。 ・第１試液 測定対象のハプテンに対する抗体を含有。 ・第２試液 膜表面上に測定対象のハプテンを固定化した標識ハプテ
ンリポソームを含有。 ・第３試液 膜溶解剤を含有。

【００２４】このようにして調製された各測定用試液の
pＨとしては、上記した如き試薬の保存安定性や抗原抗
体反応等を阻害しないpＨであれば特に限定されない
が、通常５〜９、好ましくは６〜８の範囲から適宜選択
され、該試液中には、このpＨを維持するために例えば
リン酸塩、ホウ酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、グッド（Good）緩衝剤、ベロナール緩衝剤等
の緩衝剤が含まれていてもよい。

【００２５】これら本発明の定量方法に於いて用いられ
る試薬類或いはその他必要に応じて添加される各種防腐
剤、標識物質を測定するのに必要な試薬（例えば、酵素
の基質等）等は、自体公知の補体免疫測定法に於いて通
常用いられているものの中から適宜選択して使用すれば
よく、また、これら試薬類等の測定用試液中の濃度範囲
等も自体公知の補体免疫測定法に於いて通常用いられる
濃度範囲等から適宜選択し決定すれば足りる。

【００２６】上記の定量方法を実施する際の反応条件と
しては、標識物質の有する検出可能な性質を失活させず
且つ抗原抗体反応を阻害しない条件であれば特に限定さ
れないが、具体的には反応温度としては通常20〜50℃、
好ましくは25〜40℃の範囲から、反応時間としては通常
５〜60分間、好ましくは５〜30分間の範囲から適宜選択
される。

【００２７】本発明の定量方法に於いて用いられる膜溶
解剤としては、天然起源のものでも、界面活性剤のよう
な合成膜溶解剤でも何れにてもよい。また、本定量方法
に於けるこれらの使用濃度としては、用いるリポソーム
の膜組成や調製方法、或は膜溶解剤の種類により異なる
が、その膜溶解剤によるリポソーム膜溶解が確認され、
且つリポソーム膜上に固定化されたハプテンに対する抗
体を添加することにより該リポソーム膜の膜溶解剤に対
する安定性が増加することが充分に観察される濃度であ
れば何れにてもよく、通常リポソーム溶液中の最終濃度
として、0.001〜1.0V/V%、好ましくは0.005〜0.5V/V%の
範囲で適宜選択される。

【００２８】尚、上記の定量方法に使用する膜溶解剤
は、上記の如き濃度範囲で使用した場合に標識物質の有
する検出可能な性質を失活させないものであって、且つ
抗原抗体反応を阻害しないもののなかから適宜選択され
なければならないことは言うまでもない。

【００２９】本発明の定量方法に於いて使用される抗体
としては、測定対象に対する抗体であれば何れにてもよ
く特に限定されない。即ち、常法、例えば「免疫実験学
入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、19
81」等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、
ラット、マウス等の動物に測定対象を免疫して作製され
るポリクローナル抗体でも、或はまた常法、即ちケラー
とミルスタイン（Nature,256巻,495頁,1975）により確
立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの
細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを
融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クロー
ン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこれ
らを適宜組み合わせて用いる等は任意である。

【００３０】標識物質の量を測定する方法としては、例
えば標識物質が酵素の場合には、例えば「酵素免疫測定
法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利
夫・辻章夫・石川栄治編集、51〜63頁、共立出版
（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準
じて該標識物質の測定を行えばよく、標識物質が蛍光物
質の場合には、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第
１版、（株）ソフトサイエンス社、1983」等に記載され
た方法に準じて該標識物質の測定を行えばよく、標識物
質が発光性物質の場合には、例えば「酵素免疫測定法、
蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川栄治編集、252〜263頁、共立出版（株）、
1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて該標
識物質の測定を行えばよく、また、標識物質がスピンラ
ベル化剤としての性質を有する物質の場合には、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北
川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集、264〜271
頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載さ
れた方法に準じて該標識物質の測定を行えばよい。

【００３１】以下に実施例等を挙げて本発明を更に詳細
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

【００３２】

【実施例】

参考例１．標識ハプテンリポソーム液の調製 ジミリストイルホスファチジルコリン48mg（71μmo
l）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール5.5mg
（８μmol）、コレステロール31.75mg（82μmol）及び
前記公知文献（特開昭62-501800号公報）に記載された
方法に準じて調製された所定のハプテンにより修飾され
たジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン 0.7
9μmol（使用リン脂質量の１mol％）を５mlのクロロホ
ルムに溶解した後、ロータリーエバポレーターを用いて
溶媒を留去し、次いで減圧デシケーター中で一夜放置し
薄膜をフラスコ壁面に作製させた。これにグルコース-6
-リン酸脱水素酵素水溶液7.5ml［2,500U/ml、10mM トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝液
（pＨ7.8）溶液］を加え、ボルテックスミキサーで均一
になるまで撹拌しリポソーム懸濁液を調製した。得られ
たリポソーム懸濁液をエクストルーダー（ライペックス
バイオメンブランズ社登録商標）を用いてポアサイズが
２μm、１μm、0.6μmのニュクリポアー膜（ニュクリポ
アー社登録商標）で２回、0.4μm及び0.2μmのニュクリ
ポアー膜で３回サイジングを行い、リポソームの懸濁液
を得た。得られたリポソーム懸濁液を遠心チューブに移
し４℃、36,000rpmで１時間遠心する操作を５回繰り返
し、最後に５mlの100mM Tris 緩衝液（pＨ7.8）に懸濁
したものを標識ハプテンリポソーム液とした。尚、使用
したハプテン修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノ
ールアミン（以下、H-DPPEと略記する。）の構造式は以
下の通りである。 ・フェニトイン(PHT)を修飾したもの（以下、式１と略
記する。）

【式１】 ・ジゴキシン(Dx)を修飾したもの（以下、式２と略記す
る。）

【式２】 ・トリヨードサイロニン(T₃)を修飾したもの Ａ）（以下、式３と略記する。）

【式３】 Ｂ）（以下、式４と略記する。）

【式４】 又は、 Ｃ）（以下、式５と略記する。）

【式５】

【００３３】 実施例１．標識ハプテンリポソーム膜の安定化 （試料）所定の抗血清を所定希釈倍率となるように100m
M Tris-HCl 緩衝液（pＨ7.8、30mM NaCl、15mM アジ化
ナトリウム及び0.5mM エチレンジアミン四酢酸・2Na含
有。）で希釈したものを試料とした。尚、抗血清は以下
のものを使用した。 ・抗PHT抗体：兎由来、和光純薬工業(株)製、IgG分画。 ・抗T₃抗体：国際バイオ(株)製、モノクローナル抗体。 ・抗Dx抗体：兎由来、バイオデザイン社製、。 （リポソーム試液）参考例１で調製した各種標識ハプテ
ンリポソーム液を225mM Tris-HCl 緩衝液（pＨ7.8、15m
M アジ化ナトリウム含有。）で500倍に希釈したものを
リポソーム試液とした。 （膜溶解剤溶液）所定の膜溶解剤を所定濃度含む100mM
Tris-HCl緩衝液（pＨ7.8）を調製し膜溶解剤溶液とし
た。 （酵素基質溶液）グルコース-6-リン酸を15.4mM、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を7.0mM、3-(N
-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPS
O）を20mM、Trisを20mM、アジ化ナトリウムを15mM及びN
aCl 55mM含む溶液を調製し、酵素基質溶液とした。 （操作法）所定の試料50μlを、該試料中の抗体に対す
るハプテンを膜上に固定化した標識ハプテンリポソーム
を含むリポソーム試液100μlに加え、37℃で2.5分間反
応させた後、所定の膜溶解剤溶液20μlを添加し、更に3
7℃で2.5分間インキュベイトした。次いでこれに酵素基
質溶液95μlを添加して37℃で10分間インキュベイトし
た後、10分間当たりの340nmの吸光度変化（ΔＥ）を測
定した。得られた結果を表１〜３に示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】尚、上記表１〜３に於いて、TX-100はトリ
トン Ｘ-１００（化学名；ポリオキシエチレン(10)オ
クチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商
品名）を、CHAPSOは3-[(3-コラミドアミドプロピル) ジ
メチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネ
イト（同仁化学研究所製）を夫々示す。表１〜３の結果
から明らかなように、標識ハプテンリポソーム膜は対応
する抗体の添加により遊出する酵素量が減少すること、
即ち該リポソーム膜は抗体との反応により膜溶解剤に対
して安定化することが判る。尚、PHTを膜表面に固定化
した標識ハプテンリポソームに、T₃に対する抗体又はDx
に対する抗体を反応させたところ、抗体の添加による遊
出酵素量の減少は確認できなかった。従って、本発明に
よるリポソーム膜の安定化は、抗原抗体反応に起因する
ものであると推測される。

【００３８】実施例２．PHTの測定 （試料）所定濃度のPHTを含む100mM Tris-HCl 緩衝液
（pＨ7.8）を試料とした。 （酵素基質液）グルコース-6-リン酸を15.4mM、ＮＡＤ
を7.0mM、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスル
ホン酸（MOPSO）を20mM、Trisを20mM、アジ化ナトリウ
ムを15mM、NaClを55mM含む溶液で100倍に希釈した抗PHT
抗体（和光純薬工業(株)社製、IgG分画）溶液を酵素基
質溶液とした。 （リポソーム試液）参考例１で調製したPHT固定化標識
リポソーム液を225mM Tris-HCl 緩衝液（pＨ7.8）で500
倍に希釈したものをリポソーム試液とした。 （膜溶解剤溶液）所定の膜溶解剤を所定濃度含む100mM
Tris-HCl緩衝液（pＨ7.8）を調製し膜溶解剤溶液とし
た。 （操作法）試料5μlと酵素基質液100μlとを混合し、37
℃で2.5分間インキュベイトした後、リポソーム試液95
μlを添加し、更に37℃で2.5分間インキュベイトした。
次いでこれに膜溶解剤溶液50μlを添加して37℃で５分
間インキュベイトした後、５分間当たりの340nmの吸光
度変化（ΔＥ）を測定した。得られたΔＥと試料中のPH
T濃度との関係を表わす検量線を図１〜３に示す。尚、
図１は膜溶解剤溶液としてTX-100の2.0％溶液を用いた
場合に得られた結果を、図２は膜溶解剤溶液としてCHAP
SOの0.8％溶液を用いた場合に得られた結果を、図３は
膜溶解剤溶液としてメリチン（ＳＩＧＭＡ社製）の0.02
5％溶液を用いた場合に得られた結果を夫々示す。図１
〜３の結果から明らかな如く、本発明の方法によりPHT
を感度よく測定し得ることが判る。

【００３９】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、予めリポソ
ーム膜上に固定されたハプテンとそれに対する抗体との
反応を利用したリポソーム膜の新しい安定化方法を提供
するものであり、しかもその安定化の程度は共存する抗
体の量に対応するという特徴を有しているため、この膜
安定化作用を利用することにより種々のハプテンの定量
が可能となるという顕著な効果を奏するものであり、斯
業に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２に於いて、膜溶解剤溶液としてトリト
ン Ｘ−１００（化学名；ポリオキシエチレン(10)オク
チルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品
名）の2.0％溶液を用いた場合に得られた検量線を示
す。

【図２】実施例２に於いて、膜溶解剤溶液として3-[(3-
コラミドアミドプロピル) ジメチルアンモニオ]-2-ヒド
ロキシ-1-プロパンスルホネイト(CHAPSO)の0.8％溶液を
用いた場合に得られた検量線を示す。

【図３】実施例２に於いて、膜溶解剤溶液としてメリチ
ン（ＳＩＧＭＡ社製）の0.025％溶液を用いた場合に得
られた検量線を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】予め膜表面上にハプテンを固定化したリポ
   ソームに該ハプテンに対する抗体を反応させることを特
   徴とする、リポソーム膜安定化方法。
2. 【請求項２】測定対象のハプテンを含む試料と、予め膜
   表面上に測定対象のハプテンを固定化し且つ内部に標識
   物質を保持したリポソームと、該ハプテンに対する抗体
   とを反応させた後に、更に補体以外のリポソーム膜溶解
   活性を有する物質（以下、膜溶解剤と略記する）を反応
   させ、次いで該リポソーム膜の膜溶解剤に対する安定性
   の増加の程度を測定し、その増加の程度から試料中のハ
   プテンを定量することを特徴とする、ハプテンの定量方
   法。
3. 【請求項３】ハプテンに対する抗体を、リポソーム膜に
   含有されるハプテン量（モル）の0.5〜５倍量使用す
   る、請求項２に記載の定量方法。。