JP2927486B2 - 免疫測定法及びそれに用いる試液 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、抗原抗体反応により活性化された補体のマ
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法の改良
法、及びそれに用いられる安定化された、且つ自動分析
装置に適用可能な測定試液に関する。
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法の改良
法、及びそれに用いられる安定化された、且つ自動分析
装置に適用可能な測定試液に関する。
［発明の背景］ 免疫測定法は抗原抗体反応を利用した測定法で、例え
ば体液中の微量成分を特異的に測定する方法の１つとし
て広く用いられている。
ば体液中の微量成分を特異的に測定する方法の１つとし
て広く用いられている。
現在一般によく利用されている免疫測定法としては、
例えばラジオイムノアッセイ法（RIA法）やエンザイム
イムノアッセイ法（EIA法）等が挙げられる。これらの
方法は検体中の微量成分を定量的に測定し得る方法では
あるが、夫々問題点も有している。即ち、RIA法に於い
ては、放射性同位元素を使用しなければならないことか
ら、特別な設備が必要である点、及び廃棄物の処理が問
題となる点等の問題点が、また、EIA法に於いては、測
定に比較的時間を要する点、及び自動分析機への応用が
難しい点等の問題点が夫々挙げられる。
例えばラジオイムノアッセイ法（RIA法）やエンザイム
イムノアッセイ法（EIA法）等が挙げられる。これらの
方法は検体中の微量成分を定量的に測定し得る方法では
あるが、夫々問題点も有している。即ち、RIA法に於い
ては、放射性同位元素を使用しなければならないことか
ら、特別な設備が必要である点、及び廃棄物の処理が問
題となる点等の問題点が、また、EIA法に於いては、測
定に比較的時間を要する点、及び自動分析機への応用が
難しい点等の問題点が夫々挙げられる。
そこで、最近では、これらの問題点を有さない免疫測
定法として、抗原抗体反応により活性化された補体が有
するマイクロカプセルの溶解作用を利用した測定法が提
案され注目を浴びている。
定法として、抗原抗体反応により活性化された補体が有
するマイクロカプセルの溶解作用を利用した測定法が提
案され注目を浴びている。
この方法の代表的なものとしては、例えば測定対象物
を表面に固定化し内部に標識物質（例えば酵素等）を保
持した脂質膜小胞（リポソーム）等のマイクロカプセル
（以下、標識マイクロカプセルと略記する。）を用いる
方法（以下、補体免疫測定法と略記する。）が挙げられ
る（特開昭56−132564号公報）。この方法は、検体、標
識マイクロカプセル及び測定対象物に対する抗体を混合
して抗原抗体反応を行わせた後、補対を添加すると、標
識マイクロカプセルの表面上に形成された抗原抗体複合
物により活性化された補体がマイクロカプセルの膜を溶
解して、標識マイクロカプセル中の標識物質を放出さ
せ、その量から検体中の測定対象物量を測定するという
方法である。この補体免疫測定法は、抗原抗体反応を利
用した方法であるところから微量の測定対象物を特異的
に測定し得るのみならず、均一反応系中で一連の反応を
行えるため、従来法であるRIA法やEIA法に比較して、簡
便に且つ短時間に測定を実施し得る点から注目を集めて
いる測定方法である。
を表面に固定化し内部に標識物質（例えば酵素等）を保
持した脂質膜小胞（リポソーム）等のマイクロカプセル
（以下、標識マイクロカプセルと略記する。）を用いる
方法（以下、補体免疫測定法と略記する。）が挙げられ
る（特開昭56−132564号公報）。この方法は、検体、標
識マイクロカプセル及び測定対象物に対する抗体を混合
して抗原抗体反応を行わせた後、補対を添加すると、標
識マイクロカプセルの表面上に形成された抗原抗体複合
物により活性化された補体がマイクロカプセルの膜を溶
解して、標識マイクロカプセル中の標識物質を放出さ
せ、その量から検体中の測定対象物量を測定するという
方法である。この補体免疫測定法は、抗原抗体反応を利
用した方法であるところから微量の測定対象物を特異的
に測定し得るのみならず、均一反応系中で一連の反応を
行えるため、従来法であるRIA法やEIA法に比較して、簡
便に且つ短時間に測定を実施し得る点から注目を集めて
いる測定方法である。
しかしながら、この方法は、自動分析装置への適用に
は問題があり、特に現在自動分析装置の主流となってい
る２試液系への適用に難があり、そのような報告は皆無
に近い。この原因は、この方法に用いられる試薬類（標
識マイクロカプセル、測定対象物に対する抗体及び補
体）を２つの試液中に適当に組み合わせて保存した場
合、その安定性に問題があるためである。
は問題があり、特に現在自動分析装置の主流となってい
る２試液系への適用に難があり、そのような報告は皆無
に近い。この原因は、この方法に用いられる試薬類（標
識マイクロカプセル、測定対象物に対する抗体及び補
体）を２つの試液中に適当に組み合わせて保存した場
合、その安定性に問題があるためである。
即ち、この方法に於いて用いられる主な試薬類３種を
２つの試液に分けて保存しようとする場合、以下の３つ
の組み合わせが考えられる。
２つの試液に分けて保存しようとする場合、以下の３つ
の組み合わせが考えられる。
ａ）・補体と標識マイクロカプセルとの混合溶液 ・抗体溶液 ｂ）・補体と抗体との混合溶液 ・標識マイクロカプセル溶液 ｃ）・標識マイクロカプセルと抗体との混合溶液 ・補体溶液 しかしながら、上記の何れの組み合わせで試液を調製
したとしても保存時の安定性が悪く実用的ではない。例
えばａ）の組み合わせの場合、試液に共存する標識マイ
クロカプセルと補体の相互作用により補体が不活性化さ
れ、免疫応答が徐々に低下してくるし、ｂ）の組み合わ
せの場合、測定対象物が薬物等のように動物由来の補体
溶液中に混入してくる恐れのないものの場合にはある程
度安定性は認められるものの、測定対象物がホルモンや
癌マーカー等補体溶液中に存在する可能性の高いものの
場合には、補体と抗体との混合溶液中で抗原抗体反応及
び補体の不活性化が起こるためその試液の安定性が悪く
なる。また、ｃ）の組み合わせの場合、標識マイクロカ
プセル上に固定化された測定対象物（抗原）と抗体とが
先に反応してしまうため測定感度が低下すると言う現象
が起きてしまう。従って、現在のところ補体免疫測定法
に用いる試液は、測定対象物によっては３試液系とせざ
るを得ない場合が多く、自動分析装置への適用が可能
な、２試液系の補体免疫測定用試液の出現が強く望まれ
ていた。
したとしても保存時の安定性が悪く実用的ではない。例
えばａ）の組み合わせの場合、試液に共存する標識マイ
クロカプセルと補体の相互作用により補体が不活性化さ
れ、免疫応答が徐々に低下してくるし、ｂ）の組み合わ
せの場合、測定対象物が薬物等のように動物由来の補体
溶液中に混入してくる恐れのないものの場合にはある程
度安定性は認められるものの、測定対象物がホルモンや
癌マーカー等補体溶液中に存在する可能性の高いものの
場合には、補体と抗体との混合溶液中で抗原抗体反応及
び補体の不活性化が起こるためその試液の安定性が悪く
なる。また、ｃ）の組み合わせの場合、標識マイクロカ
プセル上に固定化された測定対象物（抗原）と抗体とが
先に反応してしまうため測定感度が低下すると言う現象
が起きてしまう。従って、現在のところ補体免疫測定法
に用いる試液は、測定対象物によっては３試液系とせざ
るを得ない場合が多く、自動分析装置への適用が可能
な、２試液系の補体免疫測定用試液の出現が強く望まれ
ていた。
［発明の目的］ 本発明は上記した如き状況に鑑みなされたもので、保
存時の安定性が良好で且つ自動分析装置への適用が可能
な、２試液系の補体免疫測定法及びこれに用いる測定試
液を提供することをその目的とする。
存時の安定性が良好で且つ自動分析装置への適用が可能
な、２試液系の補体免疫測定法及びこれに用いる測定試
液を提供することをその目的とする。
［発明の構成］ 本発明は、抗原抗体反応により活性化された補体の
マイクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於い
て、測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保
持した多重層膜リポソーム（以下、第１のリポソームと
略記する。）と、測定対象物に対する抗体を内部に保持
した単一層膜リポソーム（以下、第２のリポソームと略
記する。）と、膜溶解剤としての界面活性剤を用いるこ
とを特徴とする免疫測定法、抗原抗体反応により活性
化された補体のマイクロカプセル溶解作用を利用した免
疫測定法に用いられる測定用試液に於いて、第１のリポ
ソーム及び第２のリポソームを含む第１液と、補体を含
む第２液とからなることを特徴とする免疫測定法試液、
並びに抗原抗体反応により活性化された補体のマイク
ロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於いて、
ｉ）第１のリポソーム及び第２のリポソームを含む第１
液と、測定対象物を含む試料及び界面活性剤とを反応さ
せる第１工程と、ii）第１工程で得られる反応液と、補
体を含む第２液とを反応させる第２工程と、を含むこと
を特徴とする免疫測定法の発明である。
マイクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於い
て、測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保
持した多重層膜リポソーム（以下、第１のリポソームと
略記する。）と、測定対象物に対する抗体を内部に保持
した単一層膜リポソーム（以下、第２のリポソームと略
記する。）と、膜溶解剤としての界面活性剤を用いるこ
とを特徴とする免疫測定法、抗原抗体反応により活性
化された補体のマイクロカプセル溶解作用を利用した免
疫測定法に用いられる測定用試液に於いて、第１のリポ
ソーム及び第２のリポソームを含む第１液と、補体を含
む第２液とからなることを特徴とする免疫測定法試液、
並びに抗原抗体反応により活性化された補体のマイク
ロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於いて、
ｉ）第１のリポソーム及び第２のリポソームを含む第１
液と、測定対象物を含む試料及び界面活性剤とを反応さ
せる第１工程と、ii）第１工程で得られる反応液と、補
体を含む第２液とを反応させる第２工程と、を含むこと
を特徴とする免疫測定法の発明である。
即ち、本発明者らは、自動分析装置への適用が可能
な、補体免疫測定法を見出すべく鋭意研究の途上、種々
の細胞膜溶解作用を有する物質（以下、膜溶解剤と略記
する。）のマイクロカプセルに対する溶解性が、マイク
ロカプセル膜の構成成分及びその調製法により種々異な
ってくることを見出し、この点に着目して更に研究を重
ねた結果、補体免疫測定法に於いて用いられる抗体を、
特定の膜溶解剤、即ち界面活性剤に対して第１のリポソ
ームよりも溶解され易いリポソーム内に保持させて用い
れば、保存時の安定性が良好で且つ自動分析装置に利用
し得る２試液系の補体免疫測定法を組み立てることがで
きることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、
本発明の測定試液は第１液が第１のリポソームと第２の
リポソームを含んでなり、第２液は補体を含んでなる。
な、補体免疫測定法を見出すべく鋭意研究の途上、種々
の細胞膜溶解作用を有する物質（以下、膜溶解剤と略記
する。）のマイクロカプセルに対する溶解性が、マイク
ロカプセル膜の構成成分及びその調製法により種々異な
ってくることを見出し、この点に着目して更に研究を重
ねた結果、補体免疫測定法に於いて用いられる抗体を、
特定の膜溶解剤、即ち界面活性剤に対して第１のリポソ
ームよりも溶解され易いリポソーム内に保持させて用い
れば、保存時の安定性が良好で且つ自動分析装置に利用
し得る２試液系の補体免疫測定法を組み立てることがで
きることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、
本発明の測定試液は第１液が第１のリポソームと第２の
リポソームを含んでなり、第２液は補体を含んでなる。
本発明の測定法に於いて特定の膜溶解剤として用いら
れる界面活性剤としては、第２のリポソームの膜成分は
溶解するが、第１のリポソームの膜成分は溶解しないも
のであって、測定に影響のないものであれば特に限定さ
れることなく挙げられるが、具体的には、例えばポリオ
キシエチレンセチルエーテル，ポリオキシエチレンラウ
リルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル
類、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテ
ル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト，ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート，
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート，ポリ
オキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオキシ
エチレンアルキルエステル類、例えばオクタノイル−Ｎ
−メチルグルカミド，ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミ
ド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等のメチルグル
カミド誘導体、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド等のアルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤、例え
ばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリルベンゼン
スルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンドデシルサルフェイト
（Tris DS）等のアニオン界面活性剤、例えばオクタデ
シルアミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩，ステア
リルアミン酢酸塩，ラウリルアミン酢酸塩，ラウリルジ
エタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば
塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム，塩化ドデシ
ルトリメチルアンモニウム，塩化セチルトリメチルアン
モニウム，臭化セチルトリメチルアンモニウム，塩化ラ
ウリルトリメチルアンモニウム，メチル硫酸アリルトリ
メチルアンモニウム，塩化ベンザルコニウム，塩化テト
ラデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化オクタデ
シルジメチルベンジルアンモニウム，塩化ラウリルジメ
チルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、
例えば塩化ラウリルピリジニウム，塩化ステアリルアミ
ドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等の
カチオン界面活性剤、３−［（３−コラミドアミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネイ
ト、３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネイ
ト等の両性界面活性剤、サポニン（大豆由来）、ジギト
ニン等の天然の界面活性剤等の界面活性剤が挙げられ
る。また、これらの使用濃度としては、第２のリポソー
ムのリポソーム膜を溶解し、第１のリポソームの膜は溶
解しない範囲であれば特に限定されることなく選択でき
るが、通常は測定時の濃度として通常0.01〜2V/V％、好
ましくは0.1〜1V/V％となるように適宜選択して用いら
れる。
れる界面活性剤としては、第２のリポソームの膜成分は
溶解するが、第１のリポソームの膜成分は溶解しないも
のであって、測定に影響のないものであれば特に限定さ
れることなく挙げられるが、具体的には、例えばポリオ
キシエチレンセチルエーテル，ポリオキシエチレンラウ
リルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル
類、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテ
ル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル
類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト，ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート，
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート，ポリ
オキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオキシ
エチレンアルキルエステル類、例えばオクタノイル−Ｎ
−メチルグルカミド，ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミ
ド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等のメチルグル
カミド誘導体、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド等のアルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤、例え
ばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリルベンゼン
スルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタンドデシルサルフェイト
（Tris DS）等のアニオン界面活性剤、例えばオクタデ
シルアミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩，ステア
リルアミン酢酸塩，ラウリルアミン酢酸塩，ラウリルジ
エタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば
塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム，塩化ドデシ
ルトリメチルアンモニウム，塩化セチルトリメチルアン
モニウム，臭化セチルトリメチルアンモニウム，塩化ラ
ウリルトリメチルアンモニウム，メチル硫酸アリルトリ
メチルアンモニウム，塩化ベンザルコニウム，塩化テト
ラデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化オクタデ
シルジメチルベンジルアンモニウム，塩化ラウリルジメ
チルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、
例えば塩化ラウリルピリジニウム，塩化ステアリルアミ
ドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等の
カチオン界面活性剤、３−［（３−コラミドアミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネイ
ト、３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルア
ンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネイ
ト等の両性界面活性剤、サポニン（大豆由来）、ジギト
ニン等の天然の界面活性剤等の界面活性剤が挙げられ
る。また、これらの使用濃度としては、第２のリポソー
ムのリポソーム膜を溶解し、第１のリポソームの膜は溶
解しない範囲であれば特に限定されることなく選択でき
るが、通常は測定時の濃度として通常0.01〜2V/V％、好
ましくは0.1〜1V/V％となるように適宜選択して用いら
れる。
尚、リポソーム等のマイクロカプセルの膜溶解剤とし
て通常用いられている補体、ポリミキシンＢ、メリチン
等は、本発明の目的に使用することはできない。その理
由については明らかではないが、例えば以下のようなこ
とが考えられる。即ち、補体等の膜溶解剤によるリポソ
ーム膜の溶解作用は、リポソーム自体の構造を完全に破
壊するというようなものではなく、単に膜の一部に穴を
あける程度のものであると考えられる。従って、分子量
の小さな物質（例えば蛍光物質、酵素の基質等）はその
穴を通じてリポソーム内外を自由に出入りできるが、抗
体のような分子量の大きな物質はその穴を通過すること
はできずリポソーム内部に保持されたままとなる。それ
故、これらの膜溶解剤を界面活性剤の代りに用いても、
本発明の目的を達成することはできない。
て通常用いられている補体、ポリミキシンＢ、メリチン
等は、本発明の目的に使用することはできない。その理
由については明らかではないが、例えば以下のようなこ
とが考えられる。即ち、補体等の膜溶解剤によるリポソ
ーム膜の溶解作用は、リポソーム自体の構造を完全に破
壊するというようなものではなく、単に膜の一部に穴を
あける程度のものであると考えられる。従って、分子量
の小さな物質（例えば蛍光物質、酵素の基質等）はその
穴を通じてリポソーム内外を自由に出入りできるが、抗
体のような分子量の大きな物質はその穴を通過すること
はできずリポソーム内部に保持されたままとなる。それ
故、これらの膜溶解剤を界面活性剤の代りに用いても、
本発明の目的を達成することはできない。
本発明の測定法に用いられる第２のリポソームのリポ
ソームとしては、第１のリポソームと比較して界面活性
剤に対してより溶解されやすい単一層のものであれば特
に限定することなく挙げられる。このようなリポソーム
の調製方法としては、従来から知られているボルテック
スイング法，超音波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法
（REV法），エタノール注入法，エーテル注入法，プレ
−ベジクル（Pre−Vesicle）法，フレンチプレスエクス
トルージョン（French Press Extrusion）法,Ca2+融合
法，アニーリング（Annealing）法，凍結融解融合法，
凍結乾燥法,W/O/Wエマルジョン法等の方法や、最近、S.
M.Grunerら［Biochemistry,24,2833（1985）］により報
告されたStable Plurilamellar Vesicle法（SPLV法）、
本発明者の１部らによって報告されたリポポリサッカラ
イドを膜構成成分の１部とする方法（特開昭63−107742
号公報）等の方法が挙げられるが、特に、例えば界面活
性剤除去法，ソニケイション法等の単一層膜リポソーム
を調製し得る方法が好ましいものとして挙げられる。ま
た、その主たる膜構成成分としては、通常のリポソーム
の調製に於いて膜素材として用いられている天然レシチ
ン（例えば、卵黄レシチン，大豆レシチン等）やジパル
ミトイルフォスファチジルコリン（DPPC），ジミリスト
イルフォスファチジルコリン（DMPC），ジステアロイル
フォスファチジルコリン（DSPC），ジオレオイルフォス
ファチジルコリン（DOPS），ジミリストイルフォスファ
チジルエタノールアミン（DMPE），ジパルミトイルフォ
スファチジルグリセロール（DPPG），ジミリストイルフ
ォスファチジン酸（DMPA），卵黄フォスファチジルグリ
セロール等のリン脂質の１種又は２種以上、或はこれら
とコレステロール類との混合系、或はこれらに更にリポ
ポリサッカライド等を組み合わせたもの等が全て挙げら
れるが、特に、例えば卵黄レシチン等の低いTcを有する
脂質類、ホスファチジルエタノールアミンや酸性脂質等
のヘキサゴナル相をとり易い脂質類等が好ましいものと
して挙げられる。
ソームとしては、第１のリポソームと比較して界面活性
剤に対してより溶解されやすい単一層のものであれば特
に限定することなく挙げられる。このようなリポソーム
の調製方法としては、従来から知られているボルテック
スイング法，超音波法，界面活性剤除去法，逆相蒸発法
（REV法），エタノール注入法，エーテル注入法，プレ
−ベジクル（Pre−Vesicle）法，フレンチプレスエクス
トルージョン（French Press Extrusion）法,Ca2+融合
法，アニーリング（Annealing）法，凍結融解融合法，
凍結乾燥法,W/O/Wエマルジョン法等の方法や、最近、S.
M.Grunerら［Biochemistry,24,2833（1985）］により報
告されたStable Plurilamellar Vesicle法（SPLV法）、
本発明者の１部らによって報告されたリポポリサッカラ
イドを膜構成成分の１部とする方法（特開昭63−107742
号公報）等の方法が挙げられるが、特に、例えば界面活
性剤除去法，ソニケイション法等の単一層膜リポソーム
を調製し得る方法が好ましいものとして挙げられる。ま
た、その主たる膜構成成分としては、通常のリポソーム
の調製に於いて膜素材として用いられている天然レシチ
ン（例えば、卵黄レシチン，大豆レシチン等）やジパル
ミトイルフォスファチジルコリン（DPPC），ジミリスト
イルフォスファチジルコリン（DMPC），ジステアロイル
フォスファチジルコリン（DSPC），ジオレオイルフォス
ファチジルコリン（DOPS），ジミリストイルフォスファ
チジルエタノールアミン（DMPE），ジパルミトイルフォ
スファチジルグリセロール（DPPG），ジミリストイルフ
ォスファチジン酸（DMPA），卵黄フォスファチジルグリ
セロール等のリン脂質の１種又は２種以上、或はこれら
とコレステロール類との混合系、或はこれらに更にリポ
ポリサッカライド等を組み合わせたもの等が全て挙げら
れるが、特に、例えば卵黄レシチン等の低いTcを有する
脂質類、ホスファチジルエタノールアミンや酸性脂質等
のヘキサゴナル相をとり易い脂質類等が好ましいものと
して挙げられる。
本発明に係る第２のリポソームに於いて、リポソーム
内に保持させる抗体としては、測定対象物に対する抗体
であれば何れにてもよく特に限定されない。即ち、常
法、例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、
（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法に準じ
て、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に
測定対象物を免疫して作製されるポリクローナル性抗体
でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（G.K
hler and C.Milstein;Nature,256,495,1975）により
確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインから
の細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞と
を融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クロ
ーン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこ
れらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、
これら抗体は、要すればペプシン、パパイン等の酵素を
用いて消化してＦ（ab′）２、Fab′、或はFabとして使
用してもよいことは言うまでもない。
内に保持させる抗体としては、測定対象物に対する抗体
であれば何れにてもよく特に限定されない。即ち、常
法、例えば「免疫実験学入門、第２刷、松橋直ら、
（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法に準じ
て、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス等の動物に
測定対象物を免疫して作製されるポリクローナル性抗体
でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイン（G.K
hler and C.Milstein;Nature,256,495,1975）により
確立された細胞融合法に従い、マウスの腫瘍ラインから
の細胞と測定対象物で予め免疫されたマウスの脾細胞と
を融合させて得られるハイブリドーマが産生する単クロ
ーン性抗体でも何れにてもよく、これらを単独で或はこ
れらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、
これら抗体は、要すればペプシン、パパイン等の酵素を
用いて消化してＦ（ab′）２、Fab′、或はFabとして使
用してもよいことは言うまでもない。
本発明に係る第２のリポソームの調製法を、界面活性
剤除去法によりリポソームの調製の場合を例にとり挙げ
て以下に詳しく説明する。
剤除去法によりリポソームの調製の場合を例にとり挙げ
て以下に詳しく説明する。
即ち、先ず前記した如きリン脂質及びコレステロール
類を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム，エーテル
類，アルコール類等）に溶解し、減圧下で濃縮乾固後、
デシケーター中で充分減圧乾燥する。次いで、作製され
た脂質フィルムに界面活性剤水溶液（20〜100mM）を加
えて、これを均一に分散させる。ここで使用する界面活
性剤としては、例えば、従来からよくこの分野に於いて
用いられているコール酸，ポリオキシエチレンオクチル
フェニルエーテル，オクチルグルコシド等が挙げられる
が、望ましくは、オクチルグルコシドの様な臨界ミセル
濃度（CMC）の高い界面活性剤が良い。次に、要すれば
リポポリサッカライド類を粉末のまま、或は溶液として
加え、更に所望する抗体を含む溶液（通常、0.1〜20mgA
b/ml、好ましくは１〜10mgAb/mlの溶液）を加えて充分
に撹拌混合する。この後、直ちに界面活性剤を除去する
のが最も望ましいが、その方法としては透析法，ゲル濾
過法，樹脂吸着法等、自体公知の方法が挙げられる。処
理条件は時間として１時間乃至１昼夜で、温度はリポソ
ームの膜構成成分等により若干異なるが、０〜70℃位の
範囲で適宜選択して行えばよい。特に、界面活性剤を除
去する方法として、Sepharose 4B（ファルマシア社商品
名）を用いるゲル濾過や遠心分離等の操作により行え
ば、遊離の抗体等も同時に除去できるので有利である。
かくして得られたリポソームは限外濾過等により所定の
濃度に濃縮して使用、又は保存される。リポソームのサ
イズの均一化に関しては、繁用されているポリカーボネ
ート膜を用いる方法も良いが、ゲル濾過法［例えばSeph
acryl S−1000（ファルマシア社商品名）を使用］で行
うのも効果的である。
類を適当な有機溶媒（例えば、クロロホルム，エーテル
類，アルコール類等）に溶解し、減圧下で濃縮乾固後、
デシケーター中で充分減圧乾燥する。次いで、作製され
た脂質フィルムに界面活性剤水溶液（20〜100mM）を加
えて、これを均一に分散させる。ここで使用する界面活
性剤としては、例えば、従来からよくこの分野に於いて
用いられているコール酸，ポリオキシエチレンオクチル
フェニルエーテル，オクチルグルコシド等が挙げられる
が、望ましくは、オクチルグルコシドの様な臨界ミセル
濃度（CMC）の高い界面活性剤が良い。次に、要すれば
リポポリサッカライド類を粉末のまま、或は溶液として
加え、更に所望する抗体を含む溶液（通常、0.1〜20mgA
b/ml、好ましくは１〜10mgAb/mlの溶液）を加えて充分
に撹拌混合する。この後、直ちに界面活性剤を除去する
のが最も望ましいが、その方法としては透析法，ゲル濾
過法，樹脂吸着法等、自体公知の方法が挙げられる。処
理条件は時間として１時間乃至１昼夜で、温度はリポソ
ームの膜構成成分等により若干異なるが、０〜70℃位の
範囲で適宜選択して行えばよい。特に、界面活性剤を除
去する方法として、Sepharose 4B（ファルマシア社商品
名）を用いるゲル濾過や遠心分離等の操作により行え
ば、遊離の抗体等も同時に除去できるので有利である。
かくして得られたリポソームは限外濾過等により所定の
濃度に濃縮して使用、又は保存される。リポソームのサ
イズの均一化に関しては、繁用されているポリカーボネ
ート膜を用いる方法も良いが、ゲル濾過法［例えばSeph
acryl S−1000（ファルマシア社商品名）を使用］で行
うのも効果的である。
界面活性剤除去法以外の方法で本発明に係る第２のリ
ポソームを調製する場合についても、同様に、自体公知
の或はその他のリポソーム調製法に準じてこれを行えば
良い。
ポソームを調製する場合についても、同様に、自体公知
の或はその他のリポソーム調製法に準じてこれを行えば
良い。
本発明の測定法に於いて用いられる第１のリポソーム
としては、第２のリポソームと比較して界面活性剤に対
してより溶解され難い多重層のものであれば特に限定す
ることなく挙げられる。そのようなリポソームの調製法
としては、先に第２のリポソームのところで列挙した自
体公知のリポソームの調製法が全て挙げられ、また、膜
構成成分としては同様に第２のリポソームのところで挙
げた自体公知の膜素材が全て挙げられるが、特に、DPPC
やDSPC等の高い相転移温度（Tc）を有する脂質を膜構成
成分として、SPLV法,REV法等の多重層膜リポソームを調
製し得る方法により作製したものは他と比べて界面活性
剤による溶解を受け難いのでより望ましい。このように
して標識物質を内部に保持したリポソームを調製し、こ
の表面に常法、例えば水溶性蛋白質等を固定化する場合
には架橋法，脂質活性化法，リポポリサッカライドを用
いる特開昭63−107742号公報に記載の方法等、或は低分
子ハプテン等を固定化する場合にはこれを予め脂質誘導
体としておいてリポソームに組み込む方法等により測定
対象物を固定化すれば本発明に係る第１のリポソームが
容易に得られる。第１のリポソーム内に保持される標識
物質としては、補体免疫測定法に於いて通常用いられる
検出可能な標識物質であれば何れにてもよく特に限定さ
れることなく挙げられるが、例えばアルカリホスファタ
ーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，β−ガラク
トシダーゼ等の酵素類、例えばカルボキシフルオレセイ
ン等の蛍光物質類、例えばアルセナゾIII,4−（２−ピ
リジルアゾ）レゾルシノール,2−（５−ブロモ−２−ピ
リジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）フェノールナトリウム塩等の色素類、例えば
ルミノール，ビス（2,4,6−トリクロロフェニル）オキ
ザレート,N−メチルアクリジニウムエステル等の発光物
質類、例えば2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル（TEMPO）等に代表されるスピンラベル化剤類
等が代表的なものとして挙げられる。
としては、第２のリポソームと比較して界面活性剤に対
してより溶解され難い多重層のものであれば特に限定す
ることなく挙げられる。そのようなリポソームの調製法
としては、先に第２のリポソームのところで列挙した自
体公知のリポソームの調製法が全て挙げられ、また、膜
構成成分としては同様に第２のリポソームのところで挙
げた自体公知の膜素材が全て挙げられるが、特に、DPPC
やDSPC等の高い相転移温度（Tc）を有する脂質を膜構成
成分として、SPLV法,REV法等の多重層膜リポソームを調
製し得る方法により作製したものは他と比べて界面活性
剤による溶解を受け難いのでより望ましい。このように
して標識物質を内部に保持したリポソームを調製し、こ
の表面に常法、例えば水溶性蛋白質等を固定化する場合
には架橋法，脂質活性化法，リポポリサッカライドを用
いる特開昭63−107742号公報に記載の方法等、或は低分
子ハプテン等を固定化する場合にはこれを予め脂質誘導
体としておいてリポソームに組み込む方法等により測定
対象物を固定化すれば本発明に係る第１のリポソームが
容易に得られる。第１のリポソーム内に保持される標識
物質としては、補体免疫測定法に於いて通常用いられる
検出可能な標識物質であれば何れにてもよく特に限定さ
れることなく挙げられるが、例えばアルカリホスファタ
ーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，β−ガラク
トシダーゼ等の酵素類、例えばカルボキシフルオレセイ
ン等の蛍光物質類、例えばアルセナゾIII,4−（２−ピ
リジルアゾ）レゾルシノール,2−（５−ブロモ−２−ピ
リジルアゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピ
ルアミノ）フェノールナトリウム塩等の色素類、例えば
ルミノール，ビス（2,4,6−トリクロロフェニル）オキ
ザレート,N−メチルアクリジニウムエステル等の発光物
質類、例えば2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル（TEMPO）等に代表されるスピンラベル化剤類
等が代表的なものとして挙げられる。
本発明の測定法に於いて用いられる補体としては、例
えばヒト，モルモット，馬，羊等の動物の血液から得ら
れたものを常法に従って適宜精製したもの等、この分野
で通常用いられる補体が何れも例外なく挙げられる。
えばヒト，モルモット，馬，羊等の動物の血液から得ら
れたものを常法に従って適宜精製したもの等、この分野
で通常用いられる補体が何れも例外なく挙げられる。
これら本発明の測定法に於いて用いられる試薬類或い
は必要に応じて添加される各種防腐剤等の濃度範囲等は
自体公知の補体免疫測定用試液に於いて通常用いられる
濃度範囲等を適宜選択して用いることで足りる。
は必要に応じて添加される各種防腐剤等の濃度範囲等は
自体公知の補体免疫測定用試液に於いて通常用いられる
濃度範囲等を適宜選択して用いることで足りる。
本発明の測定法に於いて用いられる緩衝剤としては、
例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，グッ
ド（Good），ベロナール等の緩衝剤が挙げられるが、特
にこれらに限定されるものではない。
例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン，グッ
ド（Good），ベロナール等の緩衝剤が挙げられるが、特
にこれらに限定されるものではない。
本発明の測定法に用いられる本発明の測定用試液は、
以下のような２液の形態をとることを特徴とする。
以下のような２液の形態をとることを特徴とする。
第１液：第１のリポソーム、第２のリポソーム、要す
れば緩衝剤、標識物質としての機能を発現させるのに必
要な物質（例えば、補酵素、酵素の基質等）、防腐剤等
を含有。
れば緩衝剤、標識物質としての機能を発現させるのに必
要な物質（例えば、補酵素、酵素の基質等）、防腐剤等
を含有。
第２液：補体、要すれば基質、補酵素、緩衝剤、防腐
剤等を含有。
剤等を含有。
本発明の測定用試液のpHは、第１液は通常６〜９の範
囲、好ましくは７〜８の範囲から、第２液は通常６〜９
の範囲、好ましくは７〜８の範囲から適宜選択され、pH
の調整は例えば上記した如き緩衝剤を用いてなされる。
囲、好ましくは７〜８の範囲から、第２液は通常６〜９
の範囲、好ましくは７〜８の範囲から適宜選択され、pH
の調整は例えば上記した如き緩衝剤を用いてなされる。
本発明の測定用試液を用いた本発明の測定法を実施す
るには、例えば以下の如く行えばよい。
るには、例えば以下の如く行えばよい。
即ち、先ず、第２のリポソームの膜成分は溶解する
が、第１のリポソームの膜成分は溶解しない界面活性剤
を測定対象物を含む試料と共に第１液に添加して抗体を
放出させ、次いでこれに補体を含む第２液を作用させた
後、常法に従って測定を行えばよく、測定方法そのもの
は自体公知の補体免疫測定法のそれに従って行うことで
足りる。
が、第１のリポソームの膜成分は溶解しない界面活性剤
を測定対象物を含む試料と共に第１液に添加して抗体を
放出させ、次いでこれに補体を含む第２液を作用させた
後、常法に従って測定を行えばよく、測定方法そのもの
は自体公知の補体免疫測定法のそれに従って行うことで
足りる。
更に具体的に述べれば、先ず、測定対象物を含む試料
と適当な界面活性剤とを混合して測定用の検体とする。
この検体と上記第１液とを適宜混合し、通常20〜50℃、
好ましくは25〜40℃で、５分間乃至１時間反応させる。
次いでこの反応液に上記第２液を適宜混合し、更に通常
20〜50℃、好ましくは25〜40℃で、５分間乃至１時間反
応させる。その後、第１のリポソームより遊離されてき
た標識物質量をその標識物質の性質に応じた自体公知の
測定法により測定する。ここで得られた標識物質量を、
濃度既知の測定対象物を含む試料を数種用いて同様の操
作を行うことにより予め作成した、測定対象物濃度と第
１のリポソームより遊離されてくる標識物質量との関係
を表わす検量線に当てはめることにより試料中の測定対
象物濃度を測定する。
と適当な界面活性剤とを混合して測定用の検体とする。
この検体と上記第１液とを適宜混合し、通常20〜50℃、
好ましくは25〜40℃で、５分間乃至１時間反応させる。
次いでこの反応液に上記第２液を適宜混合し、更に通常
20〜50℃、好ましくは25〜40℃で、５分間乃至１時間反
応させる。その後、第１のリポソームより遊離されてき
た標識物質量をその標識物質の性質に応じた自体公知の
測定法により測定する。ここで得られた標識物質量を、
濃度既知の測定対象物を含む試料を数種用いて同様の操
作を行うことにより予め作成した、測定対象物濃度と第
１のリポソームより遊離されてくる標識物質量との関係
を表わす検量線に当てはめることにより試料中の測定対
象物濃度を測定する。
尚、上記の操作に於いて、第１液及び第２液を検体と
反応させる順序は変更してはならない。また、検体と第
１液とを混合した後は一定時間反応させなければならな
い。何故ならば、第１液と第２液との順番を逆にして添
加して反応させた場合、或は第１液と第２液とを殆ど同
時に添加して反応させた場合には、測定対象物の測定が
事実上不可能となるからである。
反応させる順序は変更してはならない。また、検体と第
１液とを混合した後は一定時間反応させなければならな
い。何故ならば、第１液と第２液との順番を逆にして添
加して反応させた場合、或は第１液と第２液とを殆ど同
時に添加して反応させた場合には、測定対象物の測定が
事実上不可能となるからである。
標識物質量を測定する方法としては、例えば標識物質
が酵素の場合には、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質
核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章
夫・石川栄治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年
９月10日発行」等に記載された方法に準じて該標識物質
の測定を行えばよく、標識物質が蛍光物質の場合には、
例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソ
フトサイエンス社、1983」等に記載されて方法に準じて
該標識物質の測定を行えばよく、標識物質が発光性物質
の場合には、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸
酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石
川栄治編集、252〜263頁、共立出版（株）、1987年９月
10日発行」等に記載された方法に準じて該標識物質の測
定を行えばよく、また、標識物質がスピンラベル化剤と
しての性質を有する物質の場合には、例えば「酵素免疫
測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣
・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集、264〜271頁、共立
出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法
に準じて該標識物質の測定を行えばよい。
が酵素の場合には、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質
核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章
夫・石川栄治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年
９月10日発行」等に記載された方法に準じて該標識物質
の測定を行えばよく、標識物質が蛍光物質の場合には、
例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソ
フトサイエンス社、1983」等に記載されて方法に準じて
該標識物質の測定を行えばよく、標識物質が発光性物質
の場合には、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸
酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石
川栄治編集、252〜263頁、共立出版（株）、1987年９月
10日発行」等に記載された方法に準じて該標識物質の測
定を行えばよく、また、標識物質がスピンラベル化剤と
しての性質を有する物質の場合には、例えば「酵素免疫
測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣
・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集、264〜271頁、共立
出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法
に準じて該標識物質の測定を行えばよい。
本発明の測定法により測定可能な測定対象物として
は、何らかの方法によりそれに対する抗体を作製し得る
もの或は生体内で生じる抗体であれば特に限定すること
なく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生
体体液中に含まれる蛋白質、脂質、ホルモン、薬剤、特
定物質に対する抗体等が代表的なものとして挙げられ
る。更に具体的には、例えば、α−フェトプロテイン
（AFP）,CA19−9,前立腺特異抗原（PSA），癌胎児性抗
原（CEA）等の癌マーカー、例えばインシュリン，ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（hCG），チロキシン（T4），ト
リヨードサイロニン（T3），プロラクチン，甲状腺刺激
ホルモン（THS）等のホルモン、例えばジゴキシン，フ
ェニトイン，モルヒネ，ニコチン等の薬物、例えば抗ト
キソプラズマ抗体等の抗体等が挙げられる。
は、何らかの方法によりそれに対する抗体を作製し得る
もの或は生体内で生じる抗体であれば特に限定すること
なく挙げられるが、例えば血清，血液，血漿，尿等の生
体体液中に含まれる蛋白質、脂質、ホルモン、薬剤、特
定物質に対する抗体等が代表的なものとして挙げられ
る。更に具体的には、例えば、α−フェトプロテイン
（AFP）,CA19−9,前立腺特異抗原（PSA），癌胎児性抗
原（CEA）等の癌マーカー、例えばインシュリン，ヒト
絨毛性ゴナドトロピン（hCG），チロキシン（T4），ト
リヨードサイロニン（T3），プロラクチン，甲状腺刺激
ホルモン（THS）等のホルモン、例えばジゴキシン，フ
ェニトイン，モルヒネ，ニコチン等の薬物、例えば抗ト
キソプラズマ抗体等の抗体等が挙げられる。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。
［実施例］ 参考例1.第２のリポソームの調製 卵黄レシチンの20mMクロロホルム溶液2mlとコレステ
ロールの20mMクロロホルム溶液2mlとを丸底フラスコに
入れて混合した後、ロータリーエバポレーターにより溶
媒留去し、次いで約２時間デシケーター中で真空乾燥を
行って、脂質の薄膜をフラスコ壁面に作製させた。これ
に200mM n−オクチルグルコシド水溶液（リポポリサッ
カライドを6.6mg/ml含有）0.6ml及び0.01M N−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
（ヘペス）緩衝液（pH7.4）を加え、ボルテックスミキ
サーで均一になるまで撹拌した。次いで、抗ヒトT4血清
（5mgAb/ml）0.3mlを加え、更に撹拌を行った。これを
透析チューブに入れ、0.01Mヘペス緩衝液（pH7.4）で１
時間透析した後、リポソーム懸濁液を超遠心分離（35,0
00rpm、40min.×５）により精製し、得られたペレット
を0.01Mヘペス緩衝液（pH7.4）5mlに懸濁して、抗T4抗
体を内部に保持した第２のリポソームを得た。
ロールの20mMクロロホルム溶液2mlとを丸底フラスコに
入れて混合した後、ロータリーエバポレーターにより溶
媒留去し、次いで約２時間デシケーター中で真空乾燥を
行って、脂質の薄膜をフラスコ壁面に作製させた。これ
に200mM n−オクチルグルコシド水溶液（リポポリサッ
カライドを6.6mg/ml含有）0.6ml及び0.01M N−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
（ヘペス）緩衝液（pH7.4）を加え、ボルテックスミキ
サーで均一になるまで撹拌した。次いで、抗ヒトT4血清
（5mgAb/ml）0.3mlを加え、更に撹拌を行った。これを
透析チューブに入れ、0.01Mヘペス緩衝液（pH7.4）で１
時間透析した後、リポソーム懸濁液を超遠心分離（35,0
00rpm、40min.×５）により精製し、得られたペレット
を0.01Mヘペス緩衝液（pH7.4）5mlに懸濁して、抗T4抗
体を内部に保持した第２のリポソームを得た。
実施例1.ヒトT4の測定 （検体） 所定濃度のヒトT4を含む0.1％牛血清アルブミン溶液5
0μｌと前処理剤（2,7％ポリオキシエチレン（10）オク
チルフェニルエーテル含有の0.16N NaOH溶液）150μｌ
とを混合したものを検体とした。
0μｌと前処理剤（2,7％ポリオキシエチレン（10）オク
チルフェニルエーテル含有の0.16N NaOH溶液）150μｌ
とを混合したものを検体とした。
（試液） 第１液（R1）： T4標識リポソーム（第１のリポソーム：グルコース−
６−リン酸脱水素酵素含有） 11μmol/ml （コレステロール量として） 参考例１で得た第２のリポソーム ２μmol/ml （コレステロール量として） 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D） 3.2mg/ml in 50mM 3−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプ
ロパンスルホン酸緩衝液（pH7.4） 第２液（R2）： 補体（モルモット新鮮血清） 0.25ml/ml グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ） 6.5mg/ml in 50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（pH7.4） （操作法） 検体20μｌに、R1 200μｌを添加し、37℃で５分間加
温した後、R2 100μｌを添加し、更に37℃で５分間加温
度の340nmの吸光度変化を測定した。
６−リン酸脱水素酵素含有） 11μmol/ml （コレステロール量として） 参考例１で得た第２のリポソーム ２μmol/ml （コレステロール量として） 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D） 3.2mg/ml in 50mM 3−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプ
ロパンスルホン酸緩衝液（pH7.4） 第２液（R2）： 補体（モルモット新鮮血清） 0.25ml/ml グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ） 6.5mg/ml in 50mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（pH7.4） （操作法） 検体20μｌに、R1 200μｌを添加し、37℃で５分間加
温した後、R2 100μｌを添加し、更に37℃で５分間加温
度の340nmの吸光度変化を測定した。
（結果） 得られた検量線を、第１図に示す。尚、第１図の検量
線は、横軸の各T4濃度（μg/dl）に対して得られた吸光
度（OD340nm）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。
線は、横軸の各T4濃度（μg/dl）に対して得られた吸光
度（OD340nm）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。
第１図から明らかな如く、本発明の補体免疫測定用試
液を用いた本発明の補体免疫測定法により良好な検量線
が得られることが判る。
液を用いた本発明の補体免疫測定法により良好な検量線
が得られることが判る。
また、検体として、バイオラッド社のコントロール血
清Ｉ、II及びIIIの各50μｌに上記の前処理剤150μｌを
加えたものをを用いた以外は、上記と同じ試液を用い、
同様の操作法によりT4の測定を行い、上記で得られた検
量線から各コントロール血清中のT4値を求めた。
清Ｉ、II及びIIIの各50μｌに上記の前処理剤150μｌを
加えたものをを用いた以外は、上記と同じ試液を用い、
同様の操作法によりT4の測定を行い、上記で得られた検
量線から各コントロール血清中のT4値を求めた。
結果を表１に示す。
表１の結果から明らかな如く、本発明の方法により良
好な測定結果が得られることが判る。
好な測定結果が得られることが判る。
実施例2.試液の安定性試験 （検体） T4濃度0,10及び25μg/dlを含む0.1％牛血清アルブミ
ン溶液50μｌと前処理液（実施例１と同じ。）150μｌ
とを混合したものを検体とした。
ン溶液50μｌと前処理液（実施例１と同じ。）150μｌ
とを混合したものを検体とした。
（試液） R1:実施例１と同様に調製したものを15℃で所定日数
保存したものをR1とした。
保存したものをR1とした。
R2:実施例１と同じ。
（操作法） 検体20μｌに、R1 600μｌを添加し、37℃で５分間加
温した後、R2 300μｌを添加し、更に37℃で５分間加温
後の340nmの吸光度変化を測定した。
温した後、R2 300μｌを添加し、更に37℃で５分間加温
後の340nmの吸光度変化を測定した。
（結果） 測定結果を表２に示す。
表２の結果から明らかな如く、本発明の測定用試液は
良好な安定性を有していることが判る。
良好な安定性を有していることが判る。
尚、表には示してはいないが、本発明の第２のリポソ
ームの代りに通常の抗体溶液を用いて調製したものをR1
としてT4の測定を行った場合には、T4濃度０、10及び25
μg/dlの何れの検体を用いても得られる測定値（OD
340nm）に差は見られず、実用性がないことは明らかで
あった。
ームの代りに通常の抗体溶液を用いて調製したものをR1
としてT4の測定を行った場合には、T4濃度０、10及び25
μg/dlの何れの検体を用いても得られる測定値（OD
340nm）に差は見られず、実用性がないことは明らかで
あった。
実施例3.血清中のヒトT4の測定 （検体） 25人分の新鮮ヒト血清の各々50μｌに前処理剤（2.7
％ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
含有の0.16N NaOH溶液）150μｌを混合したものを検体
とした。
％ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル
含有の0.16N NaOH溶液）150μｌを混合したものを検体
とした。
（試液） R1:実施例１と同じ。
R2:実施例１と同じ。
（操作法） 実施例１と同じ。
比較例1.血清中のヒトT4の測定 実施例３で使用した25人分の新鮮ヒト血清を試料と
し、市販のT4測定用試薬（アマレックスT4、アマーシャ
ム社製。）を使用して、T4の測定を行った。尚、操作は
現品説明書に記載の標準操作法に従った。
し、市販のT4測定用試薬（アマレックスT4、アマーシャ
ム社製。）を使用して、T4の測定を行った。尚、操作は
現品説明書に記載の標準操作法に従った。
実施例３及び比較例１により得られた測定値に基づい
て作成した相関図を第２図に示す。
て作成した相関図を第２図に示す。
尚、実施例３及び比較例１により得られた測定値を統
計処理して得られた結果を以下に示す。
計処理して得られた結果を以下に示す。
・相関係数 γ＝0.9806 ・回帰直線式 Ｙ＝1.057X−0.75 Y:実施例３により得られた測定値。
X:比較例１により得られた測定値。
以上の結果から明らかな如く、本願発明の測定方法に
より得られたT4の測定値は、従来法により得られるそれ
と良好な相関を示すことが判る。
より得られたT4の測定値は、従来法により得られるそれ
と良好な相関を示すことが判る。
［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、新規な試薬形態の測定用
試液を用いる改良された補体免疫測定法を提供するもの
であり、本発明の測定法によれば、従来の方法では問題
のあった自動分析装置への応用が可能となった点に顕著
な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大な
る発明である。
試液を用いる改良された補体免疫測定法を提供するもの
であり、本発明の測定法によれば、従来の方法では問題
のあった自動分析装置への応用が可能となった点に顕著
な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ大な
る発明である。
第１図は、実施例１に於いて得られたT4の検量線を示し
たものである。 第２図は、実施例３及び比較例１により得られた測定値
に基づいて作成された相関図を示す。
たものである。 第２図は、実施例３及び比較例１により得られた測定値
に基づいて作成された相関図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−107742（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−55561（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−242856（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/544 G01N 33/549
Claims (6)
- 【請求項１】抗原抗体反応により活性化された補体のマ
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於い
て、測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保
持した多重層膜リポソーム（以下、第１のリポソームと
略記する。）と、測定対象物に対する抗体を内部に保持
した単一層膜リポソーム（以下、第２のリポソームと略
記する。）と、膜溶解剤としての界面活性剤とを用いる
ことを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項２】第１のリポソームが高い相転移温度を有す
る脂質類を膜構成成分として含んで成るリポソームであ
り、第２のリポソームが低い相転移温度を有する脂質類
及びヘキサゴナル相をとり易い脂質類から選ばれた脂質
類を膜構成成分として含んで成るリポソームである、請
求項１記載の免疫測定法。 - 【請求項３】抗原抗体反応により活性化された補体のマ
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に用いら
れる測定用試液に於いて、測定対象物を膜表面に固定化
し内部に標識物質を保持した多重層膜リポソーム（第１
のリポソーム）、及び抗体を内部に保持した単一層膜リ
ポソーム（第２のリポソーム）を含む第１液と、補体を
含む第２液とからなることを特徴とする免疫測定用試
液。 - 【請求項４】第１のリポソームが高い相転移温度を有す
る脂質類を膜構成成分として含んで成るリポソームであ
り、第２のリポソームが低い相転移温度を有する脂質類
及びヘキサゴナル相をとり易い脂質類から選ばれた脂質
類を膜構成成分として含んで成るリポソームである、請
求項３記載の免疫測定用試液。 - 【請求項５】抗原抗体反応により活性化された補体のマ
イクロカプセル溶解作用を利用した免疫測定法に於い
て、 ｉ）測定対象物を膜表面に固定化し内部に標識物質を保
持した多重層膜リポソーム（第１のリポソーム）、及び
抗体を内部に保持した単一層膜リポソーム（第２のリポ
ソーム）を含む第１液と、測定対象物を含む試料及び界
面活性剤とを反応させる第１工程と、 ii）第１工程で得られる反応液と、補体を含む第２液と
を反応させる第２工程と、 を含むことを特徴とする免疫測定法。 - 【請求項６】第１のリポソームが高い相転移温度を有す
る脂質類を膜構成成分として含んで成るリポソームであ
り、第２のリポソームが低い相転移温度を有する脂質類
及びヘキサゴナル相をとり易い脂質類から選ばれた脂質
類を膜構成成分として含んで成るリポソームである、請
求項５記載の免疫測定法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-27122 | 1989-02-06 | ||
| JP2712289 | 1989-02-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02290555A JPH02290555A (ja) | 1990-11-30 |
| JP2927486B2 true JP2927486B2 (ja) | 1999-07-28 |
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ID=12212254
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0382400B1 (ja) |
| JP (1) | JP2927486B2 (ja) |
| AT (1) | ATE135820T1 (ja) |
| DE (1) | DE69025968T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5919633A (en) * | 1997-09-19 | 1999-07-06 | Leonard Bloom | Liposome immunoassay |
| US7312040B2 (en) * | 2002-09-20 | 2007-12-25 | Agilent Technologies, Inc. | Microcapsule biosensors and methods of using the same |
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|---|---|---|---|---|
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| US4342826A (en) * | 1980-02-04 | 1982-08-03 | Collaborative Research, Inc. | Immunoassay products and methods |
| DE3173713D1 (en) * | 1980-09-05 | 1986-03-20 | Frappier Armand Inst | Formation of an immunosome exclusively made of viral antigens reconstituted on an artificial membrane |
| US4581222A (en) * | 1983-02-09 | 1986-04-08 | California Institute Of Technology | Membrane immune assay |
| US4565696A (en) * | 1983-08-03 | 1986-01-21 | The Regents Of The University Of California | Production of immunogens by antigen conjugation to liposomes |
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| US4752572A (en) * | 1985-08-30 | 1988-06-21 | Eastman Kodak Company | Lipid vesicles containing labeled species and their analytical uses |
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| DE3776966D1 (de) * | 1986-05-20 | 1992-04-09 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Funktionelle gruppen tragende liposome und verfahren zu deren herstellung. |
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1990
- 1990-01-31 DE DE69025968T patent/DE69025968T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-31 EP EP90301006A patent/EP0382400B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1990-01-31 AT AT90301006T patent/ATE135820T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-01 US US07/473,534 patent/US5221613A/en not_active Expired - Fee Related
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