JPS6255561A - 標識種を含む脂質小胞及びその分析への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、封入された標識種及びその生物医学的研究及
び臨床化学的測定への使用に関する。これらの封入され
た種は、特異結合性リガンド、例えば抗原を測定するた
め、競合結合分析、例えば免疫分析に特に有用である。

〔従来の技術〕

医学及び臨床化学の分野において、生物学的液体中に極
めて低濃度で存在する被分析物（本明細書においては、
リガンドと言う）、例えば蛋白質、酵素、補助因子、ホ
ルモン、麻酔剤、ステロイド、治療剤、抗原、抗体等の
測定が必要である。これらの低濃度の被分析°物を測定
するため、数種の技法が開発されている。一つの有用な
技法は、競合結合免疫分析である。競合結合免疫分析に
おいては、標識リガンド（本明細書においては、リガン
ドアナローグと言う）は、一定量の共通の結合物質（本
明細書においては、レセプターと言う）に対シテ未標識
リガンドと競合する。結合リガンドアナローグ又は遊離
リガンドアナローグからの測定シグナルから未知濃度の
リガンドを測定することができる。

このような測定においては、レセプター及びリガンドア
ナローグを早期に反応させないで、リガンドアナローグ
をレセプターに密接して保持するのがしばしば望ましい
。

リガンドアナローグとレセプターとの早期結合の問題を
回避するため、はとんどの免疫分析に使用される操作は
、リガンドアナローグを反応媒体に同時に又は試験試料
にリガンドを添加した後に添加することである。しかし
、この操作は、作業者が更に間違いをしやすい付加的工
程を必要とするので、分析を煩雑にする。

免疫分析を、溶液中で又は乾式分析要素を用いて実施す
ることができる。このような要素は、単層フィルタース
トリップ又は更に複雑な多層試験スライドであってよい
。分析に乾式要素を使用するには、要素中に既に存在す
るレセプターとりガンドアナローグとの早期結合を防止
する手段が必要である。若干の場合には、リガンドアナ
ローグは、レセプターを含むのとは別の帯域又は層中に
存在する。しかしながら、この配列は、付加的帯域又は
層を構成する必要があるので、製造方法を複雑にする。

合成膜は、文献に良く知られている。一つの型の膜は、
水中に脂質を分散することによって製造される。これら
の膜は、リポソームとしても公知である。小胞（ベシク
ル）は、球形外皮を形成する一つの脂質２分子層を有す
るリポソームである。

小胞は、標識種を封入するため使用された。例えば、米
国特許第４．３７２．７４５号明細書は、螢光物質を封
入するため燐脂質小胞を使用する不均一系免疫分析を記
載している。螢光物質を含む小胞を小胞の外にある免疫
学的種に接合させる。分析の間、小胞を溶解させるため
、非イオン性界面活性剤を使用する。

以下余白 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、米国特許第４．３７２．７４５号明細書
の免疫分析では、まだ、リガンドアナローグとレセプタ
ーとの早期結合が起、：る。アナローグのリガンド部分
が小胞の外側にあり、リガンドを、小胞溶解前に結合に
利用されるようにする。この文献では、小胞は、単に螢
光物質をリガンドに結合させる手段として使用されてい
る。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の早期結合の問題は、脂質膜、その中に封入された
生理学的に活性な標識種及び核種を本質的に含まない外
表面を有する小胞を含む組成物により克服される。

本発明は、また、脂質膜、その中に封入されたリガンド
の標識アナローグ及びリガンド又はそのレセプターを本
質的に含まない外表面を有する小胞を含んで成る、免疫
学的に活性なリガンドの測定用の乾式分析要素を提供す
るものである。

°液体中の免疫学的に活性なリガンドの測定方法は、下
記の（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む：（Ａ）リガンドに対す
るレセプターの存在下に、液体試料を、脂質膜、その中
に封入されたリガンドの標識アナローグ及びリガンド又
はそのレセプターを本質的に含まない外表面を有する小
胞と接触させる工程、 （Ｂ）小胞を溶解させる工程、そして （Ｃ）結合型又は未結合型の標識アナローグを測定する
工程。

本発明の組成物は、種々の生物医学的研究及び臨床的測
定に使用することができる。例えば、この組成物は、細
胞又は蛋白質（例えばアルブミン、ＩｇＧ　、ＩｇＭ等
）、核酸（例えばＤＮＡ）　、酵素及びその基質（例え
ばタレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、クレア
チン、乳酸塩等）、補助因子、ウィルス、白血球、成長
因子、抗原、治療剤及び麻酔剤（例えばテオフィリン、
ジゴキシン、フェノバルビタール、ジギトキシン、モル
フイン、パルピッレート、リドカイン、ゲンタマイシン
等）を含めてハブテン、抗体（例えばミクロソーム抗体
、肝炎及びアレルゲンに対する抗体）、代謝産物（例え
ば、アデノシン−５１−モノホスフェート）、ホルモン
及びホルモンレセプター（例えばチロキシン、インシュ
リン、エストリオール、絨毛性ゴナドトロピン、リオサ
イロニン、ペプチドホルモン等）、植物レクチン、毒素
、ビタミン（例えばビオチン、ビタミンＢ１□、葉酸、
ビタミンＥ２アスコルビン酸等）、天然及び合成ステロ
イド（例えばコルチゾル、アルドステロン、プロゲステ
ロン等）、及び他の薬剤及びそのレセプター、並びにこ
のような物質の検出を可能にする他の結合物質を含めて
生理学的に活性な種を標識するため使用することができ
る。

本発明の組成物は、免疫分析において免疫学的に活性な
りガントを測定するのに特に有用である。

このような分析には、３種の成分を利用する。即ち、測
定すべき種、即ち、リガンド、リガンドに対する特異結
合成分、即ち、レセプター及び標識リガンド又は標識レ
セプターであってよい標識種の３種の成分を利用する。

免疫分析は、均−系又は不均一系であってもよい（これ
らの用語は、文献に公知である）。下記の記載及び実施
例の説明において、主として、これらの好ましい実施態
様を示すが、本発明の範囲は他の任意の競合結合分析を
含むものとする。

本発明の実施に有用な標識基は、螢光物質、化学発光化
合物、放射性同位元素、酵素、補助因子及び酵素モジュ
レータ−を包含する。酵素、例えばグルコースオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及び
β−ガラクトシダーゼは、好ましい標識基である。リガ
ンドを直接又は結合基を会して標識基に結合するため使
用する技法及び物質は、周知である。一般に、リガンド
は、標識基に共有結合する。リガンドアナローグを製造
する代表的方法を下記の実施例のすぐ前に記載する。

本発明の実施に有用な小胞は、周知である。これらは、
２分子層膜を形成するように配列された袋状の構造体、
例えばリポソームである。膜の形成に使用される物質は
、両親媒性である。２分子層構造は、膜の外側に配列さ
れた親水性基と内側に配列された疎水性基とを有する。

本発明に有用な脂質膜及び脂質の適切な説明は、米国特
許第４．３５６，２５６号明細書及びその第４欄に記載
されている参考文献に見られる。

特に有用な脂を膜は、下記の群から選択される燐脂質、
例えば、ホスファチジルシリン、ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスファ
チジン酸、スフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリン
及びセラミドホスホリルエタノールアミン、糖脂質、例
えばセレブロシド、フィト糖脂質、ガングリオシド及び
グリセリド、 ホスホノ脂質、例えばセラミド−２−アミノエチルホス
ホン酸及びホスホノグリセリド、ステロール、例えばコ
レステロール、ラノステロール、エルゴステロール及び
β−シトステロール、及び 脂肪酸、例えばパルミチン酸及びステアリン酸。

本発明に有用な小胞は、下記の構造式：　　・〔式中Ｒ
゛及びＲ”はそれぞれ独立に、好ましくは炭素原子数１
０以上、更に好ましくは炭素原子数１４〜２２の２価の
置換又は非置換脂肪族基（不飽和又は飽和）を表す〕で
表される燐脂質から製造するのが好ましい。Ｒ゛及びＲ
ＩＴの代表的例は、アルキレン基（例えばオクチレン基
、デシレン基、２−メチルデシレン基、テトラデシレン
基、ヘキサデシレン基、オクタデシレン基、２゜６．１
０．１４−テトラメチルテトラデシレン基等）、アルケ
ニレン基（例えば３−デセニレン基、８−へキサデセニ
レン基等）、アルキレン−オキシ−アルキレン基（例え
ばオクチレンーオキシーヘキシレン等）、及びアルキル
ジエニレン基（例えば８．１１−へキサデカジエン基、
１．３−ヘキサデカジエン基等）を包含する。

前記の構造式において、Ｘは、アルキレン部分が置換又
は非置換であり、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜
３個の炭素原子を有するアルキしン第四級アンモニウム
陽イオンである。代表的ｘ基は、２−トリメチルアンモ
ニオエチル基、アンモニオエチル基、２−カルボキシ−
２−アンモニオエチル基等を含む。燐脂質の例は、更に
、Ｋｏｒｎ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ　Ｂｉｏｉｏ　　、１巻にューヨークのＰｌｅｎｕｍ
　Ｐｒｅｓｓ）、１９７４年、５５〜６０頁に記載され
ている。

標識種、例えぼりガンドアナローグを含む小胞を含んで
成る本発明の組成物は、下記の操作を含めて多数の公知
操作によって製造することができる： ５ｚｏｋａ　ら著、ヒｏｃ、　Ｎ旦〕エユΩ几−録し工
１針、■、４１９４〜４１９８頁、１９７８年及び米国
特許第４．２３５．８７１号明細書に記載されている逆
相蒸発法、Ｄｅａｍｅｒら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉ
ｏ　ｈ　ｓ、八ｃｔａ、　４４３　。

６２９〜６４３頁、１９７６年に記載されているエーテ
ル注入法、 Ｃａｆｉｓｏら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ
、Ａｃｔａ、　６４９　％１２９〜１３２頁、１９８１
年に記載されているフレオン注入法、 Ｍｉｍｍｓら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ、並、８３３
〜８３８頁、１９８１年に記載されているオクチルグル
コシド中の脂質の洗浄剤透析法、 Ｐａｐｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ａｃｔａ＼肛、４８３〜４９１頁
、１９７５年に記載されている負に帯電した燐脂質のカ
ルシウム誘導融合法、Ｋｉｍ　ら著、影文±功−１橡担
■紅」旦Ｖ−ル桟−・　１〜９頁、１９８１年に記載さ
れている逆相蒸発法の変法。

好ましい方法は、前記の逆相蒸発法である。小胞組成物
の代表的製造を、下記の例１に示す。一般に、この方法
は、脂質膜を製造し、その中に標識種を混入し、脂質膜
を精製することによって実施される。

リガンド又はレセプターだけを小胞中に混入するか、又
は同じ組成物又は分析要素に使用するために、それぞれ
を別個の小胞中に混入することができる。

小胞中のりガンドアナローグ：脂質のモル比は、広範に
変動できるが、一般には、１　：　　５００〜１：５０
．０００である。好ましいモル比は、１　：　　１００
０〜１　：　１０，０００である。

形成する小胞の寸法は変動できるが、一般にはネガティ
ブ染色電子顕微鏡検査で測定して０．０５〜５μｍであ
る。好ましい径範囲は、０．１〜１μｍである。

本発明の組成物及び方法は、溶液及び乾式要素での研究
又は分析に適用することができる。溶液分析では、試験
試料を適当な容器（例えば試験管、シャーレ、ビーカー
、キュベツト等）中で小胞組成物及び適切なレセプター
と物理的に接触させ、混合する。小胞を適切な方法で溶
解させてリガンドアナローグを放出する。生じる溶液を
、必要に応じて、４５℃までの温度で（一般に、３７℃
で）一定時間（例えば、数時間まで）インキュベートし
て、レセプターとリガンド及びリガンドアナローグとの
複合体の形成を促進することができる。

次いで、結合反応により生じる検出可能なシグナル（例
えば螢光又は色素形成）の量を測定することによって試
料を評価する。結合及び未結合リガンドの分離は、標準
分離技法を用いて実施することができる。

小胞を、ｐＨ変化、加水分解、光分解、超音波攪拌、又
はこれらの併用及び他の技法を含めて任意の適当な方法
で溶解することができる。好ましい技法は、小胞を界面
活性剤と接触させることである。

本発明の実施に有用な界面活性剤は、実質的にすべての
小胞を有効に溶解し、それによって小胞の内部からりガ
ンドアナローグを放出させるものを包含する。簡単な試
験を実施して、特定の界面活性剤が有用であるか、否か
決定する。界面活性剤１〜１０ｇ／Ｉ！及び小胞０．１
ｇ／βの混合物を適当な容器中で混合し、混合物の混濁
度の減少を観察することによって溶解量を測定する。少
なくとも９９％の小胞が溶解すべきである。

特に有用な界面活性剤は、少なくとも０．１ミリモルの
臨界ミセル濃度を有するものと言うこともできる。ｐｎ
臨界ミセル濃度、周知の界面活性剤パラメータであり、
それを越えると、界面活性剤分子が凝集してミセルを形
成する濃度である。代表的溶解性界面活性剤は、非イオ
ン性物質、例えばローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍ　
ａｎｄ　１ｌａａｓ）社からトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）
なる商標で市販されているもの、ＩＣＩアメリカ社から
入手しうるツイーン（ＴＷＨＩＥＮ）及びシグマ・ケミ
カル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から
入手しうるオクチルグリコシド及び陰イオン性物質、例
えばイーストマン・コダック社（Ｅａｓｔｍａｎにｏｄ
ａｋ　Ｃｏ、）から入手しうるコール酸ナトリウム及び
ドデシル硫酸ナトリウムを包含する。

分析又は生物医学的研究に小胞を含む溶液に使用する界
面活性剤の量は、はとんどすべての小胞を溶解するのに
充分な量である。この量は、使用する小胞の濃度及び界
面活性剤に応じて変動するが、一般には少なくとも０．
１ｇ／ｊ、好ましくは０、５〜５　ｇ／１．である０分
析に使用する小胞組成物の量は、測定すべきリガンドに
依存し、当業者には、決定することができる。使用する
レセプターの量は、同様に決定される。他の物質、例え
ば緩衝剤、活性剤、補助因子、試薬、触媒、発色カプラ
ー等を、必要に応じて公知の量で含んでいてよい。　　
　　一 本発明の分析用組成物を、溶解性界面活性剤及びレセプ
ターと一緒に、乾式又は溶液分析用の診断キットの一部
として提供することができる。溶液分析には、キット成
分を１回以上の分析に充分な大きさのびん又は他の包装
に入れた溶液として供給することができる。また、他の
任意の試薬及び添加剤を適当な分析用具又は容器及び分
析を実施するための指示と一緒にキットにして供給する
ことができる。下記の乾式分析要素をキットの一部とし
て供給することができる。

本発明の実施に、サンドイッチ分析を使用することもで
きる。例えば、この分析には、２種の異なる抗体を使用
する。第一の抗体は、例えば溶液分析のため試験管の側
壁上に、又は乾式分析要素の拡散層に固定することがで
きる。第二の抗体（適切な標識、例えば酵素標識を有す
る）を次に小胞中に混入し、溶液分析用の試験管に添加
するか又は分析要素（下記）中に添加又は混入する。

次に、試験試料を添加し、分析を前記のように実施する
。

更に、本発明の小胞組成物を含む吸収性担体物質、即ち
、自立性吸収性又は吸水性物質、例えば口紙又はストリ
ップの薄いシートから成っていてよい乾式分析要素を用
いて本発明方法を実施することができる。このような要
素は、更に、任意の適当な位置に、適当な方法で固定さ
れた特異結合分析用のレセプターを含んでいてよい。こ
のような要素は、試験ストリップ、診断要素、浸漬ステ
ィック、診断剤等として知られている。

乾式分析要素に使用する場合、本発明の組成物は、吸収
又は含浸によって適当な担体物質中に混入するか、又は
適当な支持体上の吸収性物質に塗布することができる。

有用な担体物質は、不溶性であり、水又は生理学的液体
、例えば尿若しくは血清に曝されたときに、その構造上
の一体性を保持するものである。有用な担体物質は、紙
、多孔性粒状構造体、セルロース、多孔性ポリマーフィ
ルム、木材、ガラス線維、織布及び不織布（合成及び非
合成）等から製造することができる。このような要素を
作るため有用な物質及び操作は、文献に良く知られてい
る。

本発明の乾式分析要素は、吸収性担体材料として少なく
とも１個の多孔性拡散帯域を有するのが好ましい。この
帯域は自立性である（即ち、その一体性を保持するのに
充分に硬い材料から成る）が、適当な支持体上に担持さ
れているのが好ましい。このような支持体は、任意の適
当な寸法安定性で、好ましくは非多孔性で、透明な（即
ち、輻射線透過性）、２００〜９００ｎｍの波長の電磁
線を透過する物質であってよい。特定の要素のため選択
される支持体は、意図する検出方法（例えば反射、透過
又は螢光分光分析）に適合するものであるべきである。

有用な支持体物質は、紙、金属箔、ポリスチレン、ポリ
エステル〔例えば、ポリ　（エチレンテレフタレート）
〕、ポリカーボネート、セルロースエステル（例えは酢
酸セルロース）等を包含する。

多孔性拡散帯域は、任意の適当な繊維状若しくは非繊維
状物質又はそのいずれか若しくは両方の混合物から製造
することができる。この帯域の空隙率及び平均孔径は、
所期の用途に応じて変動することができる。例えば、全
血又は他の、高分子量物質を含む液体試料を分析する場
合、空隙率及び平均孔径は、一般に、血清又は尿を分析
する場合より大きい。

有用な拡散帯域は、米国特許第４，２９２，２７２号、
同第３，９９２．１５８号、同第４．２５８，００１号
及び同第４、４３０．４３６号明細書並びに特開昭５７
（１９Ｂ２）−１０１７６０号公報に記載されている物
質を用いて製造することができる。拡散帯域は等方性に
多孔性である、即ち、粒子、繊維、ポリマーストランド
等の間の連続空間又は孔によって作られるように帯域の
各方向で多孔度が同じであるのが好ましい。

要素は、１個以上の試薬帯域、拡散帯域、記録帯域、媒
染帯域、輻射線遮断帯域又はフィルター帯域、下塗り帯
域、バリアー帯域、緩衝剤帯域等を有していてよい。帯
域は、−ｍに、相互に液体接触している、即ち、液体、
試薬及び反応生成物が重なったか或いは隣接する領域又
は帯域の間を通過しうる。帯域が別個に被覆された、重
ねられた層であるのが好ましいが、帯域がただ一つの層
の部分であってもよい。

本発明の分析組成物を要素の任意の帯域に混入すること
ができる。また、後から要素に施される試験試料に分析
組成物を添加することができる。

測定すべきリガンドに対応するレセプターが、要素の任
意の帯域に固定化された形で存在してもよい。

本発明の要素において、小胞の被覆量は、広範に変動す
ることができるが、一般に１０３ｇ／ｍ以下、好ましく
は１０−２〜１’０２ｇ／ｍである。

レセプターは、一般に、１ｏ−６〜Ｉｇ／ｍの被覆量で
存在する。溶解性界面活性剤は、分析前には小胞から隔
離して保持されれば、要素に混入することができる。例
えば、界面活性剤を一つの帯域に置き、小胞を別の帯域
において、試験液及び要素が接触される時にのみ放出さ
れるようにすることができる。存在する場合、界面活性
剤の被覆量ハ、少なくとも０．０１ｇ／ｍ、好まＬ　＜
　ハ０．０５〜０．５　ｇ　／　ｒｒｒである。多数の
他の、望ましいが、任意の試薬及び添加剤が要素中に当
業者に公知の量で存在してもよい。このような物質は、
相互作用試薬、非溶解性界面活性剤、緩衝剤、結合剤、
顔料、活性剤等を包含する。

本発明によれば、分析方法に応じて種々の異なる要素を
製造することができる。要素を、任意の所望の幅の長い
テープ、シート、スライド又はチップを含めて種々の形
で構成することができる。

本発明の分析は、人為的に又は自動的に行うことができ
る。一般に、乾式要素を使用する際には、供給ロール、
チップパケット又は他の供給源から要素を採取し、これ
をレセプターの存在で試験すべき液体の試料（例えば１
〜２００μｌ）と物理的に接触させることによってリガ
ンドを測定する。

このような接触は、任意の適当な方法、例えば要素を試
料中に浸漬するか、又は好ましくは、要素に手又は機械
で適当な分散手段を用いて１滴の試料のスポットを付け
ることによって達成することができる。

試料を適用した後、要素を試験結果を得るのを促進又は
容易にしうる任意のコンディショニング処理、例えばイ
ンキュベーション、加熱等にさらす。リガンドの測定は
、検出可能なシグナルを結合（即ち、複合体を形成した
）又は未結合（即ち複合体を形成しない）の標識リガン
ドアナローグから測定することによって達成される。

結合型及び遊離型の標識リガンドアナローグの分離は、
米国特許第３，８１７，８３７号及び同第３．６５４，
０９０号明細書に記載されている操作を含めて多くの操
作のいずれがを用いて達成することができる。また、例
えば、米国特許第４，５１７，２８８号明細書に記載さ
れているラディアルウオツシュ（ｒａｄｉａｌ　ｗａｓ
ｈ）技法も有用である。

本発明の一つの実施態様においては、酵素標識抗原接合
体、例えばフェノパルビタールーグルコースオキシダー
ゼを燐脂質小胞中に封入する。小胞をトリトンＸ−１０
０界面活性剤で溶解することによって接合体を放出させ
ることができる。小胞を、界面活性剤及び試験試料の適
用前に要素に施すことができる。

本発明の別の実施態様においては、小胞を公知の製造技
法及び物質を用いて製造時に要素中に混入する。

これらの実施態様では、放出される酵素標識抗原は、酸
素の存在でグルコースをグルコン酸及び過酸化水素に変
換するグルコースオキシダーゼを供給する。過酸化水素
は、ペルオキシダーゼの存在で、ロイコ色素を検出可能
な色素に変換させるか、又は発色カプラーと酸化可能な
化合物との反応を起こさせて検出可能な色素を形成させ
る。色素形成の速度は、フェノバルビタール抗体に結合
している酵素標識の量に相関することができる。

酵素標識の量は、試験試料中のフェノバルビクールの量
に相関することができる。有用な試薬及びそれぞれの、
例えばロイコ色素の量は、文献に良く知られている。

下記の実施例に使用するため、フェノパルビタールーグ
ルコースオキシダーゼ接合体を下記の方法で製造した。

ナトリウム５−エチル−５−フェニルバルビテート（５
，０ｇ、　０．０１９モル）を乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド５０＋＋＋１中に懸濁した。攪拌懸濁液に５
−ブロモ吉草酸エチル（４，６ｇ％　０．０２２モル）
を滴加した。反応混合物を４０モに１ｏ分間穏和に加熱
し、次いで、室温で１６時間攪拌した。沃化カリウムＩ
ｇを添加した後、反応混合物を更に６時間攪拌した。

反応混合物上に口過した窒素流を、半固体生成物が得ら
れるまで導通し、半固体生成物をジクロロメタン２５０
ｍ１中に溶解した。生じる溶液を蒸留水１００ＩＩｌｂ
　２．５％重炭酸ナトリウム溶液１００ｍ１．２．５％
重炭酸ナトリウム溶液５０ｍ１、蒸留水５０ｍ１で洗浄
し、次いで硫酸ナトリウム上に乾燥した。溶剤を蒸発す
ると、固体生成物５．６ｇが生じた。この生成物は、５
−エチル−５−フェニルバルビッール酸のモノ及びジエ
ステルの混合物であることが判った。エステル混合物の
試料（１，４ｇ）をクロロホルム４ｍｌ中に溶解し、溶
離溶剤としてクロロホルムとア七ト二トリル（９５１５
）との混合物を用いてシリカゲルカラム（３００ｇ、　
２．５ｃｍＸ　３６ｃｍ）でクロマトグラフにかけた。

ジエステルは溶離溶剤の最初の６００ｍ１に溶出し、モ
ノエステルは、溶離溶剤の９５０〜１４５０ｍｌで溶出
した。純粋なモノエステルの量は、０．４５　ｇであっ
た。

遣 工程１からのエステル（０，７７ｇ）を濃塩酸１６．３
ｍｌ、テトラヒドロフラン３２．５ｍｌ及び水６．５ｍ
ｌの混合物に溶解した。加水分解混合物を室温で一夜攪
拌し、次いで、テトラヒドロフランを減圧下に除去した
。反応混合物に飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍ１を添加
した。この混合物を毎回５０ｍ１のジクロロメタンで４
回抽出した。ジクロロメタン抽出液を毎回５０ｍ１の飽
和重炭酸ナトリウム溶液で３回抽出した。合した重炭酸
塩抽出液を氷水浴の温度で濃塩酸を用いてｐ）１２〜３
に注意深く酸性にした。白色固体が沈殿した。

酸性にした混合物を毎回５０ｍ１のジクロロメタンで３
回抽出した。ジクロロメタン抽出液を冷水５０ｍ１で洗
浄し、硫酸ナトリウム上に乾燥した。

ジクロロメタンを蒸発すると、粘着性固体０．９ｇが生
じた。固体をエーテル２ｍｌに溶解した。僅かな曇りが
生じるまで、石油エーテルを滴加した。

溶液を冷凍庫中に一夜保持した。結晶性生成物を集め、
減圧で一夜乾燥した。生成物の量は０．６３ｇであった
・ 以下余白 ＣＩ？Ｈ２゜Ｎ２０．としての分析： ＣＨＮ 計算値　　６１．４　　　　６．１　　　　８．４実測
値　　６１．３　　　　６．２　　　　８．２グルコー
スオキシダーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）を０．０５モル燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ−７）２１に対して２４時間透析し
た。緩衝液を２回変えた。透析したグルコースオキシダ
ーゼ（２０ｍｌ、　６．２５　Ｘ１０−７モル）を蒸留
水で５０　に希釈し、希ＮａＯＨを用いてｐＨを８．５
に調節した。

１−（４−カルボキシブチル）−５−エチル−５−フェ
ニルバルビッール酸（４１，５ｍｇ、１．２５ＸＩＯ’
モル）を乾燥ジオキサン４ｍｌ中に溶解した。トリブチ
ルアミン（２９，８μｌ、１．２５　Ｘ１０−４モル）
を添加し、溶液を１５°Ｃに冷却した。クロロギ酸イソ
ブチル（１６μ１１．２５Ｘ１０、’モル）を添加し、
反応混合物を１５℃で２０分攪拌した。この生成物をグ
ルコースオキシダーゼ溶液に滴加し、ｐＨを８．５に保
持しながら、反応混合物を室温で３０分攪拌した。

反応混合物を次いで、０．０５モルＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ（
ｐＨ＝７）２Ｎに対して２日間透析した。緩衝液を２〜
３回変えた。反応混合物をアミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　
Ｃｏｒｐ、）から入手しうる市販のミニコン（Ｍｉｎｉ
ｃｏｎ）　Ｂ　−１５試料濃縮器で濃縮し、次に、０．
０５モルＫ　Ｈｚ　Ｐ　Ｏａ　　（ｐＨ＝　７　＞で平
衡化したバイオ−ラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ
、）から入手しうるバイオ−ゲルＰ−６カラム（２００
〜４００メツシユ）でクロマトグラフィーにかけた。収
率は７５％であった。

蛋白質濃度＝６．４１ｍｇ／ｎ＋１ 活性　　　＝１１９７　１．Ｕ、／ｍｌ、１８７１．Ｕ
、／ｍｇリガンド：酵素比＝２０：１ 本明細書に使用する１、Ｕ、は、酵素活性に関する国際
単位を表し、ｔ　　ｔ、Ｕ、は、その酵素に関する標準
ｐＨ及び温度条件下に１背当たり１マイクロモルの基質
の変換を触媒するのに必要な酵素活性の量と定義される
。

■上　分所ｊ圃ｄ壓（社）１遣 この例は、小胞組成物の製造、その精製及び小胞中に混
入されるリガンドアナローグの量の測定を説明するもの
である。

ジエチルエーテル及びクロロホルム中の卵ホスファチジ
ルコリン（６９ｍｇ、９０ミリモル）、コレステロール
（２６ｍｇ、　６７ミリモル）及びパルミチン酸（５，
６ｍｇ、　２２ミリモル）の混合物を回転蒸発器に取り
つけたフラスコ中で薄いフィルム状に乾燥した。脂質を
ジエチルエーテル１０ｍ１中に再溶解させ、連続して２
回薄いフィルム状に乾燥させてすべてのクロロホルムを
除去した。脂質混合物をジエチルエーテル９ｍｌに溶か
し、燐酸塩で緩衝した塩類溶液（０，０１モル燐酸塩、
０．１５モルＣＩ　、　ｐＨ７，３）中の先に製造した
フェノパルビタールーグルコースオキシダーゼ（Ｉｍｇ
／ｍｌ）の溶液３ｍｌと合し、水で１：１０に希釈した
。２相混合物を冷超音波浴中で３〜５分超音波処理して
、脂質、エーテル及び水の安定なエマルジョンを得た。

次いで、減圧窒素雰囲気中で高速回転を用いる回転蒸発
によってエーテルを徐々に除去して、脂質及び水性液体
の厚い白色ゲルを形成させた。緩衝剤溶液’（１２ｍｌ
）を試料に添加し、回転蒸発を繰り返して残留するエー
テルを完全に除去した。標識フエノバルビクールを含む
小胞の白色水性分散液が得られた。

水性小胞分散液を充分に混合した。試料（０，５ｍ１）
を除去し、残りの容量を測定した。次いで、混合物を市
販の遠心機中で８℃で２０，０００　ｒｐｍで２０分間
遠心分離した。上澄液をデカントし、保存し、ペレット
を元の容量に等しい容量の緩衝溶液中に渦流混合によっ
て再懸濁した。次いで、脂質小胞を再遠心分離し、上澄
液を捨てた。この洗浄方法を４回、繰り返した。

最終的ベレットを元の容量の緩衝溶液中に渦動混合によ
って再懸濁し、１％トリトンＸ−１００界面活性剤の存
在及び不存在で酵素活性について分析した。比較のため
、粗製小胞調製物を同じ条件下に分析した。得られたデ
ータを下記の表に示す。

燐酸カリウム溶液（０，０５モル、ｐＨ７）５０ｍｌ、
０−ジアニシジン（３，３３ｍｇ／ｍｌ）　１．０ｍｌ
及び西洋わさびペルオキシダーゼ溶液（２，５ｍｇ／ｍ
１）０．５ｍｌを混合することによって酵素活性の測定
用試薬溶液を製造した。試薬溶液は、氷上で少なくとも
１日間安定であった。試薬溶液０．９０ｍ１に分光光度
計キュベツト中で基質溶液（溶液１００ｍ１当りグルコ
ース１８ｇ含有）０．１０ｍ１を添加し、合した溶液を
３７℃で５〜７分間分間インバエベート。

分析すべき溶液を緩衝溶液で５０〜１００１．Ｕ。

／ｍｌの概算最終活性になるまで希釈し、希釈した試料
０．０５ｍ１をインキュベーションキュベツトに加える
ことによって反応を開始させた。キュベツトを２又は３
回転倒させ、分光光度計を用いて、４３０ｎｍでの吸光
度の経時変化を記録した。１背当たりの吸光度の変化に
試料の総希釈係数（キュベツトに導入前）の１．９３倍
を乗することによって元の溶液の活性（１，Ｕ、／ｍｌ
）を計算した。

代表的分析結果を以下に挙げる。結果は総酵素１ｍｇ当
たりの１．Ｕ、とじて表す。

トリトン（商標）トリトン（商標） ？容液　　　　ｘ−ｉｏｏなし　　　ｘ−ｉｏｏ有り粗
製小胞組成物　　１４７　　　　　２３６精製小胞組成
物　　　　１　　　　　１にれらのデータは、精製組成
物が小胞内に本質的にすべてのりガンドアナローグを含
み、小胞の外側には全く含まないこと及び小胞を溶解さ
せてリガンドアナローグを放出させうろことを示す。

下記の構成及び成分を有する分析溶液を製造した： （以下余白） ポリスチレンビーズに固定した ウサギ抗フェノバルビタール 抗血清　　　　　　　　　　６５ｇ／ｎｌＫ　Ｈｚ　Ｐ
　Ｏａ緩衝剤（ｐＨ７）　０．１５　ｇ／ｎｌ拡散　　
ポリ　（アクリル酸ブチルーコ一層　　　スチレンーコ
ーアクリルアミドー２−メチルプロパンスルホン酸 ナトリウム塩）接着剤　　　２．６ｇ／ｒｄゾニＢｖ　
（ＺＯＮＹＬ）　ＦＳＮ　　　’　　　０．５　　／　
ｒｄゼラチン（硬化したもの）　　３．２ｇ／ｒｄ２−
（３，５−ジメチル−４− ヒドロキシフェニル）−４，５− ビス（４−ジメチルアミノフェニル） 記録　　イミダゾールロイコ染料　　０．３ｇ／ｒｒｆ
層　　　２．４−ジ−ｎ−アミル フェノール　　　　　　　　１．８ｇ／ｒｒｒグルコー
ス　　　　　　　　１．９ｇ／ｎｆジメドン　　　　　
　　　　　０．２　ｇ　／　ｃｄアルカノールＸＣ界面
活性剤ｏ、ｏ７ｇ７ｒｒｒヘルオキシダーゼ　　２５．
０００　Ｌｔｌ、１０ｆポリ　（エチレンテレフタレー
ト） 下記の溶液を製造し、前記の多層要素の拡散層の特定領
域に施した。特定領域に固定化リガンド−レセプター複
合体が形成し、未結合のリガンドは特定領域から水平方
向に移動した。特定領域における結合リガンドアナロー
グからの色素形成速度を６７０ｎｍで測定した。結果を
第１図に示す。

望丘へ二 前記の精製小胞組成物５μｌを前記の要素に施し、色素
形成速度を測定した。このようにして第１図に示した凱
腺人を得た。色素形成速度は最小であり、リガンドアナ
ローグ及び抗体が同じ環境中に存在するが、リガンドア
ナローグは小胞中に含まれているので、本質的には結合
が起こらないことを示す。

皇血旦： 前記小胞組成物をトリトンＸ−１００界面活性剤溶ｉ（
最終濃度１％）と予め混合し、次いで５μβを要素に施
し、色素形成速度を測定した。このようにして典亙旦を
得た。速度増加は、リガンドアナローグが小胞から放出
され、抗体によって結合されたことを示す。

痘亘旦： １ミリモルのフェノバルビタールを含む小胞組成物をト
リトンＸ−１００界面活性剤溶液（最終濃度１％）と予
め混合し、次いで、５μｌを要素に施し、色素形成速度
を測定した。このようにして典旙旦を得た。フェノバル
ビタールは、抗体結合部位に関して放出された接合体と
有用に競合した。リガンドアナローグは、溶液Ｂと同様
に、小胞から放出されたが、極めて少量のアナローグが
抗体によって結合された。

曵沃旦： 小胞組成物５μｌを要素に施した。７５秒後、最初のス
ポットの上にトリトンＸ−１００界面活性剤溶液（１％
）のスポットを重ねた。このようにしてｆｌ旦を得た。

トリトンＸ−１００界面活性剤溶液の添加後の速度増加
は、曲線Ｂと同じであり、リガンドアナローグが小胞か
ら放出され、固定化抗体に結合されたことを示す。

盗浪旦： 小胞組成物５μｌを要素に施した。７５秒後、トリトン
Ｘ−１００（１％）及び１ミリモルのフエノバルビター
ルを含む溶液を要素の同じ領域に施した。このようにし
て」Ｄ敦ヱユを得た。速度は、曲＆ＩＣに示したのと同
様である。フェノバルビタールは、小胞添加後に要素に
トリトンＸ−１００界面活性剤と共に添力ＯＬだ場合、
抗体結合部位に関して放出された接合体と有用に競合し
た。

これらのデータは、レセプター及び標識リガンドアナロ
ーグが同じ環境に存在する場合に、本質的に早期の結合
が起こらない（溶液Ａ及び曲線Ａ）ことを示す。しかし
、結合反応は、小胞が溶解する場合に起こる（溶液Ｂ及
びＤ並びに曲線Ｂ及びＤ）。従って、本発明方法は、こ
の要素と共にフエノバルビクールを測定するため使用す
ることができる。

以下余白 ±ユゝ−１でのフエノバルビクールの濱１例２に示した
ようにして製造した分析要素をフエノバルビクールの測
定のため使用した。例１に記載したようにして製造した
、燐酸ナトリウム緩衝ｔ＆　（０，０５モル、ｐＨ７）
中のフェノパルビタールーグルコースオキシダーゼ接合
体を含む小胞の溶液のスポットを５μｌの試料を用いる
要素上に付けた。次いで、緩衝液中の種々の濃度のフェ
ノバルビタール（１〜１２８μｇ／ｍｌ）及びトリトン
Ｘ−１００界面活性剤（１重量％）を含む溶液のスポッ
トを５μｉの試料を用いる要素の同じ領域上に付けた。

スポットを付けた領域の中央の固定化リガンドアナロー
グから形成された色素の反射濃度を３７℃で３〜５分か
けて、６７０　ｎｍで測定した。ウィリアムス−クラッ
パ−（Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｃ１ａｐｐｅｒ）変換（Ｆ、
Ｃ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｆ、　Ｃ。

“Ｃ１ａｐｐｅｒ著、Ｊ、　Ｏｔｉｃａｌ　Ｓｏｃ、　
Ａｍ、′、４３．５９５．１９５３）を使用した透過濃
度（Ｄｒ）値を得た。得られたデータを下記の表に示す
。

以下≦１白 １表 Ｐｈｅ濃度　　　　　　　　　　　速度（Ｌ工／　ｍ　
ｌ　）　　　　　　　　　ユ旦二Ｚ丘［１０，０６９ ２、５０，０６９ ５０，０６３ Ｂ　　　　　　　　　　　　０．０６１２０　　　　　
　　　　　　０、０５８４０　　　　　　　　　　　０
、０５７８０　　　　　　　　　　　０．０５５１２８
　　　　　　　　　　　０．０５２〔発明の効果〕 本発明は、２種の物質が同じ環境に存在する場合にレセ
プター及びリガンドアナローグの早期結合を防止する手
段を提供する。生物医学的研究及び臨床的測定、例えば
リガンドが低濃度で存在する免疫分析に利するため、本
発明の物質を使用することができる。この重要な利点は
、結合が望まれるときに溶解しうる小胞の内部に完全な
りガンドアナローグを封入することによって達成される
。

従来技術の小胞とは異なり、小胞の外表面にはリガンド
分子又は結合部位が本質的に存在しない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例２に記載した多数のフェノバルビクール測
定に関する、６７０ｎｍで測定した反射濃度（Ｄ、）を
時間（秒）に対してプロットしたグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、脂質膜、その中に封入された生理学的に活性な標識
   種及び該種を本質的に含まない外表面を有する小胞を含
   む組成物。 ２、脂質膜、その中に封入されたリガンドの標識アナロ
   ーグ及びリガンド又はそのレセプターを本質的に含まな
   い外表面を有する小胞を含んで成る乾式分析要素。 ３、（Ａ）リガンドに対するレセプターの存在下に、液
   体試料を、脂質膜、その中に封入されたリガンドの標識
   アナローグ及びリガンド又はそのレセプターを本質的に
   含まない外表面を有する小胞と接触させ、 （Ｂ）小胞を溶解させ、そして （Ｃ）結合型又は未結合型の標識アナローグを測定する 工程を含んで成る液体中の免疫活性リガンドの測定方法
   。