JPH03221865A

JPH03221865A - 微量成分の新規な分別測定方法

Info

Publication number: JPH03221865A
Application number: JP2016694A
Authority: JP
Inventors: Shinji Satomura; 慎二里村; Kenji Nakamura; 賢治中村; Shuji Matsuura; 脩治松浦
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1990-01-26
Publication date: 1991-09-30
Anticipated expiration: 2010-04-10
Also published as: JPH0731202B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の利用分野］本発明は、例えば血清、血液、血漿、尿等の生体体液、
リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の同
一の作用を有する２以上の測定対象物質又は類似した構
造を有するが異なる作用を有する２以上の測定対象物質
を、その化学的又は／及び物理的な性質に応じて、迅速
に、容易に且つ精度良く分別測定する方法に関する。

［発明の背景］生体試料中に含まれる微量成分の中には、同一の作用を
有するが化学的又は／及び物理的に異なる性質を有する
もの、或は類似の構造を有するが異なる作用を有するも
のが存在する。例えば、煩白質部分或は糖鎖部分の構造
が異なる酵素（アイソザイム）や糖鎖構造の異なるホル
モン等の生理活性物質は前者に相当し、ステロイドホル
モン類や甲状腺刺激ホルモン（ＴＳｌｌ）、卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）　、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣ
Ｇ）等のホルモン等の生理活性物質が後者に相当する。

これらの試料中の量を、種々の性質に応じて分別測定す
ることができれば、臨床上有効な指標が得られることは
良く知られている。

これらを分別測定する一般的な方法としては、例えば電
気泳動法、イムノアッセイ法、抗体やインヒビターを用
いた酵素活性の阻害を利用した方法等が挙げられる。し
かしながら、これらの方法は、測定に時間を要する、定
量性が低い等の問題点があり、必ずしも実用的な方法と
はいい難い。

一方、このような問題点を解決する方法として、イオン
交換クロマトグラフィ用充填剤を充填したカラムを用い
た高速液体クロマトグラフィ（ｌ（ＰＬＣ）により、乳
酸脱水素酵素のアイソザイムを分別測定する方法が提案
されている（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、３７４．４
５〜５０頁、１，９８６、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、
、３７８，４５６−４６１頁、１９８６）。しかしなが
ら、この方法に於いても、分別測定の対象となり得るも
のはある程度限られており、しかも分別のための測定条
件は測定対象物質に応じて設定する必要がある等の問題
点を有しているので、必ずしも良い方法であるとは言い
難く、更なる改良が望まれていた。

［発明の目的コ本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、生
体由来の試料中の、同一の作用を有する２以上の測定対
象物質又は類似した構造を有するが異なる作用を有する
２以上の測定対象物質を、その化学的又は／及び物理的
な性質に応じて、迅速に、容易に且つ精度良く分別測定
し得る方法を提供することを目的とする。

［発明の構成コ本発明は、同一の作用を有する２以上の測定対象物質又
は類似した構造を有するが異なる作用を有する２以上の
測定対象物質（以下、単に、測定対象物質と略記する。

）を含む試料を、測定対象物質全てに対して結合能を有
し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質
を有しているか又は何らかの方法により検出可能な物質
により標識されている物質（以下、結合能物質Ａと略記
する。）及び測定対象物質の少なくとも１つに対しては
結合能を有するが少なくとも１つとは結合しない物質（
以下、結合能物質Ｂと略記する。）と混合して反応させ
た後、測定対象物質と結合能物質Ａとの複合体（以下、
複合体Ａと略記する。）と、測定対象物質と結合能物質
Ａ及び結合能物質Ｂとの複合体（以下、複合体Ｂと略記
する。）と、遊離の結合能物質Ａとを高速液体クロマト
グラフィにより分離し、複合体Ａ中の結合能物質Ａの量
又は／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａの量を測定するこ
とにより試料中の測定対象物質の何れかの量を測定する
ことを特徴とする分別測定方法の発明である。

本発明の分別測定方法を実施するには、例えば以下のよ
うにして行えばよい。

即ち、先ず測定対象物質を含む生体由来の試料と、結合
能物質Ａ及び結合能物質Ｂとを、要すれば適当な緩衝液
中に添加、混合して反応させ、複合体Ａ及び複合体Ｂを
形成させた後、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物
質Ａとを所定の充填剤を充填したカラムを装着したＨＰ
ＬＣにより分離する。次いで、分離された複合体Ａ中に
含まれる結合能物質Ａの量又は／及び複合体Ｂ中に含ま
れる結合能物質Ａの量を、結合能物質Ａが保有する性質
に応じた測定方法により求めれば、試料中の測定対象物
質の何れかの量が求められる。

本発明の分別測定方法により測定可能な測定対象物質と
しては、測定対象物質の全てと結合し、且つそれ自身が
何らかの方法により検出可能な性質を有しているか又は
何らかの方法により検出可能な物質（以下、検出物質と
略記する。）により標識が可能な物質が存在し、更に測
定対象物質の少なくとも１つとは互いに強い相互作用（
ａｆｆｉｎｉｔｙ；ａ和力或は親和性）を及ぼしあい、
強固な複合体を形成するが、それらの少なくとも１つと
は結合しない物質が存在するものであれば、特に限定す
ることなく挙げられるが、例えば血清、血液。

血漿、尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等
の生体由来の試料中に含まれる酵素、生理活性物質、癌
関連抗原、糖鎖を有する物質等が代表的なものとして挙
げられる。更に具体的には、例えばアミラーゼ、アルカ
リホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミ
ルＩ・ランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ）　、　リパーゼ
、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤ
Ｈ）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）　、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（ＧＰＴ）　、レニン、プロティンキナーゼ、チロシ
ンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン、ヒ
ト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、プロラクチン、
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）　、黄体形成ホルモン（
ＬＨ）等ノ生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（ＰＳ
Ａ）　、α２マクログロブリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）、α−フェトプロティン等の癌関連抗原等が好ましく
挙げられる。

本発明に係る結合能物質Ａとしては、測定対象物質の全
てと結合し、且つそれ自身が何らかの方法により検出可
能な性質を有しているか又は検出物質により標識されて
いる物質であれば特に限定することなく挙げられる。結
合能物質Ａに係る、測定対象物賃金てに対して結合能を
有する物質の具体例としては、例えば抗原性を有する物
質（ハプテンを含む。）の特定の部分構造式は抗原決定
部位に対する抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能を有
する例えばコンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、イ
ンゲンマメレクチン、ダツラレクチン、ヒイロチヤワン
タケレクチン、ヒママメレクチン、ピーナッツレクチン
、小麦胚芽レクチン等のレクチン類、或はアミラーゼ、
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）　、グルタミン酸オキザロ
酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対するイ
ンヒビター等が挙げられ、これらに検出物質を標識した
ものが結合能物質Ａの具体例として好ましく挙げられる
９検出物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）
に於いて用いられるアルカッホスファターゼ。

β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、マイクロパ
ーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ。

グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵
素、ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばラジオイムノア
ッセイ（Ｒ工Ａ）で用いられる９９ｍＴｃ。

＋３１　■、　１２５Ｉ、　＋４（、、”ＩＩ等の放射
性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で用いら
れるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、ク
マリン、ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性
物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ル主ノー
ル、ビス＜２．４．６−ドリフロロフエニル）オキザレ
ーＩ・等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール
、アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を
有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，８−テト
ラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，
２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、
２，６−ジーし一ブチルーα−（３，５−ジ−セーブチ
ル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イ
リデン＞−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する
化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有
する物質等が挙げられるが、これらに限定されるもので
はないことは言うまでもない。

上記した如き物質に、上記した如き検出物質を標識させ
て結合能物質Ａを調製する方法としては、自体公知のＥ
ＩＡ−ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている
自体公知の標識方法（例えば、医化学実験講座、第８巻
、山村雄−監修、第１版、中国書店、１９７１　；図説
　蛍光抗体、用生明著、第１版、（株）ソフトサイエン
ス社、１９８３　；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠
、宮井潔編、第２版、医学書院、１９８２等）が何れも
例外なく挙げられ、これらに準じて行えばよい。また、
標識方法として、アビジン（又はストレプトアビジン）
とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良いこと
は言うまでもない。

本発明に係る結合能物質Ａとしては、このように検出物
質で標識されたちの以外にそれ自身何らかの方法により
検出可能な性質を有するものも挙げることができる。本
発明に係る結合能物質Ａが１有する何らかの方法により検出可能な性質の例としては
、例えば酵素活性、蛍光性、発光性或は紫外部に吸収を
有する性質等が挙げられる。

本発明に係る結合能物質Ｂとしては、測定対象物質の少
なくとも１つとは互いに強い相互作用（ａｆｆｉｎｊｔ
ｙ　；親和力或は親和性）を及ぼしあい、強固な複合体
を形成するが、測定対象物質の少なくとも１つとは結合
しない物質であれば特に限定することなく挙げられる。

具体的には、例えば抗原性を有する物質（ハプテンを含
む。）の特定の部分構造酸は抗原決定部位に対する特定
の抗体や特定構造の糖鎖に対して結合能を有する例えば
コンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、インゲンマメ
レクチン、ダツラレクチン、ヒイロチヤワンタケレクチ
ン、ヒママメレクチン、ピーナッツレクチン、小麦胚芽
レクチン等のレクチン類、或はアミラーゼ、タレアチン
キナーゼ（ＣＫ）　、グルタミン酸オキザロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ）等の酵素に対する特定のインヒ
ビター等が好ましく挙げられる。

　２尚、要すれば、結合能物質Ｂを、結合能物質Ａのところ
で述べたような検出物質で上記した如き方法により標識
してもよい。この場合に、結合能物質Ａが保持している
検出物質と同じものを標識すれば、複合体Ｂの検出感度
が高くなって検出が容易となると言う利点が生じる。但
し、標識された結合能物質Ｂを用いて本発明の分別測定
方法を実施する場合には、遊離の結合能物質Ｂは、複合
体Ａ及び複合体Ｂと、ＨＰ　Ｌ　Ｃにより分離し得る性
質を有していなければならないことは言うまでもない。

本発明の分別測定方法に於いて、測定対象物質と、結合
能物質Ａ及び結合能物質Ｂとを反応させて、複合体Ａ及
び複合体Ｂを形成させる際の反応条件としては、複合体
Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げたり、測定対象物
質、結合能物質Ａ並びに結合能物質Ｂを変質させてしま
う様な条件でさえなければ特に限定されないが、例えば
ＥＸＡＲＩＡ、ＦＩＡ、アフイニティクロマトグラフィ
等の自体公知の方法に於いて採用されている複合体等を
形成させる際の反応条件に準じて行われるのが一般的で
ある。例えば、反応時に緩衝液を用いる場合には、使用
される緩衝剤やその他の試薬はこれら自体公知の方法に
於いて用いられるものを適宜選択して用いればよい。

本発明の分別測定方法に於いて、複合体Ａ及び複合体Ｂ
を形成させる際の結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂの使用
濃度は、測定対象物質の検量限界や測定感度をどの程度
に設定するかによって適宜設定すればよく、特に限定さ
れない。結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂは通常夫々１種
を用いれば足りるが、要すれば夫々について２種以上組
み合わせて用いてもよい。この場合に、測定対象物質上
の異なる部位に各々結合する性質を有する２種類以上の
結合能物質Ａ、任意の測定対象物質」二の異なる部位に
各々結合する性質を有する２種類以上の結合能物質Ｂ等
を組み合わせて用いれば、結果的に複合体Ａ及び複合体
Ｂの分子量が大きくなり、また、場合によっては等電点
も変動すること等から、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の
結合能物質Ａの分離がより容易となり、測定精度の向上
を計ることができる。また、測定対象物質が、例えばＸ
、Ｙ及びＺの混合物である場合に、例えばＸに対する結
合能物質ＢとＹに対する結合能物質Ｂを併せて用いれば
、Ｘ、Ｙ及びＺを各々同時に分別測定することも可能と
なる。

本発明の分別測定法に於いて、反応時のｐＨとしては、
複合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げない範囲で
あれば特に限定されるものではないが、通常２〜１０、
好ましくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の温度も
、複合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのを妨げない範囲
であれば特に限定されるものではないが、通常０〜７０
℃、好ましくは２０〜４０℃の範囲が挙げられる。反応
時間は、複合体Ａ及び複合体Ｂが形成されるのに要する
時間が測定対象物質や結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂの
性質により異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至
数時間適宜反応させればよい。

本発明の測定方法に於いて、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊
離の結合能物質Ａの分離に用いられるＨＰ　５ＬＣとしては、装置自身は通常分析の分野に於いて用い
られているもので定流速のものであれば特に問題なく用
いることができるが、分離用カラムに使用する充填剤は
、複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａとの間に
どのような性質の差があるかにより種々のものが適宜選
択されて使用されなければならないことは言うまでもな
い。即ち、例えば複合体Ｂの分子量が複合体Ａの分子量
の約１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ま
しくは２倍以上あり、且つ複合体Ａの分子量が遊離の結
合能物質Ａの分子量の約１．２倍以上、好ましくは１．
５倍以上、更に好ましくは２倍以上ある場合にはゲル濾
過（ゲルクロマトグラフィ）用の充填剤が適している。

また、例えば複合体Ａ、″ａ合体Ｂ及び遊離の結合能物
質Ａの等重点が互いに異なる場合であって、各等電点の
差がｐＨで０．０５Ｊｌ上、好ましくは０．２以上ある
場合にはイオン交換クロマトグラフィ用或は等電点クロ
マトグラフィ用の充填剤が適しており、例えば複合体Ａ
、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａの疎水性に明らかな
差が　６有る場合には疎水クロマトグラフィ用充填剤、逆相クロ
マトグラフィ用充填剤或はハイドロキシアパタイト等が
適している。

ＨＰＬＣにより複合体Ａ、！合体Ｂ及び遊離の結合能物
質Ａの分離を行う際に用いられる溶媒（溶離液）として
は、形成された複合体Ａ及び複合体Ｂが再び測定対象物
質と結合能物質Ａ或は測定対象物質と結合能物質Ｂとに
分解されるようなことがなく、且つ複合体Ａ及び複合体
Ｂに含まれる結合能物質Ａが有している或は結合能物質
Ａが保持している検出物質が有している、何らかの方法
により検出し得る性質を失わしめるようなものでなけれ
ば特に限定されることなく挙げられるが、通常は例えば
Ｅ：ｒＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、アフィニティクロマトグラ
フィ等の自体公知の方法に於いて緩衝液として用いられ
ているようなものが好ましく用いられる。具体例として
は、例えばリン酸塩。

酢酸塩、クエン酸塩、グツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤、ト
リス（ヒドロキシエチル）アミノメタン等の緩衝剤、例
えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム
等の塩類、例えばメタノール、エタノール、イソプロピ
ルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等
の極性有機溶媒類及び界面活性剤等を、複合体Ａ、複合
体Ｂ及び′ｉｌｉ離の結合能物質Ａの性質に応じて適宜
選択し、添加、混合してｍ製された、ＰＨ２〜１０の緩
衝液が好ましく用いられる。

本発明の分別測定方法に於いて、ＨＰＬＣにより分離さ
れた複合体Ａ及び複合体Ｂ中に含まれる結合能物質Ａの
量の測定は、結合能物質Ａが或は結合能物質Ａに保持さ
れている検出物質が有している、何らかの方法により検
出し得る性質に応じて夫々所定の方法に従って実施され
る。例えば、その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡの常
法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ
、３１、北用常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、
５１−６３頁、共立出版（株）　、１９８７年９月１０
ＥＩ発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
く、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従
い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて
液浸型０Ｍカウンター、液体シンチレーションカウンタ
ー、井戸型シンチレーションカウンター、　１（ＰＬＣ
用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定
を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄
−監修、第１版、中国書店、１９７１等参照。）。また
、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器
を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説　蛍光抗体、用生
明著、第王版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３Ｊ
等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、その性
質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測定機器
を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵
素別冊Ｎｏ、３１、北用常廣・南原利夫・辻章夫・石川
榮治編集、２５２〜２６３頁、共立出版（株）　、　１
９８７年９月１０日発行」等に記載された方法に準じて
測定を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有
する性質の場合には分光光度針等の測定機器を用いる常
法によって測定を行えばよく、検出物質がスピンの性質
を有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常
法、例　９えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素側Ｉｎ）Ｎｏ、
３］、北用常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、２
６４〜２７１頁、共立出版（株）　、　１９８７年９月
１０日発行」等に記載された方法に準じて夫々測定を行
えばよい。

また、本発明の分別測定方法に於いて、＋１　Ｐ　Ｌ　
Ｃによる分離後の測定方式としては、例えばｒＭ新液体
クロマトグラフィ、原昭二・辻章夫編、第１版、９２〜
１０４頁、南山堂、］］９７８年２月Ｊ−日発行ｊに記
載されているような、Ｈ））　Ｌ　Ｃのカラムからの流
出液をそのまま検出部に導き、流出液中の複合体Ａ及び
複合体Ｂ中に含まれる結合能物質Ａの量を直接測定する
方式が、測定が迅速に行えるのでより好ましい。この場
合に、結合能物質Ａが或は結合能物質Ａに保持されてい
る検出物質が有している、何らかの方法により検出し得
る性質が、例えば酵素活性であれば、ＨＰ　１．Ｃのカ
ラムと検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し
流出液と反応させる、所謂ポストカラム法の反応部を設
ける必要があることは言うまでもない。結合能物質Ａの
該性０質が酵素活性である場合に該反応部に於いて用いられる
酵素活性測定用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定
法、蛋白質核酸酵素別冊Ｎ０８３１、北用常廣・南原利
夫・辻章夫・石川榮治編集、５１〜６３頁、共立出版（
株）　、１９８７年９月１０日発行」等に記載された方
法に準じて調製したものを用いてもよいし、市販されて
いる臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利用しても
よい。また、結合能物質Ａの該性質が酵素活性以外の場
合に於いても、検出感度を増加させる目的で所定の試薬
を添加、反応させるために、＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃのカラム
と検出部との間に適当な反応部を設けることは任意であ
る。

尚、結合能物質Ｂが、結合能物質Ａに保持されているの
と同じ検出物質により標識されている場合には、各複合
体中の結合能物質Ａの量を測定することにより、複合体
Ｂ中の結合能物質Ｂの量も併せて測定されることは言う
までもない。

本発明の分別測定方法に於いて、結合能物質Ａに係る、
測定対象物賃金てに対して結合能を有する物質及び／又
は結合能物質Ｂとして抗体を用いる場合には、目的に応
じて使用する抗体を適宜ペプシン、パパイン等の酵素を
用いて消化してＦ（ａｂ′）２、Ｆ　ａｂ’或はＦａｌ
）として使用することも可能である。特に、Ｆａｂ’と
した場合には、これに対して検出物質を容易に標識し得
ると言う利点が生じる。また、Ｆ　ａｂ’或はＦ’ａｂ
として利用した場合には、結合能物質Ａや結合能物質Ｂ
が、各々が結合能を有する測定対象物質１個当りに１個
（測定対象物質が２量体や３量体等になっている場合に
は単量体あたりに１個）結合するため、複合体Ａ及び複
合体ＢがＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより溶出されて来る時間が
ほぼ一定となるのでより好ましい。また、抗体として１
つの抗原認識部位のみと結合する性質を備えたモノクロ
ーナル抗体を用いた場合にも、測定対象物質１個当りに
１個（測定対象物質が２１体や３量体等になっている場
合には単量体あたりに１個）のモノクローナル抗体が結
合するため、複合体Ａ及び複合体Ｂが）Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ
により溶出されて来る時間がほぼ一定となるのでより好
ましい。この場合にも、これを消化してＦａｂ’或はＦ
ａｂとして用いてもよいことは言うまでもない。

本発明に於いて用いられる、結合能物質Ａに係る、測定
対象物賃金てに対して結合能を有する物質又は／及び結
合能物質Ｂとしての抗体は、常法、例えば「免疫学実験
入門、第２刷、松橋直ら、Ｃ株）学会出版センター、１
９８１Ｊ等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山
羊、ラット、マウス等の動ｅｅｌこ測定対象物質を免疫
して作製されるポリクローナル抗体でも、或はまた常法
、即ちケラ−とミルスタイン（Ｇ、　Ｋ６ｈｌｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｃ，Ｍｉｌｓｔ、ｅｉｎ；　Ｎａｔｕｒｅ、　２
５６．４９５．１９７５）により確立された細胞融合法
に従い、マウスの腫瘍ラインからのＭＥ胞と、測定対象
物質で予め免疫されたマウスの＃細胞とを融合させて得
られるハイブリドーマが産生ずる単クローン性抗体でも
何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み
合わせて用いる等は任意である。

本発明の分別測定方法によれば、測定に要する時間は数
分から数時間程度であり、必要な測定操作自体は、測定
対象物質を含む試料、結合能物質　３Ａ及び結合能物質Ｂを混合した後、ＨＰＬＣにより複合
体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａとを分離し、複
合体Ａ中の結合能物質Ａの量又は／及び複合体Ｂ中の結
合能物質Ａの量を検出するのみである。これらのことか
ら明らかなように、本願発明の分別測定方法は、従来の
同様な目的の分別測定方法に比べて、簡便に且つ迅速に
目的の測定を行うことができる。

以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない
。

Ｃ実施例コ実施例１１ｗ鎖構造の異なるヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ｈＣＧ）の分別測定（溶離液）リン酸１ナトリウム３．９ｇ、リン酸２ナトリウム（１
２水塩）　８１に、塩化ナトリウム４４ｇ及び３−（ｐ
−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸８．３ｇをイオ
ン交換水に溶解し、ＰＨ７，５となるようにｌＮＮａＯ
Ｈ溶液を加えた後、全量５１として溶離液とした。

（基質液）３０％過酸化水素水をイオン交換水で希釈し、１−１２
０２の２０ｍＭ溶液を調製して基質液とした。

（抗体液）抗ｌ「ＣＧ−β鎖モノクローナル抗体（和光紬薬工業（
株）製）を常法により処理してＦａｂ’とし、これに常
法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識
して得たＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆａｂ’を、５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム含有）中に９５ｒ＋４／ｍｌの蛋白濃度となるよう
に添加して抗体液とした。

（レクチン液）レンズマメレクチン（ＬＣＡ−Ａ）を、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ＰＨ７，０）中に１．５ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度
となるように添加してレクチン液とした。

（試料）市販のｈＣＧ（胎盤絨毛由来、シグマ社製）又は絨毛癌
患者血清から＠製された絨毛癌由来のｈＣＧをイオン交
換水に溶解して、ｈＣＧ濃度１００゜２００、３００．
４００又は５００ｍＩＵ／ｍｌの溶液を夫々調製し、４試料とした。

（ＨＰＬＣの使用条件）システムの概略は第２図の通り。

・カラム及び充填剤：　０．４６φＸ　６０ｃ旧ＹＭＣ
−パックＤｉｏｌ−２００（山村化学研究所（株）社商
品名）。

・流速：溶離液；　０．５ｍｌ／ｍｉｎ、、基質液；　
０．０５ｍ１／ｍｉｎ、。

・反応部：　０．０４φＸ９００ｃｍ　（４０℃保温）
。

・検出：励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０４ｎｍ　テ
蛍光を測定した。

（測定操作）抗体液４０μｍ、レクチン液４０μｍ及び試料２０μｍ
とを混合し、３０℃で３０分間放置した後、混合液の２
０μ］を＋ＩＰＬｃにより分析した。

（結果）ＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ｈ　ＣＧ
−β鎖Ｆａｂ’は１２．５分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ
−β鎖−Ｆａ　Ｉ）　’と胎盤絨毛由来のｈＣＧとの複
合体（複合体Ａ）ハ１１．ｏ分後ニ、ｐｏｏｗｓｉ抗ｈ
ｃ　Ｇ　−１９鎖−Ｆａｂ’　トＬＣＡ−Ａ及び絨毛癌
由来のｈＣＧとの複合体（複合体Ｂ）は１０．２分後に
溶出してくることが判った。この結果から明らかな如く
、ｐｏｏ標識抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆａｂ′とＬＣＡ−Ａと
を夫々結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂとして用いること
により、糖鎖構造の異なるｈｃＧを分離できることが判
る。

実施例２．ｈＣＧ及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の
分別測定（溶離液）実施例１と同じ。

（基質液）実施例１と同じ。

（抗体液１）抗ｈＣＧ−α鎖モノクローナル抗体（和光紬薬工業（株
）製）を常法により処理してＦａｂ’とし、これに常法
により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識し
て得たＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Ｆ　ａｂ’を、５０
ｍＭリンＭ緩衝液（Ｐ）＋７．０１１５０ｍＭ塩化ナト
リウム含有）中に７０ｎｇ／ｍｉの蛋白濃度となるよう
に添加して抗体液１とした。

　７（抗体液２）抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル抗体（和光紬薬工業（株
）製）を５０ｍＭ　！、１　ン酸緩衝液（ｐＨ７，５，
１５０ｍ１４ＮａＣ１含有）中に９５０μｇ／＋ｕｌの
蛋白濃度となるように添加して抗体液２とした。

（ホルモン液）市販のｈｃａ　（胎盤絨毛由来、シグマ社製）及びＴＳ
Ｈ（ｔｌｃ［（バイオプロダクトＳ、Ａ、社製）を夫Ｉ
ｔ　カ０．０４．０．０８．０．１２．０．１６又ハ０
．２０ｎＭトナルように、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５，１５０ｍＭ〜ａ［，１含有）に溶解したものを
ホルモン液とし、た。

（ｉｌＰＩ、Ｃの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・カラム及び充填剤：　０．４６φ×６０ｃｍ、ＹＭｃ
バック　Ｄｉｏｌ−２００（山村化学研究所（株）社商
品名）。

・流速：溶離液；　０．５ｍｌ／ｍｊｎ、、基質液；　
０．０５ｍ１／・反応部：　０．０４φＸ　９００ｃｍ
　（５５°Ｃ加温）、。

・検出：励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０４ｎｍで蛍
光を測定した。

（測定操作）抗体液１４０μｍ、ホルモン液２０μｍ及び抗体液２４
０μｌとを混合し３０　’Ｃで３０分間放置した後、混
合液の１５μｍをＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した。

（結果）＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分析の結果、ＰＯＤ標識抗ｈＣ
Ｇ−α鎖Ｆａｂ’は１２，５分後に、ＰＯＤ標識抗ｈＣ
Ｇ−α鎖−Ｆａｂ’とＴ　Ｓ　Ｈとの複合体（複合体Ａ
）は１１．７分後に、ＰＯＤ標諏抗ｈＣＧ−α鎖−Ｆａ
ｂ’と抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル抗体及びｈＣＧと
の複合体（？！［合体Ｂ）は１０．２分後に溶出してく
ることが判った。この結果から明らかな如く、ＰＯＤ標
諏抗ｈＣＧ−α鎖Ｆ　ａｂ’と抗ｈＣＧ−β鎖モノクロ
ーナル抗体を夫々結合能物質Ａ及び結合能物質Ｂとして
用いることにより、ｈ　ＣＧとＴ’　Ｓ　Ｈとを分離で
きることが判る。

また、ＨＰ　ｌ、Ｃによる分析の結果得られた、各試料
のｈＣＧ＠度（ｎＭ）又はＴ’　Ｓ　Ｉ−Ｔ　８度（ｎ
Ｍ）と、複合体のピーク高さ値（μＶ）との関係を表わ
す検量線を第１図に示す。尚、第１図に於いて、−０は
ｈＣＧに係る検量線を、−・−はＴ　、Ｓ　Ｈに係る検
量線を夫々示す。

実施例３．ｈＣＧ、黄体形成ホルモン（Ｌ　Ｈ）及び甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の分別測定（溶離液）実施例１と同じ。

（基質液）実施例１と同じ、。

（抗体液１）実施例２と同じ。

（抗体液２）抗ｈＣＧ−β鎖モノクローナル抗体（和光紬薬工業（株
）製）及び抗Ｌ　Ｈ−β鎖モノクローナル抗体（バイオ
クロン・オーストラリア社）を常法により処理して各々
をＦａｂとし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＩ（７，５，
１５０ｍＭ　ＮａＣ１含有）中に夫々が２μｇ／ｍ１の
蛋白濃度となるように添加して抗体液２とした。

（ホルモン液）市販のｈＣＧ（胎盤絨毛由来、シグマ社″ｇｉ）、ＬＨ
（ＩＪｃＢバイオプロダクトＳ、Ａ、社製）及びＴＳ　
Ｉ−Ｉ　（ＩＩｃＢバイオプロダクトＳ、Ａ、社製）を
夫々が１ｒＭとなるように、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１含有）に溶解したもの
をホルモン液とした。

（ＨＰ　Ｌ　Ｃの使用条件）システムの概略は第２図に同じ。

・カラム及び充填剤：　０．４６φＸ　６０ｃｍ、　Ｙ
　Ｍ　ＣバックＤｉｏｌ−２００（山村化学研究所（株
）社商品名）。

・流速：溶離液；　０．５ｍ］／ｍｉｎ、、基質液；０
，０５ｍ１／ｍｉｎ、。

・反応部：　０．０４φＸ　９００ｃｍ　（５５℃加温
）。

（測定操作）抗体液１４０μ」、ホルモン液３０μｌ及び抗体液２４
０μｍとを混合し３０℃で３０分間放置した後、混合液
の１５μ」をＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した。

（結果）＋１ＰＬｃ　ニヨル分析の結果、ＰＯＤＩＩ　ｍ抗ｈ　
ＣＧ　−ａ鎖Ｆａｂ’は１２．５分後に、ＰＯＤ標識抗
ｈ　ＣＧ　−α鎖−Ｆａｂ’と抗１＋ｃＧ−β鎖−Ｆａ
ｂ及びｈＣＧとの複合体は１０　、０分後に、ＰＯＤ標
識抗ｈ　ＣＧ　−α鎖−Ｆａｂ’と抗Ｔ−ｌ−１−β鎖
−Ｆａｂ及びＬ　Ｈとの複合体は１］、０分後に＋　Ｐ
ＯＤ標識抗ｈ　ＣＧ　−α鎖−Ｆａｂ’とＴ　Ｓ　Ｈと
の複合体は】１．９分後に夫々ピークとして溶出した。

この結果から明らかな如く、本発明の分別測定方法によ
り、ｈＣＧ、ＬＩ−Ｉ及びＴＳ　Ｉ−Ｔが混在する試料
中の各ホルモンを夫々定量することができることが判る
。

比較例１゜（溶離液）実施例１と同じ。

（抗体液１）実施例１と同じ。

（ホルモン液）実施例３と同じ。

（ＨＰＬＣの使用条件）実施例３と同様にして行った。

　９１（測定操作）抗体液１，４０μ］、ホルモン液３０μ〕及び５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１含有
）　　４０μ］とを混合し３０℃で３０分間放置した後
、混合液の１５μｍをＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した。

（結果）＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分析の結果、１２．５分後にＰ
ＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Ｆａｂ″のピークが観察され
た以外は、ブロードなピークが１つ観察されたのみで、
ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−α鎖−Ｆａｂ’とｈＣＧとの複合
体、ＰＯＤ標諏抗ｈ　ＣＧ　−α鎖−Ｆａｂ’とＬ　Ｈ
との複合体及びＩ）ＯＤ標識抗ｈ　ＣＧ　−α鎖−Ｆａ
ｂ’と７ｒ”　Ｓ　Ｉ−Ｉとの複合体のピークは何れも
特定し得なかった。

この結果から明らかな如く、ＰＯＤ標諏抗ｈＣＧ−α鎖
−Ｆａｔ３’　のみを用いた場合には、ｈＣＧ、ＬＨ及
びＴＳＨを分別して検出することができないことが判る
。

［発明の効果コ以上述べた如く、本発明は、生体由来の試料中の測定対
象物質を、その化学的又は／及び物理的な性質に応じて
、迅速に、容易に且つ精度良く分別測定し得る方法を提
供するものである。本発明の方法によれば、測定に要す
る時間は数分から数時間程度であり、必要な測定操作自
体は、測定対象物質を含む試料と結合能物質Ａ及び結合
能物質Ｂとを混合した後、ＨＰ　］、、Ｃにより複合体
Ａ、複合体Ｂ及びＴｉ離の結合能物質Ａとを分離し、複
合体Ａ中の結合能物質Ａの量又は／及び複合体り中の結
合能物質Ａの量を検出するのみであるので、従来の同様
な目的の分別測定方法に比べて、簡便に且つ迅速に目的
の測定を行うことができる点に顕著な効果を有する発明
であり、斯業に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２に於いて得られた検量線を示す。第２図は、実施例１，２．３及び比較例１で使用したＨ
　Ｐ　１．、Ｃのシステムの概略図を示したものである
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）同一の作用を有する２以上の測定対象物質又は類
似した構造を有するが異なる作用を有する２以上の測定
対象物質（以下、単に、測定対象物質と略記する。）を
含む試料を、測定対象物質全てに対して結合能を有し、
且つそれ自身が何らかの方法により検出可能な性質を有
しているか又は何らかの方法により検出可能な物質によ
り標識されている物質（以下、結合能物質Ａと略記する
。）及び測定対象物質の少なくとも１つに対しては結合
能を有するが少なくとも１つとは結合しない物質（以下
、結合能物質Ｂと略記する。）と混合して反応させた後
、測定対象物質と結合能物質Ａとの複合体（以下、複合
体Ａと略記する。）と、測定対象物質と結合能物質Ａ及
び結合能物質Ｂとの複合体（以下、複合体Ｂと略記する
。）と、遊離の結合能物質Ａとを高速液体クロマトグラ
フィにより分離し、複合体Ａ中の結合能物質Ａの量又は
／及び複合体Ｂ中の結合能物質Ａの量を測定することに
より試料中の測定対象物質の何れかの量を測定すること
を特徴とする分別測定方法。
（２）測定対象物質が、酵素、生理活性物質、癌関連抗
原又は糖鎖を有する物質である請求項１に記載の分別測
定方法。
（３）結合能物質Ａに係る、測定対象物質全てに対して
結合能を有する物質が抗体又はレクチンであり、結合能
物質Ｂが測定対象物質の少なくとも１つとは特異的に結
合するが、少なくとも１つに対しては結合しない抗体又
はレクチンである請求項１に記載の分別測定方法。
（４）抗体が、モノクローナル抗体である請求項３に記
載の分別測定方法。
（５）レクチンが、コンカナバリンＡ、レンズマメレク
チン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、ヒイロ
チヤワンタケレクチン、ヒママメレクチン、ピーナッツ
レクチン又は小麦胚芽レクチンである請求項３に記載の
分別測定方法。
（６）複合体Ａ、複合体Ｂ及び遊離の結合能物質Ａの分
離を、ゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用充填剤、イ
オン交換クロマトグラフィ用充填剤、疎水クロマトグラ
フィ用充填剤、等電点クロマトグラフィ用充填剤、逆相
クロマトグラフィ用充填剤又はハイドロキシアパタイト
を充填したカラムを装着した高速液体クロマトグラフィ
により行う請求項１〜５の何れかに記載の分別測定方法
。