JPH06103308B2 - 免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析方法Info
- Publication number
- JPH06103308B2 JPH06103308B2 JP62281578A JP28157887A JPH06103308B2 JP H06103308 B2 JPH06103308 B2 JP H06103308B2 JP 62281578 A JP62281578 A JP 62281578A JP 28157887 A JP28157887 A JP 28157887A JP H06103308 B2 JPH06103308 B2 JP H06103308B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- guinea pig
- igg
- immunoassay method
- antibody
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は血清などの生体試料中の特定物質を坑原−抗体
反応を利用して定量分析するための免疫分析用方法に関
し、特に医療分野における病気の診断に利用される免疫
分析方法に関する。
反応を利用して定量分析するための免疫分析用方法に関
し、特に医療分野における病気の診断に利用される免疫
分析方法に関する。
（従来の技術） 近年、医療分野においては病気の診断を行うに際し、血
清等の生体試料中の物質（例えば、癌マーカー）を迅速
に定量することが極めて重要な課題となっている。従
来、免疫分析法としては、RIA（ラジオイノムアッセ
イ）,EIA（エンザイムイムノアッセイ），ラテックス凝
集法などがあったが、迅速性，簡便性，感度の全てを満
足するものはなかった。
清等の生体試料中の物質（例えば、癌マーカー）を迅速
に定量することが極めて重要な課題となっている。従
来、免疫分析法としては、RIA（ラジオイノムアッセ
イ）,EIA（エンザイムイムノアッセイ），ラテックス凝
集法などがあったが、迅速性，簡便性，感度の全てを満
足するものはなかった。
かかる事情に鑑み、本出願人はリポソームなどのマイク
ロカプセルを用いて迅速かつ、感度よく測定する免疫分
析方法;MCIA（マイクロカプセルイムノアッセイ）を先
に発明した。それは測定対象物質に対する抗体又は抗原
を結合すると同時に検出可能な物質を内部に封入したマ
イクロカプセルを用い、抗原−抗体反応により、活性化
された補体が膜を溶解し、内部から溶出してきた物質を
検出することによって測定対象物質を定量するものであ
る。
ロカプセルを用いて迅速かつ、感度よく測定する免疫分
析方法;MCIA（マイクロカプセルイムノアッセイ）を先
に発明した。それは測定対象物質に対する抗体又は抗原
を結合すると同時に検出可能な物質を内部に封入したマ
イクロカプセルを用い、抗原−抗体反応により、活性化
された補体が膜を溶解し、内部から溶出してきた物質を
検出することによって測定対象物質を定量するものであ
る。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは免疫分析方法に用いられる補体試薬とし
て、補体活性の高いモルモット血清をそのまま使用して
いたが、モルモット血清中には異好抗体（マイクロカプ
セルに結合した抗体又は抗原に対する抗体）が含まれて
いる場合があり、上記抗体が存在すると測定対象物質が
なくとも抗原−抗体反応が起こり、補体が活性化され、
マイクロカプセルを溶解してしまうという問題が生じ
た。
て、補体活性の高いモルモット血清をそのまま使用して
いたが、モルモット血清中には異好抗体（マイクロカプ
セルに結合した抗体又は抗原に対する抗体）が含まれて
いる場合があり、上記抗体が存在すると測定対象物質が
なくとも抗原−抗体反応が起こり、補体が活性化され、
マイクロカプセルを溶解してしまうという問題が生じ
た。
一方、第２の問題点として、モルモット血清中にはヒト
のイムノグロブリンに対する抗体が含まれている場合が
ある。ヒトのイムノグロブリンがマイクロカプセルに結
合した抗体、又は、抗原に対する抗体が存在した場合、
上記抗体の存在により補体が活性化される場合のみでな
く抗体自身が補体を活性化しない抗体（例えばIgG,Ig
A）である場合であってもマイクロカプセル中に上記抗
体に対する抗原が含まれる場合、抗原抗体複合物（Ag-
b）が形成され、補体が活性化されマイクロカプセルを
溶解してしまうという問題が生ずる。
のイムノグロブリンに対する抗体が含まれている場合が
ある。ヒトのイムノグロブリンがマイクロカプセルに結
合した抗体、又は、抗原に対する抗体が存在した場合、
上記抗体の存在により補体が活性化される場合のみでな
く抗体自身が補体を活性化しない抗体（例えばIgG,Ig
A）である場合であってもマイクロカプセル中に上記抗
体に対する抗原が含まれる場合、抗原抗体複合物（Ag-
b）が形成され、補体が活性化されマイクロカプセルを
溶解してしまうという問題が生ずる。
これらの現象が起こると、測定対象物質が全く存在しな
くとも“存在する”という誤った結果を与えることによ
り、重大な診断誤差を招くことになる。
くとも“存在する”という誤った結果を与えることによ
り、重大な診断誤差を招くことになる。
本発明は、診断誤差の生じない免疫分析方法を提供する
ことを目的とするものである。
ことを目的とするものである。
［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 前述の問題点を解決するために本発明は、測定対象物質
に対する抗原、又は、抗体を結合すると同時に内部に検
出可能な物質を封入したマイクロカプセルを用い、抗原
−抗体反応により活性化された補体試薬が膜を溶解し、
内部から溶出してきた物質を検出することによって測定
対象物質を定量するための免疫分析方法において、前記
補体試薬として動物血清からIgGを除去したものを用い
るものである。
に対する抗原、又は、抗体を結合すると同時に内部に検
出可能な物質を封入したマイクロカプセルを用い、抗原
−抗体反応により活性化された補体試薬が膜を溶解し、
内部から溶出してきた物質を検出することによって測定
対象物質を定量するための免疫分析方法において、前記
補体試薬として動物血清からIgGを除去したものを用い
るものである。
（作 用） 前述のようにモルモット血清中からイムノグロブリンの
主成分であるIgG（イムノグロブリンＧ）を除去したも
のをマイクロカプセル中の補体試薬として使うことによ
り抗原−抗体反応による補体の活性化を防ぎ、マイクロ
カプセルが非特異的に溶解するのを大幅に軽減すること
ができる。そして、このことにより測定対象物質の定量
的分析が可能となる。
主成分であるIgG（イムノグロブリンＧ）を除去したも
のをマイクロカプセル中の補体試薬として使うことによ
り抗原−抗体反応による補体の活性化を防ぎ、マイクロ
カプセルが非特異的に溶解するのを大幅に軽減すること
ができる。そして、このことにより測定対象物質の定量
的分析が可能となる。
（実施例） 以下本発明を具体的な例を用いてより詳細に説明する。
本発明はモルモット血清から抗体の主成分であるIgG
（イムノグロブリンＧ）を除去したものをマイクロカプ
セル中の補体試薬として用いることにした。モルモット
血清中からIgGを除去する方法は公知として多く知られ
ているが、本発明ではIgGと特異的に結合するプロティ
ンＡをコーティングした粒子によるアフィニティークロ
マトグラフィーを用いる。ただし、本発明におけるモル
モットIgGを除去する方法は上記方法に限るわけではな
い。上述の他の公知のIgGを除去する例としては、例え
ば抗モルモットIgG抗体を利用したアフィニティーフロ
マトグラフィーや、硫安等による塩折等がある。
（イムノグロブリンＧ）を除去したものをマイクロカプ
セル中の補体試薬として用いることにした。モルモット
血清中からIgGを除去する方法は公知として多く知られ
ているが、本発明ではIgGと特異的に結合するプロティ
ンＡをコーティングした粒子によるアフィニティークロ
マトグラフィーを用いる。ただし、本発明におけるモル
モットIgGを除去する方法は上記方法に限るわけではな
い。上述の他の公知のIgGを除去する例としては、例え
ば抗モルモットIgG抗体を利用したアフィニティーフロ
マトグラフィーや、硫安等による塩折等がある。
しかるに本発明で言っている補体試薬とは元来10種類以
上のタンパク質成分よりなる。従ってモルモット血清中
からIgGを除く手段としては個々の補体成分を除去、又
は、失活させない限りどのような方法でも用いることが
できる。しかしながら、本発明者等の検訂の結果、プロ
ティンＡ法がそのうち最も望ましい方法であった。
上のタンパク質成分よりなる。従ってモルモット血清中
からIgGを除く手段としては個々の補体成分を除去、又
は、失活させない限りどのような方法でも用いることが
できる。しかしながら、本発明者等の検訂の結果、プロ
ティンＡ法がそのうち最も望ましい方法であった。
尚、本発明の動物血清は特に下位概念としてモルモット
の血清を用いたが、これは補体活性が他のものと比較し
て高いことになる。
の血清を用いたが、これは補体活性が他のものと比較し
て高いことになる。
〈実施例１〉 ヒト血清中のAFP（アルファフェトプロティン）の測定
を例にとり、説明する。
を例にとり、説明する。
先ず、抗ヒトAFP抗体結合リポソームを調製した。調製
法は、先ず、フラスコ内に10mMコレステロール（クロロ
フォルムで溶解した）100μ,5mMレシチ（クロロフォ
ルムで溶解した）200μ,100mMシセチルホスフェイト
（クロロフォルムで溶解した）50μ,50mM PDP−PE
（マルチン等の方法で調製したもの）100μとエタノ
ール1mlとを混合し、ロータリーエバポレータにて溶媒
を完全に除去することによってフラスコ内面に脂質膜を
作成した。カルボキシフルオレッセイン水溶液1.0mlを
加え、50℃に加温し、その後30000×ｇで30分間遠心分
離を行い、上澄を捨てた後、沈渣に生理食塩液を加え再
び遠心分離した。この操作をカルボキシフルオレッセイ
ンが遠心上澄になくなるまで行い、最後に生理食塩液50
0μを加え、リポソーム懸濁液とした。該リポソーム
懸濁液に抗ヒト−α−フェトプロテインヤギ抗体Ｆ（a
b）′２（200μｇ）をジチオスレイトール（DTT）によ
って処理したものと反応せしめ、リポソームに抗体を結
合させた。その後30000×g,30分間遠心分離を行い、上
澄を捨て抗体結合リポソーム沈澱を生理食塩液で懸濁
し、再び30000×g,30分間遠心分離を行い、上澄を捨て
た。この操作を更に２回繰り返し、生理食塩液にて抗体
結合リポソーム懸濁液（200％v/v）とした。尚、これら
の操作は全て窒素雰囲気のものとして行った。
法は、先ず、フラスコ内に10mMコレステロール（クロロ
フォルムで溶解した）100μ,5mMレシチ（クロロフォ
ルムで溶解した）200μ,100mMシセチルホスフェイト
（クロロフォルムで溶解した）50μ,50mM PDP−PE
（マルチン等の方法で調製したもの）100μとエタノ
ール1mlとを混合し、ロータリーエバポレータにて溶媒
を完全に除去することによってフラスコ内面に脂質膜を
作成した。カルボキシフルオレッセイン水溶液1.0mlを
加え、50℃に加温し、その後30000×ｇで30分間遠心分
離を行い、上澄を捨てた後、沈渣に生理食塩液を加え再
び遠心分離した。この操作をカルボキシフルオレッセイ
ンが遠心上澄になくなるまで行い、最後に生理食塩液50
0μを加え、リポソーム懸濁液とした。該リポソーム
懸濁液に抗ヒト−α−フェトプロテインヤギ抗体Ｆ（a
b）′２（200μｇ）をジチオスレイトール（DTT）によ
って処理したものと反応せしめ、リポソームに抗体を結
合させた。その後30000×g,30分間遠心分離を行い、上
澄を捨て抗体結合リポソーム沈澱を生理食塩液で懸濁
し、再び30000×g,30分間遠心分離を行い、上澄を捨て
た。この操作を更に２回繰り返し、生理食塩液にて抗体
結合リポソーム懸濁液（200％v/v）とした。尚、これら
の操作は全て窒素雰囲気のものとして行った。
次にモルモット血清からIgGを除去する操作を行った。
実施例１では先の無処理モルモット血清とIgG除去モル
モット血清を補体試薬として含有するリポソームでAFP
を定量分析した。
実施例１では先の無処理モルモット血清とIgG除去モル
モット血清を補体試薬として含有するリポソームでAFP
を定量分析した。
材料，試薬としては以下のものを用いた。
PAC:Protein A-Cellulofine生化学工業,5ml CB:100mM Citrate Buffer,pH4.0 TBS:10mM Tris Buffered Saline（3MNaCl）,pH9.0 GPS:Guinea pig Serum,デンカ生研,TBSで溶解 PBS2＋:10mM Phosphate Buffered Sailne,pH7.4,0.5mM
Mg2+,0.15mM Ca2+ 器具，装置としては以下ものを用いた。
Mg2+,0.15mM Ca2+ 器具，装置としては以下ものを用いた。
カラム（10ml容），恒温槽（10℃），ペリスタポンプ，
フラクションコレクター，分光光度計 次に方法を述べる。
フラクションコレクター，分光光度計 次に方法を述べる。
Flow Rate（流動速度）:0.25ml/minで恒温槽（10℃）中
で、カラムの中の5mlのPACを25ml TBSで洗浄し、次に、
1.5mlのGPを添加し、その次に、25ml TBSで溶出した。
該溶出液を2mlずつ分画し、A280測定を行った。……Ａ Ａのピークを集め、IgG除去モルモット血清とした。こ
れらを用いて実際にAFPの測定を行った。
で、カラムの中の5mlのPACを25ml TBSで洗浄し、次に、
1.5mlのGPを添加し、その次に、25ml TBSで溶出した。
該溶出液を2mlずつ分画し、A280測定を行った。……Ａ Ａのピークを集め、IgG除去モルモット血清とした。こ
れらを用いて実際にAFPの測定を行った。
抗AFP抗体結合リポソーム懸濁液10mlにAFP0,1,10,100,1
000ng/mlを含有するヒト血清を加え、10分間,37℃中で
反応させた。これに抗AFP抗体（ウサギ）と補体（モル
モット血清）25μｌずつを加え、37℃,30分間保った。
その後、蛍光強度（励起波長:490nm,測定波長:530nm）
を測定し、リポソームの溶解率（％）を求めた。
000ng/mlを含有するヒト血清を加え、10分間,37℃中で
反応させた。これに抗AFP抗体（ウサギ）と補体（モル
モット血清）25μｌずつを加え、37℃,30分間保った。
その後、蛍光強度（励起波長:490nm,測定波長:530nm）
を測定し、リポソームの溶解率（％）を求めた。
第１図に補体試薬として無処理モルモット血清（ａ）
と、IgG除去モルモット血清（ｂ）をそれぞれ用いた時
のAFP検量線を示した。（ａ）ではAFPが存在しなくとも
20％位、リポソームが溶解しているが、（ｂ）では５％
位に下がり、AFPの測定が可能となった。
と、IgG除去モルモット血清（ｂ）をそれぞれ用いた時
のAFP検量線を示した。（ａ）ではAFPが存在しなくとも
20％位、リポソームが溶解しているが、（ｂ）では５％
位に下がり、AFPの測定が可能となった。
〈実施例２〉 実施例２では11種の検体で上述のモルモット血清（ａ）
とIgG除去モルモット血清（ｂ）を用いたときのリポソ
ームの非特異溶解を示した。第２図に示す通りリポソー
ムは第１図のときと比較し、結合抗体の種類を変えてい
るので、全体的に無処理のモルモット血清（ａ）の補体
のみによる非特異的溶解が抑えられているか、それでも
モルモット血清（ａ）をそのまま使用すると検体によっ
ては５乃至20％のバラツキがあるに対し、IgG除去モル
モット血清（ｂ）を用いると非特異的溶解が抑えられバ
ラツキがなくなっている。
とIgG除去モルモット血清（ｂ）を用いたときのリポソ
ームの非特異溶解を示した。第２図に示す通りリポソー
ムは第１図のときと比較し、結合抗体の種類を変えてい
るので、全体的に無処理のモルモット血清（ａ）の補体
のみによる非特異的溶解が抑えられているか、それでも
モルモット血清（ａ）をそのまま使用すると検体によっ
ては５乃至20％のバラツキがあるに対し、IgG除去モル
モット血清（ｂ）を用いると非特異的溶解が抑えられバ
ラツキがなくなっている。
［発明の効果］ 以上のように従来モルモット血清をそのままリポソーム
のようなマイクロカプセルに含有させた補体試薬に比
べ、IgGを除去したIgG除去動物血清をマイクロカプセル
に含有させた補体試薬の方が非特異的なカプセルの溶解
を遥かに軽減することができ、しかも反応時間が長くな
ることなしに容易に測定対象物質の定量的な分析が可能
となり、診断誤差の生じない免疫分析方法を提供するこ
とができる。
のようなマイクロカプセルに含有させた補体試薬に比
べ、IgGを除去したIgG除去動物血清をマイクロカプセル
に含有させた補体試薬の方が非特異的なカプセルの溶解
を遥かに軽減することができ、しかも反応時間が長くな
ることなしに容易に測定対象物質の定量的な分析が可能
となり、診断誤差の生じない免疫分析方法を提供するこ
とができる。
第１図はAFP検量線を表したものであり、第２図は11種
の検体に対するリポソームの溶解率を表したものであ
る。
の検体に対するリポソームの溶解率を表したものであ
る。
Claims (7)
- 【請求項１】測定対象物質に対する抗原又は抗体を結合
すると同時に内部に検出可能な物質を封入したマイクロ
カプセルを用い、抗原−抗体反応により活性化された補
体試薬が膜を溶解し、内部から溶出してきた物質を検出
することによって測定対象物質を定量するための免疫分
析方法において、前記補体試薬として動物血清からIgG
を除去したものを用いることを特徴とする免疫分析方
法。 - 【請求項２】上記補体試薬としてモルモット血清からIg
Gを除去したものを用いることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項３】上記動物血清からIgGを除去するのに、プ
ロテインＡを用いることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項４】上記プロテインＡを粒子にコーティングし
たものをカラムに詰めたアフィニティーフロマトグラフ
ィーを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項
又は第３項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項５】上記モルモット血清からIgGを除去するの
に抗モルモットIgG抗体を粒子のまわりにコーティング
したものをカラムに詰めたアフィニティーフロマトグラ
フィーを使用することを特徴とする特許請求の範囲第１
項又は第２項に記載の免疫分析方法。 - 【請求項６】上記モルモット血清からIgGを除去するの
に塩折法を利用することを特徴とする特許請求の範囲対
１項又は第２項記載の免疫分析方法。 - 【請求項７】上記マイクロカプセルとしてリポソームを
使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
の免疫分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62281578A JPH06103308B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 免疫分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62281578A JPH06103308B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01123151A JPH01123151A (ja) | 1989-05-16 |
| JPH06103308B2 true JPH06103308B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=17641120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62281578A Expired - Lifetime JPH06103308B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 免疫分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06103308B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100435990B1 (ko) * | 2002-06-14 | 2004-06-12 | 현대자동차주식회사 | 자동차용 에어벤트 노브 고정장치 |
| AU2002951240A0 (en) | 2002-08-23 | 2002-09-19 | Royal Women's Hospital | Depletion of plasma proteins |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61250559A (ja) * | 1985-04-30 | 1986-11-07 | Toshiba Corp | 免疫分析方法 |
-
1987
- 1987-11-06 JP JP62281578A patent/JPH06103308B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01123151A (ja) | 1989-05-16 |
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