KR101981967B1

KR101981967B1 - 리보솜 단백질 s3에 대한 항체를 포함하는 암진단용 조성물, 이것을 포함하는 암진단용 키트 및 이것을 이용한 암진단에 대한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101981967B1
Application number: KR1020170069289A
Authority: KR
Inventors: 김준; 김학동; 김용중; 박용준
Original assignee: 김준
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2019-05-24
Also published as: KR20180099421A

Abstract

본 발명은 암진단용 조성물, 이를 포함하는 암진단용 키트 및 이를 이용한 암진단에 대한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 상세하게는, 상기 암진단용 조성물은 리보솜 단백질 S3에 대해 특이적으로 반응하는 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 단일클론 항체 및 다클론 항체를 포함할 수 있다.
상기 단일클론 항체, 다클론 항체, 또는 단일클론 항체 및 다클론 항체는, 암 세포에서 분비되는 rpS3을 특이적으로 인식하여 인간의 각종 암의 발생 및 전이 여부를 조기 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리보솜 단백질 S3에 대한 항체를 포함하는 암진단용 조성물, 이것을 포함하는 암진단용 키트 및 이것을 이용한 암진단에 대한 정보 제공 방법{Composition for Diagnosing Cancer Including Ribosomal Protein S3 Antibody, Kit for Diagnosing Cancer Using The Same and Method for Providing Information of Diagnosing Cancer Using The Same}

본 발명은 리보솜 단백질 S3에 대한 항체를 포함하는 암진단용 조성물, 이것을 포함하는 암진단용 키트 및 이것을 이용한 암진단에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 단일클론 항체와 다클론 항체의 제조를 위하여 243개의 아미노산으로 구성된 rpS3를 대장균에서 분리 정제한 재조합 단백질을 항원으로 사용하였다.

리보솜 단백질 S3((ribosomal protein small subunit 3: rpS3) 는 리보솜을 구성하는 단백질로, 손상된 DNA를 복구하는 효소로도 알려져 있다 (Kim et al., 1995 J. Biol. Chem. 270(23) 13620-9). rpS3는 암세포의 전이(metastasis), 세포사멸(apoptosis), 면역반응에 있어서의 전사 등에서 다양한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

최근에는 인산화 (phosphorylation), 메틸화 (methylation), 모노유비퀴틴화 (monoubiquitination) 및 당화 (glycosylation) 등과 같은 변형들 (modifications)을 통해, rpS3의 다양한 역할들이 조절될 수 있다고 알려져 있다.

rpS3 은 면역반응의 주된 유전자 조절자(gene regulator)로 알려진 NF-B 복합체의 한 가지 부차단위(subunit)로 알려졌으며(Wan et al., 2007 Cell 131(5), 927-39), IKK에 의해서 Ser209 잔기가 인산화되면 핵으로 이동하여 특정 유전자의 전사를 유도한다고 보고되었다. Ser209 잔기에 대한 인산화는 대장균(Escherichia coli) O157:H7의 감염시 NleH1에 의해 저해되어 NF-B에 의한 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려졌다(Xiaofei et al., 2009 PLoS Pathog. 5(12) e100070).

rpS3 의 Thr221 잔기의 인산화는 두 가지 키나아제들(kinases)에 의해서 유도될 수 있다. 하나는 과산화수소(hydrogen peroxide)와 같은 산화적 DNA 손상(oxidative DNA damage)에 의해 활성화된 PKC에 의해 유도되는데 이 때 Thr221 잔기의 인산화는 rpS3 단백질의 핵으로 이동을 증가시켜 DNA 복구에 기여하게 된다(Kim et al., 2009 BBA-Mol. Cell Res. 1793(2), 395405). 또한 IR(ionizing radiation)에 의해 활성화된 CK2에 의해, rpS3 의 Thr221 잔기의 인산화가 유도된 경우에는 TRAF2와의 결합이 증가하여 비소세포폐암(NSCLC)의 방사성 저항성(radioresistance)을 조절하는 것으로 보고되었다(Yang et al., 2013 J. Biol. Chem. 288, 2965-2975).

Akt는 rpS3 의 Thr70 잔기의 인산화를 유도하는데 이는 신경 세포주에서 rpS3 의 DNA 복구효소로서의 기능을 증가시켜 세포사멸(apoptosis)을 촉구하는 것으로 알려졌다(Lee et al., 2010 J. Biol. Chem. 285(38), 29457-68).

rpS3 의 메틸화는 PRMT1(protein arginine methyltransferase 1) 효소에 의해 Arg64, 65 및 67 잔기들에 이루어지는데 이는 rpS3 의 인(nucleolus)으로 이동에 관여하며 메틸화가 되지 않을 경우에는 리보솜 내로의 조립(assembly)이 이루어지지 않게 된다(Shin et al., 2009 Biochem Biophys Res Commun. 429(1-2), 57-62).

rpS3 의 모노유비퀴틴화는 Lys214 잔기에 주로 이루어지며 이러한 변형은 리보솜에서의 단백질 생합성에 중요한 영향을 끼치게 된다. rpS3 단백질의 모노유비퀴틴화는 단백질 번역 과정 중 신장 단계(elongation step)의 방해로 유도되며 이는 잘못된 단백질의 생합성을 유도하는 신호로 작용하여 세포에 손상을 일으키게 된다. 이러한 세포내 잘못된 단백질의 축적은 세포노화에 관련된 여러 가지 질병의 원인이 될 수 있다(Higgins et al., 2015 Mol. Cell. 59(1), 35-49).

rpS3 의 정확한 메커니즘이 밝혀져 있지 않으나, 암세포에서 Asn165 잔기에 N-연결당화(N-linked glycosylation) 되며, 이는 세포의 전형적인 소포체-골지체(ER-Golgi) 분비 기작(secretion pathway)을 거쳐 세포 밖으로 분비된다.

본 발명자들은 정상세포에서는 rpS3의 분비가 잘 일어나지 않는 반면에, 전이가 잘 일어나는 악성 종양세포에서는 많은 양의 rpS3가 분비되는 현상을 최근 연구를 통해 발견하였다.

본 발명은 암의 발생 가능성 또는 암의 전이 가능성을 진단할 수 있는 암진단용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 암의 발생 가능성 또는 암의 전이 가능성을 진단할 수 있는 암진단용 키트를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 암의 발생 가능성 또는 암의 전이 가능성을 예측할 수 있는 암진단에 대한 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 rpS3 의 전체 아미노산의 서열을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체와 다클론 항체를 제조하고, 상기 항체가 세포배양액 및 인체 내 혈액 속으로 분비된 rpS3 을 특이적으로 인식하여, 암세포의 전이 및 악성 상태를 두 종류의 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 기법을 통해 매우 정확하게 암 발생 및 전이를 조기 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 암 발생 및 전이시 발생되는 rpS3 의 당화과정(glycosylation)을 통하여 인체 내 혈액으로 분비된 rpS3를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 및 다클론 항체를 포함하는 암진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

암진단용 조성물은 rpS3에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 상기 항체는, 6×His 태그로 표지된, 전체 길이의 6×His-rpS3 융합 단백질로부터 제조될 수 있다.

rpS3은 고유의 비정형적인(intrinsically unstructured) 3차 구조와 함께 강한 염기성을 띠고 있어서 세균에서 유전자 재조합 발현 시 침전되는 현상이 매우 심하다. rpS3는 GST 등과 같은 비교적 규모가 큰 표지 단백질과 융합하는 것이 일반적이나, GST 등과 같은 표지 단백질은 그 자체만으로도 크기가 크기 때문에, 본 발명에서 필요로 하는 항체 제작용 항원으로는 부적합한 특성을 가진다.

효소 처리를 통해 GST 표지 만을 분해하는 방법을 고려할 수 있으나, 항원 정제 과정이 복잡해지고 항원 면역에 필요한 수준의 높은 농도를 얻기가 힘든 단점이 있다.

본 발명자들은, 6개의 아미노산으로만 구성된 6×His 표지가, GST 등에 비해 상대적으로 작은 크기를 가지므로 보다 경제적이며, 변성조건(denaturing condition) 하에서 응집된 rpS3를 염산 구아니딘으로 용해시켜 고농도의 항원 단백질을 대량으로 정제하는 것이 보다 효율적이라는 것을 발견하였다.

전체 길이의 6×His-rpS3 융합 단백질을 항원으로 사용하는 것은, rpS3와 특이적으로 결합하는 항체의 제조 효율성을 높일 수 있다.

상기 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.

상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 다클론 항체는 상기 rpS3 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 쥐, 랫트(rat), 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기의 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

암진단용 키트는 상기 암진단용 조성물을 포함한다. 상기 암진단용 키트는, rpS3 분비 수준 또는 분비량 측정의 정확도를 높이기 위해 2차 항체를 추가로 포함할 수 있다.

단백질 양을 측정하기 위한 분석방법으로는 면역블롯(웨스턴블롯), ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

샌드위치 효소면역법(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay: sandwich ELISA)이 rpS3 분비 수준 또는 분비량의 측정에 이용될 수 있다. 상기 샌드위치 효소면역법은 암세포의 전이 및 악성 상태를 두 종류의 항체를 사용하여 암 발생 및 암 전이를 매우 정확하게 조기 진단할 수 있다.

상기 암진단용 조성물에 대해서는, 앞서 상세하게 설명하였으므로, 이하 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

암진단에 대한 정보 제공 방법은, 혈액 또는 세포 배양액 내에서, 암 세포에서 분비된 rpS3 분비 수준 또는 분비량을 rpS3에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정하는 것과, 측정 결과를 정상 세포에서 분비된 rpS3 분비 수준 또는 분비량과 대비하는 것을 포함한다.

예를 들어, 암진단에 대한 정보 제공 방법은,

(a) 정상인의 생물학적 시료와 검출하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 rpS3의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 검출하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 분비된 rpS3의 발현 수준을, 정상인의 생물학적 시료로부터 rpS3 발현 수준과 비교하여 증가할 경우, 암 발병 또는 전이의 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함할 수 있다.

시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 혈액, 혈청, 혈장인 것이 바람직하다.

진단 대상이 되는 암의 종류에는, 섬유육종, 형질세포종, 기관지암, 백혈병, 유방암, 난소암, 자궁암, 피부암, 방광암, 전립선암, 신장암, 갑상선암, 식도암, 위암, 간암, 대장암, 췌장암, 폐암, 뇌종양, 골육종, 악성혈관종 및 악성 임파종 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명들은 암세포에서 분비된 rpS3의 수준을 정확하고 용이하게 측정할 수 있다.

본 발명들은 암의 발생 가능성 또는 암의 전이 가능성을 조기에 진단할 수 있는 장점이 있다.

본 발명들은 단일클론 및 다클론 rpS3 항체를 이용하여 암세포에서 분비된 rpS3 단백질의 수준을 정확하고 용이하게 측정하여 각종 암의 발생 및 전이를 조기 진단할 수 있다.

도 1 은, 면역 항원으로 사용하기 위한, 인간 rpS3 전체 단백질 코딩 유전자 발현 플라스미드 유전자 지도이다.
도 2 는, 친화도 순수분리 정제를 위해, 생산된 단일클론 항체 및 다클론 항체를 Affi-Gel 10 레진에 고정시킬 GST-rpS3 을 발현시키기 위한, 인간 rpS3 전체 단백질 코딩 유전자 발현 플라스미드 유전자 지도이다.
도 3 은 단일클론 항체 및 다클론 항체를 이용한 인간 rpS3의 웨스턴 블롯팅을 나타낸다.
도 4a 는, 대조군에 비해, 악성 암에서 rpS3이 더 많이 분비됨을 보여주는 이미지이다. 대조군으로 사용된, 피브릴라린(fibrillarin)과 다른 리보솜 단백질에서는, 이러한 현상이 보이지 않았다.
도 4b 는, 정상세포에 비해, 혈액암 및 태아 섬유 아세포에서 rpS3가 더 많이 분비됨을 보여주는 이미지이다.
도 5a 는 정상인의 혈청과 위암, 간암 및 대장암 환자의 혈청에서 rpS3 단백질의 분비를 비교한 결과, 정상인의 혈청에 비해, 암 환자의 혈청에서 rpS3의 분비율이 높게 나타남을 보여준다. 세포 용해물(Lysate)는 세포를 파쇄하여 대상 단백질의 유무를 확인하는 레인(lane)이다.
도 5b 는 자체 제작한 다클론 항체를 이용한 면역 침강(immune-precipitation, IP)을 위암 환자의 혈청을 이용하여 실시한 이후, 웨스턴 블롯팅이 수행된 결과이다. 즉 채집된 암환자의 혈청을 이용하여 본 연구진이 제작한 다클론 항체를 이용해 면역 침강 후 웨스턴 블럿을 실시하였다. 그 결과 대조구로 사용된 세포 용해물(lysate)상에 확인된 rpS3 밴드는 면역침강 대조구로 사용된 글로블린G(R IgG로 표기)에 보이지 않으나 다클론 항체를 첨가한 실험구(rpS3로 표기)에서 각각 확인이 되었다. 이는 본 연구진이 생산한 다클론 항체는 혈청에 포함된 rpS3를 정확하게 검출할 수 있으며 이는 본 연구진이 전체 길이의 rpS3 면역원을 이용하여 제작한 항체가 면역침강까지 할 수 있는 우수한 항체임이 확인이 된 것이며, 이는 이 기법을 통하여 샌드위치 ELISA assay를 성공적으로 할 수 있음이 확인된 것이다.
도 6a 는 1차 단일클론 항체 1 마이크로그램(㎍)과, 2차 다클론 항체 7 마이크로그램(㎍)을 사용하여 수행한 샌드위치 ELISA 결과이다. 1000 pg/ml의 rpS3 항원 만이 특이적으로 검출되었다.
도 6b 는 1차 단일클론 항체 2.5 마이크로그램(㎍)과, 2차 다클론 항체 7 마이크로그램(㎍)을 사용하여 수행한 샌드위치 ELISA 결과이다. 1000 pg/ml의 rpS3 항원 만이 특이적으로 검출되었다.
도 6c 는 MCF7 종양세포에 비해, MDA-MB231 악성 종양세포에서 rpS3이 2.5배 이상 더 많이 분비됨을 확인한 샌드위치 ELISA 결과이다.
도 6d 는 정상세포에 비해, 위암 환자, 간암 환자, 대장암 환자의 종양세포에서 rpS3이 더 많이 분비됨을 확인한 샌드위치 ELISA 결과이다.

이하, 실시예들 및 도면을 통해 본 발명들에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 하기의 실시예들은 본 발명들을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되지 않음은 물론이다.

<실시예 1_항원의 준비>

본 발명에서는 rpS3의 효과적인 면역침강을 유도할 수 있는 항체를 제조하기 위하여, 전체 길이의 인간 rpS3 유전자(ribosomal protein small subunit 3, Genbank accession number NM_001005.4)를 pET-21a 벡터에 삽입한 다음 발현시켜 면역원으로 사용한다.

pET-21a(Merck Millipore-Novagen Cat. #69740)의 다중 클로닝 부위(MCS) 중 EcoRI - XhoI 제한효소 부위를 사용하여, 인간 rpS3의 전체 단백질 코딩 유전자(732bp)를 삽입하여 6개의 히스티딘 아미노산(6×His)이 표지된 전체 길이(full-length)의 rpS3을 발현시킬 수 있는 플라스미드를 구축하였다(도 1 참조).

플라스미드를 E. coli 계통의 단백질 표현용 세균주 BL-21(Amersham Pharmacia Biotech, Cat. #27-1542-01)에 형질전환(transformation)하여 유전자 재조합 세균을 제조하였다.

유전자 재조합 세균을 LB(Lysogeny broth) 액체 배지 내에서 37℃로 3시간 동안 배양한 다음, 0.5mM IPTG(Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)가 첨가된 배지에서 강하게 유도(induction)한 후 30℃에서 4시간 배양하였다.

이렇게 배양한 세균을 초음파분산기(sonicator)를 사용하여 세포벽과 세포막을 분해하였다. 재조합 rpS3이 그 특성상 80% 이상이 봉입체(inclusion body)로 들어가서 침전되는 현상을 방지하기 위하여 그 상등액을 6M 농도의 염산 구아니딘(Guanidine chloride)을 포함하는 변성조건(denaturing condition)의 완충용액 하에서, 6×His 표지와 강하게 결합하는 성질을 가진 니켈-니트릴로트리아세트산 한천 레진(Nickel-NTA agarose resin)에 흘려 넣어 6×His 표지된 rpS3이 니켈 이온을 통해 한천 레진에 결합하도록 하였다.

rpS3이 결합된 레진을 레진 부피의 20배 양의 세척액으로 세척하여 불특정한 단백질을 제거한 후, 이미다졸(Imidazol)이 첨가된 용출 용액(Elution buffer)을 주입하여 융합된 단백질을 레진에서 회수하였다. 이를 다시 셀룰로오스 반투막을 통한 투석(dialysis) 정제를 거쳐 이미다졸과 구아니딘을 제거한 후, 최종적으로 얻어진 6×His-rpS3 융합단백질의 농도는 6.01mg/mL에 달했다.

< 실시예 2_면역 >

단일클론 항체 제조를 위하여 실시예 1에서 획득한 6×His-rpS3 융합 단백질을 유성보조제와 혼합한 후, 이를 BALB/c 생쥐에 정맥주사 하였고, 2주 후 다시 2차 면역을 실시하였다.

다클론 항체 제작을 위해서 실시예 1에서 획득한 6×His-rpS3 융합 단백질을 약 20 주령의 토끼에 정맥 주사하였고, 1차 접종 2주 후 2차 접종을, 그 후 3주 후 다시 3차 접종을 실시하여 면역 증강하였다.

< 실시예 3 >

단일클론 항체 융합세포(hybridoma) 제조 및 선별

2차 면역이 완료된 생쥐를 동물복지법에 따라, 인도적인 방법으로 도살하여 비장을 채취한 후, B 림프구를 분리해 낸 뒤, 전기펄스 융합기를 사용하여 이를 골수종(myeloma) 세포주인 SP2/0 세포와 세포융합시켰다.

융합된 세포를 비융합 세포와 분리시키기 위해서 히포산틴(Hypoxanthin), 아미놉테린(Aminopterin) 및 타이미딘(Thymidine)이 첨가된 HAT 배지에서 3주 이상 배양하고 비융합 세포를 제거하고 융합된 세포만을 얻었다.

이 융합세포들을 다시 세포 한계희석법(limiting dilution)을 통해서 순수한 단일클론의 집단으로 분리하고, 각 집단에서 rpS3에 특징적으로 결합하는 항체를 분비하는지 여부를 효소면역측정법(ELISA)으로 분석하여 rpS3 단일클론 항체를 생산하는 융합세포를 수득하였다.

이 세포는 rpS3에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 영구적으로 분비하는 세포이며, 상기 세포를 배양한 상등액을 채집하는 것으로 단일클론 항체를 수득할 수 있게 된다.

항체의 정제

실시예 2에서 3차 면역이 완료된 토끼에서 인도적인 방법으로 채혈한 혈장에서 다클론 항체를 정제하기 위해 하기와 같이 실시하였다.

pGEX-5X-1(Amersham Pharmacia Biotech Cat. #27-4584-01) 벡터의 MCS 중 EcoRI 및 SalI을 이용하여, rpS3의 코딩 유전자를 융합하고, GST 단백질과 융합된 GST-rpS3 융합 재조합 단백질 발현용 플라스미드를 제조하였다(도 2 참조).

상기 플라스미드를 BL-21 세균주에 형질전환시키고, 실시예 1과 동일한 방법으로 GST-rpS3 재조합 단백질을 발현시킨 후, 이를 GST-sepharose 4B 레진(GE Healthcare Life Sciences, Cat. 17075601)에 세포 용해액을 흘려 넣어 GST-rpS3을 회수하여 정제하였다.

상기 방법으로 정제한 GST-rpS3을 Affi-Gel 10 레진(Bio-Rad, Cat. #1536099)와 반응시켜 GST-rpS3가 고정된 레진을 제작한 후, 여기에 면역화시킨 토끼에서 채혈한 혈장을 통과시킨 후 항체 용리액(elution buffer: 100mM Glycine-HCl pH2.4, 150mM NaClm 4℃)를 2분간 반응시켜 rpS3에 특이적으로 결합하는 항체만을 분리하였다.

< 실험예 1 >

단일클론 항체 및 다클론 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western blotting) 시험

상기 실시예에서 얻은 단일클론 항체를 분비하는 융합세포가 실제로 인간 세포에 존재하는 rpS3을 검출할 수 있는지 여부를 웨스턴 블로팅을 통해서 확인하였다.

인간에서 유래된 대표적인 자궁암 세포주인 HeLa 세포를 단백질분해효소 억제제(Protease inhibitors)가 포함된 Tris-NaCl-NP40 완충용액(TNN buffer)에 넣고 냉동용해법(Freeze-thawing)을 통하여 세포를 용해시켰다.

여기서 얻은 세포용해물(cell lysate)을 정량한 후, 각각 20㎍씩의 세포총단백이 되도록 하여 10% SDS Acrylamide 겔에서 전기영동을 실시한 후, 이를 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 막에 활착된 세포총단백을 탈지분유(skim milk)로 만들어진 블로킹 용액(blocking solution)으로 1시간 동안 블로킹(blocking) 반응을 시킨 후, 여기에 단일클론 항체 융합세포에서 분비된 항체를 포함하는 배양액(도 3-1 lane) 및 토끼를 사용한 다클론 항체(도 3-3 lane)를 0.2㎍/mL의 농도로 희석한 용액을 상온에서 1시간 반응시켰다.

이들 샘플을 호스래디쉬 퍼옥시데이즈(horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 염소 유래 항-마우스 및 항-토끼 IgG 혈청(Horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit and anti-mouse IgG serum)을 상온에서 1시간 처리 후, Chemiluminescence substrate(Roche Diagnostics cat. #1 501 399)를 처리하여 X-ray 필름에 감광시켰다(도 3 참조).

실험 결과, 본 발명에서 제작된 단일클론 항체(Lane 1) 및 다클론 항체(Lane 3)는 HeLa 세포에서 얻은 총단백 중 rpS3 만을 특이적으로 검출해 낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2 >

항체를 이용한 암세포주의 배지에서 rpS3의 분비율 조사

실시예 3에서 생산된 다클론 rpS3 항체를 이용하여, 상대적으로 악성 유방암 세포주인 MDA-MB-231과 이에 대한 대조군으로 MCF7 세포주를 이용하여 배양 배지로 분비되는 rpS3을 확인하였다.

세포주들을 배양한 후 16시간 동안 혈청이 들어있지 않은 배지에 다시 배양하였고, 배지를 수집하여 배지 내 죽은 세포를 걸러내기 위하여 1,000rpm에서 3분간 원심분리를 수행하였다.

용기 바닥에 형성된 알갱이(pellet)를 제거한 후 다시 배지를 amicon tube에 수집하여 원심분리기를 이용하여 1/200로 응축시켰다. 응축된 배지를 12% SDS-PAGE에 전개시킨 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane, PVDF membrane)에 이동시킨 다음 상기 멤브레인을 블로킹 용액(blocking solution)으로 1시간 반응시킨 후 리보솜 단백질 S3, RACK1, L11, L13 및 세포 내 핵 속에 존재하는 단백질인 피브릴라린(fibrillarin) 항체를 넣어 웨스턴 블럿을 수행하였다.

두 세포주 간의 웨스턴 블럿에 사용된 단백질 양이 동일함을 확인하기 위하여 CBB(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 수행하였다.

CBB 염색에서 사용된 단백질 양을 동일하게 맞춘 조건에서 분비율 측정 웨스턴 방법을 실시하였다. 상기 실시예 3에서 제조된 다클론 rpS3 항체를 이용하여, MCF7 유방암 세포주 보다 상대적으로 더 악성 종양 세포인 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 rpS3이 세포 외부로 더 많이 분비된다는 것을 확인하였다(도 4a 참조).

또한 피브릴라린(fibrillarin) 단백질은 세포내의 단백질로서 본 측정 방법에 의해 검출이 되지 않았음으로 이는 실험과정 중 죽은 세포들에 의해 터져서 나온 단백질이 없었음을 의미한다. 따라서 측정된 rpS3은 모두 분비 과정을 통해 세포 외부로 나온 단백질임이 증명되었다.

정상 세포주 인간 피부 섬유 아세포((human dermal fibroblast: HDF)에 비하여 상대적으로 악성 종양 세포인 RBL-2H3(Rattus basophilic leukemia: 쥐 호염기성)에서 분비율이 현저하게 증가됨이 확인되었다(도 4b 참조).

< 실험예 3 >

다클론 항체를 이용한 위암 환자와 정상인의 혈액에서 rpS3 분비율 조사 및 면역침강(immune-precipitation, IP) 기법 실시

실험예 2에서 검증된 사실을 기초로, 위암 환자, 간암 환자 및 대장암 (결장암, sigmoid-colon cancer) 환자의 혈액과 정상인 3명의 혈액을 통하여 in vivo 실험을 수행하였다.

헌혈된 혈액에서 3,000rpm/10min/4? 원심분리를 통하여 혈청만을 걸러내 프로테아제 억제인자(protease inhibitor) 칵테일이 포함된 Phosphate Buffered Saline(PBS) 용액에 각각 수집된 혈청을 1:20의 비율로 희석 혼합해 SDS-PAGE 전개하였고, 이를 리보솜 단백질 S3를 웨스턴 블럿으로 확인하였다(도 5a 참조). S3 단백질 확인을 위해 실시예 3에서 제조한 다클론 S3 항체를 사용하였다. 세포 용해물(Lysate)는 세포를 파쇄하여 대상 단백질의 유무를 확인하는 레인(lane)이다.

위암 환자로부터 채혈된 혈액으로부터 분리된 혈청에서 다클론 S3 항체를 이용하여 면역 침강 기법을 수행하였다.

이는 채집된 혈청 100㎕ 에 각각 Phosphate-buffered saline 용액(도 5b의 PBS), 0.1% tween20이 포함된 PBS(도 5b의 PBST), 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 PBST(도 5b의 PBST+5%B) 900㎕를 혼합하여 다클론 항체 2㎍과 2시간 반응을 시킨 후 항체와 반응한 단백질을 추출해 내기 위해 아가로즈 비드(argaros bead)와 함께 2시간 동안 반응시켰다.

이를 10% SDS-PAGE에 전개시킨 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane, PVDF membrane)에 이동시킨 다음, 다클론 항체를 이용해 웨스턴 블럿을 실시하였다.

그 결과 대조군으로 사용된 세포 용해물(lysate) 상에 확인된 rpS3 밴드는 면역침강 대조군으로 사용된 글로블린G(R IgG로 표기)에 보이지 않으나 다클론 항체를 첨가한 실험군(rpS3로 표기)에서 각각 확인이 되었다.

결국, 웨스턴 블럿과 면역침강 기법을 통하여, 다클론 항체는 혈청에 포함된 rpS3를 정확하게 검출할 수 있으며 sandwich ELISA assay에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 실험을 통하여 명확하게 확인하였다.

< 실험예 4 >

단일클론 및 다클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)의 실시 (암세포주의 배양배지 이용)

실시예 1에서 개시한 방법으로 합성된 재조합 rpS3와 대조군 rpS5 (ribosomal protein small subunit 5) 리보솜 단백질을 사용하여, 실시예 3에서 제조한 단일클론 항체와 다클론 항체를 이용하여 ELISA 기법을 확립하였다.

도 6a 및 6b 에서 보는 바와 같이 사전 실험을 수행하였다.

먼저, 단일클론 rpS3 항체로 96개의 홈이 파인 배양접시(96 well plate)에 피복(coating)시키고 인산완충식염수(PBS) 용액으로 5번 씻어낸 후 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin: BSA)이 혼합된 PBS로 16시간 동안 배양시켰다.

각각의 재조합 단백질은 각 홈에 주입하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 5번 씻어냈다. 이 후 실시예 3에서 제조한 다클론 항체를 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰으며, 마지막에 PBS 용액으로 5번 씻어냈다.

반응을 끝낸 시료는 2차 항체로서 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit IgG로 다시 반응시킨 후, 5번 씻어 내고, 2차 항체의 기질로서 TMB 용액을 첨가하고 30분 후 STOP 용액을 첨가하여 microplate reader에서 450nm 파장의 흡광도를 측정하였다(도 6a 및 6b 참조).

그 결과, 실시예 3에서 제조한 단일클론 항체는 1㎍의 양에서 충분히 표적 단백질을 검출해 낼 수 있음을 확인하였으며, 이를 바탕으로 배양배지 상의 rpS3(세포 외부로 분비된 rpS3)을 측정하기 동일한 방법으로 MCF7 세포주와 MDA-MB-231 세포주를 배양한 배지를 각 홈에 50㎕씩 주입하여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 450nm 파장의 흡광도를 측정한 후 이 값을 대조군에 대한 증감비율로서 도식화하였다(도 6c 참조).

그 결과, 인간 유방암 세포인 MCF7 세포주에서 1.66배의 증가를 보였으며, 악성 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포주에서는 약 4배 이상의 현저한 증가율을 보였다. 또한 이 결과는 상대적으로 더 전이가 잘 일어나는 악성 종양 세포로서 알려진 MDA-MB-231 세포주의 배지에서 세포 외부로 분비된 rpS3의 양이 유방암 세포주인 MCF7 세포주보다 2배이상 증가했음을 확인하였다.

이는 실시예 3에서 제조한 단일클론 항체 및 다클론항체를 이용한 Sandwich ELISA 기법이 각종 암세포에서 전이의 정도를 조기에 정확히 측정할 수 있는 방법임을 의미한다.

위암 환자, 간암 환자, 대장암 환자의 혈액에서 단일클론 및 다클론 항체를 이용한 샌드위치 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시하였다. 정상세포에 비해, 위암 환자, 간암 환자, 대장암 환자의 종양세포에서 rpS3이 더 많이 분비되었다(도면 6d 참조).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

rpS3의 면역침강을 유도하기 위해 pET-21a 벡터에 삽입 및 발현하고 상기 pET-21a의 다중 클로닝 부위 중 EcoRI-XhoI 제한효소 부위에 인간 rpS3의 전체 단백질 코딩 유전자를 삽입하여 6개의 히스티딘 아미노산(6*His)이 표지된 전체 길이의 rpS3을 발현하는 플라스미드가 구축되어 결합하는 항체를 포함하고, 암세포에서 분비된 rpS3 수준을 측정하며,
상기 플라스미드를 E. coli 계통의 단백질 표현용 세균주 BL-21에 형질전환하여 유전자 재조합 세균을 제조하는 것을 특징으로 하는 암진단용 조성물.
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제1 항에 있어서,
상기 항체는 단일클론 또는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 암진단용 조성물.
제1 항에 있어서,
rpS3은 환자의 시료에서 측정하는 것인 암진단용 조성물.
제1 항에 있어서,
rpS3의 분비 수준은 ELISA 방법으로 측정하는 것인 암진단용 조성물.
제1항 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 암진단용 조성물을 포함하는 암진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 키트는 면역침강이 가능한 효율적인 2차 항체를 추가로 포함하여 분비된 rpS3에 대한 정확도를 높인 것을 특징으로 하는 암진단용 키트.
(a) 정상인의 생물학적 시료와 검출하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 rpS3의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(b) 검출하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 분비된 rpS3의 발현수준을, 정상인의 생물학적 시료로부터 rpS3 발현수준과 비교하여 증가할 경우, 암발병 또는 전이의 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계를 포함하고,
상기 rpS3의 발현수준을 rpS3의 면역침강을 유도하기 위해 pET-21a 벡터에 삽입 및 발현하고 상기 pET-21a의 다중 클로닝 부위 중 EcoRI-XhoI 제한효소 부위에 인간 rpS3의 전체 단백질 코딩 유전자를 삽입하여 6개의 히스티딘 아미노산(6*His)이 표지된 전체 길이의 rpS3을 발현하는 플라스미드가 구축되어 결합하는 항체를 이용하여 측정하고,
상기 플라스미드를 E. coli 계통의 단백질 표현용 세균주 BL-21에 형질전환하여 유전자 재조합 세균을 제조하는 것을 특징으로 하는 암진단에 대한 정보 제공 방법.
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