CN110045129B

CN110045129B - 一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法

Info

Publication number: CN110045129B
Application number: CN201910308241.5A
Authority: CN
Inventors: 胡静; 尹健; 施奇敏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN110045129A; WO2020211317A1

Abstract

本发明公开了一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法，属于免疫学检测领域。本发明提供了一种经济、快速、准确、实用性高用于检测人体sASGPR的ELISA法。该方法基于ASGPR的特异性配体与ASGPR之间的特异性识别，选取半乳糖基化人血清白蛋白(GSA)作为ASGPR的特异性配体，GSA由人血清白蛋白制备得来，具有价格便宜、容易制备、易于保存等优点，且该方法的检测限度适用于人血清样品中sASGPR的检测，不需要使用特殊、大型仪器设备，在普通实验室即可开展，具有特异性高、稳定性好、操作简便、费用低廉等优势，为临床肝功能评估提供一定的参考价值。

Description

一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法

技术领域

本发明涉及一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法，属于免疫学检测领域。

背景技术

数十年来肝脏疾病一直是全球范围内一项重要且发病率高的疾病，肝硬化、肝炎、脂肪肝等肝损伤都是肝癌的必经之路，肝脏损伤严重威胁着我国乃至全球人民的健康和生命。目前，肝脏损伤的主要检测手段有组织病理学诊断、血清学诊断及影像学诊断。其中血清学诊断的主要临床血清标志物有谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)及血清胆红素(BIL)等，但这些指标存在着特异性不高的缺点，除了肝损伤会对这些指标存在影响，其他一些疾病也会引起这些指标的异常变化。因此需要发掘一种新的肝损伤血清标志物，从而可以特异性的指示肝功能的异常。

可溶性去唾液酸糖蛋白受体(sASGPR)是肝脏特异性表达的一种可溶性蛋白，血液中因机体正常组织代谢、损伤、饮食、疾病等因素会出现可溶性的半乳糖/N-乙酰半乳糖胺糖配体来竞争性的结合细胞组织间的凝集素，血液中的sASGPR主要参与这些有害的糖配体的清除，从而维持体内半乳糖水平的稳定。有研究表明人体血液中的sASGPR的含量在健康人群中保持一定的恒定水平，并且当肝损伤发生时，会引起sASGPR含量的变化。因此，sASGPR作为一个新型的潜在的肝功能标志物正在受到研究者的关注，如果能建立sASGPR与肝损伤之间的联系，将为肝功能临床检测提供极大的帮助。

目前，可以买到的检测人体sASGPR的试剂盒产品很少，且已有的检测人体ASGPR的ELISA试剂盒均为双抗夹心法试剂盒。双抗夹心法试剂盒需要用到两种针对ASGPR不同位点的不同抗体，抗体制备过程比较费时费力，制备成本也相对较高，从而导致试剂盒价格比较昂贵，使用者检测成本增高；另外，现有的一些ELISA试剂盒的检测限度也不适用于对人体血清中sASGPR的检测，使得对血清样本的检测操作不便，同时结果不够准确。为了更好的检测人体血清中的sASGPR，为肝功能检测提供新的可能的检测方法，本研究建立了一种检测人体sASGPR的ELISA方法，本方法利用配体与受体的特异性结合进行检测，大大降低了检测方法的成本和制备难度，并且本方法的检测限度可以很好的适用于血清样品的检测，是一种经济、快速、准确、实用性高的ELISA法。

发明内容

本发明提供了一种经济、快速、准确、实用性高用于检测人体sASGPR的ELISA法。该ELISA方法是基于ASGPR的特异性配体与ASGPR之间的特异性识别所建立的间接ELISA法。相对于常见的双抗夹心ELISA法而言，本方法选取半乳糖基化人血清白蛋白(GSA)作为ASGPR的特异性配体，GSA由人血清白蛋白制备得来，具有价格便宜、容易制备、易于保存等优点，且该方法的检测限度适用于人血清样品中sASGPR的检测，实用性较高。该方法不需要使用特殊、大型仪器设备，在普通实验室即可开展。

本发明的第一个目的是提供一种检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体的方法，所述方法以半乳糖基化人血清白蛋白(GSA)作为ASGPR的特异性配体，应用ELISA法进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述半乳糖基化人血清白蛋白(GSA)的制备方法如下；

在干净的反应瓶中加入20mg人血清白蛋白，再加入20mL 0.5M MES生物缓冲液(pH5.25)将人血清白蛋白充分溶解，再依次加入108.6mg氨基半乳糖和62mg EDC充分溶解，加样全部完成后将反应瓶放入37℃油浴锅中，反应16h；反应结束后，向反应瓶中加入3.4mL1M CH₃COOH溶液(pH 4.5)来终止反应；反应终止后将反应液转移至

ΜLtra离心过滤器中，5000×g离心20min，倒掉下层离心管中滤液，在上层过滤器中加入10mM CH₃COOH溶液(pH 7)复原至样本原体积，再次5000×g离心，重复多次超滤来除去未反应的氨基半乳糖及降低醋酸钠的浓度；多次超滤后最终得到的GSA溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：用CBS缓冲液稀释的GSA包被酶标板,4℃包被12～24h，随后用洗涤缓冲液洗涤；在包被好的酶标板中加入封闭液，35～37℃封闭1.5～2.5h；弃封闭液，用洗涤缓冲液洗涤；向酶标板中加入样品，35～37℃孵育2～2.5h，随后用洗涤缓冲液洗涤，拍干；加入ASGPR1一抗35～37℃孵育2～2.5h，随后洗涤缓冲液洗涤；加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，35～37℃孵育1～2h，洗涤缓冲液洗涤；用TMB显色液显色，避光孵育10～20min，随后立即用H₂SO₄终止显色；测定450nm处吸光度。

在本发明的一种实施方式中，所述CBS缓冲液的浓度为0.05M。

在本发明的一种实施方式中，所述GSA的包被浓度为15～25μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述封闭液是含1％脱脂牛奶的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)。

在本发明的一种实施方式中，所述ASGPR一抗稀释50倍后添加；所述ASGPR一抗购自Santa Cruz Biotechnology，货号为sc-166633。

在本发明的一种实施方式中，所述酶标二抗稀释2000倍后添加；所述酶标二抗购自康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0102。

在本发明的一种实施方式中，用浓度为2M的H₂SO₄终止显色。

在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤如下：

(1)包被：用0.05M CBS缓冲液将GSA稀释到20μg/mL包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被24h，随后用含0.1％tween-20的PBS洗涤三次，3min/次，拍干；

(2)封闭：在包被好的ELISA孔板中按照300μL/孔加入1％脱脂牛奶，封板膜封板，37℃封闭2h；弃封闭液，用含0.1％tween-20的PBS洗涤三次，3min/次，拍干；

(3)加样：待测样品加入96孔酶标板中，每孔加样量为100μL；加样后封板膜封板，37℃孵育2h。

(4)孵育一抗：用封闭液以1:50稀释ASGPR1/2的鼠来源一抗进行孵育，100μL/孔，37℃孵育2h，随后用含0.1％tween-20的PBS洗涤四次，3min/次，拍干；

(5)孵育二抗：用封闭液以1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠酶标二抗进行孵育，100μL/孔，37℃孵育1h，用含0.1％tween-20的PBS洗涤四次，3min/次，拍干；

(6)TMB显色：用TMB显色液(碧云天生物技术公司，P0209)显色，200μL/孔，避光孵育15min，随后立即用2M H₂SO₄终止显色，50μL/孔。终止显色后用酶标仪尽快测定450nm处各孔吸光度。

在本发明的一种实施方式中，所述酶标板应用96孔板制备。

本发明的第二个目的是提供一种检测试剂盒，包括经GSA包被的酶标板、封闭液、ASGPR标准品、ASGPR一抗、羊抗鼠酶标二抗、终止液和洗涤缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述GSA包被的酶标板是按如下方法制备：用包被液将GSA稀释到20μg/mL包被96孔酶标板,100μL/孔，4℃包被24h，随后用洗涤缓冲液(含0.1％tween-20的PBS)洗涤三次，3min/次，拍干。

在本发明的一种实施方式中，所述包被液为CBS缓冲液，其配制方法为：称取1.59gNa₂CO₃、2.93g NaHCO₃溶于800mL ddH₂O中，用NaOH调节溶液pH至9.6，最后用ddH₂O准确定容至1L，4℃保存。

在本发明的一种实施方式中，所述洗涤缓冲液包括第一洗涤缓冲液和第二洗涤缓冲液；所述第一洗涤缓冲液为0.01M PBS缓冲液，其配制方法为：称取2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8g NaCl、0.2g KCl溶解于800mL ddH₂O中，用HCl调节溶液pH至7.4，最后用ddH₂O准确定容至1L，4℃保存；所述第二洗涤缓冲液为PBST缓冲液，其配制方法为：将1mL吐温20加入1L配置好的0.01M PBS缓冲液中，混合均匀，4℃保存。

在本发明的一种实施方式中，所述封闭液的配制方法为：称取1g脱脂牛奶溶解于100mL PBST缓冲液中，充分溶解后，用0.22μm的无菌滤膜过滤后于-20℃保存。

在本发明的一种实施方式中，所述ASGPR标准品稀释液的配制方法为：取1mL提前配制好的1M NaCl溶液、100μL 1M Tris-HCl溶液(pH 7.4)、100μL 1M CaCl₂溶液于烧杯中，并准确称取0.1g BSA加入烧杯中，用ddH₂O准确定容至10mL，充分溶解后，用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，-20℃保存。

在本发明的一种实施方式中，所述ASGPR一抗购自Santa Cruz Biotechnology，货号为sc-166633；所述酶标二抗购自康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0102；所述TMB显色液购自碧云天生物技术，货号为P0209。

在本发明的一种实施方式中，所述终止液为2M H₂SO₄，配制方法为：在烧杯中加入89.15mL ddH₂O，之后逐滴加入浓硫酸(98％)10.85mL，边加边缓慢搅拌。

本发明还要求保护所述试剂盒在检测肝功能指标中的应用。

有益效果：本方法选取半乳糖基化人血清白蛋白(GSA)作为ASGPR的特异性配体，代替价格高昂的抗体包被酶标板，并优化ELISA检测的条件，建立了适用于人血清样品中sASGPR的检测方法，可达到检测限4μg/L；批间重复试验和批内重复试验的变异系数均值均小于7％，有较好的重复性；且重复检测获得的拟合直线线性相关系数r均大于0.990，该方法满足预期设定的4-100μg/L线性范围；应用本发明的方法包被好的酶标板在37℃下稳定保存10天后仍能够达到良好的重复性、线性范围，检测限符合标准，具有重要的应用前景。

附图说明

图1为检测人体sASGPR的ELISA法的原理图。

图2为ASGPR标准品纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳(A)及Western Blot(B)。

图3为ASGPR标准曲线示意图。

图4为测定浓度与理论浓度的线性拟合图。

图5为对临床血清样本中sASGPR的检测。

具体实施方式

实施例1配体GSA的制备

在干净的反应瓶中加入20mg人血清白蛋白，再加入20mL 0.5M MES生物缓冲液(pH5.25)将人血清白蛋白充分溶解，再依次加入108.6mg氨基半乳糖和62mg EDC充分溶解，加样全部完成后将反应瓶放入37℃油浴锅中，反应16h。反应结束后，向反应瓶中加入3.4mL1M CH₃COOH溶液(pH 4.5)来终止反应。反应终止后将反应液转移至

ΜLtra离心过滤器中，5000×g离心20min，倒掉下层离心管中滤液，在上层过滤器中加入10mM CH₃COOH溶液(pH 7)复原至样本原体积，再次5000×g离心，重复多次超滤来除去未反应的氨基半乳糖及降低醋酸钠的浓度。多次超滤后最终得到的GSA溶液，将其分装后放入-80℃冰箱中储存待用。用BCA试剂盒(Takara,T9300A)检测GSA的蛋白浓度。测定前，按照BCA试剂A液：BCA试剂B液＝100：1的比例混合后配制成工作液。将BSA标准品溶液分别稀释至2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL，分别将稀释后的BSA标准品溶液以及待测GSA样品溶液依次加入96孔板中，10μL/孔，每个浓度取两个平行样，每孔加入200μL工作液，立即混匀，随后放入37℃水浴槽中反应30min，冷却至室温，用酶标仪检测562nm处吸光值。绘制BSA标准品溶液的标准曲线，并根据标准曲线计算出待测GSA蛋白的蛋白浓度。

实施例2ASGPR标准品的提纯

取150mL提前收集好的HepG2细胞上清液用离心机离心5min(3500×g)，取离心后的上清液加入到50mL的

ΜLtra离心过滤器中(3500×g)进行浓缩，最终浓缩至终体积为8mL。向浓缩后的HepG2细胞上清液中加入8mL裂解缓冲液，混合均匀，4℃裂解2-3h。裂解完成后，20000×g离心30min，取上清至新的离心管中，加入800μL 1M CaCl₂，冰上孵育30min。再次20000×g离心30min，弃沉淀。将乳糖琼脂糖珠柱预先用50mL洗涤缓冲液Ⅰ平衡，将乳糖琼脂糖珠充分转移至离心管中，与离心后的细胞上清4℃过夜结合。将结合后的乳糖琼脂糖珠充分转移至柱子中，依次用10mL洗涤缓冲液Ⅰ和5mL洗涤缓冲液Ⅱ洗柱。用14.4mL洗脱缓冲液洗脱乳糖琼脂糖珠柱，收集的洗脱液中加入1.6mL 1MTris-HCl(pH 7.8)缓冲液。用BCA法检测提纯的sASGPR的浓度，并用Western blot进行特异性验证。

实施例3一抗的选择

购买两个ASGPR1鼠来源的一抗，分别为：ASGPR1/2(E-1)(Santa CruzBiotechnology,sc-166633)和ASGPR1(A-5)(Santa Cruz Biotechnology,sc-393849)，以下分别称为鼠抗人ASGPR-1单抗、鼠抗人ASGPR-2单抗。用10μg/mL的GSA包被2块96孔酶标板，每孔加入100μL GSA，4℃条件下包被24h，包被结束后，用PBST洗涤5次，每次3min，拍干。每孔加入300μL 1％BSA进行封闭全孔，4℃条件下封闭过夜，封闭结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，拍干。分别设置ASGPR稀释液为阴性对照孔、质控品孔以及0.15μg/mL、0.50μg/mL、2.00μg/mL、8.00μg/mL的ASGPR标准品为样品孔，将阴性对照及样品依次加入酶标板中，样品做4个重复孔，每孔加样量为100μL。加样后37℃恒温箱中孵育1h。样品孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，拍干。两块酶标板中分别加入1:500稀释的鼠抗人ASGPR-1单抗，鼠抗人ASGPR-2单抗，每孔加样量为100μL，37℃恒温箱中孵育1h。一抗孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，拍干。两块板中加入1:2000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP，每孔加样量为100μL，37℃恒温箱中孵育1h。二抗孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，拍干。每孔加入200μLTMB显色液，37℃恒温箱中避光显色15min。显色结束后，每孔迅速加入50μL 2M H₂SO₄终止显色并混匀。立即用酶标仪测各孔450nm处吸光度值，分析结果。

表1不同ASGPR一抗的检测效果

从表中数据可以看出使用鼠抗人ASGPR-1单抗时，OD₄₅₀的值会随着ASGPR浓度的增加有明显的梯度增加，因此选择鼠抗人ASGPR-1单抗作为本间接ELISA法的检测一抗。

实施例4包被缓冲液的选择

分别选择磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)、Tris盐酸盐缓冲液(0.01M TBS)、碳酸盐缓冲液(0.05M CBS)、0.9％NaCl作为待选包被液。分别用0.01M PBS、0.01M TBS、0.05M CBS和0.9％NaCl将10μg/mL的GSA包被到96孔酶标板中，每孔100μL的GSA，4℃条件下包被24h，包被结束后，用PBST洗涤5次，每次3min，拍干。每孔加入300μL 1％BSA进行封闭全孔，4℃条件下封闭过夜，封闭结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，拍干。分别设置阴性对照孔及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品孔，将阴性对照及样品依次加入酶标板中，样品做4个重复孔，每孔加样量为100μL。加样后37℃恒温箱中孵育1h。样品孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次3min，拍干。两块酶标板中分别加入1:500稀释的鼠抗人ASGPR-1单抗，每孔加样量为100μL，37℃恒温箱中孵育1h。一抗孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，拍干。两块板中加入1:2000稀释的山羊抗鼠IgG-HRP，每孔加样量为100μL，37℃恒温箱中孵育1h。二抗孵育结束后，用PBST洗涤4次，每次3min，拍干。每孔加入200μL TMB显色液，37℃恒温箱中避光显色15min。显色结束后，每孔迅速加入50μL 2M H₂SO₄终止显色并混匀。立即用酶标仪测各孔450nm处吸光度值。

表2不同包被缓冲液的检测效果

从表中数据可以看出，使用0.05M CBS作为包被缓冲液，阳性样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀(P/N)值最高。

实施例5不同包被浓度的选择

用0.05M CBS分别将GSA稀释为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL，并分别包被在不同的酶标板上，每孔包被100μL。其余步骤同上，分别检测阴性对照孔及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品孔的OD₄₅₀值，每个样品设置4个重复孔进行检测。

表3不同包被浓度的检测结果

结果显示。包被20μg/mL GSA时，P/N值最高。

实施例6包被时间的选择

用0.05M CBS将20μg/mL GSA包被到酶标板上，包被条件分别设定为：37℃条件下包被1h、37℃条件下包被2h、4℃条件下包被12h、4℃条件下包被24h。其余步骤同上，分别检测阴性对照孔及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品孔的OD₄₅₀值，每个样品设置4个重复孔进行检测，最终根据P/N值确定最佳GSA包被时间。

表4不同包被时间的检测结果

结果显示，4℃条件下包被24h，P/N值最高。因此，选择4℃条件下包被24h作为间接ELISA法的包被时间。

实施例7封闭液的选择

用0.05M CBS将20μg/mL GSA包被在4℃条件下包被24h，分别用1％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、1％FBS、5％FBS这6种不同的封闭液进行封闭，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭1h。其余步骤同上，分别检测阴性对照孔及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品孔的OD₄₅₀值，每个样品设置4个重复孔进行检测，最终根据P/N值确定最佳封闭液。

表5不同封闭液的检测效果

使用1％脱脂奶粉作为封闭液时，P/N值最高。

实施例8封闭时间的选择

用0.05M CBS将20μg/mL GSA包被在4℃条件下包被24h，用1％脱脂奶粉封闭，封闭时间分别设置为37℃条件下封闭1h、37℃条件下封闭1.5h、37℃条件下封闭2h、37℃条件下封闭2.5h、37℃条件下封闭3h。其余步骤同上，分别检测阴性对照孔及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品孔的OD₄₅₀值，每个样品设置4个重复孔进行检测，最终根据P/N值确定最佳封闭时间。

表6不同封闭时间的检测效果

结果显示，封闭时间为2h时，P/N值最高。

实施例9样品孵育时间的选择

选择上述实验确定的最佳条件进行包被、封闭。分别检测阴性对照以及标准品ASGPR1(80μg/L)、标准品ASGPR2(40μg/L)样品，每个样品设置4个重复孔进行检测，样品孵育时间分别设置为1h、1.5h、2h、2.5h、3h，最终根据OD值及P/N值确定最佳样品孵育时间。

表7不同样品孵育时间的检测效果

当孵育时间达到2h时，P/N值达到最高，孵育时间再增加，虽然样品孔OD值会增大，但相应的阴性对照值也会增大，P/N值维持稳定。

实施例10一抗二抗稀释度的优化

选择上述实验确定的最佳条件进行包被、封闭。分别检测阴性对照孔及ASGPR样品孔，每个样品设置4个重复孔进行检测。一抗分别按照为1:30、1:50、1:100、1:200、1:400稀释，二抗分别按照1:1000、1:2000、1:4000、1:6000稀释。最终根据P/N值确定最佳二抗稀释度。

表8不同一抗二抗稀释度的检测效果

表9棋盘滴定法的P/N值

从结果中看到，当一抗稀释度为1:50，二抗稀释度为1:2000时，P/N值达到最大。

实施例11TMB显色时间的选择

用上述优化好的各个最适条件进行间接ELISA检验，最后一步TMB显色时间分别设置为5min、10min、15min、20min，之后用2M H₂SO₄终止显色，并用酶标仪测定OD₄₅₀值，最终根据P/N值确定TMB显色时间。

表10不同显色时间的检测效果

当显色时间为15min的时候，P/N值达到最高点，随着显色时间的增加，P/N值会有所下降。

实施例12ELISA法标准曲线的绘制

(1)包被：用0.05M CBS缓冲液将GSA稀释到20μg/mL包被96孔酶标板,100μL/孔，4℃包被24h，随后用洗涤缓冲液(含0.1％tween-20的PBS)洗涤三次，3min/次，拍干。

(2)封闭：在包被好的ELISA孔板中按照300μL/孔加入1％脱脂牛奶，封板膜封板，37℃封闭2h；弃封闭液，洗涤缓冲液洗涤三次，3min/次，拍干。

(3)加样：分别设置ASGPR阴性对照孔以及ASGPR标准品孔，标准品分别用标准品稀释液稀释5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L这7个浓度，将阴性对照及ASGPR标准品依次加入96孔酶标板中，做复孔，每孔加样量为100μL。加样后封板膜封板，37℃孵育2h。

(4)孵育一抗：用封闭液以1:50稀释ASGPR1/2的鼠来源一抗(Santa CruzBiotechnology)进行孵育，100μL/孔，37℃孵育2h，随后洗涤缓冲液洗涤四次，3min/次，拍干。

(5)孵育二抗：用封闭液以1:2000稀释HRP标记的羊抗鼠酶标二抗(康为世纪生物科技有限公司，CW0102)进行孵育，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗涤四次，3min/次，拍干。

(7)标准曲线绘制：读取不同浓度ASGPR标准品的OD₄₅₀值，绘制标准曲线。

实施例13最低检测限的确定

按照实施例12的方法，将ASGPR阴性对照样品在包被好的同一个酶标板上重复测定20孔，且重复测定五批。计算阴性对照样品OD₄₅₀值的平均值M以及标准差SD，计算出M±3SD的值，并将其带入标准曲线的方程中即可得到该ELISA法的最低检测限，结果显示最低检测限为4μg/L。

表11重复5个批次的检测结果

实施例14批间及批内重复性试验

用同一批次和不同批次制备的GSA包被酶标板，按照实施例12的方法，对3个不同浓度的ASGPR阳性样品、阴性样品及血清样品进行重复性试验，各进行三次重复，测定OD值之后，计算得到批间重复试验和批内重复试验的变异系数均值均小于7％，因此该方法有较好的重复性。

表12批间重复性试验

表13批内重复性试验

实施例15线性范围

用三个批次包被的酶标板分别检测5个不同浓度(5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、70μg/L、100μg/L)的ASGPR标准品，按照实施例12的方法，对测定浓度与理论浓度做线性拟合，重复检测三次。三次测定获得的拟合直线线性相关系数r均大于0.990，因此该方法满足预期设定的4-100μg/L线性范围。

实施例16准确性(回收试验)

取三个血清样品，并向三个血清样品中分别添加高(20μg/L)、中(10μg/L)、低(5μg/L)三个浓度的ASGPR标准品，按照实施例12的方法检测原始血清样品及添加ASGPR后的样品中的sASGPR浓度，每个样品重复检测三次，计算ASGPR的回收量及回收率。

表14回收试验

实施例17ELISA法检测临床血清样品

按照实施例12的方法，分别检测ASGPR阴性对照样品、ASGPR标准品和待测样品(3个血清样品)，标准品分别用标准品稀释液稀释至5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L这7个浓度，血清样品用1×PBS稀释两倍待用。绘制标准曲线，根据样品孔的OD₄₅₀值计算出对应样品的ASGPR含量。

表15ELISA检测血清样本

从上述表中可以看到，血清样品的OD值处于标准曲线的测试范围内，该方法可以达到预期的检测效果。

实施例18ELISA法检测临床血清样品

用实施例12的间接ELISA法检测共533个血清样本，其中含489例健康人的血清样本及44例肝损伤病人的血清样本。检测结果显示健康人血清样本中sASGPR的含量为85.94±59.69μg/L，肝损伤病人血清样本中sASGPR的含量为20.41±10.59μg/L，经统计学分析，健康样本与肝损伤样本间血清sASGPR含量有显著统计学差异(P＜0.001)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种非诊断目的体外检测人体可溶性去唾液酸糖蛋白受体ASGPR的方法，其特征在于，以半乳糖基化人血清白蛋白作为ASGPR的特异性配体，应用ELISA法进行检测；

所述方法包括如下步骤：以去唾液酸糖蛋白受体特异性结合的半乳糖基化人血清白蛋白作为配体，将配体包被在酶标板上，封闭，洗涤后加入待测样品，孵育、洗涤后依次加入ASGPR一抗和酶标二抗，再加入底物显色，以显色结果表征待测样品中去唾液酸糖蛋白受体的含量；所述半乳糖基化人血清白蛋白的包被浓度为15~25 μg/mL；

所述方法具体为：用CBS缓冲液稀释的半乳糖基化人血清白蛋白包被酶标板，4 ℃包被12~24 h，随后用洗涤缓冲液洗涤；在包被好的酶标板中加入封闭液，35~37 ℃封闭1.5~2.5h；弃封闭液，用洗涤缓冲液洗涤；向酶标板中加入样品，35~37 ℃孵育2~2.5 h，随后用洗涤缓冲液洗涤，拍干；加入ASGPR一抗35~37 ℃孵育2~2.5 h，随后洗涤缓冲液洗涤；加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，35~37 ℃孵育1~2 h，洗涤缓冲液洗涤；用TMB显色液显色，避光孵育10~20 min，随后立即用H₂SO₄终止显色；测定450 nm处吸光度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CBS缓冲液的浓度为0.03~0.08 M。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ASGPR一抗购自Santa CruzBiotechnology，货号为sc-166633；所述酶标二抗稀释2000倍后添加；所述酶标二抗购自康为世纪生物科技有限公司，货号为CW0102。

4.权利要求1~3任一所述方法在非诊断目的检测肝功能指标中的应用。