CN104292289B - 半乳糖配体及其在肝靶向脂质体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种半乳糖配体分子以及其在肝靶向脂质体中的应用。本发明提供了一种全新的半乳糖配体分子，可作为肝靶向介导物质，修饰脂质体，使得由其制备的脂质体具有肝靶向性。该半乳糖配体分子是以半乳糖基、固醇基和二元酸二乙酯基为原料酯化而得。本发明还提供了由半乳糖配体分子修饰的脂质体载体，以及包载药物的肝靶向脂质体复合物，从而实现半乳糖配体分子介导相关药物靶向到肝细胞，降低其对正常组织的毒性，提高药物的肝病防治效果。

Description

半乳糖配体及其在肝靶向脂质体中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体是涉及一种小分子量半乳糖配体，其合成方法及利用该半乳糖配体制备的肝靶向脂质体及肝靶向药物。
背景技术
在新药研发中，如何让活性成分有效地靶向到目标细胞或组织中是重要的研究课题之一。例如，不论某药物的药理作用如何好，如果不能到达需治疗的组织，如病灶部位，也不能达到期望的药理效果。除了局部给药方法外，通常，活性药物成分(药物)，需要经过口服或注射的方式给药，药物经血液运输达到作用部位后发挥其药理作用。如果药物不能有效到达治疗组织，就需要加大药物的给药剂量，但药物的副作用随之增加。为了提高药物在靶点部位的聚集，需要供助载体、配体或抗体将药物通过胃肠道、或全身血液循环而选择性地浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构，我们称这种定向的给药方式为靶向给药系统。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是位于肝实质细胞表面的内吞性受体，可专一识别未端带有非还原性半乳糖残基的糖蛋白或小分子化合物。由于ASGPR是肝实质细胞特有受体，专一存在于肝实质细胞表面，因此ASGPR成为肝脏定向转移的最佳受体，为肝癌的治疗、肝脏基因的定向表达和肝功能检测提供了良好的研究途径。利用ASGPR的特性，可设计一种含半乳糖配基的小分子化合物，将其共价偶联于脂质体表面得到肝脏靶向脂质体，用于装载药物发挥导向作用，选择性提高肝实质细胞内的药物浓度、延长作用于肝部位药物的时效、同时减少给药剂量、降低药物毒性，提高药物的治疗指数。
其中可被ASGPR专一性识别的未端带有非还原性半乳糖残基的糖蛋白或小分子化合物，我们称之为半乳糖配体。目前半乳糖配体分子的合成多采用化学合成法。化学合成法工艺较复杂，合成步骤多，产率较低，所用试剂多含有一定毒性。例如，Shao-ning等(Wang SN，Deng Y H，Xu H，et al.Synthesis of a novel galactosylated lipid and itsapplication to the hepatocyte-selective targeting of liposomal doxorubicin[J].Eur J Pharm Biopharm，2006，62(1)：32-38.)用胆固醇、乳糖酸钙、乙二胺、琥珀酸酐等为原料，分三步合成目标产物：第一步将乳糖酸脱水形成内酯，然后与乙二胺酰化生成1-N-[O-β-D-Galactopyranosyl-(1，4)-D-Gluconamide]-2-N`-methylamine(LA-ED)；第二步胆固醇、琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺生成N-Hydroxysuccinimidly5-Cholesten-3-yloxySuccinate(CHS-NHS)；第三步LA-ED与CHS-NHS生成目标产物(5-Cholesten-3-yl)4-oxo-4-[2-(lactobionyl amido)ethylamido]butanoate(CHS-ED-LA)，如果以乳糖酸钙为起始原料计算收率，最终得率为10.8％，前述反应过程可参见下文所列反应式：
又比如，Leo等(Sliedregt L A，Rensen P C，Rump E T，et al.Design andsynthesis of novel amphiphilic dendritic galactosides for selective targetingof liposomes to the hepatic asialoglycoprotein receptor[J].J Med Chem，1999，42(4)：609-618.)用化学法合成一种带三个半乳糖单元配体分子，合成步骤达6步之多，最终收率约为0.1％，这种合成效率远不能满足实际生产需求。
总结以往公开有关半乳糖配体分子的制备方法，尚存在以下不足：
1、文献中记录的半乳糖配体分子的制备方法都是采用化学法，所用试剂和反应介质多有毒性，而且反应后很难除尽，产品很难满足注射制剂的质量要求。
2、化学合成法步骤较多，而且副产物多，产品纯化困难，只能满足实验室少量制备要求，不适用工业化生产。
3、合成产率低，目前采用化学合成法最高得率仅为10％左右。
4、化学合成法所用的试剂和反应所产生的副产物一般很难回收再利用，对环境造成一定的污染。
除此之外，上述现有方法合成的半乳糖配体分子结构，不能轻易地任意延长碳桥的长度来获得不同链长的配体分子。而分子中半乳糖基与脂质体表层的空间距离可以显著影响ASGPR对脂质体的识别能力，一般来说，距离越长，ASGPR对半乳糖化脂质体的识别能力越高。故，现有方法合成的配体分子很难调整被ASGPR识别的能力。同时，背技术提到的半乳糖配体分子呈正电性，与带负电性的磷脂耦联制备脂质体时，会降低脂质体ZETA电位，导致得到脂质体不稳定，使制备肝脏靶向脂质体时，收率低。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明目的之一是提供一种新型的半乳糖配体分子，其具有至少与现有技术的半乳糖配体分子相当或更佳的特性，便于与脂质体耦联制备肝靶向脂质体。
本发明的半乳糖配体分子，其包括三个部分：半乳糖基、长链碳桥和固醇基，其化学结构式(I)为：
其中n为0到99的整数，较佳为1-50，更佳为5-20；
其中R为固醇基，选自以下结构中的一种：
上述固醇基分别来源于菜籽固醇、胆固醇、麦角固醇、谷固醇及豆固醇。
R’为半乳糖基，反应位点为C-6位，选自以下结构中的一种：
所述的半乳糖基分别来源于乳糖醇、半乳糖及乳糖。
上述n可以取值0-99之间，通过选择不同链长的酯基化合物作为碳桥，连接在半乳糖基和固醇基之间，可以任意延长碳桥的长度来获得不同链长的配体分子，以增加ASGPR对载体的识别能力。本发明半乳糖配体分子为几乎呈中性分子或略带负电，与带负电的脂质体耦联后，不会降低脂质体的ZETA电位，故脂质体稳定性更佳。
本发明的半乳糖配体分子的一端含有可被去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)识别的半乳糖残基，另一端含有固醇基，可用于耦联在脂质体表面而发挥肝靶向作用。
本发明另一个目的是提供一种新的半乳糖配体分子合成方法，可避免使用有毒化学试剂和原料，满足制作注射剂型靶向药物的质量要求，对环境无污染，且合成步骤简单，副产物少，纯化容易。
本发明的半乳糖配体分子是采用固醇、乳糖醇(或乳糖或半乳糖)与二乙烯酯在酶的催化酯化而成。具体地，本发明的合成方法是在非水相中，分两步用生物酶催化酯化后，采用重结晶法和硅胶柱层析法纯化即得，所述步骤包括：
步骤1：固醇基连接碳桥步骤：
将一定量的二乙烯酯、固醇在脱水有机溶剂中溶解后，加入适量酶催化剂，温度35℃～55℃，反应0～48h后，过滤，滤液浓缩挥去有机溶剂，浓缩液重结晶即得中间产物(式II)；反应表示为：
其中n＝0～99，较佳为1-50，更佳为5-20；
其中ROH为菜籽固醇、胆固醇、麦角固醇、谷固醇或豆固醇，R为固醇基，R选自以下5种基团的至少一种：
其中，固醇与二乙烯酯的投料摩尔比为1∶1～20∶1；进一步优选为5∶1～10∶1。
其中，所述的脱水有机溶剂为异辛烷、正已烷、环已烷、石油醚、丙酮其中至少一种或任意几种的组合；出于后续作为药物的靶向载体的考虑，较佳采用低毒低沸点溶剂。
其中所采用的酶催化剂为选自RCL(来源于Candida rugosa)、Chirazyme L-2脂肪酶(来源于C.Antarctica type B)、Chirazyme L-1脂肪酶(来源于Ps.cepacia)及LipaseQLM[购自Meito Sangyo Co.Ltd.(Aich，Japan)]中的一种。
其中，步骤1酶的用量为1～20mg/mL反应体系，进一步优选为5～10mg/mL反应体系。
步骤2：半乳糖基连接碳桥步骤：将步骤1得到的中间产物式II与乳糖醇或半乳糖或乳糖R’OH在脱水有机溶剂中溶解后，加入适量的另一种酶催化剂和适量的分子筛，置于恒温20～60℃，反应0.5～48h，抽滤，滤液真空低温浓缩挥去有机溶剂，浓缩液层析纯化，得到半乳糖配体分子式I，上述反应过程表示如下：
其中R’OH为乳糖醇、半乳糖或乳糖，R’为半乳糖基，反应位点为C-6位，R’选自以下结构中的一种：
其中，步骤1得到的中间产物式II与R’OH的投料摩尔比为1∶1～20∶1；进一步优选为3∶1～10∶1。
在步骤2中，所选的为南极假丝酵母脂肪酶B(Candida Antarctica lipases-B，CAL-B)，或者其商品化固定酶Novozym 435。
酶催化剂用量为：1～50mg/mL反应体系，进一步优选为5～20mg/mL反应体系。
其中，所用反应溶剂选自吡啶、吡啶+丙酮、吡啶+THF、吡啶+叔戊醇、吡啶+乙二醇二甲醚、吡啶+DMF及吡啶+DMSO中的一种。
在溶剂的选择方面，因乳糖醇不溶于非极性溶剂中，而酶在非极性溶剂中活性较高，因此要选择一种合适的反应溶剂能同时兼顾底物的溶解度和酶的活性。单一溶剂较难满足上述要求。故，其中最优选择为丙酮∶吡啶(1∶1～1∶10)，可以较好溶解底物和保持酶活。
如上所述的，本发明的半乳糖配体分子合成方法分两步完成：第一步，固醇与二乙烯酯发生酯交换反应，生成固醇单乙烯酯，第二步，固醇单乙烯酯与乳糖醇或乳糖或半乳糖的6号位C进一步酯交换反应，得到目标产物。
这两步反应的顺序也可以颠倒，即第一步，先由乳糖醇或乳糖或半乳糖的6号位C与二乙烯酯发生酯交换反应生成二酸乳糖单酯，第二步，二酸乳糖单酯另一端的乙烯酯基与固醇再次发生酯交换，生成目标产物。但经实验发现，由于，若乳糖醇先与二酸二乙烯酯反应，易生成二元糖酯，而一元糖酯的产率较低；而二酸二乙烯酯如果先与固醇反应，通过控制投料比，很容易得到单酯产物。故，本发明优先使二酸二乙烯酯与固醇反应得到中间产物后，再以中间产物与乳糖醇反应，以合成目标产物半乳糖配体分子。
本发明的第三个目的是提供一种含有前述半乳糖配体的肝靶向配体脂质体，其是将上述的半乳糖配体共价偶联于脂质体表面而形成。
脂质体是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。胆固醇与磷脂是共同构成细胞膜和脂质体的基础物质。
本发明的肝靶向配体脂质体是由前述半乳糖配体与磷脂及胆固醇制成的脂质体，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～10，半乳糖配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％。
按照上述组分配比关系，可采用薄膜法、注入法和逆向蒸发法三种方法制备肝靶向配体脂质体，可制备得到粒径及zeta电位稳定的肝靶向配体脂质体，包封率在80％～95％。关于肝靶向脂质体的制备方法为现有方法，在此不详述。
优选的，上述的磷脂采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂类型。具体地，制备肝靶向脂质体时采用的磷脂为中性磷脂，负电荷磷脂或正电荷脂质材料。
本发明还包括一种肝靶向药物，它是是运用上述的肝靶向配体脂质体作为包封层，将用于治疗肝病的基因、蛋白、多肽或小分子药物中的任意一种包封于其内的复合物。
虽然在本发明实施方式中是采用酶促合成方法获得半乳糖配体分子的结构，但并不能排除本领域技术人员在了解本发明半乳糖配体分子的结构和其良好的物化性质后，而采用化学合成方法来合成。
本发明的技术效果在于：
(1)、本发明半乳糖配体分子与脂质体组成肝靶向配体脂质体，由于配体分子具有亲水性的半乳糖基在脂质体外层形成一层亲水保护层，增加了脂质体的稳定性，导致药物不易外泄；配体分子的加入也使配体脂质体的Zeta电位绝对值比普通脂质体增加，因为合成的半乳糖配体分子基本呈中性而略带负电，若加入到同样带有负电荷的脂质体后可以增加电位绝对值，增加配体脂质体的稳定性。通过半乳糖配体脂质体的肝靶向性验证实验，证明含半乳糖配体分子的脂质体有明显的肝靶向性。
(2)、本发明合成的半乳糖配体分子均采用酯键连接，可降解为相应的单体成分，因此整个载体系统具有良好的生物相容性和生物可降解性。
(3)、本发明首次采用酶促合成的方式，在非水相中全合成半乳糖配体分子。本发明所用合成法可以克服化学合成法的诸多不足，所用试剂和反应介质无毒性，使纯化简单，可为后续作为注射药剂的载体提供有利条件，本发明酶促法合成步骤简单，而且副产物少，收率高，可应用于工业化生产。由于半乳糖基与脂质体表面的距离大小与ASGPR受体的识别能力大小相关联，通过选择不同链长的二乙烯酯作为碳桥，可轻易增长固醇基与半乳糖基之间的距离，以按照需要调节配体脂质体被肝ASGPR受体识别的能力。
(4)、本发明的半乳糖配体分子具有两亲性，可以作为脂质体膜材与磷脂混合制备脂质体，提高包载药物的肝靶向性，降低药物全身副作用。通过半乳糖配体实现介导相关药物(如小分子肝病治疗药物，大分子肝病防治药物包括蛋白、多肽和基因)靶向到肝细胞，降低其对正常组织的毒性，提高药物的肝病防治效果。
附图说明
图1为实施例1的目标产物半乳糖配体分子13C NMR图。
图2为实施例1步骤1得到的中间产物(式II)的高效液相色谱图。
图3为实施例1的步骤2得到的目标产物半乳糖配体分子(式I)的高效液相色谱图。
图4为空白普通脂质体(下方)与半乳糖配体脂质体(上方)Zeta电位值的分布图。
图5为不同碳桥长度的半乳糖配体分子修饰的脂质体(GAL10-FL、GAL13-FL、GAL15-FL)、以及普通脂质体FL与细胞结合率的计算结果比较图。
图6为实施例7的方法(1)得到的DOC半乳糖配体脂质体(GAL-DOC-L，上方)与DOC普通脂质体(DOC-L，下方)的Zeta电位值的分布图。
图7为DOC-LP的CL与GAL-DOC-LP的血药浓度c(μg/mL)对时间t(min)的变化关系图。
具体实施方式
为了使审查员能够详细了解本发明，以及验证本发明的半乳糖配体分子的合成方法，半乳糖配体分子的有益技术效果，以下举出具体实施例予以说明。
本发明酶促合成半乳糖配体分子的方法，分为两步，第一步，固醇与二酸二乙烯酯发生酯交换反应，生成固醇单乙烯酯，第二步，固醇单乙烯酯与乳糖醇或乳糖或半乳糖的6号C进一步酯化，得到目标产物。这两步反应的顺序也可以颠倒，即第一步，乳糖醇或乳糖或半乳糖的6号C与二酸二乙烯酯反应生成二酸乳糖单酯，第二步，二酸乳糖单酯的另一端乙烯基酯与固醇酯化，生成目标产物。以下实施例1-实施例5是以不同的反应原料制备半乳糖配体分子的具体实施例。
实施例1：反应原料：胆固醇，癸二酸二乙烯酯，乳糖醇
步骤1：取10mL带塞锥形瓶，加入癸二酸二乙烯酯0.224mmol、胆固醇0.025mmol，用5mL脱水异辛烷超声溶解，置于空气浴恒温震荡器振摇30min，加入酶RCL7.7mg/mL反应体系，启动反应，反应温度35℃，反应11.47h结束后，过滤回收酶，滤液低温真空除去异辛烷，然后用20倍量甲醇超声溶解，置于0℃下静置24h，待有大量晶体析出时，低温快速抽滤，得白色粉未状固体中间产物(II)，产率92％。反应过程如下方所示：
中间产物(Ⅱ)的结构表征：
MS：ESI源(+)模式；喷雾电压3kV；毛细管温度为350℃。MS谱图显示[M+Na]+峰：619.5，揭示产物相对分子质量为596.5，与目标物相对分子质量596.2相吻合。
NMR数据如下：13C-NMR(126MHz，CDCl3)δ：173.57(C-28)，171.15(C-37)，141.50(C-38)，140.02(C-6)，122.90(C-9)，97.76(C-39)，74.01(C-2)，56.99(C-14)，56.43(C-15)，50.32(C-7)，42.61(C-13)，40.03(C-12)，39.82(C-22)，38.46(C-4)，37.30(C-3)，36.90(C-5)，36.48(C-20)，36.09(C-18)，34.97(C-29)，34.22(C-36)，32.21(C-10)，32.16(C-8)，29.34(C-31)，29.32(C-32，C-33)，29.26(C-34)，28.53(C-16)，28.32(C-23)，28.12(C-1)，25.30(C-30)，24.85(C-35)，24.58(C-17)，24.13(C-21)，23.12(C-25)，22.86(C-24)，21.33(C-11)，19.63(C-27)，19.01(C-19)，12.16(C-26)。
步骤2：取10mL带塞锥形瓶，加入中间产物(II)0.15mmol，乳糖醇0.04mmol，加入2.1mL脱水溶剂(吡啶∶丙酮，2∶1)，混合均匀，置于空气浴恒温振荡器内(55℃，250r/min)预热30min，加22.8mg脂肪酶CAL-B，分子筛100mg，反应温度55℃，反应时间31.14h。反应结束后，反应液真空抽滤回收酶，滤液低温真空旋蒸除去有机溶剂得白色粉未。所得固体硅胶柱层析，柱层析条件为：层析硅胶(100-200目)，湿法装填色谱柱，柱高40cm，柱径2cm，洗脱剂∶环已烷∶乙酸乙酯(95∶5)，得白色固体，产率94％。反应过程表示如下：
目标产物结构表征：
ESI-MS m/z：920[M+Na]+.13CNMR：173.45(C-28)，172.80(C-37)，139.81(C-6)，122.55(C-9)，106.23(C-44)，84.68(C-40)，76.80(C-48)，74.96(C-46)，73.61(C-2)，72.74(C-42)，72.67(C-45)，71.46(C-39)，70.15(C-41)，69.62(C-47)，66.50(C-38)，63.63(C-43)，61.59(C-49)，56.55(C-14)，56.13(C-15)，50.02(C-7)，42.25(C-4)，39.70(C-13)，39.49(C-12)，38.36(C-22)，37.01(C-3)，36.58(C-5)，36.25(C-20)，35.78(C-18)，34.50(C-29)，34.12(C-36)，31.90(C-10)，31.80(C-8)，29.08(C-31，C-34)，29.03(C-32，C-33)，28.25(C-1)，27.98(C-16)，27.95(C-23)，25.10(C-30)，24.93(C-35)，24.24(C-17)，23.90(C-21)，22.68(C-25)，22.44(C-24)，21.03(C-11)，19.13(C-27)，18.71(C-19)，11.75(C-26).1H NMR：δ5.42(d，J＝4.2Hz，1H)，5.15(d，J＝7.8Hz，1H)，4.91-4.82(m，2H)，4.81-4.62(m，4H)，4.59(t，1H)，4.54-4.28(m，7H)，4.10(dd，J＝9.4，3.3Hz，1H)，4.04(t，J＝6.2Hz，1H)，2.59-2.44(m，2H)，2.35(dt，J＝33.7，7.5Hz，4H)，2.06-1.78(m，4H)，1.75-1.34(m，14H)，1.33-1.02(m，20H)，0.99(d，J＝6.4Hz，3H)，0.91(d，J＝6.6Hz，6H)，0.69(s，3H)。
目标产物半乳糖配体分子13C NMR图见图1。其中，MS(赛默飞世尔科技有限公司)：ESI源(+)模式，喷雾电压3KV，毛细管温度：350℃。1H、13C NMR(Avance III400MHz，Switzerland)，溶剂：氘代吡啶，1H、13C NMR分辨率分别是：400MHz、101MHz。
述两个步骤的总收率为86.48％；远大于现有化学合成方法的收率。其中用到的原料及试剂毒性低，固醇基与半乳糖基之间的碳桥长度由二烯酯的链长直接决定；因此能够通过采用不同链长的二酸二烯酯增加固醇基与半乳糖基之间的距离，提升肝脏特异性受体对配体载体的识别能力。
实施例2：完全按照实施例1的方法，只是将用到的癸二酸二乙烯酯改为H2C＝CH-OOC-(CH2)11-COO-CH＝CH2，步骤1中的酶改为采用Chirazyme L-2脂肪酶，用量约5mg/mL，溶剂换为丙酮；而步骤2中的酶改为采用商品化固定酶Novozym435，用量约30mg，溶剂为丙酮∶吡啶1∶5；得到的产物形状为白色蜡状固体，总收率为83.26％，结构为：
目标产物的结构表征为：
MS：[M+Na]+：961.3；13C NMR(101MHz，Pyridine-d5)δ173.06，172.40，139.40，122.16，105.88，84.38，79.08，76.42，74.57，73.21，72.35，72.28，71.08，69.76，69.23，66.11，63.25，61.20，56.15，55.74，49.62，41.85，39.31，39.09，37.97，36.61，36.19，35.85，35.39，34.15，33.75，31.50，31.40，29.14，29.05，28.90，28.74，27.85，27.58，24.77，24.59，23.85，23.51，22.29，22.05，20.64，18.74，18.3 1，11.36.1H NMR(400MHz，Pyr)δ5.41(s，1H)，5.14(d，J＝7.8Hz，1H)，5.12-4.46(m，9H)，4.48(d，J＝2.9Hz，1H)，4.52-4.28(m，3H)，4.16-3.96(m，1H)，2.46(dd，J＝27.3，10.6Hz，2H)，2.33(dd，J＝24.2，16.7Hz，2H)，1.98(s，1H)，1.93(d，J＝16.9Hz，1H)，1.91-1.65(m，4H)，1.91-1.37(m，11H)，1.36-0.65(m，26H)，1.08-0.95(m，6H)，0.95(ddd，J＝117.5，54.7，47.0Hz，14H)，0.90(d，J＝6.5Hz，6H)，0.68(s，2H)。
实施例3：完全按照实施例1的方法和条件，只是将用到的癸二酸二乙烯酯改为H2C＝CH-OOC-(CH2)13-COO-CH＝CH2，步骤1中的酶改为采用理帕兹QLM(Lipase QLM，脂肪酶的一种)，用量约10mg/mL，溶剂换为石油醚；而步骤2中的酶改为采用商品化固定酶Novozym435，用量约35mg，溶剂为吡啶+THF(1∶1)；得到的产物形状为白色蜡状固体，总收率为80.59％，结构为：
目标产物结构表征：
MS：[M+Na]+峰：990.1；13C NMR(101MHz，Pyridine-d5)δ173.09，172.43，139.40，122.17，105.88，84.36，76.44，74.59，73.22，72.37，71.10，69.77，69.24，66.13，63.26，61.21，56.14，55.73，49.62，41.85，39.30，39.09，37.97，36.60，36.19，35.85，35.38，34.16，33.76，31.50，31.40，29.23，29.10，28.93，28.75，27.85，27.57，24.78，24.60，23.84，23.50，22.28，22.04，20.63，18.73，18.30，11.35.H NMR(400MHz，Pyr)δ5.41(s，1H)，5.22-4.48(m，13H)，4.81-4.48(m，4H)，4.84-4.48(m，4H)，4.48-4.15(m，3H)，4.15-3.92(m，1H)，3.59(d，J＝5.0Hz，1H)，2.52(s，1H)，2.43(s，1H)，2.33(s，2H)，2.19-1.71(m，5H)，1.80(d，J＝9.5Hz，2H)，1.89-1.71(m，3H)，1.73(s，1H)，1.63(s，1H)，1.60(s，3H)，1.52(dd，J＝45.0，38.5Hz，8H)，1.37-0.57(m，30H)，0.90(d，J＝6.0Hz，5H)，0.90(d，J＝6.0Hz，5H)，0.68(d，J＝5.4Hz，2H)，0.68(d，J＝5.4Hz，2H)。
实施例4：完全按照实施例1的方法和条件，只是将步骤1用到的胆固醇改为谷固醇，二乙烯酯仍为癸二酸二乙烯酯，步骤2用的乳糖醇改为乳糖；步骤1中的酶改为Chirazyme L-1脂肪酶，用量约6mg/mL，溶剂换为石油醚；得到的产物形状为白色蜡状固体，总收率为83.23％，结构为：
实施例5：完全按照实施例1的方法和条件，只是将步骤1用到的胆固醇改为豆固醇，二乙烯酯仍为癸二酸二乙烯酯，步骤2用的乳糖醇改为半乳糖；步骤1中的酶改为Chirazyme L-2脂肪酶，用量约16mg/mL反应体系，溶剂换为正已烷；得到的产物形状为白色蜡状固体，总收率为87.61％，结构为：
以上已经分别以胆固醇、癸二酸二乙烯酯、乳糖醇；胆固醇、13或15个碳的二酸二乙烯酯、乳糖醇；谷固醇、癸二酸二乙烯酯、乳糖为原料；豆固醇、癸二酸二乙烯酯、半乳糖为原料为例对合成方法进行举例说明。经测定，所分别得到的对应半乳糖配体均具有基本相同的粒径、电性等物化性质，在此不再穷尽列举。
如图1所示为实施例1合成的半乳糖配体的13C NMR谱图。在乳糖醇的13C NMR谱图上，δ61.4、63.3、63.8和72.4ppm分别归属于三个伯羟基(C-6’、C-1、C-6)和仲羟基(C-5)。酯化产物的谱图上，δC-6化学位移向低场移动到66.5ppm，另二个伯羟基化学位移没有变化，而且与C-6位相邻的C-5向高场移动到71.4ppm，说明步骤2中酯化位置只发生在C-6位上。由于多羟基糖类的酯化选择性主要受醇羟基周围立体位阻影响，而酶可以显著地区别这些微小的差异。乳糖醇三个伯羟基(C-6’、C-1、C-6)都具有较高被酶催化活性，但是脂肪酶CAL-B可以特异的选择催化C-6，而不是其他位置。
由此证明，本发明的半乳糖配体分子的酶促合成法，相对于化学合成法一个显著优势是：酶催化剂具有高度保守的区域选择性，特别是催化多羟基糖的酯化反应时，只得到某单一羟基的酰化产物。
又参见图2和图3，分别为实施例1步骤1得到的中间产物(式II)和步骤2得到的目标产物半乳糖配体分子(式I)的高效液相色谱图。分别取实施例1的步骤1和步骤2反应完成后未纯化的制备原液进高效液相分析，记录色谱图，如图2和图3所示。从色谱图记录的色谱峰可以看出，产物峰单一，峰形完好，周围无杂质峰出现，说明酶催化合成法的高效，高度专一性，几乎无副反应发生。两步酶促合成法累积产率采用步骤1的中间产物(式II)的得率×第二步半乳糖配体分子(1)的得率，算得结果为80％以上，而现有化学合成的文献报道的有关半乳糖配体分子的化学合成法中，累积产率均未超过10％。
由此证明，本发明所提供的半乳糖配体分子的酶促合成法，相对于化学合成法另一个显著优势是：高产率、低副产物。
由此总结出，本发明半乳糖配体分子酶法合成工艺可克服以往有文献报道的化学法合成工艺的不足，具体表现如下：(1)、本发明所用的生物酶催化剂是一种高效的绿色催化剂。化学合成法对于含多羟基糖类化合物的酯化时，很难得到某一羟基单一酯化产物；而生物酶具有高区域选择性，反应位点高度保守，因此反应产物单一，几乎无副反应。(2)、本发明所用生物酶催化合成法，合成步骤少，只需要两步；产率高，两步合成累计产率达80％以上；反应条件温和，节能环保。(3)、本发明所用的纯化工艺简单，分离出的反应底物可以循环使用，大大降低了生产成本。(4)、本发明所用相关原料和试剂均为无毒或极低毒性，经简单纯化后，均易除去，保证产品的人体用药安全性。(5)、本发明合成的半乳糖配体分子均采用酯键连接，可降解为相应的单体成分，因此整个载体系统具有良好的生物相容性和生物可降解性。
接下来，可进一步将实施例1-5所制备得到的半乳糖配体分子偶联在脂质体表面，形成由半乳糖介导的肝靶向脂质体载体，它是由实施例1-5是制备的半乳糖配体分子与胆固醇(CHOL)和磷脂(PC)制成。胆固醇可以是胆固醇或胆固醇硫酸钠、磷脂包括天然及合成磷脂不同类别，其中，各组分配比关系如下：按胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～10，半乳糖配体分子的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～50％的配比关系制备的肝靶向脂质体。进一步优选，半乳糖配体分子的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的5～50％。
具体地，脂质体可采用薄膜法、注入法和逆向蒸发法制备肝靶向脂质体，以下为几种制备方法的概述：
1、薄膜法：
a、称取半乳糖配体分子、胆固醇和磷脂(例如氢化大豆磷脂HSPC)适量置于旋蒸瓶中，加入氯仿、乙醚或氯仿-甲醇复合溶剂使之完全溶解；
b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；
c、在脂质体膜中加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)或纯化水水化得肝靶向空白脂质体溶液；
d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶向空白脂质体溶液孵育，即得。
若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共同成膜，或先溶于c步骤中的水化溶剂中。
若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于c步骤中的水化溶剂中。
2、注入法
a、称取半乳糖配体分子、胆固醇和HSPC适量，乙醚或乙醇使之完全溶解；
b、注入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或纯化水溶液中，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，即得肝靶向空白脂质体溶液；
c、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶向空白脂质体溶液孵育，即得。
若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于b步骤中的水相溶剂中。
若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于b步骤中的水相溶剂中。
3、逆向蒸发法
a、称取半乳糖配体分子、胆固醇和HSPC适量，氯仿或乙醚使之完全溶解；
b、加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂；
c、减压蒸发有机溶剂，达到胶态后，加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS等溶液，旋转使器壁上的凝胶脱落，在减压下继续蒸发，除尽有机溶剂，即得肝靶向空白脂质体溶液；
d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶向空白脂质体溶液孵育，即得。
若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于b步骤中的水溶液中。
若制备载基因(包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体)、蛋白或多肽(包括各种电性的蛋白或多肽)的肝靶向脂质体，则先将基因、蛋白或多肽溶于b步骤中的水溶液中。
实施例6：空白脂质体的制备及特性比较：
1、空白配体脂质体和普通脂质体的制备方法：
A、空白半乳糖配体荧光脂质体(GAL-FL)的配方：EPC∶胆固醇CHOL∶荧光磷脂NBD-PC∶配体分子(实施例1得到的CHS-SE10-LA)(4∶1∶0.04∶0.5，质量比)；
B、空白普通荧光脂质体(FL)的配方：EPC∶CHOL∶NBD-PC(4∶1∶0.04)；制备方法：精密称量以上各配方，用适量氯仿溶解，移入250mL茄形瓶中，真空旋蒸挥去氯仿，直至在瓶壁形成均匀脂膜，继续真空干燥24h，后加入5mL PBS(pH7.4)水化1小时，育孵30min后将脂质体水化液探头超声15min(超声功率200W)，然后依次通过0.45、0.22、0.1μm微孔滤膜3次，即得到本发明未载有药物的半乳糖配体脂质体和空白普通脂质体，于4℃充氮保存，备用。
2、空白普通脂质体与半乳糖配体脂质体的外观、粒径以及Zeta电位值测定，结果见表1及图4所示。
表1：普通脂质体与配体脂质体的比较
配体分子的加入，会使粒径和Zeta电位有轻微增大，且粒径分布控制在70nm以内，粒径大小适中，符合脂质体制剂相关质量要求，加入的半乳糖配体分子对粒径影响不大；又测定其zeta电位如图4所，结果显示：掺入半乳糖配体分子对脂质体zeta电位影响不大，说明本发明半乳糖配体分子为中性略微偏负电性。
3、半乳糖配体脂质体的靶向验证：
再按照上述空白脂质体的制备方法，再以实施例2和实施例3得到的13个碳链长度和15个碳链长度的半乳糖配体制备得到的空白半乳糖配体荧光脂质体(分别命名为GAL13-FL、GAL15-FL)和空白普通荧光脂质体FL(不含半乳糖配体)，用无血清培养液稀释成含磷脂浓度为1mmol/L，备用。取对数生长周期的细胞(HepG2)经消化，细胞计数，稀释成浓度为(1.0～5.0)×104cells/mL的细胞悬液，并按1mL/孔接种于24孔板中，于培养箱中贴壁预培养24h，换液，用PBS洗去未贴壁的细胞。取预先制备的荧光标记脂质体(GAL10-FL、GAL13-FL、GAL15-FL和空白普通脂质体FL)加入细胞培养板中，每孔0.5mL，与细胞共同培养一定时间后将培养液小心吸出，以预冷的PBS轻轻冲洗细胞，以除去未与细胞牢固结合的脂质体，共3次，每次0.5mL。加入1％TriotnX-100的PBS溶液，0.5mL/孔，常温轻度振摇混匀30min，以溶解破坏细胞膜，释放并溶解与细胞结合的NBD-PC荧光标记脂质体，测定细胞裂解液的荧光强度值(F)，用BCA蛋白测定试剂盒测定该液体中细胞蛋白的浓度(mg/L)。用F值与细胞蛋白的浓度比值为指标来评价HepG2对脂质体的摄取率，每份样品平行测试三个复孔，取均值计算，结果参见图5所示。
其中深色柱状体代表含有半乳糖配体的空白脂质体，灰色的柱体代表普通空白脂质体，由图5中可明显观察到半乳糖修饰的空白脂质体与细胞结合率远高于普通脂质体，说明半乳糖配体可以引导脂质体经ASGPR介导途径进入细胞内。
4、不同碳桥长度的半乳糖配体CHS-SE10-LA、CHS-SE13-LA或CHS-SE15-LA制备得到的空白半乳糖配体脂质的横向比较
参见图5所示，通过本实验我们发现，半乳糖基与脂质体的表层空间距离会影响ASGPR对半乳糖配体的识别能力，其识别能力大小为C-15＞C-13＞C-10。不同碳桥长度的半乳糖配体分子修饰的脂质体(GAL10-FL、GAL13-FL、GAL15-FL)。
另在细胞结合率实验中，还可预先在细胞培养液加入乳糖，考察其抑制作用，结果显示，作为ASGPR受体抑制剂乳糖的加入，显著降低细胞对半乳糖修饰脂质体的摄取率，而对普通脂质体没有影响，这些结果表明，本发明制备的半乳糖配体分子在修饰脂质体后，通过肝细胞ASGPR介异作用下，有明显的肝靶向性。
在本实施例中主要考察脂质体接载半乳糖配体分子后，HepG2细胞对其摄取情况。考虑到DOC会对细胞产生杀灭作用，使实验结果产生偏差，因此我们选用空白脂质体作为考察对象。但在脂质体作为靶向药物载体时，仍需要了解封包有药物的普通脂质体与半乳糖配体脂质体之间的差异。
实施例7：载药脂质体的制备及比较：
A：载药半乳糖配体脂质体的三种不同的制备方法的制备例：
(1)：薄膜法制备DOC半乳糖配体脂质体(GAL-DOC-L)
精密称量HSPC、胆固醇、多烯紫杉醇DOC、DSPE-PEG2000(4∶1∶0.3∶0.3)，加入10％由实施例1得到的半乳糖配体分子，用无水氯仿溶解，移至茄形瓶中，真空旋干至瓶壁形成均匀脂膜。真空干燥24h，加pH7.4PBS溶液于45℃水化1小时，育孵30min，探头超声(功率200W)15min，挤压过0.45、0.22、0.1μm微孔滤膜，充氮气于4℃密封，即得多烯紫杉醇的肝靶向脂质体。
(2)：注入法制备DOC半乳糖配体脂质体(GAL-DOC-L)
精密称量HSPC、胆固醇、荧光磷脂(NBD-PC)(4∶1∶0.05)，加入10％由实施例1得到的半乳糖配体分子，用无水乙醇溶解，注入pH 7.4 PBS溶液中，真空旋转蒸发除尽乙醇，育孵30min，探头超声(功率200W)15min，挤压过0.45、0.22、0.1μm微孔滤膜，充氮气于4℃密封，即得荧光标记的肝靶向脂质体。
(3)：逆向蒸发法制备DOC半乳糖配体脂质体(GAL-DOC-L)
精密称量HSPC、胆固醇、多烯紫杉醇、DSPE-PEG2000(4∶1∶0.3∶0.3)，加入10％由实施例1得到的半乳糖配体分子，用氯仿溶解，加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂；减压蒸发有机溶剂，达到胶态后，加入HEPS溶液，旋转使器壁上的凝胶脱落，在减压下继续蒸发，除尽残留氯仿，育孵30min，探头超声(功率200W)15min，挤压过0.45、0.22、0.1μm微孔滤膜，充氮气于4℃密封，即得多烯紫杉醇(DOC)的肝靶向脂质体。
研究发现，半乳糖配体分子在脂质体表面的密度能影响ASGPR对脂质体的识别能力，密度越大，识别能力越强；但是当加入的配体分子的量超过脂质体总量的10％以后，易被Kuffer细胞识别并拦截。因此半乳糖配体分子于制备配体脂质体时，配体分子加入的量为脂质体质量的10％。
B：载药普通脂质体的制备：
采用薄膜法制备DOC的普通脂质体(DOC-L)
具体制备方法如下：精密称量HSPC、CHOL、DOC、DSPE-PEG 2000(4∶1∶0.3∶0.3)，用无水氯仿溶解，移至茄形瓶中，真空旋干至瓶壁形成均匀脂膜。真空干燥24h，加pH7.4PBS溶液于45℃水化1小时，育孵30min，探头超声(功率200W)15min，挤压过0.45、0.22、0.1μm微孔滤膜，充氮气于5℃密封保存，备用。
C：载药半乳糖配体脂质体与载药普通脂质体的物理性质比较：
现将由实施例7的方法(1)得到的，即薄膜法制备得到的DOC半乳糖配体脂质体(GAL-DOC-L)与DOC普通脂质体(DOC-L)外观形态、包封率、粒径和Zeta电位数据如表2和图6所示。
表2：DOC-L(DOC普通脂质体)和GAL-DOC-L(DOC配体脂质体)的参数比较
根据上表2及图6的结果可知，载药脂质体和半乳糖配体分子修饰的载药脂质体分别为：139.8nm和155.6nm，粒径大小适中，符合脂质体制剂相关质量要求，加入的半乳糖配体分子对粒径影响不大；又测定其zeta电位，结果显示：掺入半乳糖配体分子对脂质体zeta电位影响不大，说明本发明半乳糖配体分子为中性略微偏负电性。
同时，如表2所示，测定其包封率，结果显示：半乳糖配体分子修饰的含药脂质体和含药普通脂质体包封率分别为94.1％和93.5％。可见，说明本发明半乳糖配体分子对包封率无显著影响，并且还由于半乳糖配体分子的加入，可稍微增加包封率，可能与配体分子的亲水性半乳糖基在脂质体外层形成一层亲水保护层，增加了脂质体的稳定性，导致药物不易外泄；同时配体分子的加入，导致粒径有所增加；配体分子的加入也使配体脂质体的Zeta电位绝对值比普通脂质体增加，因为合成的CHS-SE-LA分子带负电，加入脂质体后可以增加电位绝对值。
D：载药半乳糖配体脂质体与载药普通脂质体的药动学比较
取12只SD大鼠(雌雄各半，150～180g)，每组6只，分别按剂量10mg/kg尾静脉注射DOC-LP(载药普通脂质体)和GAL-DOC-LP(载药半乳糖配体脂质体，由实施例7的方法(1)得到的)。给药后分别于5、15、30、60、120、360min经大鼠眼毗静脉采血，色谱条件测定DOC浓度，以血药浓度c(μg/mL)对时间t(min)作图，其结果参见图7所示。由图7所示，DOC-LP的CL值小于GAL-DOC-LP，而t1/2值大于GAL-DOC-LP，说明GAL-DOC-LP在血液中清除较快，说明与肝细胞对GAL-DOC-LP摄取率较高有关。
本申请中的英文缩略语

Claims (5)

1.一种半乳糖配体分子的合成方法，其特征在于该方法是在非水相中，分两步用生物酶催化酯化后，采用重结晶法和硅胶柱层析法纯化即得，方法主要包括两个步骤，分别是：
步骤(1)：固醇基连接碳桥步骤；将一定量的二乙烯酯、固醇在脱水有机溶剂中溶解后，加入适量酶催化剂，温度35℃～55℃，反应0～48h后，过滤，滤液浓缩挥去有机溶剂，浓缩液重结晶即得中间产物式II；反应式为：
其中n＝5-20；
其中ROH为固醇，R为固醇基，R选自以下5种基团的至少一种：
步骤(2)：半乳糖基连接碳桥步骤：将步骤1得到的中间产物式II与乳糖醇或半乳糖或乳糖R’OH在脱水有机溶剂中溶解后，加入适量的另一种酶催化剂和适量的分子筛，置于恒温20～60℃，反应0.5～48h，抽滤，滤液真空低温浓缩挥去有机溶剂，浓缩液层析纯化，得到半乳糖配体分子；反应式为：
其中R’OH为乳糖醇、半乳糖或乳糖，R’为半乳糖基，反应位点为C-6位，R’选自以下结构中的一种：
其中步骤(1)中所采用的酶催化剂为选自RCL、Chirazyme L-2脂肪酶、Chirazyme L-1脂肪酶及Lipase QLM中的一种，酶的用量为1～20mg/mL反应体系；步骤(2)中所采用的酶催化剂为南极假丝酵母脂肪酶B，或者其商品化固定酶Novozym 435；酶催化剂用量为：1～50mg/mL反应体系。
2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于步骤(1)中，固醇与二乙烯酯的投料摩尔比为1∶1～20∶1。
3.如权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于步骤(1)中，所述的脱水有机溶剂为异辛烷、正己烷、环己烷、石油醚、丙酮其中至少一种或任意几种的组合。
4.如权利要求3所述的合成方法，其特征在于步骤(2)中，步骤1得到的中间产物式II与R’OH的投料摩尔比为1∶1～20∶1。
5.一种含有如权利要求1-4所述的方法制得的半乳糖配体分子的肝靶向配体脂质体，其特征在于由权利要求1-4的合成方法制得的半乳糖配体分子与磷脂及胆固醇制成，胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～10，半乳糖配体的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％。
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