CN112778389B - 一种靶向配体分子及其制备方法和载药系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的靶向糖配体分子及其脂质体的制备，特别是涉及肝脏ASGPR受体靶点的靶向糖配体分子，以及应用该靶向糖配体分子制备的脂质体。该肝靶向糖配体分子由三部分构成：肝靶向糖基团、亲脂性“锚”结构和调节亲水/疏水平衡性的连接臂。该糖配体分子特定加载于纳米载药系统，能够使得该载药系统被机体吸收后，能够精确锁定肝实质细胞，使得抗肿瘤药物最大限度浓集于肝肿瘤部位，降低全身毒副作用，改善患者的生存质量。

Description

一种靶向配体分子及其制备方法和载药系统

技术领域

本发明涉及一种新型的靶向糖配体分子及其脂质体的制备，特别是涉及肝脏ASGPR受体靶点的靶向糖配体分子，以及应用该靶向糖配体分子制备的脂质体。

背景技术

原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，其中90％为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。我国为HCC高发国，约占世界HCC发生总数的70％，占国内肿瘤死亡率第3位[Chen,W.,et al.,Cancer statistics inChina,2015.CA Cancer J Clin,2016.66(2):p.115-32]。早期 HCC首选治疗方法包括手术切除和肝移植在内的外科治疗。但大多数患者确诊时已是中晚期，且常合并乙/丙型病毒性肝炎、肝硬化等，已失去外科手术机会，而此时化疗常常是唯一有效的治疗手段。然而化疗药物普遍存在疗效低、副作用多等诸多缺点。除化疗药物本身药理作用尚不够理想外，其主要原因就是不能将药物准确有效地转运至肝脏病灶部位，导致药物生物利用度低下；即使药物能够靶向运输到肝脏，又被肝脏迅速代谢，加大剂量和缩短用药时间间隔又导致对其他正常器官严重毒副作用，大大降低了药物的有效作用。因以提高癌变部位的药物浓度、延长药物作用时间和降低药物毒副作用为目的的新型纳米靶向控释系统在肝癌药物治疗研究中的应用，逐渐成为肝癌治疗研究的热点。

肝实质细胞表面存在大量的受体，例如去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)、转铁蛋白受体 (transferrin receptor，TfR)、高密度脂蛋白受体(high density lipoprotein receptor，HDLR)、低密度脂蛋白受体(lowdensity lipoprotein receptor，LDLR)、生长因子受体、胰岛素受体等，其中ASGPR和TfR是两种高效的内吞受体，TfR存在于许多种细胞的细胞膜上，而ASGPR只存在于肝实质细胞，因此ASGPR成为肝脏定向转运的最佳受体[黄渊余、梁子才,去唾液酸糖蛋白受体及其在药物肝靶向递送中的应用.生物化学与生物物理进展,2015(06):第 501-510页]。

ASGPR是数量丰富的一种异源低聚物的内吞型受体，只存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，能特异性地识别与结合具有D-半乳糖(D-galactose，Gal)或N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine，GalNAc)作为末端糖基的配体分子

[Franssen,E.J.F.,et al.,Hepatic and intrahepatic targeting of ananti-inflammatory agent with human serum albumin and neoglycoproteins ascarrier molecules.Biochemical Pharmacology,1993.45(6):p.1215-26]。文献研究发现，ASGPR 受体与配体的亲和性主要受以下因素影响：1)配体末端糖分子类型。末端为Gal或GalNAc的配体分子均可以被ASGPR识别，GalNAc与 ASGPR结合的亲和性比Gal高10～50倍[Rensen,P.C.,et al., Determination of the upper size limit for uptake andprocessing of ligands by the asialoglycoprotein receptor on hepatocytes invitro and in vivo.J Biol Chem,2001.276(40):p.37577-84]，而且GalNAc配体分子更容易逃逸Kupffer细胞的识别而更多靶向于肝肿瘤细胞[D'Souza,A.A.and P.V.Devarajan,Asialoglycoprotein receptor mediated hepatocyte targeting- strategies andapplications.J Control Release,2015.203:p. 126-39]；2)糖分子取代位点与ASGPR受体亲和性有如下规律：Gal (或GalNAc)上的1-OH、2-OH(或2-amino)、3-OH、4-OH和5-CH2-都参与ASGPR受体的结合；5-CH2-连有负电性基团或4-OH、3-OH、 2-OH(或2-amino)被取代后，与受体亲和力急剧下降；1-OH发生苷化取代时，当糖苷键为α构象时，与受体亲和力减弱，β构象时且取代基为直链结构时，亲和力不受影响[Lee,R.T.,Binding site of therabbit liver lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine.Biochemistry,1982.21(5):p. 1045-50]；只有6-OH不参与受体结合且指向溶剂区，因而适合作为连接位点与载体、药物等相连[Stokmaier,D.,et al.,Design, synthesis and evaluation ofmonovalent ligands for the asialoglycoprotein receptor(ASGP-R).Bioorg MedChem,2009. 17(20):p.7254-64]；然而，使用不同的末端分子、间隔臂的长度以及配体分子的亲水/亲油平衡值与亲和力之间的关系并没有更详细的数据披露。

进一步研究发现，任意延长或缩短半乳糖靶头与胆固醇之间的碳桥长度，会显著影响配体分子的肝靶向效率，例如将碳桥从8个CH2 减少至4个或增加至13个，肝靶向效率显著降低，可能与碳桥长度影响配体分子的亲水/疏水平衡性，进而影响靶头在脂质体表面分布有关。

因此，根据上述HCC治疗现状，仍然急需提供一种与肝实质细胞 ASGPR受体特异性结合力显著增强的靶向糖配体分子，以引导无靶向作用的载药系统使得肿瘤药物最大限度浓集于肝肿瘤细胞，减少药物在其他正常组织分布，显著提高药物治疗指数，降低全身毒副作用，改善患者的生存质量。

发明内容

本发明提供一种新型的肝靶向糖配体分子，该糖配体分子特定加载于纳米载药系统，能够使得该载药系统被机体吸收后，能够精确锁定肝实质细胞，使得抗肿瘤药物最大限度浓集于肝肿瘤部位，降低全身毒副作用，改善患者的生存质量。该肝靶向糖配体分子由三部分构成：肝靶向糖基团、亲脂性“锚”结构和调节亲水/疏水平衡性的连接臂。

所述肝靶向糖基团包括但不限于乙酰氨基半乳糖(CAS： 14215-68-0,GalNAc)，beta-D-吡喃半乳糖(CAS：7296-64-2,Gal), 乳糖醇(CAS:585-86-4,Lac),优选为GalNAc。

所述亲脂性“锚”结构包括但不限于胆固醇或其衍生物。

进一步，所述连接臂优选为含乙二醚结构的二元酸二乙烯酯，组成如下所示：

其中n≥1，优选为1≤n≤5，进一步优选为n＝2或n＝3。所述连接臂两端通过酯化偶联分别于肝靶向糖基团和亲脂性“锚”结构相连接。

所示糖配体分子，如下所示：

其中n≥1，优选为1≤n≤5，进一步优选为n＝2(DIO)或n＝3(TRIO)。

优选地，本发明所述半乳糖配体分子为CHS-DIO-GalNAc，即5- 胆甾烯-3a-氧代)[(2-乙酰氨基-2-脱氧-d-吡喃半乳糖6-氧)3,6- 二氧杂辛酸]，结构如下所示：

进一步，本发明提供一种含有上述糖配体分子的纳米载药系统，所述载药系统优选为脂质体。

所述脂质体配方如下：

组分	摩尔质量
		磷脂	0.01-0.1mmol
胆固醇	0.01-0.1mmol
		药物	0.001-0.01mmol
糖配体分子	0.001-0.01mmol

进一步，所述脂质体配方如下：

进一步，所述脂质体含有电荷磷脂，优选为负电荷磷脂，包括但不限于二鲸蜡磷酸酯(DCP)，1-棕榈酰基-2油酰基磷脂酰甘油 (POPG-Na)，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG-Na)，优选为1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油钠盐(DSPG-Na)。

进一步，所述脂质体配方如下：

组分	摩尔质量
		磷脂	0.01-0.1mmol
胆固醇	0.01-0.1mmol
		药物	0.001-0.01mmol
糖配体分子	0.001-0.01mmol
		负电荷磷脂	0.005-0.05mmol

优选地，所述脂质体配方如下：

组分	摩尔质量
		HSPC	0.05mmol
CHS	0.045mmol
		药物	0.0034mmol
糖配体分子	0.005mmol
		DSPG-Na	0.01mmol

本发明还提供一种糖配体分子的酶促合成方法，包括如下步骤：采用生物酶1作为催化剂，将亲脂性“锚”结构与

进行酯化偶联生成中间体2，然后用生物酶2作为催化剂将中间体 2与肝靶向糖基团进行酯化偶联即得。

本发明还提供一种CHS-DIO-GalNAc的酶促合成方法，包括如下步骤：采用生物酶1作为催化剂，将中间体1，3,6-二氧杂-(辛二酸二乙烯基酯和胆固醇进行酯化偶联生成中间体2，然后用生物酶2作为催化剂将中间体2与GalNAc进行酯化偶联即得。

具体包括如下步骤：

第一步：中间体1，即含乙二醚结构的二元酸二乙烯酯的合成。所用催化剂为醋酸汞与浓硫酸组成的汞盐催化体系。

第二步：中间体2，即胆固醇-PEG-单乙烯酯的合成。所用催化剂 1为脂肪酶:(Candida rugosa lipase,皱褶假丝酵母脂肪酶；Novozym 435固定化脂肪酶,CandidaAntarctica B)；Amano脂肪酶PS-IM (Burkholderia cepacia,硅藻土载体固定)中的任一种或两种以上及其组合，优选为Novozym 435；所述溶剂为四氢呋喃，丙酮，乙腈，二氧六环，吡啶中的任一种或两种以上及其组合，优选为四氢呋喃。

第三步：胆固醇-PEG-Sugar(糖)的合成。所用催化剂2为脂肪酶:Novozym 435固定化脂肪酶,Candida Antarctica B)，Lipozyme TL IM脂肪酶(Thermomyceslanuginose)中的任一种或两种以上及其组合，优选为Lipozyme TL IM脂肪酶。溶剂为四氢呋喃，丙酮，乙腈，二氧六环，吡啶中的任一种或两种以上及其组合，优选为丙酮。

在上述反应中，所述胆固醇部分可以用结构类似物替换，包括但不限于环戊烷多氢菲的衍生物，例如胆汁酸、类固醇激素、7-脱氢胆固醇、维生素D3等。

本发明研究证明，中间“桥”，即连接臂部分，我们采用含乙二醚结构的辛二酸二乙烯酯[3,6-dioxa-(divinyl octanedioate)]，分子两端的乙烯酯结构可在脂肪酶催化下与胆固醇和GalNAc高效酯化偶联，同时分子中的乙二醚结构具有一定的亲水性，可用于调节配体分子整体的亲水亲油平衡性。

采用胆固醇与3,6-dioxa-(divinyl octanedioate)为起始原料，采用脂肪酶催化法合成(5-cholesten-3b-ol)3,6-dioxa-(vinyl octanedioate)。我们发现Novozym 435具有较好的催化活性，在此条件下，单酯的转化率达90％以上。并且，

(5-cholesten-3b-ol)3,6-dioxa-(vinyl octanedioate)与含半乳糖、乳糖醇或乙酰氨基半乳糖酯化偶联时，反应只发生在糖基部份的 C-6’位，并且脂酶以TL IM为催化剂时，产率最高。

为进一步确定酯化位置，我们采用¹H的异核多碳相关谱(¹H detectedheteronuclear multiple bond correlation，HMBC)进行分析。图5显示，C-33与H-6’a/H-6’b远程相关，进一步说明酯化位点为GalNAc C-6’位。

脂质体采用薄膜分散-高压挤出法制备，粒径<80nm，且分布单一 (PDI<0.1)。在膜材中加入配体分子及DSPG Na基本没有改变脂质体的粒径大小和PDI，说明配体分子和DSPGNa的掺入对脂质体结构没有明显影响。

本发明采用的酶促合成配体工艺具有显著的优势：合成步骤少，只需要简单的三步；所需原料廉价易得；酶促反应条件温和，区域选择性高；反应效率高，总收率约50％以上(从第一步反应算起)，而化学合成法合成类似单簇头配体，反应步骤多，产率低下，上述优势使本研究的成果极具工业化前景。

术语解释及简写说明

GalNAc:乙酰氨基半乳糖(N-Acetyl-D-galactosamine)

Lac:乳糖醇(Lactitol)

Gal：D-半乳糖(D-Galactose)

CL-LP DOX：阿霉素普通脂质体

GalNAc-LP DOX：含CHS-C8-GalNAc配体的阿霉素脂质体

Gal-LP DOX：含CHS-C8-Gal配体的阿霉素脂质体

Lac-LP DOX：含CHS-C8-Lac配体的阿霉素脂质体

GalNAc-DIO-LP DOX：含CHS-DIO-GalNAc配体的阿霉素脂质体

附图说明

附图1中间体1的MS图谱

附图2中间体1的1HNMR图谱

附图3中间体1的13CNMR图谱

附图4中间体2的MS图谱

附图5中间体2的1HNMR图谱

附图6中间体2的13CNMR图谱附图7CHS-DIO-GalNAc MS图谱

附图8 CHS-DIO-GalNAc1HNMR图谱

附图9 CHS-DIO-GalNAc 13CNMR图谱

附图10 CHS-DIO-GalNAc的HMBC图谱

附图11.阿霉素脂质体电镜图片。图C中箭头标示为包载于脂质体内部的DOX。 A:×2500，bar 200nm；B：×5000，bar 100nm；C：×10000，bar 50nm；D：×25000， bar 20nm

附图12.尾静脉注射CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX后30min平均血药浓度。

附图13.尾静脉注射CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX后30min平均肝脏药物浓度(B)。

附图14.尾静脉注射CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX及其对应的阴离子脂质体后30min平均血药浓度(A)。

附图15.尾静脉注射CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX及其对应的阴离子脂质体后30min平均肝药浓度(B)。

附图16.小鼠尾iv CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX及GalNAc-DIO-LP DOX后DOX 的平均血药浓度-时间曲线(A)和平均肝脏药物浓度-时间曲线(B)(

n＝ 5)。

附图17.脂质体各组成部分在磷脂双分子层半膜中的位置分布图。红色代表氧原子；灰色代表碳原子；蓝色代表氮原子；紫色代表磷原子。纵坐标标示为原子键长。

具体实施方式

下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例涉及材料信息如下：

Candida rugosa lipase(皱褶假丝酵母脂肪酶)(CRL，VII型，酶活力≥700U/mg)，collagenase type I(胶原酶I)，asialofetuin(去唾液酸胎球蛋白)，Sephadex G-50，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；胆固醇(cholesterol，CHS)，质量分数＞98.5％，生产批号A90719，日本精化株式会社；氢化大豆磷脂 (hydrogenated soya phosphatide，HSPC)，1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂质量分数＞98.0％，生产批号B40932，日本丘比株式会社；二硬脂酰磷脂酰甘油钠(distearoyl phosphatidylglycerole sodium salt，DSPG-Na)，注射级，艾伟拓(上海)医药科技有限公司；盐酸阿霉素(doxorubicin，DOX)，质量分数＞98.0％，大连美仑生物技术有限公司；N-乙酰半乳糖胺(GalNAc，质量分数＞98.0％)、D-半乳糖 (D-galactosamine，Gal，质量分数＞99.0％)、D-乳糖醇(D-lactitol， LA，质量分数＞98.0％)，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； Lipozyme TL IM脂肪酶(酶活力＞250IUN/g)、Novozym 435固定化脂肪酶(酶活力＞10 000PLU/g)，均购自丹麦诺维信；超滤离心管， 1mL，截留相对分子质量100 000，美国PALL公司；透析袋，截留相对分子质量10000，Spectrum Laboratories，Inc.，CA，美国；其他试剂均为市售分析纯。

Thermo TSQ Quantum ACESS三重四极杆液质联用仪，赛默飞世尔科技有限公司；Bruker 500MHz核磁共振仪，瑞士布鲁克公司； RE-5299旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TGL-16MC冷冻离心机，长沙湘锐离心机有限公司；TBX 001高压挤出机，加拿大ATSEngineering Inc.；Alliance 2695高效液相色谱仪，包括四元梯度输液泵、自动进样器、可降温柱温箱、2475FLR多波长荧光检测器，美国沃特世公司；ZetasizerNano ZS90粒度测定仪，英国马尔文仪器有限公司；UV-1800紫外分光光度计，日本岛津公司；BS110s型电子分析天平，德国Sartorius公司。

实施例1CHS-DIO-SA-GalNAc的化学合成路线

合成步骤如下：

步骤1中间体1，3,6-二氧杂-(辛二酸二乙烯基酯) (3,6-dioxa-(divinyloctanedioate))的合成

称取3,6-dioxaoctandioic acid 28mol，醋酸乙烯酯(vinyl acetate)5.6mol，乙酸汞0.028mol及微量乙酸铜加入到1000mL 三口颈烧瓶中。将盛有上述物质的三口颈烧瓶在50℃的恒温水浴中加热并搅拌，10min后滴加0.5mL浓硫酸，反应8h。反应完毕后，加入约4g乙酸钠充分震荡以中和硫酸。水泵减压蒸馏除去过量乙酸乙烯酯后，将剩余蓝色液体经硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯(9∶ 1)等度洗脱，分离得到纯品，收率约60％。产物经MS、NMR鉴定，结果如下：MS:[M+Na]⁺253.4¹H NMR(500MHz,Pyr)δ7.45(H-7, H-9,dd,J＝13.9,6.3Hz,2H),4.95(H-8α,H-10α,dd,J＝ 13.9,1.6Hz,2H),4.61(H-8β,H-10β,dd,J＝6.3,1.6Hz, 2H),4.39(H-2,H-5,s,4H),3.86(H-3,H-4,s,4H).¹³C NMR (126MHz,Pyr)δ168.57(C-1,C-6),141.62(C-7,C-9),98.84(C-8, C-10),71.69(C-3,C-4),68.74(C-2,C-5).相关谱图见附图1-3。

步骤2中间体2(5-胆甾烯-3b-氧代)3,6-二氧杂-(辛二酸乙烯酯) (5-cholesten-3b-ol)3,6-dioxa-(vinyl octanedioate)的合成

取具塞锥形瓶，称取9.2g 3,6-dioxa-(divinyloctanedioate)、 3.86g胆固醇，加入脱水四氢呋喃适量溶解，置于恒温震荡器于 45℃振摇30min后，加入Novozym 435500mg，反应24h。反应结束后，过滤除去Novozym 435，续滤液真空旋干得黏稠液体，然后用适量甲醇超声溶解，0℃下静置24h析晶，低温下真空抽滤，得白色粉未，收率约95％。产物经MS、NMR鉴定，结果如下：MS:[M+ NH₄]⁺590.8，[M+Na]⁺595.8¹H NMR(500MHz,Pyr)δ7.48(H-34, dd,J＝13.9,6.3Hz,1H),5.40(H-9,d,J＝4.9Hz,1H),4.96 (H-35α,dd,J＝13.9,1.6Hz,1H),4.93–4.85(H-2,m,1H), 4.61(H-35β,dd,J＝6.3,1.6Hz,1H),4.43(H-29,s,2H),4.38 (H-32,s,2H),3.95–3.89(H-30,H-31,m,4H),2.56–2.38 (H-4,m,2H),2.09–1.04(m,26H),0.99(H-19,H-27,m,6H), 0.92(H-24、H-25,dd,J＝6.6,0.9Hz,6H),0.69(H-26,s,3H). ¹³C NMR(126MHz,Pyr)δ170.52(C-33),168.54(C-28), 141.57(C-34),140.22(C-6),123.42(C-9),98.75(C-35), 74.97(C-2),71.66(C-31),71.59(C-30),69.42(C-32),68.73(C-29),57.19(C-14),56.78(C-15),50.63(C-7), 42.91(C-13),40.35(C-12),40.17(C-22),38.84(C-4),37.57(C-3), 37.20(C-5),36.92(C-20),36.47(C-18),32.56(C-10),32.44(C-8), 28.93(C-16),28.68(C-23),28.47(C-1),24.92(C-17), 24.59(C-21),23.38(C-25),23.13(C-24),21.69(C-11), 19.75(C-27),19.38(C-19),12.42(C-26)。相关谱图见附图4-6。

步骤3CHS-DIO-GalNAc的合成

称量GalNAc 0.4mmol(5-cholesten-3b-ol)3,6-dioxa-(vinyl octanedioate)0.8mmol，Lipozyme TL IM脂肪酶100mg，丙酮50 mL加入具塞锥形瓶中，置于空气浴摇床中45℃，250r/min反应24 h。反应结束后，取反应液抽滤除去酶，滤液真空旋干后加入适量醋酸乙酯，0℃静置24h重结晶，即得白色固体产物CHS-DIO-GalNAc 0.282g(0.365mmol)，收率为91.1％。产物经MS、NMR鉴定，结果如下：MS:[M+NH₄]⁺767.9，[M+Na]⁺773.0。¹H NMR(500MHz,Pyr) δ5.94(H-1’,d,J＝3.4Hz,1H),5.38(H-9,d,J＝4.5Hz, 1H),5.32–5.23(H-5’,m,1H),4.88(dtd,J＝30.5,12.6, 6.9Hz,4H),4.59(H-3’,dd,J＝10.9,3.2Hz,1H),4.43(H-4’, d,J＝2.7Hz,1H),4.39–4.26(H-29,H-32,m,4H),3.92– 3.82(H-30,H-31,m,4H),2.50–2.37(H-4,m,2H),2.15– 2.08(H-8’,m,3H),2.07–1.01(m,31H),0.98(H-19,H-27, d,J＝5.9Hz,6H),0.90(H-24、H-25,dd,J＝6.6,0.9Hz,6H), 0.67(H-26,s,3H).¹³C NMR(126MHz,Pyr)δ171.46(C-8’), 171.18(C-33),170.63(C-28),140.28(C-6),123.47(C-9),93.34(C-1’),75.02(C-2),71.62(C-31),71.60(C-30), 70.84(C-4’),69.93(C-3’),69.48(C-5’),69.47(C-32), 69.18(C-29),66.10(C-6’),57.24(C-14),56.83(C-15), 52.60(C-2’),50.68(C-7),42.96(C-21),40.40(C-12), 40.22(C-22),38.89(C-4),37.61(C-3),37.25(C-5),36.97(C-20), 36.51(C-18),32.61(C-10),32.48(C-8),28.98(C-16), 28.73(C-23),28.52(C-1),24.97(C-17),24.63(C-21), 23.72(C-8’),23.42(C-25),23.17(C-24),21.74(C-11), 19.80(C-27),19.43(C-19),12.47(C-26)。相关谱图见附图7-10。

对比例1CHS-C8-GalNAc的酶促合成

GalNAc 0.4mmol，CHS-SE 0.8mmol，Lipozyme TL IM脂肪酶100 mg，丙酮50mL加入具塞锥形瓶中，置于空气浴摇床中45℃，250 r/min反应24h。反应结束后，取反应液抽滤除去酶，滤液真空旋干后加入适量醋酸乙酯，0℃静置24h重结晶，即得白色固体产物 CHS-C8-GalNAc 0.282g(0.365mmol)，产率为91.1％。

CHS-C8-GalNAc结构式如下：

对比例2酶促合成CHS-C8-Lac

D-乳糖醇0.4mmol，CHS-SE 1.5mmol，Novozym 435 228mg，吡啶-丙酮(2∶1)21mL，加入具塞锥形瓶中，置于空气浴摇床中 55℃，250r/min反应31.1h。反应结束后，取反应液抽滤除去酶，滤液真空旋干后加入适量异辛烷，0℃静置24h重结晶，即得白色固体产物CHS-C8-LA 0.341g(0.380mmol)，产率为94.3％。

CHS-C8-Lac结构式如下：

对比例3酶促合成CHS-C8-Gal

Gal 0.4mmol，CHS-SE 0.8mmol，Novozym 435 100mg，丙酮 50mL，加入具塞锥形瓶中，置于空气浴摇床中45℃，250r/mim反应24h。反应结束后，取反应液抽滤除去酶，取反应液抽滤除去酶，滤液真空旋干后加入适量醋酸乙酯，0℃静置24h重结晶，即得白色固体产物CHS-C8-Gal 0.271g(0.37mmol)，产率为92.1％。

CHS-C8-Gal结构式如下：

实施例3载药系统脂质体的制备

3.1阿霉素脂质体的制备

阿霉素脂质体的制备采用梯度载药法^[18]。将HSPC、CHS按一定比例混合(见表1)，溶于氯仿中，置于55℃水浴旋转蒸发仪中，挥干氯仿至瓶内壁上形成一层脂质薄膜，置真空干燥器内干燥过夜(12 h)，然后加入硫酸铵溶液(300mmol/L)水化，55℃缓慢搅拌，孵育1h，然后用高压挤出器过0.1、0.05μm聚碳酸酯膜各10次，即得空白脂质体。然后将空白脂质体过Sephadex G-50柱除去未包封的硫酸铵，最后加入DOX溶液，65℃孵育1h即得载DOX普通脂质体(CL-LP DOX)。

表1普通脂阿霉素质体配方

组分	摩尔质量
		HSPC	0.05mmol
CHS	0.05mmol
		DOX	0.0034mmol

配体脂质体的制备采用上述工艺，在脂质材料中分别加入一定比例的CHS-C8-GalNAc、CHS-C8-Gal、CHS-C8-Lac、CHS-DIO-GalNAc分别得到阿霉素配体脂质体：GalNAc-LPDOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、 GalNAc-DIO-LP DOX。

表2靶向阿霉素脂质体配方

组分	摩尔质量
		HSPC	0.05mmol
CHS	0.045mmol
		DOX	0.0034mmol
靶向材料	0.005mmol

采用上述工艺，在脂质材料中加入一定比例DSPG-Na制得阴离子脂质体：CL-LPDOX^(-)、GalNAc-LP DOX^(-)、Gal-LP DOX^(-)、Lac-LP DOX^(-)、 GalNAc-DIO-LP DOX^(-)。

表3靶向阴离子阿霉素脂质体配方

组分	摩尔质量
		HSPC	0.05mmol
CHS	0.045mmol
		DOX	0.0034mmol
靶向材料	0.005mmol
		DSPG-Na	0.01mmol

实施例4脂质体的表征

4.1脂质体粒径及Zeta电位测量

分别取上述脂质体溶液100μL，用生理盐水稀释至2mL，混合均匀，采用激光散射粒径测定仪对其粒径分布、Zeta电位、聚合物分散性指数(polymer dispersity index，PDI)进行分析。实验数据均表示为

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，各组间的粒径、PDI和Zeta电位的均数比较采用方差分析。结果见表4。

表4脂质体表征(

n＝3)

(-)表示含有DSPG-Na的阴离子脂质体。泄漏率＜3％

**表示GalNAc-DIO-LP DOX组粒径与GalNAc-LP DOX组有显著差异(P<0.01)；***表示CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX ZETA电位值与各组加入DSPG-Na后ZETA电位值相比有极显著差异(P<0.001)。

4.2脂质体形态表征

通过负染透射电镜技术观察脂质体的形貌。吸取样品滴于铜网上，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，然后滴加磷钨酸(3％, pH7.0)于铜网，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余染液，最后滴加纯水于铜网，用滤纸从铜网边缘吸取多余水，待干后即可用于电镜观察。结果如附图11所示(图C中箭头标示为包载于脂质体内部的DOX。 A:×2500，bar200nm；B：×5000，bar 100nm；C：×10000，bar 50nm；D：×25000，bar 20nm。)

如图所示，脂质体外观圆整，边缘清晰，粒径大小介于60～80nm 之间，且粒径分布均一，与激光散射粒径测定仪测定结果基本吻合。装载于脂质体内水相的DOX呈类似咖啡豆状的白色胶状物。

4.3脂质体包封率的测定

DOX含量采用HPLC法测定。色谱柱为XBridge Peptide BEH C₁₈ (250mm×4.6mm，5μm，Waters公司)；流动相为甲醇-乙腈-水- 冰醋酸(30∶20∶50∶0.25)；体积流量1.0mL/min；检测激发波长为470nm，发射波长为580nm。以柔红霉素为内标，进样量10μL，测定峰面积，内标法计算样品中DOX的含量。

阿霉素脂质体包封率测定采用超滤法。平行取脂质体混悬液0.4 mL 3份，分别装入1mL超滤离心管上层，放入离心机中以6 000r/min 离心30min，分别测量脂质体混悬液及超滤管中下层滤液中DOX的质量浓度，计算脂质体混悬液中总DOX质量([DOX]_total)及未包封的 DOX质量([DOX]_suspernatant)，按下列公式计算脂质体包封率。为验证超滤管中游离DOX能否完全透过超滤膜而不被截留，称取适量DOX溶于水中制备游离DOX溶液([DOX]_{total free})，其质量浓度为脂质体混悬液总DOX质量浓度的1％。将上述DOX溶液加入超滤管中以6 000r/min 离心30min，取下层滤液测定DOX浓度([DOX]_{transmissivity})，按公式计算DOX透过率。结果显示超滤离心管对游离DOX截留率为＜5％，RSD 为1.58％(n＝3)，说明超滤法可用于阿霉素脂质体包封率的测定。

包封率＝([DOX]_total－[DOX]_suspernatant)/[DOX]_total

透过率＝[DOX]_{transmissivity}/[DOX]_{total free}

泄漏率＝[DOX]_{24h透析介质中药量}/[DOX]_{透析前脂质体包封药量}阿霉素脂质体的渗漏率采用透析法测定。平行取脂质体混悬液0.2mL 3份，分别装入透析袋中，密封两端，放入盛有100mL磷酸缓冲液 (pH 7.4)烧杯中，以37℃缓慢搅拌24h。在规定的时间间隔取样测定透析液中DOX质量浓度。脂质体的包封率及泄漏率结果见表4。

实施例5脂质体在小鼠体内药动学和组织分布实验

5.1样品处理方法 血浆样品和肝组织样品预处方法如下：取0.8 mL盐酸乙醇溶液(0.3mol/L HCL)和0.1mL柔红霉素溶液(5μg/mL) 加入到0.1mL血浆中，超声混匀，于暗处4℃放置30min，然后 10 000r/min离心5min，取上清液进高效液相按实施例4.3项下方法测定DOX含量。组织样品洗净血液后，吸干水分，精密称定质量，按组织质量的2倍量加入生理盐水匀浆，取0.1mL组织匀浆液按上述血浆样品处理方法处理。

5.2实验操作 取KM小鼠，给药前12h禁食不禁水，将小鼠随机分为组。每只小鼠按10mg/kg剂量(以磷脂质量计)尾iv给药。抑制实验组于给药前1min注射asialofetuin(50mg/kg)。每组6只小鼠分别于给药后按一定时间间隔眼内眦取血至肝素化的EP管中，并处死，解剖，取心、肝、脾、肺、肾等器官。取血0.5mL，4 000r/min 离心10min，分取血浆，于-20℃保存待测。

5.3不同配体类型对脂质体组织分布的测定结果

为考察不同半乳配体修饰脂质体在小鼠体内组织分布特征，尾静脉注射CL-LPDOX、GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、 GalNAc-DIO-LP DOX后30min血药浓度及肝药浓度见附图12-13。

结果显示，Gal-LP DOX、Lac-LP DOX与CL-LP DOX组血药浓度并无显著差异(P>0.5)，30min缓慢下降至(80％-90％)。与CL-LP DOX 相比，GalNAc-DIO-LP DOX在血液中清除最快，30min血药浓度下降到初始值的50％(P<0.001)，并在肝组织中快速蓄集，30min肝药浓度达42.45％，显著高于其他组(P<0.001)。其次为Lac-LP DOX 组，30min血药浓度下降到初始值的60％(P<0.001)，但在肝药浓度仅为16.51％，但显著高于CL-LP DOX组(P<0.001)。GalNAc-LP DOX组虽然在血液中清除较慢，但肝药浓度显著高于CL-LP DOX组(P <0.001)。

预先注射ASGPR抑制剂asialofetuin对各组血药浓度并无显著改变(P>0.5)，但极大减少了GalNAc-DIO-LP DOX在肝组织的蓄积量 (42.45％→8.23％)(P<0.001)，并显著减少了GalNAc-LP DOX在肝组织的蓄积量(16.51％→10.09％)(P<0.001)，其余各组肝组织蓄积量无显著改变(P>0.5)。

对比HSPC、CHS、CHS-C8-Gal、CHS-C8-GalNAc、CHS-C8-Lac及 CHS-DIO-GalNAc在脂质体双分子膜层的位置如附图17所示。

5.4DSPG Na负电荷磷脂对脂质体组织分布的测定结果

为考察不同半乳配体修饰脂质体在小鼠体内组织分布特征，尾静脉注射CL-LPDOX^(-)、GalNAc-LP DOX^(-)、Gal-LP DOX^(-)、Lac-LP DOX^(-)、 GalNAc-DIO-LP DOX^(-)后30min血药浓度及肝药浓度见附图14-15。

从附图14、15显示的实验结果可知，CL-LP DOX在掺入DSPG Na 后，没有显著改变其在体内的分布特征(P>0.99)。GalNAc-LP DOX、 Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LPDOX在掺入一定比例的DSPG Na，不同程度改变了在血液及肝组织的分布特征。首先，DSPGNa显著加快了GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX在血液中的清除速率，30min血药浓度改变分别为：

81.13％→32.29％(48.84％)，81.08％→49.05％(32.03％)， 59.20％→19.42％(39.78％)，49.74％→11.92％(37.82％)(P＜0.001)。其次DSPG Na显著增加了肝脏对GalNAc-LP DOX、Gal-LP DOX、Lac-LP DOX、GalNAc-DIO-LP DOX的摄取率(P<0.01)，30min肝药浓度改变分别为：17.50％→63.20％(45.70％)，10.74％→36.31％(25.57％)， 16.51％→56.24％(39.73％)，42.45％→75.39％(32.94％)。

5.5脂质体药动学及组织分布的药物浓度-时间曲线

CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX及GalNAc-DIO-LP DOX经小鼠尾静注后，体内血药和肝药随时间变化情况。实验数据及图形采用 GraphPad Prism7.0软件进行处理。多样本均数比较采用Tukey's检验，P＜0.05表示显著性检验水平。结果见附图16。

由结果可知静注给药后GalNAc-DIO-LP DOX血药浓度急剧下降，说明脂质体快速从血液中清除，与此同时GalNAc-DIO-LP DOX在肝脏中快速蓄积，1.5h肝药浓度达到极大值，为初始给药剂量的63.7％。而CL-LP DOX与GalNAc-LP DOX在注射给药，在血液中清除速率和在肝脏的蓄积速率相对缓慢。

5.6肝清除率测定结果

肝清除率计算：肝组织分布数据评估采用组织分布清除率计算方法。组织摄取率采用下列方程计算：

这里X_t表示时间为t时组织所含脂质体总量，CL_uptake表示组织摄取清除率，C_b表示血药浓度。对方程(1)进行积分，得方程(2)：

X_t＝CL_uptake×AUC_(0-t)……(2)

这里AUC_(0-t)表示0-t时间内血液中药时曲线下面积。因此CL_uptake可由X_t与AUC_(0-t)所得方程的斜率得到。

为比较CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX及GalNAc-DIO-LP DOX在肝脏的分布特征，我们选取15min作为计算CL_uptake的时间截点，以忽略脂质体代谢引起的偏差。由表2可知，GalNAc-DIO-LP DOX的AUC小于 CL-LP DOX和GalNAc-LP DOX，而GalNAc-DIO-LP DOX的CL_uptake高于CL-LP DOX、GalNAc-LP DOX，分别是其的3.7倍和2.5倍。

表6不同脂质体药时曲下面积与肝清除率

*AUC和CL计算时限为注射给药后15min内。

GalNAc-DIO-LP DOX注射后约69％的给药剂量在1.5h内从血液中清除，与此同时约63％的给药剂量在肝脏蓄积，是GalNAc-LP DOX 的3.1倍，CL-LP DOX的4倍。我们还考察了三种类型脂质体的在肝脏中的清除速率CL_uptake，结果显示GalNAc-DIO-LP DOX的CL_uptake显著高于其余两种脂质体，说明脂质体经CHS-DIO-GalNAc修饰后，显示出高效的肝靶向效率。

Claims (6)

1.一种肝靶向糖配体分子，其特征在于，结构如下所示：

2.一种含有权利要求1所述糖配体分子的纳米载药系统，所述载药系统优选为脂质体。

3.如权利要求2所述的纳米载药系统，所述脂质体配方如下：

组分 摩尔质量 磷脂 0.01-0.1mmol 胆固醇 0.01-0.1mmol 药物 0.001-0.01mmol 糖配体分子 0.001-0.01mmol

。

4.如权利要求3所述的纳米载药系统，所述脂质体含有电荷磷脂。

5.如权利要求4所述的纳米载药系统，所述电荷磷脂为负电荷磷脂。

6.一种如权利要求1所述的肝靶向糖配体分子或根据权利要求2-5任一项所述的纳米载药系统中的糖配体分子的酶促合成方法，包括如下步骤：采用生物酶1作为催化剂，将中间体1，3,6-二氧杂-(辛二酸二乙烯基酯)和胆固醇进行酯化偶联生成中间体2，然后用生物酶2作为催化剂将中间体2与GalNAc进行酯化偶联即得。

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