CN109796445B - 一种吲哚美辛二聚体前药及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种吲哚美辛二聚体前药，其结构如式Ⅱ所示：

上述吲哚美辛二聚体前药的合成路线如下：

吲哚美辛二聚体前药的制备方法是以式Ⅲ所示化合物为起始原料，骈合两分子吲哚美辛得到二聚体前药，同时，本发明将上述公开的吲哚美辛二聚体前药应用在制备小分子前药抗肿瘤纳米载体，通过本发明公开的技术方案不仅提供了一种吲哚美辛二聚体前药，且上述二聚体前药与阿霉素制备成载药粒子，表现出显著的生物活性，具体表现在可控释放药物，通过引入化疗增敏剂吲哚美辛，抑制MRP1表达，显著提高了化疗疗效。

Description

一种吲哚美辛二聚体前药及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于前药载体和药物缓控释放技术领域，具体涉及的是一种吲哚美辛二聚体前药及其制备方法和应用。

背景技术

近几十年里来，药物化疗一直是临床治疗癌症的主要方法之一。然而，在传统的给药方式中，如静脉注射、口服给药，小分子药物往往代谢快、半衰期短，不能有效富集在肿瘤部位，导致一个低效的治疗效果。此外，长期服用某种抗肿瘤药物，也会促使肿瘤细胞产生多药耐药性，这将是药物化疗失去作用。进一步地，大多数的抗癌药物分子对肿瘤细胞和机体正常细胞无选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会对机体带来严重的毒副作用。

针对以上缺点，近年来，多种剂型的纳米药物传递系统被开发出来，如胶束、脂质体、纳米粒子等。这些纳米载体能够提高药物的稳定性、增强药物在体内的循环时间、降低药物的毒副作用、靶向性富集在肿瘤部位等，最终导致一个增强的抗肿瘤疗效。然而，纳米载体成功用于临床的仍然较少，主要是由于其缓慢、不彻底的药物释放，不能有效地克服临床肿瘤多药耐药性的发生以及制备繁琐、成本较高。

研究发现，肿瘤部位微环境与正常组织存在很大差异，如过表达的酶、不同的pH梯度以及EPR效应的存在。通过这些差异，可以在纳米载体中引入刺激响应性的化学组分，如原酸酯、二硫键等，从而有效的控制抗肿瘤药物的释放。

此外，一些抗肿瘤增敏剂如二甲双胍、吲哚美辛、维拉帕米等能够有效抑制肿瘤细胞内耐药蛋白的表达以及药物外排泵的功能，将其与抗肿瘤药物联用能够有效地克服肿瘤细胞的多药耐药性，增强化疗疗效。因此，可以通过简单、易行的结构设计，将pH刺激响应与克服多药耐药结合，得到一种全新的多功能的纳米药物载体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种吲哚美辛二聚体前药及其制备方法和应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

一种吲哚美辛二聚体前药，吲哚美辛二聚体前药的结构如式Ⅱ所示：

本发明同时公开上述吲哚美辛二聚体前药的制备方法，吲哚美辛二聚体前药的合成路线如下：

上述吲哚美辛二聚体前药的制备方法如下：

将如式Ⅲ所示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、式Ⅰ所示的吲哚美辛、EDCI、NHS、和三乙胺加入至反应器中，加入DMSO作为溶剂，通氮气保护条件下，室温搅拌48h后，反应液采用透析袋透析，透析液为去离子水，透析之后，冷冻干燥得到如式Ⅱ所示吲哚美辛二聚体前药的粗品产物，粗产物经柱层析分离后得到如式Ⅱ吲哚美辛二聚体前药。

优选地，所述式Ⅲ所示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、式Ⅰ所示的吲哚美辛、EDCI、NHS、和三乙胺添加量的摩尔比为1:2.5:5:2.5:1。

优选地，所述透析袋为截留分子量500Da的透析袋。

优选地，所述透析液为pH8.0的去离子水。

本发明同时公开采用上述吲哚美辛二聚体前药在制备小分子前药抗肿瘤纳米载体中的应用，所述小分子前药抗肿瘤纳米载体包括如式Ⅱ所示吲哚美辛二聚体前药以及抗肿瘤药物。

优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明公开一种吲哚美辛二聚体前药的制备方法，按照药物骈合原来设计以示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)为底物，骈合两分子吲哚美辛后得到吲哚美辛二聚体前药。本发明公开的吲哚美辛二聚体前药分子中，通过引入引入pH敏感的原酸酯化学键(式Ⅲ所示化合物)，可控释放药物，通过引入化疗增敏剂吲哚美辛，抑制MRP1表达，显著提高了化疗疗效。

附图说明

图1是本发明实施例2中吲哚美辛二聚体前药的氢谱图；

图2是本发明实施例2中吲哚美辛二聚体前药的碳谱图；

图3a是本发明实施例3中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子粒径及分布图；

图3b是本发明实施例3中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子扫描电镜图；

图3c是本发明实施例3中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子透射电镜图；

图4a是本发明实施例4中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液降解的核磁检测谱图；

图4b 是本发明实施例4中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液降解速率统计结果图；

图5a是本发明实施例5中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液降解粒径变化图；

图5b是本发明实施例5中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液动态浓度变化图；

图5c是本发明实施例5中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液在pH5.0缓冲液中降解形貌变化图；

图6是本发明实施例7中吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子乳液体外释放阿霉素药物结果图；

图7a是本发明实施例8中人乳腺癌细胞(MCF-7)定性摄取结果图；

图7b是本发明实施例8中人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)定性摄取结果图；

图8a为本发明实施例9中吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药纳米粒子对人乳腺癌细胞(MCF-7)毒性检测结果图；

图8b为本发明实施例9中吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药纳米粒子对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)毒性检测结果图；

图8c为本发明实施例9中阿霉素、阿霉素+吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子对人乳腺癌细胞(MCF-7)毒性检测结果图；

图8d为本发明实施例9中阿霉素、阿霉素+吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)毒性检测结果图；

图9a为本发明实施例10中人乳腺癌细胞(MCF-7)中MRP1蛋白表达结果图；

图9b为本发明实施例10中人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)中MRP1 蛋白表达结果图；

图中，空白表示吲哚美辛二聚体前药纳米粒子，载药粒子表示吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种吲哚美辛二聚体前药，吲哚美辛二聚体前药的结构如式Ⅱ所示：

实施例2

吲哚美辛二聚体前药的制备：

吲哚美辛二聚体前药的合成路线如下：

吲哚美辛二聚体前药的制备方法如下：

依次向100mL的反应瓶中加入如式Ⅰ所示的吲哚美辛(5.0g，14mmol)、 EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(5.4g，28mmol)，NHS(N- 羟基琥珀酰亚胺)(1.65g，14.3mmol)，(0.5g，5.59mmol)三乙胺，再加入30 mL的二甲基亚砜作溶剂，通氮气避光反应4h后；再加入如式Ⅲ所示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)(1.73g，5.61mmol)，继续避光搅拌反应 48h。

反应结束后，用截留分子量500Da的透析袋透析，透析液为pH8.0的去离子水，之后冷冻干燥得到粗产物偶联体，然后将粗产物以葡聚糖凝胶柱 Sepandex-LH20(以二氯甲烷：甲醇2:1为洗脱剂)分离得到吲哚美辛二聚体前药，产率72.1％。

吲哚美辛二聚体前药的结构表征如下：

¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ(ppm):2.95(s,6H,CH₃-O-C),3.19–3.43(m,8H, NH-CH₂-CH₂,CH-CH₂-O),3.47–3.64(m,8H,CH₂-O-CH,CH-CH₂-O),3.82(s,6H, C-O-CH₃),3.88–4.41(m,6H,CH-O-CH₂,CH₂-CH-O),5.79–5.84(d,2H,CH(O)₃), 6.65–6.71(m,2H,CH-CH-C),6.83–6.94(m,4H,C-CH-CH,C-CH-C),7.41–7.49(d, 4HCH-CH-C,C-CH-CH)7.65–7.72(d,4H,C-CH-CH,CH-CH-C)。

吲哚美辛二聚体前药的氢谱如图1所示。

¹³CNMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm):13.36,32.36,40.89,55.87,64.21,66.11,71.42,74.41,101.04,111.36,112.38,113.02,115.06,128.63,128.88,129.45,130.67,130.93,131.3,133.69,136.41,139.65,156.47,168.26,170.11。

吲哚美辛二聚体前药的碳谱如图2所示。

实施例3

吲哚美辛二聚体前药纳米粒子的制备及粒径与电镜观察：

将30mg的吲哚美辛二聚体前药加入到0.5mL的二氯甲烷中充分溶解后，在涡旋的条件下加入到1.0mL的5％的聚乙烯醇(PVA，Mn＝13,000-23,000)溶液中，然后立即用细胞破碎仪仪超声(3次，每次10s，间隔5s，功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的PVA溶液中，搅拌3h，使二氯甲烷完全挥发，离心获取纳米粒子，即为吲哚美辛二聚体前药纳米粒子。

将吲哚美辛二聚体前药纳米粒子分散在0.01MpH8.0的PB缓冲液中，取 1mL吲哚美辛纳米粒子乳液，稀释适当成浓度，在室温下用DLS测其粒径及分布，粒径及分布如图3a所示。

由图3a可知：制备的吲哚美辛二聚体前药纳米粒子的尺寸约在160nm，分散性良好。

取一滴稀释后的吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液(约20μL)，滴加到铜网上，烘干，使用透射电镜和扫描电镜对其形貌进行观察，扫描电镜如图3b所示，透射电镜如图3c所示。

由图3b和图3c可知：吲哚美辛二聚体前药纳米粒子呈现规整的球形形貌。

实施例4

吲哚美辛二聚体前药纳米粒子核磁跟踪降解：

将实施例3中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液等分成10份，在10000rpm 下离心10min，其中5份用0.01M，pH7.4的PB缓冲液在EP管中分散，另外 5份用0.01MpH5.0的PB缓冲液在EP管中分散。将EP管置于摇床晃动(100 rpm),在设定的时间点，两种不同缓冲液分散的粒子各取一管，冷冻干燥。之后，以氘代DMSO溶解冻干样品，进行核磁检测，核磁检测谱图如图4a所示，降解速率统计如图4b所示。

由图4a和图4b可知：吲哚美辛前药纳米粒子在中性环境中相对比较稳定，而在弱酸条件下，原酸酯水解，酸处理24h后，原酸酯基本被完全降解。

实施例5

吲哚美辛二聚体前药纳米粒子粒径与形貌降解：

将实施例3中吲哚美辛二聚体前药纳米粒子乳液分别分散在pH7.4和5.0 的PB缓冲液中，再设定的时间点使用DLS测其粒径变化。对纳米粒子降解起始、降解过程中及彻底降解后的产物使用透射电镜进行形貌观察，降解粒径变化如图5a所示，动态浓度变化如图5b所示，pH5.0缓冲液中降解形貌变化如图 5c所示。

由图5a、图5b、图5c可知：在pH7.4时，纳米粒子的尺寸及浓度基本无变化，而在pH5.0时，由于粒子内部原酸酯的断裂，纳米粒子逐渐溶胀，体积先增大，然后分解成碎片。同时可以发现，随着降解时间的延长，纳米粒子的浓度呈持续下降的趋势。

实施例6

包载阿霉素的纳米药物载体的制备：

将5mg阿霉素与30mg吲哚美辛二聚体前药共溶在1mL二氯甲烷中，在涡旋的条件下加入到1.0mL的5％的聚乙烯醇(PVA，Mn＝13,000-23,000)溶液中，然后立即用细胞破碎仪仪超声(3次，每次10s，间隔5s，功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的PVA溶液中，搅拌3h，使二氯甲烷完全挥发后，得到载药纳米粒子，即为吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子。载药量和包封率如表1所示：

表1

载药量和包封率的计算公式如下：

载药量(％)＝吲哚美辛二聚体前药载药粒子中阿霉素的质量/载药粒子的质量×100％；

包封率(％)＝吲哚美辛二聚体前药载药粒子中阿霉素的质量/投入总阿霉素的质量×100％。

由表1推测可知：由于疏水作用和π-π堆积作用，二聚体载药粒子具备较高的载药率，表面呈现负电荷，分散性较好。

实施例7

吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子的体外药物释放检测：

取1mL吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子乳液(药物浓度为500μg/ml)，置于截留分子量为8-14kD的透析袋中，两端用棉线扎紧，放入到50mL的EP 管中，加入5mL不同pH的缓冲液。在37℃，100rpm条件下振荡，在设定的时间间隔如0.5h、1h、2h、4h、6h.....12h、36h，吸出旧缓冲液并储存，加入新的缓冲液，每个样品设置三个平行组。最后检测缓冲液中的阿霉素浓度，计算累积阿霉素释放量，结果如图6所示。

由图6可知：在弱酸环境中，由于原酸酯的断裂，24h时就有70％作用的药物被释放，48h到达90％。而在中性环境中，只有不足15％的药物被释放，从而说明了制备的载药粒子具备很好的pH响应性能力。

实施例8

吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子细胞定性摄取：

将人乳腺癌细胞(MCF-7)或人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)加入到细胞培养皿中，培养24h，允许细胞贴壁。之后，吸去旧培养基，加入1.8mL 新鲜培养基，以及0.2mL游离阿霉素、游离阿霉素+吲哚美辛和吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子(阿霉素终浓度为4μg/mL)。

共培养两小时后，吸去旧培养基，加入2mL新鲜培养基继续培养4h。最后，去除培养基，用PBS清洗两次，4％多聚甲醛液固定细胞(5min)，PBS 清洗两次，DAPI染核试剂染细胞核(5min)，PBS再次清洗两次，然后用激光共聚焦显微镜观察。人乳腺癌细胞定性摄取结果如图7a所示，人乳腺癌耐阿霉素细胞定性摄取结果如图7b所示。

由图7a和图7b可知：在乳腺癌细胞中，游离阿霉素和载药粒子均能在细胞中发现很强的药物荧光信号。在耐药细胞中，游离阿霉素的信号明显降低，当添加游离吲哚美辛后，阿霉素的信号又明显提高，特别是吲哚美辛前药载药纳米粒子呈现更强的药物荧光信号。

实施例9

细胞毒性检测：

将人乳腺癌细胞(MCF-7)或人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)加入到96孔板中，每孔细胞约在5,000个，培养24h后，去除培养基，加入180μL 的新鲜培养基，20μL的自由吲哚美辛或者吲哚美辛二聚体前药纳米粒子(吲哚美辛浓度从1-500μg/mL)以及自由阿霉素、游离阿霉素+吲哚美辛或者吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子(阿霉素浓度从0.5-10μg/mL)。

共培养两小时后，吸去旧培养基，加入200μL新鲜培养基，继续培养24h。之后，去除培养基，加入180μL的新鲜培养基和20μLMTT(5mg/mL)共培养4h后。最后，去除培养基，加入150μL的DMSO，震荡10min后，在570nm 波长下检测活细胞产生的结晶紫吸光度，计算细胞存活率，结果如图8a、图8b、图8c、图8d所示。

其中，图8a为吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药纳米粒子对人乳腺癌细胞(MCF-7)毒性检测结果图；

图8b为吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药纳米粒子对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)毒性检测结果图；

由图8a和图8b可以发现，吲哚美辛及其二聚体前药纳米粒子在高浓度时，两种细胞的存活率均在90％以上，表现出良好的生物相容性。

图8c为阿霉素、阿霉素+吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子对人乳腺癌细胞(MCF-7)毒性检测结果图；

由图8c可以发现，随着药物浓度的提高，MCF-7细胞的存活率逐渐降低。此外，联合使用吲哚美辛将导致更强的细胞杀伤作用。

图8d为阿霉素、阿霉素+吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子对人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)毒性检测结果图。

由图8d可知：由于药物外排泵的存在，大量药物被排出细胞，导致游离阿霉素在细胞中呈现较低的细胞毒性。然而，阿霉素+吲哚美辛及吲哚美辛二聚体前药载药纳米粒子呈现出较强的细胞杀伤性，这是由于吲哚美辛可以降低药物外排，提高阿霉素在细胞中的毒性。

实施例10

吲哚美辛二聚体前药纳米粒子调控MRP1蛋白表达：

将人乳腺癌细胞(MCF-7)或人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)加入细胞培养皿中，细胞贴壁后，去除培养基，加入1.8mL的新鲜培养基，0.2mL 的游离吲哚美辛或者吲哚美辛二聚体前药纳米粒子(吲哚美辛终浓度为100 μg/mL)。共培养两小时后，去除培养基，加入2mL的新鲜培养基继续培养12h。之后，用PBS清洗三次，4％的多聚甲醛固定细胞，滴加正常山羊血清，室温封闭30min。

吸去封闭液，再在皿上滴加足够量的稀释的MRP1(1:100)一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。之后，加入Cy3标记的二抗，并孵化1h，滴加DAPI避光染细胞核5min。再用PBS清洗三次，用吸水纸吸干爬片上的液体，最后滴加含抗荧光淬灭剂的封片液封片，使用激光共聚焦显微镜观察，结果如图9a、图9b所示。

其中，图9a人乳腺癌细胞(MCF-7)中MRP1蛋白表达结果图；图9b为人乳腺癌耐阿霉素细胞(MCF-7/ADR)中MRP1蛋白表达结果图。

由图9a和图9b可知：药物外排蛋白MRP1在MCF-7细胞中低表达，而在耐药细胞MCF-7/ADR中高表达。此外，吲哚美辛二聚体纳米粒子能明显降低 MRP1在细胞中的表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种吲哚美辛二聚体前药，其特征在于，吲哚美辛二聚体前药的结构如式Ⅱ所示：

2.一种如权利要求1所述的吲哚美辛二聚体前药的制备方法，其特征在于，所述吲哚美辛二聚体前药的合成路线如下：

3.根据权利要求2所述的吲哚美辛二聚体前药的制备方法，其特征在于，所述吲哚美辛二聚体前药的制备方法如下：

将如式Ⅲ所示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、式Ⅰ所示的吲哚美辛、EDCI、NHS、和三乙胺加入至反应器中，加入DMSO作为溶剂，通氮气保护条件下，室温搅拌48h后，反应液采用透析袋透析，透析液为去离子水，透析之后，冷冻干燥得到如式Ⅱ所示吲哚美辛二聚体前药的粗品产物，粗产物经柱层析分离后得到如式Ⅱ吲哚美辛二聚体前药。

4.根据权利要求3所述的吲哚美辛二聚体前药的制备方法，其特征在于，所述式Ⅲ所示4’-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)、式Ⅰ所示的吲哚美辛、EDCI、NHS和三乙胺添加量的摩尔比为1:2.5:5:2.5:1。

5.根据权利要求3所述的吲哚美辛二聚体前药的制备方法，其特征在于，所述透析袋为截留分子量500Da的透析袋。

6.根据权利要求3所述的吲哚美辛二聚体前药的制备方法，其特征在于，所述透析液为pH8.0的去离子水。

7.一种采用如权利要求1所述的吲哚美辛二聚体前药在制备小分子前药抗肿瘤纳米载体中的应用，其特征在于，所述小分子前药抗肿瘤纳米载体包括如式Ⅱ所示吲哚美辛二聚体前药以及抗肿瘤药物。

8.根据权利要求7所述的吲哚美辛二聚体前药在制备小分子前药抗肿瘤纳米载体中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自阿霉素。

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