CN1911450A

CN1911450A - 一种含d－半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料及其制剂

Info

Publication number: CN1911450A
Application number: CNA2006101217942A
Authority: CN
Inventors: 邓意辉; 吴红兵; 王绍宁; 周新羽
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2007-02-14

Abstract

本发明公开了一种含有半乳糖结构的甲酸酯衍生物的合成及含有该衍生物的制剂，该类衍生物是由甾醇或脂肪醇与含乳糖结构的化合物经二伯胺类化合物的两个氨基经酯化反应制得，可以在反应中加入常规的催化剂，所用的溶剂为除去水的有机溶剂。该衍生物可以对脂质体、乳剂、毫微囊(粒)和胶束等载体进行修饰，提高药物的肝靶向。含有该衍生物的制剂可提高药物的肝脏摄取和降低肾毒性，是一很好的肝靶向辅料。其结构通式如图，式中：R₁为胆固醇、谷甾醇等甾醇或脂肪醇类化合物，R₂为2－10个碳原子的直链或支链烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；聚乙二醇－CH₂ (CH₂OCH₂)_nCH₂－，n＝1－200)；氨基酸烷基酯。

Description

一种含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料及其制剂

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，确切地说是涉及一类含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料及其制剂。

背景技术：

肝细胞癌(HCC)是最普通的恶性原发性肝脏肿瘤，HCC在美国和欧洲的大部分人口中，并不普遍。但在许多亚洲和非洲国家中，是三大致命癌症之一。我国是病毒性肝炎的高发区，平均年发病率为120-140/10万，每年有约28万人死于与肝炎有关的疾病。我国乙肝病毒携带者达1.3亿，乙型肝炎病毒(HBV)感染率高达57.63％，即全国至少有6亿人感染过HBV。HBsAg阳性率9.75％，约有1.2亿人，占全球的1/3；其中约1/4将发展为慢性肝病，部分患者可发展为肝硬化，甚至演变为肝癌。乙型肝炎不仅严重危害我国人民的健康，而且还为国家带来严重的社会经济负担。慢性乙肝的治疗时间长，医疗费用较高，再加不恰当的滥用药物，更加重了额外的经济负担。我国每年用于治疗慢性肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费约300亿元人民币。因此，加强病毒性肝炎的预防；探求慢性肝炎的有效治疗方法，是当前亟待解决的重大课题。

肝脏参与体内消化、排泄、解毒和免疫调节等许多过程，肝细胞主要分为肝实质细胞(parenchymal cell，P)和肝非实质细胞(non-parenchymalcell，NP)。肝实质细胞是肝细胞中最主要的细胞，同时也是受病毒等侵扰的主要细胞，如肝炎及肝癌主要发生在肝实质细胞。去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotei recepters，ASGPR)是肝实质细胞膜上所特有的一种高效内吞受体，能够专一性识别分子末端带有半乳糖残基的糖蛋白并与之结合，复合物发生微观簇集，内陷化后被吞入溶酶体，释出药物。去唾液酸糖蛋白受体并不被降解，重新被转运到细胞膜上，参与下一轮循环。可利用此作用以半乳糖残基的糖蛋白(Gal-HSA)为载体，研制肝靶向药物。

目前尚无一种能迅速、直接清除乙肝病毒的药物。目前最好的抗病毒药物的疗效也仅能达到50％左右。介入治疗疗效虽好，但需在X线、CT和超声设备的导向下，利用特定的器械进行治疗的技术。而通过能与去唾液酸糖蛋白受体特异结合的含半乳糖基肝靶向辅料给药载体，则可能清除肝内全部的病毒和大大提高基因转移效率，并降低药物毒副作用、避免手术痛苦。

乳糖酸含D-半乳糖端基，还含有反应活泼基团-COOH，易与其它化合物反应生成肝靶向辅料。国内外有许多学者以半乳糖或乳糖为起始物，将半乳糖残基与治疗药物(包括蛋白或多肽类)或载体材料相偶联，制备肝靶向载体。Takenaga等以乳糖内酯与α-干扰素在0.1％十二烷基硫酸钠缓冲液中反应，制得产物应用于人体羊膜/sindbis病毒系统，使药物浓度维持55.1％-82.4％，并在小鼠实验中显示出很强的肝靶向定位性。(Takenaga M，Sakurai K，Igarashi R，et al.Can PatAppl，CA，130，230；CA，123：144661)。杨今祥等合成了含氧乙基的半乳糖衍生物Galβ₁-(CH2-CH2-O)3-C14H29，用其修饰斑蝥素脂质体。通过药理实验表明半乳糖修饰的斑蝥素脂质体对活性肝脏的靶向功能明显优于斑蝥素普通脂质体，两者在肝内蓄留量最大可相差2.6倍，且滞留时间显著延长。而且乙氧基可以增强肝半乳糖受体与一些半乳糖衍生物修饰的脂质体的结合能力。(Hisachi Yoshioka.J Pham Sci，1993，82：273)。Mitsuru Hashida等将IME-半乳糖甙与胆固醇反应，合成胆甾烯-5-氧基-N-[4-[[1-亚胺基-2-β-D-硫代半乳糖乙基]氨基]丁基]甲酰胺(Gal-C4-Chol)；并用此材料制备肝靶向脂质体，结果发现含Gal-C4-Chol的肝靶向脂质体在肝实质细胞和非实质细胞中分布比是15.1，而普通脂质体在肝实质细胞和非实质细胞中分布比是1.1。(Kawakami S，Munakata C，Fumoto S，et al.Novel galactosylated liposomes for hepatocyte-selectivetargeting of lipophilic drugs.J Pharm Sci，2001，90(2)：105-113.)。王绍宁等用乳糖酸、琥珀酸酐和胆固醇为原料，合成了(5-胆甾烯-3β-氧基)4-氧代-4-[2-乳糖酰胺基乙氨基]丁酸酯，并将此新型肝靶向辅料制备肝靶向阿霉素脂质体，发现10％的半乳糖化脂质体的阿霉素肝靶向效率(Te)是普通脂质体的3.25倍，且在肝实质细胞和非实质细胞中分布比是普通脂质体分布比的6.77倍(Shaoning Wang，Yingkun Qiu，Hui Xu，et al.Chi Chem Letter，2006，17(2)：173～176.)。Fujita T将超氧化物岐化酶(SOD)用半乳糖修饰后(Gal-SOD)，可靶向于肝实质细胞，并且显示出优于普通SOD的抗肝缺血再灌注损伤的能力(Nishikawa M，Tamakic，et al.J Pharmcol Exp Ther，1992，263(3)：971-978.)。

以半乳糖或乳糖作反应原料，需先活化羟基以提高反应程度，且对非反应的羟基需进行保护，故反应比较复杂，产率低。乳糖酸含半乳糖端基，同时含有反应活泼基团-羧基，易与其它化合物发生酰化反应。

发明内容：

本发明的目的是提供一种含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料，并应用于给药载体中，以实现肝靶向的需要。本发明的目的是通过以下方案实现的，它以乳糖酸、二元胺和甾醇或脂肪醇的氯甲酯为原料制成，其特征在于，结构通式如下：

式中：

R₁为胆固醇、谷甾醇等甾醇或脂肪醇类化合物。

R₂为2-10个碳原子的直链或支链烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；聚乙二醇-CH₂(CH₂OCH₂)_nCH₂-，n＝1-200)；氨基酸烷基酯(芳基酯)。

为了得到目标化合物采取了以下措施：

1、合成(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯(以乙二胺和胆固醇氯甲酯为例)，

再与乳糖酸内酯反应得到目标化合物

胆固醇氯甲酯用二氯甲烷溶解，置加料漏斗中，滴加到过量1-10倍的乙二胺CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得腊状白色固体，即(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯。

取乳糖酸加入甲醇溶解，50℃减压蒸发，除去甲醇，在加入2～10倍体积的乙醇，超声分散后再减压蒸发除去乙醇，重复3～10次后，将其固体置于70～80℃烘箱中放置12～48hr，即得乳糖酸内酯。

乳糖酸内酯加入极性溶剂中溶解，(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯用非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h。取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，冻干，得产物。

2、合成(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯，再与N-(乳糖酰氧基)二酰亚胺反应得到目标化合物

(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯的合成同上。

合成乳糖酸活性酯。将乳糖酸溶于DMF中，冷却至-5℃～-30℃，加入N，N＇-二环己基碳二亚胺，于-10℃～-20℃搅拌反应10～120min，升至-5℃反应5～60min，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，于-5℃搅拌反应0.5～2h，在室温继续搅拌6～36h。将反应混合物滤去二环己基脲，所得滤液蒸干，加入无水乙醇，超声分散后滴加乙醚，析出白色絮状物，再经抽滤，乙醚洗涤，真空干燥，得白色无定形产物。

取乳糖酸活性酯加入极性溶剂中溶解，(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯用非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h。取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，50～90℃减压蒸干，得产物。

其中极性溶剂包括：甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。非极性溶剂包括：二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、四氢呋喃、丙酮、甲苯、二氧六环、乙醚等。

3、先制备脂肪醇氯甲酯，再合成(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯(以乙二胺和二十二烷醇为例)，再与乳糖酸内酯反应得到目标化合物

二十二烷醇加入三氯乙烯溶解，另取三光气溶于2～50倍三氯乙烯和0.1～5倍DMF，在回流下0.5～5h滴加完毕，继续反应2～12h，过滤除去不溶物，减压蒸除过量溶剂，残留物用环己烷萃取回流5～60min，蒸除部分环己烷，趁热过滤除去不溶物，冰水冷却滤液，析出产物粗品，经重结晶得二十二烷醇氯甲酯白色固体。

二十二烷醇氯甲酯用二氯甲烷溶解，置加料漏斗中，滴加到过量1-10倍的乙二胺CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得白色固体，即(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯。

乳糖酸内酯的制备同上。乳糖酸内酯加入极性溶剂中溶解，(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯加非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h。取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，冻干，得产物。

其中极性溶剂包括：甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、三氯乙烯、N-甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。非极性溶剂包括：二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、四氢呋喃、丙酮、甲苯、二氧六环、乙醚等。

利用乳糖酸既有靶向基团—半乳糖基和反应活性基团-羧基的特点，与指肪醇或甾醇经过系列酯化和酰化反应得到一种肝靶向两亲性辅料，脂质端基可用于脂质体、乳剂、纳米粒、微球、纳米囊、胶束等给药载体的靶向。此反应历程短，且避免了某些剧毒试剂如：红磷、溴、氢化钠等的应用；反应得到的辅料含酯键和酰胺键，体内易降解。

本肝靶向辅料可用来修饰脂质体、乳剂、纳米粒、微球、纳米囊和胶束等给药载体，含量可达到脂质成分的0.1-100％(mol％)，用于抗肝癌、肝炎药物的靶向治疗。

附图说明：

图1[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CH-ED-LA)的合成路线

图2阿霉素水溶液(Dox solution)、普通脂质体(Dox-CL)和靶向脂质体(Gal-DOX-L)在小鼠血浆和肝内分布

图3齐多夫定水溶液(AZT solution)、齐多夫定棕榈酸酯普通纳米乳剂(AZTP-NE)和齐多夫定棕榈酸酯靶向纳米乳剂(Gal-AZTP-NE)在小鼠血浆和肝内分布

图4齐多夫定水溶液(AZT solution)、齐多夫定棕榈酸酯普通脂质体(AZTP-CL)和齐多夫定棕榈酸酯靶向脂质体(Gal-AZTPL)在小鼠血浆和肝内分布

具体实施方式：

下面结合实例对本发明做进一步详细的描述

实施例1：[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CH-ED-LA)的合成

通过合成(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯，再与乳糖酸内酯反应得到目标化合物[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CH-ED-LA)。见附图1。

1.乳糖酸内酯的合成

取乳糖酸加入甲醇溶解，50℃减压蒸发，除去甲醇，重复3～4次后，将其固体置于70～80℃烘箱中放置48hr，即得乳糖酸内酯。

2.(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯(I)

取0.45g胆固醇氯甲酯(1mmol)，用60mL CH₂Cl₂溶解，置滴液漏斗中，缓缓加入到含5.84g乙二胺(100mmol)CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得腊状白色固体(I)0.48g，(产率为91.1％)，TLC(二氯甲烷/甲醇＝9∶1)：R_f＝0.2。FTIR(cm^-1)：3339.2，1551.2(NH)，2939.3(环烯CH)，1716.7，1696.8，1276.9，1136.8(NHCOOR)ESI-MS(m/z)：474.1(M+H)⁺，495.3(M+Na)⁺。

3.(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(II)

取乳糖酸内酯0.52g(1.53mmol)，加入二甲基亚砜8mL，40℃水浴下搅拌溶解，逐滴加入二氯甲烷溶解的化合物I溶液(0.48g，1mmol)，再滴加3～5滴三乙胺，然后升温至50℃回流反应36hr。减压除去二氯甲烷，抽滤虑，除去沉淀物，滤液加入2倍体积的蒸馏水，置于透析袋中透析48hr，除去二甲基亚砜和未反应的乳糖酸，将透析液蒸干。再加入二氯甲烷/无水乙醇混合溶剂20mL，超声溶解固体，抽虑除去不溶物，滤液蒸干后，得终产物CH-ED-LA(0.44g，产率53.7％)。TLC(乙酸乙酯/乙醇/水＝6∶4∶1，苯胺/二苯胺/85％磷酸显色剂)，Rf＝0.4。FTIR(cm^-1)：3327.3，1626.1，1576.8(NH)，2939.3(环烯CH)，1696，1245，891.4(NHCOOR)。HPLC-DAD：面积归一化法计算，产物的纯度大于90％。ESI-MS(m/z)：835.5(M+Na)⁺，¹H NMR(C₅D₅N，ppm)：8.13(brt，1H，J＝6.8，-NH)，7.99(brt，2H，J＝6.8，-NH)，5.37(t 1H，H-6)，5.20(d，1H，J＝6.7，H-1″)，5.18(d，1H，J＝4.26，H-2＇)，4.84(m，1H，H-3)，4.78(m，1H，H-4′)，4.70(m，1H，H-5′)，¹³C NMR(C₅D₅N，δppm)：174.79(C-1′)，157.35(C-1)，140.45(C-5)，122.57(C-6)，106.54(C-1″)。

实施例2：(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CH-ED-LA)的合成

通过合成N-(乳糖酰氧基)二酰亚胺，再与(2-氨基乙胺基)甲酸胆固醇酯反应得到[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(CH-ED-LA)。

1.合成乳糖酸活性酯

将1.80g乳糖酸(5mmol)溶于30mLDMF中，冷却至-15℃～-20℃，加入3.10gN，N＇-二环己基碳二亚胺(15mmol)，于-15℃搅拌反应20min后，升至-5℃反应15min，然后加入1.15gN-羟基琥珀酰亚胺(10mmol)，于-5℃搅拌反应1h，在室温下搅拌25h。将反应混合物滤去二环己基脲，所得滤液蒸干至约5mL，加入20mL无水乙醇，超声分散后滴加乙醚，析出白色絮状物，再经抽滤，2mL乙醚洗涤，真空干燥后，得白色粉末2.05g(产率90％)，TLC(二氯甲烷/乙醇＝1∶1，苯胺/二苯胺/85％磷酸显色剂)，R_f＝0.61。FTIR(cm^-1)：3326.6，2929.3(br，OH)，1627.5(imide，C＝O)，1574.7，1271.4(RCOON)，1088.2(C-O-C)。

2.合成[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸胆固醇酯(II)

取乳糖酸活性酯0.46g(1mmol)，加入二甲基亚砜3mL，40℃水浴搅拌溶解后，逐滴加入化合物I的二氯甲烷溶液(0.28g，0.6mmol)10mL，再滴加2～4滴三乙胺，升温至50℃回流反应12hr。然后减压除去二氯甲烷，抽滤得浅黄色DMSO溶液，向滤液中加入2倍体积的蒸馏水，超声1min后置于透析袋内透析48hr，除去DMSO和剩余的乳糖活性酯。最后将透析液蒸干，再加入二氯甲烷/无水乙醇混合溶剂20mL，超声溶解固体，抽滤除去不溶物，滤液蒸干后，得终产物II(0.41g，产率50％)。

实施例3：[(2-乳糖酰胺基)己胺基]甲酸胆固醇酯(CH-HD-LA)的合成

通过合成(2-氨基己胺基)甲酸胆固醇酯，再与乳糖酸内酯反应得到[(2-乳糖酰胺基)己胺基]甲酸胆固醇酯(CH-HD-LA)。

取0.45g胆固醇氯甲酯(1mmol)，用60mL CH₂Cl₂溶解，置滴液漏斗中，缓缓加入到含11.6g己二胺(100mmol)CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的己二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得灰色固体0.43g，(产率为82.1％)，TLC(二氯甲烷/甲醇＝9∶1)；R_f＝0.3。FTIR(cm^-1)：3341.2，1561.4(NH)，2938.6(环烯CH)，1715.7，1676.4(C＝O)，1277.1(C-N)。ESI-MS(m/z)：528.5(M+H)⁺，551.7(M+Na)⁺。

取乳糖酸内酯0.52g(1.53mmol)，加入二甲基亚砜8mL，40℃水浴下搅拌溶解，逐滴加入二氯甲烷溶解的(2-氨基己胺基)甲酸胆固醇酯溶液(0.53g，1mmol)，再滴加3～5滴三乙胺，然后升温至50℃回流反应36hr。减压除去二氯甲烷，抽滤，除去沉淀物，滤液加入2倍体积的蒸馏水，置于透析袋中透析48hr，除去二甲基亚砜和未反应的乳糖酸，将透析液蒸干。再加入二氯甲烷/无水乙醇混合溶剂20mL，超声溶解固体，抽滤除去不溶物，滤液蒸干后，得终产物CH-HD-LA(0.44g，产率53.7％)。TLC(乙酸乙酯/乙醇/水＝6∶4∶1，苯胺/二苯胺/85％磷酸显色剂)，R_f＝0.46。FTIR(cm^-1)：3327.7，627.5，1561.2(NH)，12940.6(环烯CH)，1694.5(NHCOOR)。ESI-MS(m/z)：868.6(M+Na)⁺。¹³C NMR(C₅D₅N，δppm)：174.7(COON)，157.6(NCOOR)。

实施例4：[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸二十二烷醇酯(DS-ED-LA)的合成

1.合成二十二烷醇氯甲酯

二十二烷醇加入三氯乙烯溶解，另取三光气溶于2～50倍三氯乙烯和0.1～5倍DMF中，在回流下0.5～5h滴加完毕，继续反应2～12h，过滤除去不溶物，减压蒸除过量溶剂，残留物用环己烷萃取回流5～60min，蒸除部分环己烷，趁热过滤除去不溶物，冰水冷却滤液，析出产物粗品，经重结晶得二十二烷醇氯甲酯白色固体。

2.合成(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯

二十二烷醇氯甲酯用二氯甲烷溶解，置加料漏斗中，滴加到过量1～10倍的乙二胺二氯甲烷溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用二氯甲烷(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得白色固体，即(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯。TLC(二氯甲烷/甲醇＝2∶1)：R_f＝0.45。FTIR(cm^-1)：2958.4，2931.2，2878.3(br，CH)，1776.7(C＝O)，1728.1(COOR)。ESI-MS(m/z)：388.6(M+H)⁺。

3.合成[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸二十二烷醇酯(DS-ED-LA)

乳糖酸内酯的制备同上。乳糖酸内酯加入极性溶剂中溶解，(2-氨基乙胺基)甲酸二十二烷醇酯加非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h。取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，冻干，得产物。TLC(二氯甲烷/甲醇＝2∶1)：R_f＝0.4。FTIR(cm^-1)：3274.7，2875.3(br，NH，CH)，15671.2(NH)，1687.2(NHCOOR)。ESI-MS(m/z)：776.1(M+Na)⁺。¹³C NMR(C₅D₅N，δppm)：175.4(COON)，169.5(NCOOR)。

实施例5：阿霉素肝靶向脂质体的制备及体内分布

阿霉素(doxorubicin)是治疗肝癌的一个一线药物，是临床常用的抗肿瘤药物，抗瘤谱广、疗效好。然而该药在杀伤肿瘤细胞的同时，也会产生全身性的严重不良反应，如心脏毒性、骨髓抑制等，治疗指数低，临床应用受到限制。采用本发明的材料制备的肝靶向脂质体，可提高药物在肝内的浓度，以提高抗肝癌效果。

脂质体的制备：

处方组成：

阿霉素 0.10g

HSPC 5.0g

胆固醇(CH) 1.7g

CH-ED-LA 0.30g

硫酸胺 3.3g

水加至100mL

将处方量的HSPC、CH、CH-ED-LA加入配置容器中，60℃条件下用适量乙醇溶解，并挥尽乙醇成膜，同温度下加入300mM的硫酸铵缓冲液水化，制备空白脂质体。空白脂质体经微射流仪处理，通过0.22μm微孔滤膜整粒。整粒后的脂质体置入透析袋中，用生理盐水透析，除去外水相的硫酸铵，得到梯度脂质体。取阿霉素溶液与梯度脂质体按一定比例混合，于60℃孵化30min，即得到阿霉素肝靶向脂质体(1mg/mL)。粒度为：50～350nm。平均粒度89nm。

体内分布：

取昆明种小鼠，体重18～22g，分3组：阿霉素水溶液、普通脂质体组和靶向脂质体组，按10mg/kg的剂量尾静脉给药，于不同时间点经眼眶静脉取血，断头处死动物，结果表明靶向脂质体组阿霉素在血浆中的浓度显著降低，而在肝中的浓度显著提高(见附图2)，在肝中的AUC_0-4是普通脂质体的3倍。

实施例6齐多夫定棕榈酸酯肝靶向纳米乳剂的制备及体内分布

人体感染HIV后，肝脏是极易受到损害的器官，在感染后期，肝脏更成为HIV的深层贮库之一，传统制剂很难清除残留于肝脏中的HIV病毒。齐多夫定(Zidovudine，AZT)作为抗HIV首选药之一，其疗效确切，能减少机会性感染，延缓艾滋病相关综合症(ARC)向AIDS的发展。AZTP为AZT的棕榈酸酯衍生物，利用此棕榈酸脂肪链插入纳米乳剂中。在实现被动靶向给药的基础上，在原有的处方中，加入本发明的肝靶向辅料，制备具有主动肝靶向作用的半乳糖化纳米乳剂，可使药物浓集于肝脏，有利于清除残留于肝脏中的HIV病毒。

纳米乳剂的制备

处方组成：

AZTP 0.30g

中链油 5g

卵磷脂 2g

TPGS 0.50g

甘油 2g

CH-ED-LA 0.30g

水加至100mL

称取处方量的中链油、卵磷脂与TPGS置于小烧杯中，70℃水浴中高速分散机14000l/min下搅拌使其分散溶解，然后加入处方量的AZTP继续搅拌使其溶解；另将处方量的甘油与6.0mL水置于同温度的水浴中磁力搅拌下溶解，作为水相；在分散机14000l/min搅拌下，分次将水相缓慢加入到油相中，然后在10000l/min下分散15min，冷却至室温后，加水定容至30mL，即得初乳。将初乳用微射流仪以70psi压力均质8次，灌装，充氮气，加塞，加铝盖密封，流通蒸汽灭菌30min，即得。

药物动力学及体内分布

取昆明种小白鼠72只，随机分为2组，按30mg·kg^-1剂量分别尾静脉注射AZT溶液剂、AZTP普通纳米乳剂和Gal-AZTP纳米乳剂，于1、5、10、15、20、30、40和60min(每点3只小鼠)经眼眶静脉取血，脱臼处死后取出肝，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重，取0.1g经匀浆，沉淀蛋白后，进行HPLC分析，测定齐多夫定的浓度。血和肝中的药物浓度-时间曲线见附图3。

实施例7齐多夫定棕榈酸酯肝靶向脂质体的制备及体内分布

脂质体是一种非常有前景的药物传递载体，其双分子层结构类似细胞膜，具有良好的细胞亲和性和组织相容性。胆固醇是构成脂质体膜的基础物质，本发明的新型肝靶向辅料含胆固醇或脂质端基，可以很容易插入脂质体磷脂双分子层膜中，D-半乳糖端基在脂质体表面伸出，将制备的含药脂质体导向肝脏实质细胞，使药物浓集于肝，有利于清除残留于肝脏中的HIV病毒，提高治疗效果。

AZTP脂质体的制备

处方组成：

AZTP/mg 60

Epikuron 170/mg 1000

胆固醇/mg 125

肝靶向辅料/mg 适量

5mmol·L^-1PBS(pH7.0) 加至20mL

乙醇注入法将处方量的磷脂、胆固醇、肝靶向辅料与AZTP(药脂比为1∶16.7)溶于适量无水乙醇中，以注射器缓慢滴加乙醇溶液于50℃恒温磁力搅拌的PBS(5m mol·L^-1，pH7.0，按中国药典2000版二部附录XV D配制)中，搅拌5min，之后将温度下调至40℃继续搅拌，孵化10min。将制得的脂质体以上述PBS定容。冷却至室温后，于细胞破碎仪的探头下超声分散，功率为600w×8min(工作10s，间歇10s)。最后经0.8、0.45和0.22μm微孔滤膜依次整粒，得AZTP脂质体，备用。

药物动力学及体内分布

取昆明种小白鼠72只，随机分为2组，按30mg·kg^-1剂量分别尾静脉注射AZT溶液剂、AZTP普通脂质体和Gal-AZTP脂质体，于1、3、5、7、10、15、20和30min(每点3只小鼠)经眼眶静脉取血，脱臼处死后取出肝，用生理盐水洗净，滤纸吸干，称重，取0.1g经匀浆，沉淀蛋白后，进行HPLC分析，测定齐多夫定的浓度。血和肝中的药物浓度-时间曲线见附图4。

Claims

1、一种含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料，其特征在于：该肝靶向辅料其结构通式如下：

式中：

R₁为胆固醇、谷甾醇等甾醇或脂肪醇类化合物

R₂为2-10个碳原子的直链或支链烷基、取代烷基、芳香基或取代芳香基；聚乙二醇-CH₂(CH₂OCH₂)_nCH₂-，n＝1-200；氨基酸烷基酯。

2、根据权利要求1所述的一种含D-半乳糖结构的肝靶向辅料，其特征在于：它是由含D-半乳糖端基的糖、甾醇或脂肪醇与一系列两端含胺基的二元胺经酰化反应制得。

3、根据权利要求2所述的一种含D-半乳糖结构的肝靶向辅料，其特征在于：所含的D-半乳糖结构选自含D-半乳糖端基的糖，乳糖酸，乳糖酸内酯和乳糖酸活性酯；甾醇包括胆固醇和谷甾醇或固醇；脂肪醇指C数为6～50的饱和或不饱和脂肪醇；二元胺中的R₂可为C₂～C₂₀的直链或支链烷基、取代烷基、芳香基和取代芳香基，或为氧乙基(CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂)_n，即为聚乙二醇二胺，其中n＝1～100；氨基烷基酯。

4、一种如权利要求1所述的一种含D-半乳糖结构和甾醇的肝靶向辅料的制备方法，其特征在于：

胆固醇氯甲酯用二氯甲烷溶解，置加料漏斗中，滴加到过量1-10倍的二元胺CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得腊状白色固体，即二元胺单甲酸胆固醇酯；

取乳糖酸加入甲醇溶解，50℃减压蒸发，除去甲醇，在加入2～10倍体积的乙醇，超声分散后再减压蒸发除去乙醇，重复3～10次后，将其固体置于70～80℃烘箱中放置12～48hr，即得乳糖酸内酯；

乳糖酸内酯加入极性溶剂中溶解，二元胺单甲酸胆固醇酯加非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h。取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，冻干，得产物。

5、一种如权利要求1所述的一种含D-半乳糖结构和脂肪醇的肝靶向辅料的制备方法，其特征在于：脂肪醇加入三氯乙烯溶解，另取三光气溶于2～50倍三氯乙烯和0.1～5倍DMF，在回流下0.5～5h滴加完毕，继续反应2～12h，过滤除去不溶物，减压蒸除过量溶剂，残留物用环己烷萃取回流5～60min，蒸除部分环己烷，趁热过滤除去不溶午，冰水冷却滤液，析出产物粗品，经重结晶得脂肪醇氯甲酯白色固体；

脂肪醇氯甲酯用二氯甲烷溶解，置加料漏斗中，滴加到过量1-10倍的二元胺CH₂Cl₂溶液中，冰水浴下搅拌反应10hr。减压蒸除CH₂Cl₂，加水20mL(洗去未反应完的乙二胺及其盐酸盐)，混匀，再用CH₂Cl₂(15ml×2)萃取，去离子水洗(15ml×2)，再用适量无水Na₂SO₄干燥过夜。减压蒸去溶剂，得白色固体，即二元胺单甲酸脂肪醇酯；

乳糖酸内酯的制备同上，乳糖酸内酯加入极性溶剂中溶解，二元胺单甲酸脂肪醇酯加非极性溶剂溶解，0～100℃搅拌反应1～36h，取反应混合物于30～80℃减压蒸发除去部分溶剂，过滤除去沉淀，滤液加蒸馏水稀释2～10倍，再将稀释液置于透析袋内透析12～72h，浓缩透析液，冻干，得产物。

6、根据权利要求4或5所述的肝靶向辅料的制备方法，其特征在于：极性溶剂包括：甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮；非极性溶剂包括：二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、四氢呋喃、丙酮、甲苯、二氧六环、乙醚。

7、一种含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料制剂，其特征在于：含半乳糖胺胆固醇酯衍生物肝靶向辅料的制剂，作为脂质体、乳剂、纳米粒、微球、纳米囊、胶束给药载体的靶向组成部分，用于药物的肝靶向、肝靶向基因转染，其肝靶向辅料占载体中脂质成分的0.1～100％。

8、根据权利要求7所述的含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料制剂，其特征在于：所述药物包括：抗肿瘤药物、抗肝炎病毒药物，抗肝炎辅助药物、肝内特殊用药以及基因药物。

9、根据权利要求8所述的含D-半乳糖和甾醇或脂肪醇的肝靶向辅料制剂，其特征在于：抗肿瘤药物包括：齐多夫定、拉米夫定、阿霉素、氟达拉宾、长春碱、长春新碱、秋水仙碱、丹参、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、人参多糖、黄芪多糖、顺铂、卡铂、塞替派、替加氟/尿嘧啶、奥沙利铂、干扰素、白介素-2、肿瘤坏死因子和三磷酸腺苷；抗肝炎病毒药物包括：阿昔洛韦、更昔洛韦、三氮唑核苷、阿德福韦、阿德福韦酯、葡醛内酯、思替卡韦、α-干扰素、葫芦素、苦参碱、苦参素、斑蝥素、去甲斑蝥素及去甲斑蝥酸；抗肝炎辅助药物及肝内特殊用药包括：肌苷、肝细胞生长素、辅酶Q₁₀、辅酶A、齐墩果酸、甘草酸、甘草酸单胺、甘草酸二胺、联苯双酯、马洛替酯、水飞蓟宾、双环醇、丙帕锗、维丙胺及维生素A、E、B和K₁。