CN101328220A - 半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素的制备及应用 - Google Patents

Abstract

半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素的制备及应用，属于靶向生物药物技术领域。本发明以人血清白蛋白融合干扰素为半乳糖基化前体，可为半乳糖基化提供足够多的位点，从而更有效地制备所需不同糖密度(7－35)的半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素。该化合物与人血清白蛋白融合干扰素相比，具有明显的肝靶向性和相同的药理活性，有望开发用于制备新型的病毒性肝炎肝靶向治疗药物，显著提高IFN在肝脏中的药物浓度，延长其生物半衰期，有效降低临床IFN的用量，减轻患者反复注射的痛苦，减少副反应的发生，大幅度降低患者的治疗费用，提高我国病毒性肝炎的治疗水平，促进我国人民的身体健康，具有较好的社会效益和巨大的经济效益。

Description

半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种半乳糖基化修饰的融合干扰素，属于靶向生物药物技术领域。

背景技术

我国是个人口大国，同时也是一个肝病大国，各类肝脏疾病病人很多。我国HBV携带率高达10％～13％，其中约有50％转为慢性乙肝病人，在这些慢性乙肝病人中，又有约25％～40％病人最终将死于肝硬化或合并肝癌；HCV感染率为3.2％，约为4200万人，HCV感染的慢性化率极高，可达50％～85％，经过20年的感染，大约10％～30％可发展为肝硬化，其中又约有3％～10％可演变为肝细胞癌。

目前，病毒性肝炎的治疗尚无特效药，主要采用α-干扰素(Interferonα，IFN-α)、核苷类抗病毒药和各类中成药(主要是免疫增强剂)等。IFN-α是哺乳动物细胞诱导物诱导下产生的一种特异糖蛋白，它能够抑制病毒在细胞内的增殖，加强巨噬细胞的吞噬作用和对癌细胞的杀伤作用，在临床上已广泛用于病毒性肝炎和肿瘤等的治疗(Hofnagle JH.Digestion 1998；59：563-578)。但普通IFN由于其在体内极易被蛋白水解酶降解，生物半衰期较短，患者需多次重复给药(一般每次肌肉注射IFN300～500万单位，隔日1次，连续应用6～12个月)，这不仅增加了患者因多次注射带来的痛苦，加重了患者的经济负担，也较易导致副反应的发生，不利于治疗，限制了其临床的应用。

为了克服普通IFN的上述缺点，国内外学者采用缓释剂型、化学修饰手段(如用PEG等)和基因工程融合表达等手段对普通IFN进行修饰，以延长其生物半衰期，增长其药效时间，减少注射的次数。目前较为成功的长效IFN有：(1)罗氏和先灵葆雅制药公司生产的聚乙二醇化干扰素(PEG-IFNα)，如Pegasys(聚乙二醇化干扰素-2a)和PEG-Intron(聚乙二醇化干扰素-2b)(McHutchisonJG，Fried MW.ClinLiver Dis，2003，7：149-161；Mager DE，Neuteboom B，Jusko WJ.Pharm Res 2005；22：58-61)。PEG-IFNα不仅具有较强的抗病毒活性，还具有较长的生物半衰期，只需一周皮下注射180μg PEG-IFNα一次，大大方便了医患双方。(2)美国HGS(Human Genome Science)公司率先研制的融合IFN(多为HSA-IFN)，它是采用基因重组技术，将人血清白蛋白(HSA)基因与人IFN基因进行融合，并与表达载体连接后引入酵母菌，经酵母发酵生产GHSA-IFN(又名Albuferon)。Albuferon临床前药代动力学实验研究结果表明其半衰期为142小时，推荐每2-4周给药一次；I期和II期临床药代动力学研究结果均表，Albuferon每二周注射一次后，血清Albuferon的浓度持续高于普通IFN和PEG-IFN，在第二次注射后的4周时仍能在测定出血清中Albuferon，其平均半衰期为148小时；而Pegasys的平均半衰期为80小时(50-140小时)，Peg-Intron为40小时(22-60小时)，普通IFN仅为4～6小时(Osborn B，Olsen H，Nardelli B，etal.J Pharmacol Exp Ther 2002；303：540-548；Balan V，Nelson DR，Sulkowski MS，etal.Antivir Ther.2006；11：35-45；Bain VG，Kaita KD，Yoshida EM，et al.J Hepatol2006；44：671-678；HGS Website：http://www.hgsi.com/products/albuferon.html)。国内也已有多家单位成功研制了GHSA-IFN，并申请了专利(金坚，等.中国专利CN200610038790.8和CN200610038791.2)。

但是普通IFN和长效IFN在肝脏中的最大分布均还不到给药剂量的10％，肝靶向性均不高，临床上为达到治疗病毒性肝炎的效果常常需要加大给剂量，这不仅加重了患者的经济负担，也较易导致副反应的发生，致使疗效也不够理想，因此有必要增加IFN的肝靶向性，提高IFN在肝脏中的浓度。

去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGP-R)只存在于哺乳动物肝细胞表面，且数量众多，它能特异性地识别和结合末端为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白(Wu J，Nantz MH，Zern MA.Front Biosci 2002；7：717-725)。将蛋白质或药物用半乳糖修饰后，就可有效增加该蛋白质或药物在肝脏中的浓度。

糖分子生物学研究表明在糖与蛋白质的相互作用中会产生所谓的“多价效应(MultivalentEffect)”或“簇集效应(Cluster Effect)”。ASGP受体与其配基结合中也存在这样的“簇集效应”，配基的半乳糖基化程度越高，其与ASGP受体的亲和力越强，越能有效地靶向肝脏(Bezouska K.Design.Reviews in MolecularBiotechnology 2002；90：269-290)。

1997年Fiume等用半乳糖化多聚赖氨酸(NGpL)-阿糖腺苷交联物治疗慢性乙肝，疗效显著；2001年Biessen与Bijsterbosch等将阿地弗韦(Adefovir，9-(2-phosphonylmethyl)adenine，PMEA)与半乳糖化的高密度脂蛋白(LacNeoHDL)结合，可将PMEA在肝脏中的药物浓度提高至总给药量的70％左右(Fiume L，Di Stefano G，Busi C，et al.J Hepatol 1997；26：253-259；Bijsterbosch MK，Ying CX，de Vrueh RLA，et al.Mol Pharmacol 2001；60：521-527；Biessen EAJ，A.R.P.M.Valentijin，de Vrueh RLA，et al.FASEB J 2000；14：1784-1792.)。

为增加IFN的靶向性，1994年华西医科大学药学院钟裕国等公开了其国家发明专利(CN1087093A)“肝靶向性的半乳糖干扰素偶联偶联物”，2000年他们又公开了另一项国家发明专利(CN99117484.4)“肝靶向性高糖密度半乳糖基干扰素偶联物”，这二项专利均是以普通IFN为半乳糖基化前体，但由于普通IFN所含赖氨酸残基仅为10个左右，可用于糖基化的赖氨酸残基数就更少了，因此导致半乳糖基化修饰时，半乳糖基化程度还不够高，还不能有效地将IFN靶向肝脏。

HSA分子所含赖氨酸残基约为59个，HSA-IFN所含赖氨酸残基达69个，因此，采用HSA-IFN作为半乳糖基化前体，不仅可为半乳糖基化提供了足够多的位点(赖氨酸残基)，克服普通IFN因所含赖氨酸残基过少导致半乳糖化程度不高、不能有效靶向肝脏的缺点；还由于融合了HSA，可有效降低IFN的体内降解速度，延长其生物半衰期。本发明拟以HSA-IFN为半乳糖基化前体制备GHSA-IFN。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型肝靶向干扰素——GHSA-IFN的制备方法和产品及其在病毒性肝炎预防和治疗上的应用。本发明可为临床提供一种新型的病毒性肝炎靶向治疗药物，显著提高IFN在肝脏中的药物浓度，延长其生物半衰期，有效降低临床IFN的用量，减轻患者反复注射的痛苦，减少副反应的发生，大幅度降低患者的治疗费用，提高我国病毒性肝炎的治疗水平，促进我国人民的身体健康，具有较好的社会效益和巨大的经济效益。

本发明的技术方案包括四项内容：

(1)一种GHSA-IFN；

(2)一种GHSA-IFN的制备方法；

(3)GHSA-IFN的抗病毒活性分析和肝靶向性分析；

(4)GHSA-IFN在制备预防和治疗病毒性肝炎药物上的应用。

一种半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素GHSA-IFN，结构通式如下：

                                n为7-35

                                HSA为人血清白蛋白

                                IFN为干扰素

其半乳糖密度，即每分子GHSA-IFN所含半乳糖基数为7-35。

其中干扰素为IFNα及其亚型：IFNα1a、IFNα2a、IFNα1b、IFNα2b或IFNα2c；IFNβ及其亚型；或IFNγ及其亚型。

所述的任一种GHSA-IFN的制备方法，采用基因重组任一种HSA-IFN为半乳糖基化前体而不是以干扰素为前体，步骤如下：

(1)0.69mmol腈甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖在10mL无水甲醇中与0.069mmol甲醇钠反应，20～22℃搅拌24小时，得2-亚胺基-2-甲氧基乙基-1-硫代半乳糖甙，即IME-硫代半乳糖甙，产率约为56％，无需分离，直接用于下步操作；

(2)吸取反应溶液6mL，旋转蒸发，去除溶剂；

(3)加入4.5mL用0.1mol/L pH 8.5硼酸缓冲液配制的50mg～900mg的HSA-IFN溶液，20-22℃搅拌反应4小时；

(4)用PD-10柱纯化后，再用蒸馏水进行透析，每4小时更换一次透析液，直至透析外液中无糖检出为止，得GHSA-IFN；

(5)用Lowry法测定GHSA-IFN的蛋白浓度，用苯酚-硫酸法测定GHSA-IFN的糖浓度，SDS-PAGE法测定GHSA-IFN分子量。

所述的任一种GHSA-IFN的应用，该种化合物用于制备肝靶向治疗药物，制备病毒性肝炎的治疗药物。

改变步骤(3)中IME-硫代半乳糖甙与HSA-IFN的配比，可以得到所需不同糖密度的GHSA-IFN。

本发明的有益效果：

(1)制备了一类新型化合物GHSA-IFN，可作为病毒性肝炎靶向预防和治疗药物；

(2)GHSA-IFN制备工艺简单，反应条件温和，对IFN的活性影响小；

(3)以HSA-IFN为半乳糖基化前体，不仅为半乳糖基化提供了足够多的位点(赖氨酸残基)，有效地制备所需不同糖密度(7-35)的GHSA-IFN，克服普通IFN因所含赖氨酸残基过少导致半乳糖化程度不高、不能有效靶向肝脏的缺点，而且还由于融合了HSA，可有效降低IFN的体内降解速度，延长其生物半衰期；

(4)GHSA-IFN具有明显的肝靶向性，可显著提高IFN在肝脏中的药物浓度，延长其生物半衰期，有效降低临床IFN的用量，减轻患者反复注射的痛苦，减少副反应的发生，大幅度降低患者的治疗费用，提高我国病毒性肝炎的治疗水平，促进我国人民的身体健康，具有较好的社会效益和巨大的经济效益。

附图说明

图1.GHSA-IFN合成路线。

图2.GHSA-IFNα2b SDS-PAGE分析，A：GHSA-IFNα2b的分子量；B：标准分子量的蛋白质；C：HSA-IFNα2b的分子量。

图3.GHSA-IFNα2b抗病毒活性分析。

图4.¹³¹I-GHSA-IFNα2b正常兔SPECT显像。

具体实施方式

实施例1：GHSA-IFNα2b的制备

反应方程式为：

化合物1(0.28g，0.69mmol)溶于10mL无水甲醇中，加入甲醇钠(3.7mg，0.069mmol)，20～22℃搅拌24小时以上，得IME-硫代半乳糖甙(化合物2，产率约为56％)和副产物(化合物1的脱乙酰产物)，化合物2无需分离。

吸取上述反应溶液6mL，旋转蒸发，去除溶剂，加入4.5mL用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制的50mg～900mg HSA-IFN溶液，20-22℃搅拌反应4小时后，用PD-10柱纯化后，再继续用蒸馏水进行透析，每4小时更换一次透析液，直至透析外液中无糖检出为止，得GHSA-IFNα2b(化合物3)。

实施例2：GHSA-IFNα2b的分析与鉴定

用Lowry法测定GHSA-IFNα2b的蛋白浓度，蛋白定量后分装，冷冻干燥，-30℃保存；用苯酚-硫酸法测定GHSA-IFNα2b的糖浓度，经计算所制得的GHSA-IFNα2b的平均糖密度为24。

通过公式控制糖密度：

糖密度＝4.5+0.12×(IME-硫代半乳糖甙/HSA-IFNα2b)

实施例1中，控制IME-硫代半乳糖甙与HSA-IFNα2b的反应摩尔比，可以制得不同糖密度的GHSA-IFNα2b。

以标准分子量的蛋白质(附图2中B)和HSA-IFNα2b(附图2中C)为对照，采用SDS-PAGE测定GHSA-IFNα2b(附图2中A)的分子量，结果显示半GHSA-IFNα2b呈单一条带，分子量约为91KD。

实施例3：GHSA-IFNα2b的抗病毒活性分析

按中国药典2005版第三部附录XC干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑制法)，采用WISH/VSV系统对HSA-IFN和GHSA-IFNα2b的抗病毒活性进行比较分析，结果如附图3所示，随着VSV滴度的增加，细胞存活率逐渐降低。但是同一VSV的滴度对应的HSA-IFNα2b和GHSA-IFNα2b的细胞存活率几乎相同，这说明半乳糖基化前后HSA-IFNα2b的抗病毒活性几无变化。

实施例4：GHSA-IFNα2b体外细胞药效学分析

利用转染HBV病毒基因的Hep3B细胞株，采用ELISA法测定细胞培养上清中HBsAg和HBeAg含量，采用SRB法测定细胞存活率，进行GHSA-IFNα2b与HSA-IFNα2b药物干预药效对比研究，以抑制HBsAg分泌的抑制率来表示。研究结果表明GHSA-IFNα2b与HSA-IFNα2b具有相似的药效，均可有效抑制Hep3B细胞株HBsAg和HBeAg的表达，且抑制效果呈剂量依赖性和时间依赖性(P/N＜2.1说明药物无效，表1)。

表1.GHSA-IFNα2b与HSA-IFNα2b体外细胞药效比较

实施例5：¹²⁵I-和¹³¹I-GHSA-IFNα2b的制备与分析

用0.2mol/L磷酸钠(PB)pH8.0溶液将待标记物GHSA-IFNα-2b或HSA-IFNα-2b配制成1mg/mL的溶液，取10μL加入标记管中，加入适量Na¹²⁵I(或Na¹³¹I)溶液，迅速加入20μL含60μg氯胺-T的0.2mol/L PB pH8.0溶液，混匀，室温反应约60秒后，加入40μL含200μg偏焦亚硫酸钠的0.2mol/L PBpH 8.0溶液终止反应，5分钟后，加入100μL含25mmol/L CaCl₂和0.1％BSA(牛血清白蛋白)的20mmol/L TBS(Tris-HCl 0.9％NaCl)pH7.4溶液(以下简称TBBSC缓冲液)，混匀后，吸出标记液，加至用上述TBBSC缓冲液平衡好的PD-10柱上，分离纯化，用TBBSC缓冲液洗脱，分管收集，0.5mL/管，共收30管，分别取2μL加入塑料测量管中用γ计数仪测量其计数(CPM)。

在上述测量的蛋白峰管中，分别加入750μL TBBSC缓冲液，混匀，再加入750μL 10％TCA(三氯醋酸)溶液，混匀，4000rpm离心15分钟后，吸去上清，γ计数仪测量沉淀计数，将沉淀计数除以总计数算得其放化纯。取放化纯最高的一管用TBBSC缓冲液适当稀释后，4℃放置冰箱备用。

表2.标记物的放射化学特性

实施例6：GHSA-IFNα2b肝受体靶向性分析

采用肝细胞悬液(约6×10⁶/mL)和¹²⁵I-GHSA-IFNα-2b进行体外肝细胞饱和结合分析和竞争结合分析，结果显示¹²⁵I-GHSA-IFNα-2b可特异性地与肝细胞结合，体外肝细胞特异性结合可达59.08％，且呈现可饱和性，符合受体结合的特性；而¹²⁵I-HSA-IFNα-2b与肝细胞的结合仅为1.88％，由此说明HSA-IFNα-2b半乳糖基化后制得的GHSA-IFNα-2b是肝ASGP受体的特异性配基，与肝细胞ASGP受体的结合显著增高。

实施例7：¹²⁵I-GHSA-IFNα2b小鼠体内分布

36只健康ICR小鼠，平均体重约为20g，随机分为6组，每组6只，雌雄各半，按0.2ml 0.37MBq(约含GHSA-IFNα-2b 0.1μg)/只由尾静脉注射¹²⁵I-GHSA-IFNα-2b，各组分别于给药后5、10、15、30、60和120分钟放血处死，取各有关脏器测量放射性计数。参照系为100倍稀释的6份标准样品，以其平均计数值乘以100作为总注入剂量(ID)，最后求出各脏器放射性占注入量的百分率(ID％)，结果参见表3。

表3.¹²⁵I-GHSA-IFNα-2b小鼠体内分布结果

*其中血按小鼠体重的7％计算

**肠指十二指肠段

实施例8：¹³¹I-GHSA-IFNα2b正常兔显像

正常新西兰兔(约重2Kg)一只，氯胺酮麻醉后固定，由尾静脉注射0.20mL浓度约为0.01mg/mL活度约为18.5MBq的¹³¹I-GHSA-IFNα-2b溶液，立即用配备通用高能准直器的SPECT进行胸腹部30分钟动态显像，结果显示¹³¹I-GHSA-IFNα-2b可快速被肝脏特异性摄取，且主要经胃肠道排泄，10-30分钟是显像的最佳时间(参见图4)。

Claims (4)

1、一种半乳糖基化人血清白蛋白融合干扰素GHSA-IFN，其特征在于结构通式如下：

n为7-35

HSA为人血清白蛋白

IFN为干扰素

其半乳糖密度，即每分子GHSA-IFN所含半乳糖基数为7-35。

2、根据权利要求1所述的GHSA-IFN，其特征是其干扰素为IFNα及其亚型：IFNα1a、IFNα2a、IFNα1b、IFNα2b或IFNα2c；IFNβ及其亚型；或IFNγ及其亚型。

3、权利要求1所述的任一种GHSA-IFN的制备方法，其特征在于采用基因重组任一种HSA-IFN为半乳糖基化前体而不是以干扰素为前体，步骤如下：

(1)0.69mmol腈甲基2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖在10mL无水甲醇中与0.069mmol甲醇钠反应，20～22℃搅拌24小时，得2-亚胺基-2-甲氧基乙基-1-硫代半乳糖甙，即IME-硫代半乳糖甙，无需分离，直接用于下步操作；

(2)吸取反应溶液6mL，旋转蒸发，去除溶剂；

(3)加入4.5mL用0.1mol/L pH 8.5硼酸缓冲液配制的50mg～900mg的HSA-IFN溶液，20-22℃搅拌反应4小时；

(4)用PD-10柱纯化后，再用蒸馏水进行透析，每4小时更换一次透析液，直至透析外液中无糖检出为止，得GHSA-IFN；

(5)用Lowry法测定GHSA-IFN的蛋白浓度，用苯酚-硫酸法测定GHSA-IFN的糖浓度，SDS-PAGE法测定GHSA-IFN分子量。

4、权利要求1中所述的任一种GHSA-IFN的应用，其特征是该种化合物用于制备肝靶向治疗药物，制备病毒性肝炎的治疗药物。

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