CN104147036B

CN104147036B - 地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中应用

Info

Publication number: CN104147036B
Application number: CN201410417386.6A
Authority: CN
Inventors: 曾苏; 刘彦卿; 郑小丽; 于琴琴; 王�华; 谭付清; 蒋惠娣; 余露山
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-08-24
Filing date: 2014-08-24
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2034-08-24
Also published as: CN104147036A

Abstract

本发明提供地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中的应用，其中地西他滨和奥沙利铂的优选摩尔浓度比值为1:5～1:8，组合药是由地西他滨和奥沙利铂与药学上可接受的辅料制成。本发明经体内、外实验研究证明，地西他滨对奥沙利铂治疗肾细胞癌具有明显的协同作用，该结果扩大了它们临床应用的范围。本发明提供的组合药可增强奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中的积聚，同时增强肾细胞癌小鼠模型对奥沙利铂的敏感性。

Description

地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中应用

技术领域

本发明属医药领域，涉及地西他滨与奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中应用，地西他滨与奥沙利铂组合用时能显著增强奥沙利铂治疗肾细胞癌中的作用。

背景技术

肾细胞癌是泌尿生殖系肿瘤中死亡率最高的癌症，也是最常见的肾实体肿瘤，其发病率约占肾恶性肿瘤的90％，占癌症综合发病率的2～3％。除早期局部性肾癌可通过外科手术治愈外，转移性肾细胞癌的治疗一直未取得突破性进展。化学治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但是肾细胞癌的多药耐药性常常导致化疗失败。

联组合用药是目前肿瘤化学药物治疗的主流治疗方案，其主要目的是为了增强疗效。药物组合用可能产生的药效学上的药物相互作用包括协同作用、相加作用及拮抗作用。协同作用是指药物组合用的治疗效果优于各单一药物的治疗效应之和。反之，若药物组合用的治疗效果低于各单一药物治疗效应总和则为拮抗作用。药物协同作用产生的积极效果包括：1）增强疗效；2）在保证疗效的基础上减少用药剂量以降低毒副作用；3）延缓或减弱肿瘤细胞对药物的耐受性。因此，临床药物治疗应充分利用药物间的协同作用，优化治疗效果。

地西他滨（Dacogen，Eisai）是一种DNA甲基转移酶抑制剂，已于2006年被FDA批准用于治疗骨髓增生异常综合征，但其对于实体肿瘤的疗效并不理想。奥沙利铂为第三代铂类抗癌药物，通过与基因组DNA结合，影响细胞活性。与第一代铂类抗癌药顺铂相比，奥沙利铂具有更广谱的抗肿瘤活性，且肾毒性显著降低。但体外实验已经证明肾细胞系对奥沙利铂不敏感。近年来，地西他滨与铂类药物组合用药以逆转实体肿瘤对铂类抗癌药的耐受性已有报道。

发明内容

本发明的目的是提供地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中的应用，其中地西他滨和奥沙利铂的优选摩尔浓度比值为1:5～1:8。本发明提供的组合药可增强奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中的积聚，同时增强肾细胞癌小鼠模型对奥沙利铂的敏感性。总之，地西他滨和奥沙利铂组合用药能协同增强它们对肾细胞癌细胞系的药物敏感性。

本发明提供的地西他滨和奥沙利铂组合药是由地西他滨和奥沙利铂与药学上可接受的辅料制成，药物剂型为固体制剂或液体制剂，选用口服制剂、注射液、冻干粉针剂、大输液剂型、贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。

本发明提供一种地西他滨和奥沙利铂组合在制备治疗肾细胞癌药物中的应用。地西他滨是一种DNA甲基转移酶抑制剂，已用于骨髓增生异常综合征的治疗。本发明经体内、外实验研究证明，地西他滨对奥沙利铂治疗肾细胞癌具有明显的协同作用，该结果扩大了它们临床应用的范围。同时，这种协同作用是地西他滨通过增强奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中的积聚，同时增强肾细胞癌小鼠模型对奥沙利铂的敏感性实现的。

附图说明

图1 是地西他滨和奥沙利铂在786-O和769-P两株肾细胞癌细胞系中单独给药和药物组合用时的药物剂量－细胞活性抑制效应曲线。

图2-1是地西他滨和奥沙利铂在786-O肾细胞癌细胞系中的药物组合用指数效果分析图。

图2-2是地西他滨和奥沙利铂在769-P肾细胞癌细胞系中的药物组合用指数效果分析图。

图2-3是786-O和769-P两株细胞系中的药物组合用等效线图分析。

图3是地西他滨和奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型上的给药方案图。

图4是不同给药方式对肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中DNA－奥沙利铂加合物形成的影响示意图。

图5-1是地西他滨和奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型上单独给药及药物合用后肿瘤相对体积增长示意图。

图5-2是地西他滨和奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型上单独给药及药物合用第20天肿瘤重量示意图。

图5-3是地西他滨和奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型上单独给药及药物合用第20天肾细胞癌小鼠模型及分离后的肿瘤照片。

图5-4是地西他滨和奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型上单独给药及药物合用肾细胞癌小鼠模型相对体重变化示意图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

本发明提供地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中的应用，其中地西他滨和奥沙利铂的优选摩尔浓度比值为1:5～1:8。

实施例2 地西他滨与奥沙利铂组合能协同增强肾细胞癌细胞系对这两种药物的敏感性。

1.试剂和材料：

肾癌细胞系786-O［CRL-1932™，ATCC］和769-P [CRL-1933™, ATCC]均购自中国科学院上海细胞库。两株细胞系均培养于RPMI-1640培养基(GIBCO,货号31800022, 添加NaHCO₃ 1.5 g/L, glucose 2.5 g/L, Sodium Pyruvate 0.11 g/L)中,并含优质胎牛血清10%。培养条件为37℃，5% CO₂.

地西他滨购自Sigma-Aldrich（5-Aza-2’-deoxycytidine,A3656）。奥沙利铂购自中国食品药品检定研究院。

2.实验方法：

地西他滨，奥沙利铂储备液及工作液配制：

以DMSO为溶剂，将地西他滨，奥沙利铂分别稀释为1000 x储备液和250 x储备液，储存于-20 ℃。

工作液临用前现配，加药时每孔加入10 μL工作液/200 μL培养体系/ well：

地西他滨工作液：2 μL储备液＋98 μL培养基100 μL工作液（20 x）

奥沙利铂工作液：8 μL储备液＋92 μL培养基100 μL工作液（20 x）

细胞培养及加药：

按一定密度将786-O (200 cells/well)和769-P（1000 cells/well）细胞种于96孔板，培养过夜。24 h后，向培养基中加入10 μL预定浓度的地西他滨。奥沙利铂组及对照组加入0.1％ DMSO处理。每24 h更换新的含药培养基。72 h后，地西他滨组（DAC）的基础培养基更换为含0.4％ DMSO的完全培养基，地西他滨浓度维持不变。奥沙利铂组（OXA）的基础培养基更换为含0.1％ DMSO的完全培养基，并加入10 μL预定浓度的奥沙利铂。两药组合用组（COMBO）同时加入10 μL预定浓度的地西他滨及奥沙利铂。各组培养体系中DMSO终浓度均为0.5％，每个浓度点设置4份复孔。24 h后，更换各组培养基为不含药的完全培养基，786-O继续培养48 h，其余两种细胞继续培养72 h。两株细胞系中地西他滨与奥沙利铂的药物终浓度如表1所示。

细胞活性实验：

药物处理终止并继续培养48 h后，向96孔板每孔加入100 μL含0.5 mg / mL MTT的新鲜培养基，37 ℃避光孵育2～4 h。弃培养基，每孔加入100 μL DMSO及12.5 μLSorsen’s Glycine Buffer，37℃振摇10 min。用酶标仪读取570 nm处吸光度。

地西他滨与奥沙利铂药物组合用剂量－效应的定量分析：

首先计算出各浓度点的抑制效应（inhibitory%）。以地西他滨或奥沙利铂单药浓度为横坐标，各浓度对应的抑制效应为纵坐标，使用Prism 5.0作图，得到剂量－效应曲线及其各项参数。再使用Compusyn软件（Combosyn Inc.）计算地西他滨与奥沙利铂药物组合用的 CI值（Combination index，联组合用药指数）以及DRI（Dosing reduction index，剂量减少指数），对这两种药物的组合用进行中位药物效应分析（Median-drug effectanalysis）。CI > 1.2 为拮抗效应，CI < 0.8 为协同效应，CI介于0.8～1.2之间视为加合效应。DRI定义为达到同等抑制效应水平时，药物组合用比单独用药所能减少的药物剂量倍数。DRI > 1对临床用药有积极意义。

3.实验结果：

地西他滨与奥沙利铂单独用药以及组合用时对786-O和769-P细胞系的剂量－效应曲线如图1所示，参数见下表2。剂量－效应拟合曲线的相关系数R均大于0.9, 因此所得数据适用于进行中位药物效应分析。

如图2-1所示，地西他滨与奥沙利铂两药组组合用时，对于786-O细胞，值在各种细胞活性抑制水平下，联合用药指数CI均小于0.8。如图2-2所示，对于769-P细胞，在细胞活性抑制水平大于50%时，CI值小于0.8。说明这两种药物组合用，对786-O和769-P细胞的细胞毒性有协同作用。由这两幅图可以看出，随着抑制效应的提高，CI值降低，协同效应增强。

对地西他滨与奥沙利铂药物组合用效应进行等效线图（isobologram）分析。如图2-3 所示，当细胞活性抑制水平达到90%时，对于786-O和769-P细胞，两药组合用的浓度点均落在拟合等效线图的左侧，显示出协同效应，这也意味着为达到相同水平的细胞毒性，两药组合用可以显著降低用药剂量。

地西他滨与奥沙利铂联组合用药的DRI值（剂量减少指数）如表3所示。药物组合用时，当细胞活性抑制水平达到90%时，对于786-O和769-P细胞，地西他滨可以使奥沙利铂的用药剂量分别降低5倍和9倍。另一方面，奥沙利铂能提高地西他滨对肾癌细胞的毒性。达到相同细胞毒性水平时，两药组合用，奥沙利铂可以使地西他滨的用药剂量下降1～2倍。

表注：数据通过Compusyn软件计算所得。CI值为联组合用药指数，CI<0.8为协同效应， CI>1.2为拮抗效应，0.8≤CI≤1.2为相加效应. DRI为剂量减少指数，定义为在相同细胞活性抑制水平下，药物组合用相比于单独用药时，药物剂量降低的倍数。

实施例3

本发明发现地西他滨与奥沙利铂组合用增强奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中的积聚以及增强肾细胞癌小鼠模型对奥沙利铂的敏感性。

1.试剂和材料

雌性Balb/C 裸鼠购自上海实验动物研究中心。饲养于浙江大学实验动物中心。

肾癌细胞系786-O［CRL-1932™，ATCC］购自中国科学院上海细胞库。两株细胞系均培养于RPMI-1640培养基(GIBCO,货号31800022, 添加NaHCO₃ 1.5 g/L, glucose 2.5 g/L, Sodium Pyruvate 0.11 g/L)中,并含优质胎牛血清10%。培养条件为37℃，5% CO₂。

2.实验方法

肾细胞癌小鼠模型的建立：

每只裸鼠腋下接种1x10⁷ 786-O细胞。约5～6周后，当肿瘤平均体积达到100 mm³时，开始给药。每天监测并记录肿瘤体积和裸鼠体重。肿瘤体积计算公式：L×W2/2，L为肿瘤长度，W为肿瘤宽度。肿瘤相对体积计算为每天的肿瘤体积与给药第1天的肿瘤体积比值。相对体重计算为每天的小鼠体重与给药第1天第体重比值。

给药：

实验分组及药物组合用设计见图3。将裸鼠分为4组，每组6～9只。地西他滨和奥沙利铂均溶解于生理盐水中。第1天，地西他滨组和药物组合用组的每只小鼠腹腔注射地西他滨2.5 mg/kg/次，每隔3 h注射一次，共注射三次。余下两组按相同剂量和时间点注射生理盐水。第9，13，18天，奥沙利铂组和药物组合用组的每只小鼠腹腔注射奥沙利铂10mg/kg/次。余下两组按相同剂量和时间点注射生理盐水。余下第20天，将所有模型裸鼠处死，分离肿瘤。

奥沙利铂积聚测定：

第10天，即第一次奥沙利铂给药24 h后，生理盐水组、奥沙利铂组和药物组合用组各取三只裸鼠，处死，分离肿瘤。使用Trizol法提取基因组DNA。DNA经HNO₃消解后，使用浙江大学分析测试中心等离子耦合质谱仪对样品中的铂离子浓度进行测定，即得肿瘤细胞中与基因组DNA结合的奥沙利铂浓度。

3.实验结果

如图4所示，与奥沙利铂组相比，药物组合用组中DNA-铂加合物的浓度提高了2.8倍，提示药物组合用促进奥沙利铂在肾细胞癌小鼠模型肿瘤细胞中的积聚。

如图5-1所示，奥沙利铂和地西他滨单独用药，对肾细胞癌小鼠模型无明显抗肿瘤作用。相反，药物组合用使肿瘤生长停滞。如图5-2和图5-3所示，给药19天后，药物组合用组的肿瘤重量仅为分别为奥沙利铂和地西他滨单独给药组的30%。因此，地西他滨与奥沙利铂药物组合用极大增强肾细胞癌小鼠模型对奥沙利铂的敏感性。

另一方面，如图5-4所示，四组间模型鼠的体重并无显著差异，提示模型鼠对这种药物组合用组合耐受性较好。

Claims

1.一种地西他滨和奥沙利铂在制备治疗肾细胞癌组合药物中的应用，其特征在于，地西他滨和奥沙利铂的摩尔浓度比值为1:5～1:8，所述组合药由地西他滨和奥沙利铂与药学上可接受的辅料制成。