CN111718416B

CN111718416B - 抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒

Info

Publication number: CN111718416B
Application number: CN202010592858.7A
Authority: CN
Inventors: 崔鹏; 何志强; 孟媛; 钟冬梅; 魏钟杰; 范凌云
Original assignee: Fapon Biotech Inc
Current assignee: Fapon Biotech Inc
Priority date: 2020-06-25
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-06-25
Also published as: CN111718416A

Abstract

本发明公开了一种抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗体或其功能性片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区。本发明公开的抗体或其功能性片段能够与硫氧还蛋白特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力，该抗体或其功能性片段的用途广泛，具有良好的应用前景。

Description

抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒。

背景技术

硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一类已知存在于所有生物体中的氧化还原小蛋白。它在许多重要的生物过程中发挥作用，包括氧化还原信号。它是一种通过半胱氨酸硫醇-二硫键交换促进其他蛋白还原而起抗氧化剂作用的蛋白质，分子量12kD的氧化还原酶。它无处不在，存在于从植物、细菌到哺乳动物的许多生物体中。

硫氧还蛋白在氨基酸序列水平上的特征是在CXXC基序中存在两个邻近的半胱氨酸。这两种半胱氨酸是硫氧还蛋白还原其他蛋白的关键。硫氧还蛋白还具有一种称为硫氧还蛋白折叠的特征性三级结构。硫氧还蛋白-1通过其活性中心二硫醇可逆氧化成二硫化物，参与氧化还原反应中的氢供体，伴随着2个电子和2个质子的转移。它涉及许多细胞过程，包括脱氧核糖核苷酸合成，氧化损伤蛋白的修复，蛋白质折叠，硫代谢和氧化还原稳态。硫氧还蛋白依赖性酶包括磷酸腺苷-磷酸硫酸还原酶MET16，烷基-氢过氧化物还原酶DOT5，硫氧还蛋白过氧化物酶TSA1和TSA2，烷基氢过氧化物还原酶AHP1和过氧化还原酶HYR1。硫氧还蛋白还参与保护免受减轻压力。作为LMA1复合物的一部分，它参与促进囊泡融合，例如同型液泡和ER衍生的COPII囊泡与高尔基体的融合。

随着分子克隆技术的普通应用，大量有价值的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，这些蛋白在大肠杆菌中表达后，往往以不溶性的包涵体形式存在。包涵体的形成能有效抵抗细胞内的蛋白质水解作用，致使重组蛋白大量富集，通过高速离心等简单操作可以得到较纯的包涵体，利于纯化。然而，为获得可溶的活性蛋白，必须将包涵体内的蛋白变性溶解后复性，重新折叠成有活性的可溶性蛋白。这个过程通长耗时长，且回收率低，且有些蛋白本身复性就非常困难。分析真核生物蛋白在大肠杆菌中表达易形成包涵体的原因，其中之一是由于大肠杆菌和真核细胞的还原状态存在差异，影响了蛋白质之间的相互作用与多肽的正确折叠，异常的二硫键形成使蛋白易发生凝聚。大肠杆菌的Trx具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可以帮助蛋白质正确折叠，这样对于复性困难的蛋白质，串联表达Trx就避开了包涵体复性的难题。

因此，基于Trx的上述特性及功能，它常作为分子伴侣构建可溶性表达系统，在基因工程上具有重要价值。对于可溶性较差，空间结构依赖性比较强的重组蛋白抗原，如艾滋病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、丁型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、庚型肝炎病毒抗原、风疹病毒抗原、人巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒1型抗原、单纯疱疹病毒2型抗原、狂犬病毒抗原、人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、登革热病毒抗原、人乳头瘤病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、森林脑炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、水痘病毒抗原、艾柯病毒型抗原、柯萨奇病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、柯萨奇病毒抗原、EB病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、包柔氏螺旋体抗原、沙眼衣原体抗原、肺炎衣原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、解脲脲原体抗原、肺炎支原体抗原、结核分枝杆菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、淋球菌抗原、疟原虫抗原、枯氏锥虫抗原和弓形虫抗原等，在克隆构建过程中引入Trx蛋白，使Trx蛋白与重组蛋白抗原融合表达，可以有助于重组蛋白抗原的可溶性表达以及正确空间折叠。在诊断试剂中，当上述重组蛋白抗原直接被标记HRP、吖啶脂、胶体金等可被检测的标记物时，多数重组蛋白抗原会出现标记失活现象。对此，本领域提出了间接标记的方法，通过抗Trx蛋白的抗体间接地将HRP、吖啶脂、胶体金等可检测标记物标记在重组蛋白抗原上，有效避免标记失活，同时大大降低了假阳反应。

上述间接标记的方法建立在特异性单抗的基础上，需要针对Trx蛋白的特异性单克隆抗体。目前用于Trx蛋白的单克隆抗体灵敏度、特异性以及亲和力上都存在一些缺陷，还有较大的改善空间，本领域对于Trx蛋白的单克隆抗体的仍然存在着强烈需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒。本发明提供的抗体能够与硫氧还蛋白特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力，该抗体具有多种用途，例如可以用于硫氧还蛋白的检测，也可以用于通过与硫氧还蛋白的特异性结合实现对抗原的间接标记等诸多领域。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种抗硫氧还蛋白的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

互补决定区CDR1-VH(重链可变区的互补决定区1)，其氨基酸序列为T-F-S-X1-X2-W-M-D，其中，X1是D或E，X2是A；

互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为X1-R-N-X2-A-H-N-H-R-T，其中，X1是L、V或I；X2是N；

互补决定区CDR3-VH，其氨基酸序列为T-X1-R-X2-P-E-G-T，其中，X1是R；X2是L、V或I；

互补决定区CDR1-VL(轻链可变区的互补决定区1)，其氨基酸序列为Q-S-X1-L-N-S-X2-N-Q-K-N-Y，其中，X1是L；X2是V或I；

互补决定区CDR2-VL，其氨基酸序列为F-X1-S-T-R-X2-S，其中，X1是A；X2是D或E；

互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为Q-Q-X1-Y-X2-T-P-P，其中，X1是N或H；X2是S。

上述互补决定区是新的序列结构，可以形成与硫氧还蛋白特异性结合的结构域，含有上述互补决定区的抗体或其功能性片段能够与硫氧还蛋白特异性结合，具有较好的结合活性和亲和力。本发明提供的抗体或其功能性片段具有广泛的用途，例如可以用于硫氧还蛋白的检测，也可以用于通过与硫氧还蛋白的特异性结合实现对抗原的间接标记等诸多领域，只要是需要以硫氧还蛋白作为结合靶标的领域，均可以使用本发明的抗体或其功能性片段。基于此，将本发明提供的抗体或其功能性片段应用于此类领域也是属于本发明的保护范围。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-27中的任一种：

。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其功能片段以K_D≤7.57×10^- ¹⁰mol/L的亲和力结合硫氧还蛋白。

可选的，在本发明的一些实施方式中，K_D≤5.16×10^-11mol/L。

可选的，在本发明的一些实施方式中，K_D≤7×10^-10mol/L、6×10^-10mol/L、5×10^- ¹⁰mol/L、4×10^-10mol/L、3×10^-10mol/L、2×10^-10mol/L、1×10^-10mol/L、9×10^-11mol/L、7×10^-11mol/L、6×10^-11mol/L、5×10^-11mol/L、4×10^-11mol/L或K_D≤3×10^-11mol/L。

可选的，在本发明的一些实施方式中，2.78×10^-11mol/L≤K_D≤5.16×10^-11mol/L。

K_D的检测参考本发明实施例中的方法进行。

一方面，本发明提供另一种抗硫氧还蛋白的抗体或其功能性片段，该抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

CDR1-VH：T-F-S-D-G-W-M-D；

CDR2-VH：L-R-N-D-A-H-N-H；

CDR3-VH：T-K-R-V-P-E-G-T；

CDR1-VL：Q-S-I-L-N-S-I-N-Q-K-N-Y；

CDR2-VL：F-G-S-T-R-D-S；

CDR3-VL：Q-Q-N-Y-T-T-P-P。

可选的，在本发明的一些实施方式中，上述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

通常情况下，重链可变区(VH)和轻链的可变区(VL)可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

可选的，在本发明的一些实施方式中，上述抗体还包含恒定区。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ IDNO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述功能性片段选自上述抗体的VHH、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。

上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

另一方面，本发明提供如上任一项所述的抗体或其功能性片段在制备以硫氧还蛋白为结合靶标试剂中的应用。

另一方面，本发明提供一种缀合物，其含有如上任一项所述的抗体或其功能性片段。

可选的，在本发明的一些实施方式中，上述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或观察到的特性例如发光、显色、放射性等或其他，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测的一类物质。例如在本发明的一些实施方式中，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述缀合物还含有融合有硫氧还蛋白的被标记物；所述抗体或其功能性片段与所述被标记物的硫氧还蛋白结合。

通过利用本发明的抗体或其功能性片段与硫氧还蛋白的特异性结合特点，可以间接地实现在被标记物上的标记。该被标记物可以是本领域技术人员跟感兴趣的任何物质，例如被标记物可以是多肽、酶、蛋白、小分子化合物、高分子聚合物、药物、抗原、甚至可以是抗体等物质，但不包括上述标记物、上述抗体或其功能性片段、硫氧还蛋白、非本发明的抗硫氧还蛋白的抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员可以根据需要合理选择，无论何种物质，其均属于本发明的保护范围。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述被标记物为抗原部分。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述抗原部分为传染性疾病、内分泌、肿瘤或药物相关的抗原。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述抗原部分为病毒性或细菌性疾病的相关抗原。

可选的，在本发明的一些实施方式中，所述抗原部分包括但不限于艾滋病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、丁型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、庚型肝炎病毒抗原、风疹病毒抗原、人巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒1型抗原、单纯疱疹病毒2型抗原、狂犬病毒抗原、人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、登革热病毒抗原、人乳头瘤病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、森林脑炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、水痘病毒抗原、艾柯病毒型抗原、柯萨奇病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、柯萨奇病毒抗原、EB病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、包柔氏螺旋体抗原、沙眼衣原体抗原、肺炎衣原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、解脲脲原体抗原、肺炎支原体抗原、结核分枝杆菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、淋球菌抗原、疟原虫抗原、枯氏锥虫抗原和弓形虫抗原。

对于抗原部分的具体类型，本领域技术人员可以根据实际的检测目的任意选择，包括但不限于上述所列举的抗原类型，利用本发明提供的抗体或其功能性片段均可以实现对抗原部分的间接标记并不影响该抗原部分与其相应抗体的结合活性，能够避免标记失活，提高检测的特异性和灵敏度。当然，需要说明的是，利用本发明提供的抗体或其功能性片段与硫氧还蛋白的结合特异性实现间接标记并不以避免标记失活作为唯一的目的，利用抗体或其功能性片段与硫氧还蛋白的结合特异性实现间接标记也能实现其他目的，这也是属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种诊断试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段，或者如上任一项所述的缀合物。

另一方面，本发明提供一种载体，其含有核酸分子，所述核酸分子编码如上任一项所述的抗体或其功能性片段。

在本发明公开了上述抗体或其功能性片段的氨基酸序列基础上，本领域技术人员根据氨基酸对应的密码子容易获得编码上述抗体或其功能性片段的核酸序列，并根据密码子的简并性，可以得到多种编码上述抗体或其功能性片段的核酸序列，无论是何种核酸序列，只要其编码上述抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有如上所述的载体。

另一方面，本发明提供一种生产如上任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。

另一方面，本发明提供一种检测硫氧还蛋白的方法，其包括：将如上任一项所述的抗体或其功能性片段与待测样品混合。

另一方面，本发明提供一种对抗原标记的方法，其包括：将融合有硫氧还蛋白的抗原与带有标记物的如上任一项所述的抗体或其功能性片段混合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例4的硫氧还蛋白的单克隆抗体进行还原性的SDS-PAGE。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

下文参考用于说明的实例应用描述了本发明的若干方面。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的充分理解。然而，相关领域普通技术人员将很容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个具体细节的情况下或用其它方法实践本发明。本发明不限于展示的活动或事件排序，因为一些活动可以以不同的顺序和/或与其它活动或者事件同时发生。此外，实施根据本发明的方法不需要所有展示的活动或事件。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

抗Trx杂交瘤细胞株的筛选

1.小鼠免疫

免疫抗原为硫氧还蛋白(Trx)，免疫剂量为100μg/只小鼠，免疫周期为14天，首次背部皮下多点免疫，其后3次免疫为腹腔注射，最后一针尾静脉加强免疫；免疫佐剂为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。

2.小鼠融合

将小鼠脾脏取出，在400目滤网上研磨获得分散的单个脾细胞，利用PEG将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，培养基终止后离心复溶铺96孔板，置于二氧化碳培养基中静置培养7天。实施例中的培养基购自Gibco的RPMI 1640培养基，胎牛血清购自四季青公司，PEG购于罗氏。

3.抗Trx杂交瘤单克隆抗体筛选

融合细胞于96孔板中培养7天，换液两次，取上清进行酶免间接法检测，包被抗原为Trx，根据检测结果选择OD相对高的孔进行有限稀释，静置培养7天，再取上清进行酶免间接法检测，根据检测结果选择OD相对高的孔进行有限稀释，静置培养7天，再取上清进行酶免间接法检测；如此重复有限稀释3-4次，当检测孔全部为阳性且孔内细胞为单克隆时挑OD值最高的细胞孔进行扩培保种，得到抗Trx杂交瘤细胞株6F8。

实施例2

表达质粒构建

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。取抗Trx杂交瘤单克隆6F8细胞株复苏备用。

1.抗体基因制备

从抗Trx杂交瘤细胞株6F8中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。

2.抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为342bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为369bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。

3.重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.4kb的Heavy Chain基因片段。

Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

实施例3

稳定细胞株筛选

1.重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性。

质粒用超纯水稀释至400μg/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

包被液(主要成分NaHCO₃)稀释Trx至3μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na₂HPO₄+NaCl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠-HRP，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50μl/孔，含2.1g/L柠檬酸、12.25g/L醋酸钠、0.07g/L乙酰苯胺和0.5g/L过氧化脲)，加入显色液B液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对Trx有活性。

2.重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50μl、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

3.重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株。

质粒用超纯水稀释至400μg/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×10⁶cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

实施例4

重组抗体生产

1.细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

2.摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图1所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为50KD(重链，SEQ ID NO.14)，另一条Mr为28KD(轻链，SEQ ID NO.13)。

实施例5

抗体的性能检测

(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测

进一步分析，实施例4的硫氧还蛋白的单克隆抗体(WT)的重链可变区如SEQ IDNO:12所示，其中，各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1-VH：T-F-S-D(X1)-G(X2)-W-M-D；

CDR2-VH：L(X1)-R-N-D(X2)-A-H-N-H；

CDR3-VH：T-K(X1)-R-V(X2)-P-E-G-T；

其轻链可变区如SEQ ID NO:11所示，其中，轻链的各互补决定区的氨基酸序列如下：

CDR1-VL：Q-S-I(X1)-L-N-S-I(X2)-N-Q-K-N-Y；

CDR2-VL：F-G(X1)-S-T-R-D(X2)-S；

CDR3-VL：Q-Q-N(X1)-Y-T(X2)-T-P-P。

在上述硫氧还蛋白的单克隆抗体基础上，经分析，在互补决定区中对于抗体活性和亲和力有关的位点进行突变，其中，X1、X2均为突变位点，见下表1。

表1与抗体活性有关的突变位点

分析发现，突变1的亲和力比WT的亲和力显著提升。进一步地，在突变1的基础之上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表2，并对表2中突变体进行亲和力的验证，表3为WT和基于突变1抗体突变体的亲和力检测结果。

表2与抗体亲和力有关的突变位点

亲和力检测：

利用AMC传感器，将纯化出来的抗体(表2中的突变抗体)用PBST稀释到10μg/ml，Trx蛋白用PBST进行梯度稀释：70μg/ml、35μg/ml、17.5μg/ml、8.75μg/ml、4.38μg/ml、2.19μg/ml、1.095μg/ml、0.548μg/ml。

运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体240s，缓冲液2(PBST)中孵育90s，抗原溶液中结合240s，缓冲液2中解离800s，用10mM pH 1.68GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据，见表3。K_D表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。

表3亲和力检测数据

表3数据显示，突变1的亲和力高于WT，此外，在突变1的基础上按表2中的突变方式进行突变后所得到的26种抗体，其亲和力也均明显高于WT。基于此，本领域技术人员可以预期到当上述抗体的CDR1-VH中的X1是D或E、CDR2-VH中的X1是L、V或I、CDR3-VH中的X2是L、V或I、CDR1-VL中的X2是V或I、CDR2-VL中的X2是D或E、以及CDR3-VL中的X1是N或H时，其均有较高的亲和力。

实施例6

抗体应用于HCV间接标记

将上述纯化出来的抗体突变1-12、带Trx的HCV重组抗原(Trx蛋白与HCV重组抗原的融合蛋白)、HCV包被抗原制备成HCV胶体金侧向层析检测试纸条，具体流程如下：

1.胶体金制备

在三角烧瓶中加入100ml超纯水，磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％氯金酸(Sigma-Aldrich公司，货号：16961-25-4)溶液，沸腾后立刻加入1ml1％柠檬酸三钠(Sigma-Aldrich公司，货号：6132-04-3)水溶液，继续沸腾10分钟，然后自然冷却即可。

2.胶体金标记

(1)标记间接标记胶体金偶合物

取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入170μl的0.2M K₂CO₃调节pH至7.5，继续搅拌20秒；加入终浓度为10μg/ml上述纯化单抗，继续搅拌10分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；8000g离心20分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(20mM PB，150mM NaCl，1％BSA，0.2％TritonX-100，2％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1ml；最后在该1ml胶体金标记的单抗复合物中加入2μg/ml的带Trx的HCV重组抗原，单抗与Trx特异性结合，实现HCV重组抗原的间接标记，充分混匀后放-4℃保存，将上述标记好的胶体金复合物命名为“HCV间接标记-Au”。

(2)标记直接标记胶体金偶合物

取10ml上述胶体金放入烧杯中，搅拌中加入170μl的0.2M K₂CO₃调节pH至7.5，继续搅拌20秒；加入2μg/ml的带Trx的HCV重组抗原，继续搅拌10分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；8000g离心20分钟，弃掉上清，将沉淀用胶体金稀释液(同上)定容至1ml，充分混匀后放-4℃保存，将上述标记好的胶体金复合物命名为“HCV直接标记-Au”。

3.金标垫制备

将上述胶体金复合物分别用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司)，冻干，即制成金标垫。

4.硝酸纤维素膜(NC膜)包被

用检测线稀释液(10mM PBS+2％蔗糖)稀释HCV包被抗原至0.5mg/ml制成检测线工作液，用点膜仪划线到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，37度干燥1小时。

5.组装

将上述两种金标垫，分别搭配包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫料组装成HCV金标检测试剂条，分别命名为“HCV间接标记胶体金检测试纸条”和“HCV直接标记胶体金检测试纸条”。

6.检测方法

加80μl待测样品(例如：血清)到样品垫处，室温放置15分钟之后，判定结果。

7性能比较

HCV间接标记与直接标记的胶体金检测试纸条性能比较：以浙江东方基因生物制品股份有限公司的HCV胶体金检测试剂盒作为对照，分别用上述制备好的间接标记与直接标记检测试剂条检测HCV阳性血清和阴性血清。结果显示使用本发明的HCV间接标记胶体金检测试纸条用于检测HCV抗体，其灵敏度、特异性等指标均显著优于HCV直接标记胶体金检测试纸条。

(1)灵敏度

用间接标记与直接标记的胶体金检测试剂条，在同样的条件下对100份系列稀释比例的血清进行检测，得到了表4的结果，对于所有稀释倍数的可检出血清，也基本上是HCV间接标记胶体金检测试纸条的灵敏度要明显高于HCV直接标记胶体金检测试纸条，此结果表明，HCV间接标记胶体金检测试纸条的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。

表4间接标记与直接标记的胶体金检测试剂条检测HCV抗体的灵敏度比较

(2)特异性

用间接标记与直接标记的胶体金检测试剂条，在同样的条件下对2000份临床阴性血清进行检测，结果是，HCV间接标记胶体金检测试纸条的特异性为99.4％，假阳率为0.6％，HCV直接标记胶体金检测试纸条的特异性为97.2％，假阳率为2.8％，此结果表明，HCV间接标记胶体金检测试纸条的特异性要显著好于HCV直接标记胶体金检测试纸条。

(3)稳定性

将本发明上述实施例中的HCV间接标记-Au标记物放在37℃考核7天，取出后与同时4℃存放的标记物，制备成HCV间接标记胶体金检测试纸条，在同一条件下检测相同的阴、阳性血清，以考察“HCV间接标记-Au”标记物的稳定性，结果如表5所示。

表5HCV间接标记-Au标记物稳定性实验结果

表5的实验结果表明，HCV间接标记-Au标记物放的稳定性较好。

实施例7

抗体应用于HEV间接标记

(1)间接标记的HEV胶体金检测试剂盒

用突变1抗体参照实施例6制备合适的胶体金和HEV抗原-胶体金间接标记复合物，将金标复合物用胶体金稀释液10倍稀释后浸泡玻璃纤维(Watman公司)，冻干，即制成金标垫。用检测线稀释液(10mM PBS+2％蔗糖)稀释抗人IgMμ链至0.8mg/ml制成检测线工作液，用同一稀释液稀释羊抗鼠IgM单抗至0.5mg/ml制成对照线工作液，用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，37度干燥1小时。将上述金标垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成HEV金标检测试剂盒。

检测方法：

加100ul待测样品(例如：血清)到样品垫处，室温放置20分钟之后，判定结果。结果判定标准如下：

①仅质控区出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性(-)；

②有两条条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，表示阳性(+)；

③质控区未出现条带，表明不正确的操作过程或检测卡已变质损坏。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。

(2)HEV直接标记的IgM纳米颗粒检测试剂盒的制备

取10ml实施例6制备的胶体金放入烧杯中，搅拌中加入150ul的0.2M K₂CO₃调节pH至7.0，继续搅拌20秒；加入一定量的Trx-HEV抗原，继续搅拌10分钟；加入0.1ml 10％BSA，继续搅拌5分钟；5000g离心10分钟，吸出上清，将沉淀收集至一合适容器；对上清再用10000g离心15分钟，重复第一次离心的操作；对上清再用12000g离心30分钟，弃掉上清，将三次离心的沉淀收集到同一离心管中，用胶体金稀释液(20mM PB，150mM NaCl，1％BSA，0.1％TritonX-100，2％Sucrose，0.01％Proclin300)定容至1ml。参照实施例6组装HEV直接标记的胶体金检测试纸条。

(3)HEV间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测效果的比较

分别比较了间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒检测HEV IgM阳性血清和阴性血清的效果。结果显示本发明的试剂盒用于检测HEV IgM抗体，其灵敏度、特异性等指标均显著优于直接标记的试剂盒。

7.1灵敏度

用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒，在同样的条件下对100份系列稀释比例的血清进行检测，得到了如下表6的结果，而且对于所有稀释倍数的可检出血清，也基本上是间接标记法的灵敏度要明显高于直接标记法，此结果表明，间接标记试剂盒的灵敏度要显著高于直接标记的试剂盒灵敏度。

表6

7.2特异性

用间接标记与直接标记的纳米颗粒检测试剂盒，在同样的条件下对1000份HEVIgM临床阴性血清进行检测，结果是，间接标记试剂盒的特异性为99.8％，假阳率为0.2％，直接标记试剂盒的特异性为98.5％，假阳率为1.5％，此结果表明，间接标记试剂盒的特异性要显著好于直接标记的试剂盒特异性。

7.3精密性

用间接标记的试剂盒检测同一份已知HEV IgM阳性标本，做10次重复检测，得到各检测条的结果均为阳性，且各检测条的显色程度也无显著差异，说明本试剂盒精密性较好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 菲鹏生物股份有限公司

<120> 抗硫氧还蛋白的抗体、其应用和诊断试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val

1 5 10 15

Tyr

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

20 25

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

1 5 10 15

Asp Ser Gln Ser Asn Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

20 25 30

Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

1 5 10 15

Ala

<210> 9

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 11

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser

20 25 30

Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Gly Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Asn Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 12

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Gly

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Leu Arg Asn Asp Ala His Asn His Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Asn

65 70 75 80

Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Lys Arg Val Pro Glu Gly Thr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 13

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Gly Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Asn Ser

20 25 30

Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Gly Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

Asn Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

115 120 125

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

145 150 155 160

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

180 185 190

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

195 200 205

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210 215 220

<210> 14

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Gly

20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Leu Arg Asn Asp Ala His Asn His Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Asn

65 70 75 80

Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Lys Arg Val Pro Glu Gly Thr Gly Ser Trp Phe Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro

115 120 125

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser

130 135 140

Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala

195 200 205

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

210 215 220

Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val

225 230 235 240

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr

245 250 255

Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln

275 280 285

Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser

290 295 300

Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys

305 310 315 320

Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro

340 345 350

Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met

355 360 365

Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr

385 390 395 400

Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn

405 410 415

Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu

420 425 430

His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440 445

Claims

1.一种抗硫氧还蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

互补决定区CDR1-VH，其氨基酸序列为T-F-S-X1-X2-W-M-D，其中，X1是D或E，X2是A；

互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为Q-S-X1-L-N-S-X2-N-Q-K-N-Y，其中，X1是L；X2是V或I；

互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为Q-Q-X1-Y-X2-T-P-P，其中，X1是N或H；X2是S；所述抗体或其功能性片段与硫氧还蛋白以K_D低于7.57×10^-10 mol/L数量级的亲和力结合。

2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述互补决定区CDR1-VH中，X1是E；

所述互补决定区CDR2-VH中，X1是V或I；

所述互补决定区CDR3-VH中，X2是L或I；

所述互补决定区CDR1-VL中，X2是V；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是E；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是H。

3.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述互补决定区CDR1-VH中，X1是D；

所述互补决定区CDR2-VH中，X1是L；

所述互补决定区CDR3-VH中，X2是V；

所述互补决定区CDR1-VL中，X2是I；

所述互补决定区CDR2-VL中，X2是D；

所述互补决定区CDR3-VL中，X1是N。

4.一种抗硫氧还蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

互补决定区CDR1-VH，其氨基酸序列为T-F-S-X1-A-W-M-D；

互补决定区CDR2-VH，其氨基酸序列为X1-R-N-N-A-H-N-H-R-T；

互补决定区CDR3-VH，其氨基酸序列为T-R-R-X2-P-E-G-T；

互补决定区CDR1-VL，其氨基酸序列为Q-S-L-L-N-S-X2-N-Q-K-N-Y；

互补决定区CDR2-VL，其氨基酸序列为F-A-S-T-R-X2-S；

互补决定区CDR3-VL，其氨基酸序列为Q-Q-X1-Y-S-T-P-P；

所述抗体或其功能性片段的各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1-27中的任一种：

CDR1-VH X1 CDR2-VHX1 CDR3-VHX2 CDR1-VL X2 CDR2-VL X2 CDR3-VLX1 突变组合1 D L V I D N 突变组合2 E I V I E N 突变组合3 D V L V D H 突变组合4 E V V V E H 突变组合5 D L L I D H 突变组合6 E V L V E N 突变组合7 D L V I E N 突变组合8 E V I I E N 突变组合9 D V L V E N 突变组合10 E V L I E H 突变组合11 D L I V D N 突变组合12 E L V V D H 突变组合13 D I L I E H 突变组合14 E L V V E H 突变组合15 D V I I E N 突变组合16 E I L I E H 突变组合17 D I V V E H 突变组合18 E L L I E N 突变组合19 D L L V D N 突变组合20 E L V V D N 突变组合21 D I I I D H 突变组合22 E I L V E H 突变组合23 D L I I E H 突变组合24 E L I I D N 突变组合25 D L L V D H 突变组合26 E V I I E H 突变组合27 D L V V E N

。

5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能片段以K_D≤7.57×10^-10 mol/L的亲和力结合硫氧还蛋白。

6.一种抗硫氧还蛋白的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括如下互补决定区：

CDR1-VH：T-F-S-D-G-W-M-D；

CDR2-VH：L-R-N-D-A-H-N-H；

CDR3-VH：T-K-R-V-P-E-G-T；

CDR1-VL：Q-S-I-L-N-S-I-N-Q-K-N-Y；

CDR2-VL：F-G-S-T-R-D-S；

CDR3-VL：Q-Q-N-Y-T-T-P-P。

7.根据权利要求6所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ IDNO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

8.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体还包含恒定区。

9.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

10.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

11.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述牛选自乳牛，所述鸡选自火鸡或斗鸡。

12.根据权利要求10所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。

13.根据权利要求8所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述恒定区的轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。

14.根据权利要求7所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

15.权利要求1-14任一项所述的抗体或其功能性片段在制备以硫氧还蛋白为结合靶标试剂中的应用。

16.一种缀合物，其特征在于，其含有如权利要求1-14任一项所述的抗体或其功能性片段。

17.根据权利要求16所述的缀合物，其特征在于，所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。

18.根据权利要求17所述的缀合物，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

19.根据权利要求18所述的缀合物，其特征在于，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物。

20.根据权利要求18所述的缀合物，其特征在于，所述催化底物显色的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

21.根据权利要求18所述的缀合物，其特征在于，所述放射性同位素选自²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F。

22.根据权利要求18所述的缀合物，其特征在于，所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

23.根据权利要求18所述的缀合物，其特征在于，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒、胶体。

24.根据权利要求23所述的缀合物，其特征在于，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。

25.根据权利要求23所述的缀合物，其特征在于，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

26.根据权利要求25所述的缀合物，其特征在于，所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒。

27.根据权利要求16所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物还含有融合有硫氧还蛋白的被标记物；所述抗体或其功能性片段与所述被标记物的硫氧还蛋白结合。

28.根据权利要求27所述的缀合物，其特征在于，所述被标记物为抗原部分。

29.根据权利要求28所述的缀合物，其特征在于，所述抗原部分为传染性疾病、内分泌、肿瘤或药物相关的抗原。

30.根据权利要求28所述的缀合物，其特征在于，所述抗原部分为病毒性或细菌性疾病的相关抗原。

31.根据权利要求28所述的缀合物，其特征在于，所述抗原部分选自艾滋病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、丁型肝炎病毒抗原、戊型肝炎病毒抗原、庚型肝炎病毒抗原、风疹病毒抗原、人巨细胞病毒抗原、单纯疱疹病毒1型抗原、单纯疱疹病毒2型抗原、狂犬病毒抗原、人类T淋巴细胞白血病病毒抗原、登革热病毒抗原、人乳头瘤病毒抗原、西尼罗河病毒抗原、森林脑炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、副流感病毒抗原、水痘病毒抗原、艾柯病毒型抗原、柯萨奇病毒抗原、乙型脑炎病毒抗原、EB病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、梅毒螺旋体抗原、包柔氏螺旋体抗原、沙眼衣原体抗原、肺炎衣原体抗原、鹦鹉热衣原体抗原、解脲脲原体抗原、肺炎支原体抗原、结核分枝杆菌抗原、幽门螺旋杆菌抗原、淋球菌抗原、疟原虫抗原、枯氏锥虫抗原和弓形虫抗原。

32.一种诊断试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-14任一项所述的抗体或其功能性片段，或者权利要求16-31任一项所述的缀合物。

33.一种载体，其特征在于，其含有核酸分子，所述核酸分子编码如权利要求1-14任一项所述的抗体或其功能性片段。