JP2634374B2

JP2634374B2 - 微量アナライト物質または生物体の測定装置

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Publication number: JP2634374B2
Application number: JP5273573A
Authority: JP
Inventors: 通宏中村; 聡美松井; 桂子岡; 仁志鶴田
Original assignee: BAIO SENSAA KENKYUSHO KK
Current assignee: BAIO SENSAA KENKYUSHO KK
Priority date: 1993-11-01
Filing date: 1993-11-01
Publication date: 1997-07-23
Anticipated expiration: 2012-07-23
Also published as: US5674696A; EP0651251B1; DE69429961T2; EP0651251A2; JPH07128281A; DE69429961D1; EP0651251A3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微量アナライト物質また
は生物体の測定装置、特に、測定対象となるアナライト
物質または生物体の生理活性に基づく基質溶液のｐＨ変
化を利用して、生体試料のような多成分系に微量含まれ
る特定の物質または生物体を定量的に測定するのに適し
た装置に関する。本発明の装置は、臨床検査における微
量生体物質の測定のみならず、基礎医学、獣医学、生化
学、薬理学等広い分野への適用が可能である。

【０００２】

【従来の技術】生体の生理活性に関与する物質は概して
微量であり、しかも生体に対して非常に重要な役割を演
じるものが少なくない。したがって、このような微量の
生理活性物質を定量的に測定することは医学、生化学等
の生物関連分野においては重要であり、そのために種々
の方法が考案され、実用化されている。例えば、かかる
生理活性物質の一つである酵素に対しては、該酵素に対
する基質溶液を作用させ、該基質溶液の光学的性質の変
化を測定する測定方法が一般的に採用されている。ま
た、細胞、微生物等の生物体も生理活性を有するもので
あり、上記生理活性物質と同様、これらを定量的に測定
することは上記生物関連分野においては重要である。か
かる生物体の測定方法としては、例えば、細胞に対して
は、該細胞を培養した後顕微鏡による観察を行う方法、
フローサイトメトリ法あるいはロゼット法［月刊 Medic
al Technology 編、「細胞免疫機能検査のすべて」、医
歯薬出版（１９８５年発行）参照］が多用されており、
最近では遺伝子による検出法［例えば、斎藤隆監訳、
「ＰＣＲ実験マニュアル」、ＨＢＪ出版局、（１９９１
年発行）参照］も活発化しつつある。また、微生物に対
しては、従来から行われている顕微鏡による観察を行う
方法に加え、近年では遺伝子による検出法も普及しつつ
ある。しかしながら、これらの方法はいずれも繁雑な操
作と熟練、さらには高価な測定装置を必要とする。

【０００３】本発明者らは、微量アナライト物質の測定
方法および測定装置として、アナライト−レセプタ反応
を終えた固相と基質溶液を接触させて、該基質溶液中の
基質の分解反応に伴う基質溶液のｐＨ変化を利用した微
量アナライト物質の測定方法であって、上記固相を基質
溶液のｐＨ変化を測定するｐＨ電極のｐＨ感応面との間
隙が１ｍｍ以下となるように対面配置して、該間隙内に
おける基質溶液のｐＨ変化を測定することを特徴とする
微量アナライト物質の測定方法および該方法を実施する
ための装置を提案した（特開平１−２１２３４７号参
照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の装置は、不均一
法ＥＩＡ、いわゆるエリサ（ＥＬＩＳＡ： Enzyme Link
ed Immuno Sorbent Assay）法を想定しており、主とし
てそれ自体では基質溶液のｐＨを変化させる能力（以
下、これをｐＨ変化誘引能という）を有しないアナライ
ト物質を測定対象としている。したがって、固相とアナ
ライト間の第一免疫反応を行ってアナライト物質を固相
表面に捕捉した後、ウレアーゼ等のｐＨ変化誘引能を有
する酵素で標識した第二レセプタを上記固相表面に捕捉
したアナライト物質に結合させるか（サンドイッチ法）
またはｐＨ変化誘引能を有する酵素で標識したアナライ
トを固相と反応させる（競合法）等の第二免疫反応を行
う必要がある。すなわち、ＥＬＩＳＡの装置において
は、第一免疫反応→第一の洗浄→第二免疫反応→第二の
洗浄→ｐＨ変化の測定という一連の操作が必要であり、
操作が繁雑であるとともに、これらの操作すべてを自動
化すると大がかりな装置とならざるを得なかった。これ
に対して、酵素、細胞、微生物等、それ自体でｐＨ変化
誘引能を有する物質や生物体が測定対象であれば、ウレ
アーゼ等のｐＨ変化誘引能を有する酵素で標識した第二
レセプタを測定対象たるアナライト物質に結合させるこ
とは必ずしも必要ではなく、アナライト物質または生物
体を固相表面に捕捉し、洗浄を行った後に基質溶液のｐ
Ｈ変化を測定すればよい。

【０００５】本発明は上記の問題に鑑みてなされたもの
であって、アナライト物質や生物体を捕捉した後の固相
の洗浄と基質溶液のｐＨ変化の測定を同一のセル内で行
えるように工夫して簡単な操作によって、ｐＨ変化誘引
能を有する微量アナライト物質や生物体を測定すること
のできる簡略化された装置を提供することを目的とす
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記の
課題は、少なくともその内壁面上にｐＨ変化誘引能を有
する微量アナライト物質または生物体を捕捉した細径管
に基質溶液を接触させて、該細径管内部における該基質
溶液中の基質の反応に伴うｐＨ変化を利用して微量アナ
ライト物質または生物体の測定を行う装置であって、該
装置は、基質溶液の入口と出口を有するセルと、該セル
内に収容されたｐＨ電極と、該セル内に上記基質溶液を
供給するポンプ手段と、少なくともその内壁面上に測定
対象となるｐＨ変化誘引能を有するアナライト物質また
は生物体を捕捉した細径管を該セル内に収納したとき
に、セル内に収納された細径管の内壁面とｐＨ電極のｐ
Ｈ感応面を１ｍｍ以下の間隙にて対面配置させる位置決
め手段と、セル内に収納された細径管の外壁と該セルの
内壁とで形成される空間を液密状態に保持するシール手
段よりなることを特徴とする微量アナライト物質または
生物体の測定装置を提供することによって達成される。

【０００７】

【作用】本発明の装置は、ｐＨ変化誘引能を有する微量
アナライト物質または生物体を捕捉した細径管に基質溶
液を接触させて、該基質溶液中の基質の反応に伴うｐＨ
変化を測定するので、測定対象であるｐＨ変化誘引能を
有する微量アナライト物質または生物体を高感度で測定
することができる。なお、本明細書においては、基質の
反応とは、酵素等による基質の分解、酸化、還元、転
移、加水分解、脱離、異性化、重合等の各種反応、およ
び生物体による基質の代謝を意味する。また、本発明の
装置はセル内に収納された細径管の外壁と該セルの内壁
とで形成される空間が液密状態にシールされており、ポ
ンプ手段によってセル内に供給される基質溶液が細径管
内部を流通するので、該細径管内部が該基質溶液によっ
て自動的に洗浄される。かくして、一つのセルで細径管
内部の洗浄とｐＨ変化の測定を行うことができ、測定装
置が簡略化されるとともに測定操作も簡便になる。

【０００８】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面にしたがって説
明する。図１に本発明装置の一実施例の概略構成を示
す。図１に示されるように本発明の装置は、基質溶液の
入口２と出口３を有するセル４と、該セル４内に収容さ
れたｐＨ電極５と、該セル４内に上記基質溶液を供給す
るポンプ手段６と、測定対象となるｐＨ変化誘引能を有
するアナライト物質または生物体を少なくともその内壁
面上に捕捉した細径管１を該セル４内に収納したとき
に、セル内に収納された細径管１の内壁面とｐＨ電極の
ｐＨ感応面とをその間隔が１ｍｍ以下となるように対面
配置する位置決め手段７と、セル内に収納された細径管
１の外壁と該セル４の内壁とで形成される空間を液密状
態に保持するシール手段８より構成されている。９は比
較電極、１０は基質溶液を貯留する液溜め、１１はｐＨ
電極作動回路であり、１２はポンプの動作を制御し、か
つｐＨ電極の信号を読取り表示する手段である。

【０００９】セル４は、上下部に円筒状の太径部、中間
部に細径部を有し、かつ太径部の両端は開口している。
そして、下部太径部に基質溶液の入口２、上部太径部に
基質溶液の出口３が取り付けられている。セル４の下端
開口には後に記載するｐＨ電極５および比較電極９をセ
ル内に液密に収容するための電気絶縁樹脂１３で閉塞さ
れている。セル４の材質としてはプラスチック、金属、
無機ガラスなどを用いることができる。

【００１０】上記セル４内に収容されるｐＨ電極５とし
ては従来から最も多用されているいわゆるガラス電極の
他に、ｐＨ感応性電界効果トランジスタ（以下ｐＨ−Ｆ
ＥＴという）、酸化パラジウム／パラジウムワイヤ等の
表面酸化金属線タイプのｐＨ電極、プロトン受容体を含
有するｐＨ感応性高分子膜を金属線や炭素線にコートし
た、コーテイドワイヤ型のｐＨ電極等、各種の微小ｐＨ
電極を用いることができる。しかしながら、ガラス電極
型のｐＨ電極は細径化すると、誘導ノイズが増大する傾
向がある。表面酸化金属線型ｐＨ電極は細径化が容易で
あるが、長期の水中寿命等に難点がある。コーテイドワ
イヤ型のｐＨ電極も細径化が容易であるが、ｐＨ変化に
対する直線応答域が狭い、水中寿命が短いなどの難点が
ある。そのためこれらのｐＨ電極を使用する場合には上
記問題点を予め解消しておく必要がある。

【００１１】これに対してｐＨ−ＦＥＴは（１）細径化
が容易である、（２）細径化したときの誘導ノイズが少
ない、（３）ＩＣ技術で製造するので、電極間の特性の
バラつきが小さくでき、かつｐＨ感応面（ゲート部）を
微小化することができる、（４）ｐＨ変化に対する応答
が極めて速く、かつ応答曲線にヒステリシスが残らな
い、（５）ｐＨ変化に対する直線応答域が広い、（６）
水中の保存寿命が半永久的で、かつｐＨ感度等の特性の
経時変化が少ない、等の優れた特徴を有しているので本
発明装置に用いるｐＨ電極としては最適である。ｐＨ−
ＦＥＴとしては（１）全周絶縁型（特公昭５７−４３８
６３号参照）、（２）接合分離型（実公昭５８−５２４
５号参照）、（３）ＳＯＳ型（特開昭５９−４８６４６
号参照）等いくつかのタイプが知られている。本発明に
おいてはこれらのいずれのタイプのものを用いてもかま
わないが、その構造は基本的に、（１）その先端近傍に
ｐＨ感応面を有し、（２）該ｐＨ感応面を含む素子先端
部が、測定対象物質を捕捉した細径管内に挿入可能な太
さであり、（３）素子先端部の長さは１〜１０ｍｍ、好
ましくは１〜３ｍｍであり、（４）素子先端部の上・下
面、側面全ての面が外部溶液との間で電気的に絶縁され
ていることが必要である。

【００１２】素子先端部の太さとしては、内径２．０ｍ
ｍ以下、通常内径０．８ｍｍ以下の細径管内に入るもの
であることが望ましい。例えば細径管の内径が０．５５
ｍｍであれば、素子先端部の幅としては０．４５ｍｍ以
下、厚みとしては０．２０ｍｍ以下であれば十分であ
る。素子先端部の長さが１０ｍｍ以上になると折れやす
くなり、細径管の測定対象となるアナライト物質または
生物体を捕捉する部分の必要長が大きくなる等の点で問
題が生じてくる。また、長さが１ｍｍ以下になると、素
子先端部の細径管内への挿入長が短くなりすぎ、そのた
めに細径管内における基質の反応が細径管外の溶液の影
響を受けやすくなるので好ましくない。

【００１３】本発明に用いられるｐＨ−ＦＥＴは、２５
℃において４０ないし６０ｍＶ／ｐＨ、さらには５０な
いし６０ｍＶ／ｐＨのｐＨ感度を有することが望まし
い。またｐＨ感応膜としては窒化ケイ素、酸化アルミニ
ウム、酸化タンタル等の水中安定性のすぐれたものを採
用することが望ましい。特に酸化タンタルや酸化アルミ
ニウムは水中での安定性、ｐＨ応答特性等の点で優れて
いる。酸化タンタルをｐＨ感応膜とするｐＨ−ＦＥＴは
本発明に用いるｐＨ電極として適している。本発明の装
置を用いてｐＨ変化誘引能を有する微量アナライト物質
または生物体の測定を行うためには、ｐＨ−ＦＥＴはノ
イズレベルの極めて低い（定ｐＨ下で通常０．０５ｍＶ
以下）ものを用いることが好ましい。そのためには、相
互コンダクタンスが５０マイクロジーメンス、好ましく
は１００マイクロジーメンス、より好ましくは２００マ
イクロジーメンス以上のものを用いることが望ましい。
また、ｐＨ−ＦＥＴの素子先端部と外部電極とを室温の
生理食塩水中につけて、ｐＨ−ＦＥＴのソース電極と外
部電極との間に３Ｖの電圧をかけた時のもれ電流が３０
ｎＡ以下、好ましくは１０ｎＡ以下であることが望まし
い。相互コンダクタンスが５０マイクロジーメンス以下
であったり、上記もれ電流が３０ｎＡ以上であったりす
ると、測定時のノイズが大きくなる。

【００１４】比較電極９としては、飽和カンコウ電極や
銀−塩化銀電極等の液絡式比較電極、イオン不感応性膜
をゲート膜とする電界効果トランジスタ（特公昭５８−
２５２２１号参照）、あるいはイオン不感応性膜を金属
線や炭素線にコートしたコーテイドワイヤ型の比較電極
等を用いることができる。本発明の装置にはいずれの方
式の比較電極を用いてもかまわないが、現時点では液絡
式比較電極が最も信頼性が高く好ましく用いられる。比
較電極のセル内への設備場所としては通常第１図に示し
たように、セル４の下部太径部で、かつｐＨ電極のｐＨ
感応面と液絡している場所に取り付けることが好まし
い。また、比較電極９は、ｐＨ電極のｐＨ感応面と液絡
している場所であればいずれに収容してもよく、例え
ば、ポンプ６とセル４の入口２との間などセル外に設置
することも可能である。

【００１５】セル４内に基質溶液を供給するポンプ手段
６としては、５〜１０００ｍｌ／ｈの流速が得られるも
のであればよく、例えば、ペリスタポンプ、シリンジポ
ンプ等、従来より公知のものが特に制限なく使用でき
る。

【００１６】細径管１の位置決め手段としては、細径管
１の内表面とｐＨ電極５のｐＨ感応面との間隙を調整す
る公知の手段を採用できる。例えば、細径管１を直径方
向に移動可能としてもよいし、あるいは、図１に示すよ
うに、セル４の上部太径部を細径管１に対するガイドと
することもできる。上記細径管の位置決め手段によっ
て、細径管１の内表面とｐＨ電極のｐＨ感応面の距離を
１．０ｍｍ以下、好ましくは０．５ｍｍ以下に設定す
る。上記の細径管１の内表面とｐＨ感応面との距離が
１．０ｍｍ以上になると細径管１の内表面とｐＨ感応面
の間隙に封入された基質溶液のｐＨ変化速度が急激に遅
くなるために、高い検出感度を達成することが事実上不
可能となる。

【００１７】セル内に収納された細径管１の外壁と該セ
ル４の内壁とで形成される空間を液密状態に保持するシ
ール手段８としては、上記空間の液密状態を保持する機
能を有するものであれば特に制限はないが、通常、Ｏリ
ングやテーパが使用される。

【００１８】細径管１は、少なくともｐＨ電極のｐＨ感
応面が十分にその中に入り得る長さであることが必要で
ある。例えば、ｐＨ電極のｐＨ感応面の長さが１．５ｍ
ｍであれば、細径管１の測定対象となるアナライト物質
または生物体を捕捉する部分の長さは通常３ｍｍ以上で
ある。細径管全体の形状としては、測定対象となるアナ
ライト物質または生物体を捕捉する部分が上記の条件を
満たすものであれば、任意の形状のものを使用すること
ができ、細径管部と太径管部とから成るピペットチップ
形状としてもよい。

【００１９】細径管１の材質としては、例えば、ポリス
チレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフ
ロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレ
ート、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコ
ール共重合体等のポリオレフイン系ポリマー、ポリエチ
レンテレフタレートやポリブチレンテレフタレート等の
ポリエステル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の
ポリシロキサン系ポリマー、６ナイロン、６，６−ナイ
ロン等のポリアミド系ポリマー、ポリカーボネート、酢
酸セルロースやニトロセルロースのようなセルロース系
ポリマー、さらには各種無機ガラスを用いることができ
る。

【００２０】細径管１は、少なくともその内壁面上にｐ
Ｈ変化誘引能を有する微量アナライト物質または生物体
を捕捉し得るものであることが必要である。上記の素材
からなる細径管１に、測定対象となる上記微量アナライ
ト物質または生物体を捕捉する機能を付与する手段とし
ては、公知の手段を使用することができる。例えば、酵
素のような蛋白質分子を捕捉する場合にあっては、細径
管１の少なくとも内壁面上に該蛋白質分子に対する抗体
を該蛋白質分子のレセプタとして固定化し、しかる後
に、牛血清アルブミン等のブロッキング剤を吸着させる
方法が挙げられるが、その他酵素免疫測定の分野におい
て公知の方法［例えば、石川他著、「酵素免疫測定法、
第三版」、医学書院発行（１９８７年）参照］が適宜使
用できる。一方、細胞、微生物等の生物体を捕捉する場
合にあっては、細径管１の少なくとも内壁面上に該生物
体の表面に露出している各種蛋白質分子に対する抗体、
同生物体の表面に露出している各種受容体に対するリガ
ンド分子またはその部分ペプチド、あるいは同生物体の
表面に露出している各種細胞接着因子に対する受容体ま
たはその部分ペプチドを固定化し、上記と同様にブロッ
キングしておけばよい。

【００２１】本発明の装置は、ｐＨ変化誘引能を有する
アナライト物質または生物体を測定対象とする。かかる
物質または生物体として、例えば、酵素、細胞、微生
物、およびミトコンドリア等のオルガネラ、などを挙げ
ることができる。

【００２２】セル内に供給される基質溶液は、測定対象
となるアナライト物質または生物体に応じたものを使用
する必要がある。例えば、測定対象が酵素である場合に
は、基質溶液として、該酵素の作用を受けてｐＨ変化を
誘引する基質を含む溶液が使用される。かかる酵素と基
質の組み合わせとしては、例えばアルコールデヒドロゲ
ナーゼ／アルコール、グルコースオキシダーゼ／グルコ
ース、カテコールオキシダーゼ／カテコール、ＮＡＤＨ
ペルオキシダーゼ／ＮＡＤＨ、リパーゼ／トリアシルグ
リセロール、アセチルエステラーゼ／酢酸エステル、ア
セチルコリンエステラーゼ／アセチルコリン、グルコノ
ラクトナーゼ／グルコノラクトン、アルカリフォスファ
ターゼ／ｐ−ニトロフェノールリン酸、アリルサルファ
ターゼ／アリルサルフェート、ウレアーゼ／尿素等を挙
げることができる。また、細胞、微生物等の生物体を測
定対象とする場合には、基質溶液として、これら生物体
によって代謝されてｐＨ変化を誘引する基質を含む培養
液を使用すればよい。このような基質としては、例えば
グルコース、フラクトース、シュクロース等の糖類が最
も一般的である。この場合、該生物体の代謝作用によっ
て敏感にｐＨが変化するような緩衝能の弱い培養液を使
用することが好ましい。

【００２３】以下、本発明装置を用いた測定方法を、図
３を参照して説明する。まず、上記のｐＨ変化誘引能を
有する物質または生物体を捕捉し得る細径管１の先端部
に試料溶液を吸引し、一定時間静置する。かかる操作に
より、細径管１の内壁面上に測定対象たるｐＨ変化誘引
能を有するアナライト物質または生物体が捕捉される。
なお、細径管１の先端部を試料溶液に浸漬し、一定時間
インキュベートすることによって測定対象たるｐＨ変化
誘引能を有するアナライト物質または生物体を細径管１
の内壁面上に捕捉してもよい。

【００２４】つぎに、上記のようにしてｐＨ変化誘引能
を有するアナライト物質または生物体を内壁面上に捕捉
した細径管１を、セル４の上端開口よりセル４内に手動
により挿入して、ｐＨ電極のｐＨ感応面を該細径管１の
内壁で完全に取り囲むようにする。この際、シール手段
８によってセル４内に収納された細径管１の外壁と該セ
ル４の内壁とで形成される空間は液密状態にシールされ
る。なお、細径管１をセル内に挿入する操作については
別途に細径管収納手段を設けて自動化してもよい。かか
る細径管収納手段としては、例えば、特開平１−２１２
３４７号に記載されているような公知の手段を採用する
ことができる。

【００２５】上記のようにして細径管１をセル４内に収
納した状態で、送液ポンプ６により基質溶液を液溜め１
０よりセル４内に供給する。セル４内に供給された基質
溶液は、細径管１の内部をその下部から上部へ向かって
流れ、セル４の出口３より排出される。かくして細径管
１の内部が基質溶液によって自動的に洗浄される。この
細径管内部の洗浄の際には、細径管内部で基質溶液中の
基質の反応が起こり該基質溶液のｐＨ変化が進行する
が、基質溶液の送液速度を十分に高く保つことにより、
ｐＨ変化をほぼ０とすることができる。なお、送液ポン
プ６により基質溶液を液溜め１０よりセル４内に供給し
つつ細径管１をセル４内に挿入すれば、細径管１のセル
４内への挿入と細径管内部の洗浄とを一連の操作で行う
ことができ、簡便である。

【００２６】基質溶液を十分に供給し、細径管１の内部
の洗浄が終了した時点で送液を停止する。その後、基質
溶液中の基質の反応に伴う細径管１の内部での基質溶液
のｐＨ変化を測定する。このときのｐＨ変化速度から、
試料溶液中の測定対象物質であるアナライト物質または
生物体の濃度を求めることができる。

【００２７】測定終了後、細径管１をセル４から抜き出
し、再び送液ポンプ６により基質溶液を液溜め１０より
セル４内に供給する。かくして、セル４の内部が自動的
に洗浄される。

【００２８】図２は本発明の第二の実施例を示す。この
図において、セル４の上部太径部７は、細径管１に対す
るガイドとしての機能を有しており、細径管１の位置決
め手段としての役割を果たすとともに、テーパ状の構造
をしていることから、細径管１の外壁と該セル４の内壁
とで形成される空間を液密状態に保持するシール手段と
しての役割を果たしている。セル４の上部太径部をこの
ようなテーパ状の構造とすれば、細径管１の位置決め手
段とシール手段を１つにすることができ、実用的であり
好ましい。なお、その他の構成は、図１に示す第一の実
施例と同様であり、同一部分または相当部分に同一符号
を付して、その説明を省略する。

【００２９】上記各実施例では、細径管１はセル４の上
方から挿入されるが、セル４の形状を適宜変更すれば、
細径管１をセルの横方向あるいはセルの下方向から挿入
することも可能である。

【００３０】つぎに本発明装置の効果をより明瞭にする
ために、以下に試験例を示す。試験例１（ウレアーゼの測定）Ａ．測定装置の組み立て図１に示す装置を製作した。ｐＨ電極５としては、特公
昭５７−４３８６３号に記載の方法で製造された全周絶
縁型のｐＨ−ＦＥＴのゲート部に、タンタル酸化物をｐ
Ｈ感応膜として蒸着したものを用いた。このｐＨ−ＦＥ
Ｔの全体の寸法は長さ５．５ｍｍ、幅０．４５ｍｍ、厚
み０．１５ｍｍで、その先端０．８ｍｍの部分にゲート
部（ｐＨ感応面）が設けられている。このｐＨ−ＦＥＴ
をゲート部を含む先端約１．５ｍｍ程度をセル内に露出
させ、残りの部分を樹脂で絶縁した。細径管としては内
径０．５５ｍｍ、外径１．０ｍｍ、長さ３０ｍｍのポリ
プロピレン製チューブを用い、該細径管１の内径中心部
にｐＨ−ＦＥＴが収容されるようにセル４の上部太径部
７を設計した。この場合ｐＨ−ＦＥＴのｐＨ感応面と細
径管１の内壁面の間隙の最大値は（０．５５−０．１
５）／２＝０．２０ｍｍであった。シール手段８として
は内径１ｍｍのＯリングを用いた。比較電極９としては
銀／塩化銀型の液絡式比較電極を用い、セル４内の下部
太径部に設置した。ポンプ６としてはペリスタポンプを
用い流速を０．５ｍｌ／分に設定した。使用したｐＨ−
ＦＥＴのｐＨ感度は２５℃で５８ｍＶ／ｐＨ、相互コン
ダクタンスは３５０マイクロジーメンスであった。ｐＨ
−ＦＥＴの作動は、ドレイン電圧４ボルト、ドレイン電
流１００μＡで定電流回路に接続して行った。またｐＨ
−ＦＥＴの出力信号としては比較電極９を基準とするｐ
Ｈ−ＦＥＴのソースの電位（以下これをソース電位と略
称する）を測定した。

【００３１】Ｂ．細径管への抗ウレアーゼ抗体の固定ウレアーゼのレセプタとして抗ウレアーゼ抗体（シグマ
社製、ナタマメ由来ウレアーゼを免疫源とするマウスモ
ノクローナル抗体、クローンＵＲ−２５）を選び、上
記の細径管１に次のようにして固定した。１００μｇ／
ｍｌの上記抗ウレアーゼ抗体を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ
７．４）を調製し、該溶液１μｌを上記ポリプロピレン
製チューブの先端内部にマイクロピペッタで注入し、つ
いで、保湿箱中、室温下２４時間静置することにより、
該チューブ先端内壁面上に抗ウレアーゼ抗体を固定化し
た。該チューブ先端部に残留した、抗ウレアーゼ抗体を
含むＰＢＳ溶液を紙タオルで吸い取ることによって除去
した後、該チューブをシュクロース１０％、牛血清アル
ブミン１％およびアジ化ナトリウム０．１％を含むＰＢ
Ｓ溶液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、次いで４℃にて２４
時間静置することにより、ブロッキング処理を行った。

【００３２】Ｃ．ウレアーゼの測定ウレアーゼとしてナタマメ由来のもの（シグマ社製、Ｕ
３７６）を使用した。該ウレアーゼを牛血清アルブミン
１％、ＥＤＴＡ１ｍＭおよびアジ化ナトリウム０．１
％を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に所定の濃度となる
ように溶解し、試料溶液とした。該試料溶液１μｌを上
記（試験例１のＢ）にて得られた、抗ウレアーゼ抗体を
内壁面上に固定化した細径管１内に吸引し、次いで室温
にて１０分間静置することによりウレアーゼを該細径管
１の内壁面上に捕捉した。基質溶液として尿素１５５ｍ
Ｍ、塩基アンモニウム１０ｍＭ、食塩１５４ｍＭを含む
ＰＢＳ溶液を使用し、ペリスタポンプ６を駆動して、基
質溶液をセル４内に供給しつつ、ウレアーゼを内壁面上
に捕捉した細径管１を図３のようにセル４内に挿入し、
該細径管１の内部を３０秒間洗浄した。その後、ペリス
タポンプ６を停止し、その直後から１０秒間のソース電
位の変化を測定し、その変化速度を最小二乗法により求
めた。測定終了後、上記細径管１をセル４から抜き出
し、ペリスタポンプ６を２０秒間駆動して、基質溶液を
セル４に供給し、セル４の洗浄を行い次の測定に備え
た。測定結果を図４に示した。図４から明らかなよう
に、１μｌの試料溶液中の０．５ｎｇ／ｍｌ（ウレアー
ゼの分子量を５６万とすれば、約８×１０^-13Ｍ）のウ
レアーゼを検出することができる。すなわち絶対量で８
×１０^-19モルのウレアーゼを検出することが可能であ
る。

【００３３】試験例２（マウスＴリンパ球内のＬｙｔ−
２陽性サブセットの測定）Ａ．細径管への抗マウスＬｙｔ−２，１抗体の固定化マウスのＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞のレセプタとして抗マウ
スＬｙｔ−２，１抗体（コスモバイオ社製、クローン４
９−３１，１）を使用した。１０μｇ／ｍｌの抗マウス
Ｌｙｔ−２，１抗体を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を
調製し、該溶液１μｌを使用して、試験例１のＢと同様
の操作により、試験例１において使用したのと同じポリ
プロピレン製チューブの先端内壁面上に抗マウスＬｙｔ
−２，１抗体を固定化した。ついで、試験例１のＢと同
様の操作によってブロッキング処理を行った。

【００３４】Ｂ．マウスＬｙｔ−２陽性、および陰性Ｔ
細胞の分離、培養５０μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｃａｐｐｅｌ
社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）３ｍｌを直径６
ｃｍのプラスチック製シャーレ（Ｆａｌｃｏｎ社製＃
３００２）に入れ、ついで、４℃にて２４時間静置する
ことにより、該ヤギ抗マウスＩｇ抗体を該シャーレに吸
着させた。マウスのヒ臓から通常の比重遠心法によって
分離したリンパ球画分の細胞３×１０⁷個を３ｍｌの５
％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０（培地、ＧＩＢＣＯ社
製、＃３２０−１８９５ＰＫ）に浮遊させ、上記のヤギ
抗マウスＩｇ抗体を吸着させたシャーレ１枚にまき込
み、室温で３０分間静置した。該シャーレを穏やかにゆ
すって細胞を浮遊させ、次いで室温で３０分間静置し、
上記と同様の操作により細胞を再度浮遊させて浮遊した
細胞を回収することにより、マウスリンパ球Ｔ細胞を分
離した。つぎに、５０μｇ／ｍｌの抗マウスＬｙｔ−
２，１抗体（コスモバイオ社製、クローン４９−３１，
１）を含むＰＢＳ溶液を使用して上記と同様の操作を行
い、抗マウスＬｙｔ−２，１抗体をプラスチック製シャ
ーレに吸着させた。上記操作により分離したマウスリン
パ球Ｔ細胞３×１０⁷個を３ｍｌの５％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ−１６４０（培地）に浮遊させ、上記の抗マウスＬｙ
ｔ−２，１抗体を吸着させたシャーレにまき込み、４℃
で３０分間静置した。該シャーレを穏やかにゆすって細
胞を浮遊させ、ついで、４℃で３０分間静置し、上記と
同様の操作により細胞を再度浮遊させて浮遊した抗マウ
スＬｙｔ−２，１と結合しない細胞（以下Ｌｙｔ−２陰
性Ｔ細胞という）を回収した。つぎに５％ＦＣＳ−ＲＰ
ＭＩ−１６４０（培地）でＬｙｔ−２陰性細胞を回収し
た後のシャーレを穏やかに４回洗浄し、ついで、該シャ
ーレに５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０（培地）を加
え、強くピペッティングして抗マウスＬｙｔ−２，１抗
体と結合する細胞（以下Ｌｙｔ−２陽性Ｔ細胞という）
を回収した。

【００３５】Ｃ．マウスＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞の測定試験例１と同じ装置を使用してＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞の
測定を行った。上記（試験例２のＢ）において分離した
Ｌｙｔ−２陽性Ｔ細胞とＬｙｔ−２陰性Ｔ細胞を５％Ｆ
ＣＳ−ＲＰＭＩ−１６４０（培地）に浮遊させ、１ｍｌ
当たり１０⁷個のマウスリンパ球Ｔ細胞を含み、その内
Ｌｙｔ−２陽性Ｔ細胞の比率が０、１０、２５、５０、
７５、１００％である６種類の試料溶液を調製した。上
記（試験例２のＡ）で得られた抗マウスＬｙｔ−２，１
抗体を内壁面上に固定化した細径管１内に上記試料溶液
１μを吸引し、次いで室温にて２０分間静置することに
よりＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞を該細径管１の内壁面上に捕
捉した。基質溶液として塩化アンモニウム１０ｍＭ、炭
酸水素カリウム１ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、グルコース
０．５％および食塩１５４ｍＭを含むＰＢＳ溶液を使用
し、ペリスタポンプ６を駆動して、基質溶液をセル４内
に供給しつつ、Ｌｙｔ−２陽性Ｔ細胞を内壁面上に捕捉
した細径管１を第３図のようにセル４内に挿入し、該細
径管１内部を３０秒間洗浄した。その後ペリスタポンプ
６を停止し、その直後から６０秒間のソース電位の変化
を測定した。測定終了後、上記細径管１をセル４から抜
き出し、ペリスタポンプ６を４０秒間駆動して基質溶液
をセル４に供給し、セル４の洗浄を行い、つぎの測定に
備えた。測定結果を図５に示した。図５から明らかなよ
うに、本発明の装置によってＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞を選
択的に測定することが可能である。

【００３６】

【発明の効果】本発明の装置によれば、ｐＨ変化誘引能
を有する微量アナライト物質または生物体を高感度に、
かつ簡単な操作で測定できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第一の実施例に係る装置の概略構成
を示す図である。

【図２】本発明の第二の実施例に係る測定装置の概略
構成を示す図である。

【図３】本発明の装置によって測定を行っている状態
を示す図である。

【図４】本発明の装置でウレアーゼを測定した結果を
示す。

【図５】本発明の装置によってＬｙｔ−２陽性Ｔ細胞
を測定した例を示す。

【符号の説明】

１細径管２基質溶液入口３基質溶液出口４セル５ｐＨ電極６ポンプ手段７位置決め手段８シール手段９比較電極１０液溜め１１ｐＨ電極作動回路１２ポンプ作動およびｐＨ電極信号読み取り用手段１３電気絶縁樹脂

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者鶴田仁志岡山県倉敷市酒津2045の１株式会社クラレ内 (56)参考文献特開平１−212347（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともその内壁面上に基質溶液のｐ
Ｈを変化させる能力を有する微量アナライト物質または
生物体を捕捉した細径管に上記基質溶液を接触させて、
該細径管内部における該基質溶液中の基質の反応に伴う
ｐＨ変化を利用して微量アナライト物質または生物体の
測定を行う装置であって、該装置が、基質溶液の入口と出口を有するセルと、該セル内に収容されたｐＨ電極と、該セル内に上記基質溶液を供給するポンプ手段と、少なくともその内壁面上に測定対象となる上記基質溶液
のｐＨを変化させる能力を有するアナライト物質または
生物体を捕捉した細径管を該セル内に収納したときに、
セル内に収納された細径管の内壁面とｐＨ電極のｐＨ感
応面を１ｍｍ以下の間隙にて対面配置させる位置決め手
段と、セル内に収納された細径管の外壁と該セルの内壁とで形
成される空間を液密状態に保持するシール手段と、からなることを特徴とする微量アナライト物質または生
物体の測定装置。
【請求項２】該ｐＨ電極がｐＨ感応性電界効果トラン
ンジスタである請求項１記載の測定装置。
【請求項３】該セルが、上下部に太径部、中間部に細
径部を有し、太径部の両端が開口した構造であり、上部
太径部に中間部に向かって細くなるテーパが付され、こ
れが該位置決め手段およびシール手段に供される請求項
１記載の測定装置。