KR910004246B1 - 아날라이트 물질의 측정 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

아날라이트 물질의 측정 방법 및 장치

제 1 도는 본 발명에 의한 측정 방법의 원리를 도시한 단면도.

제 2 도는 본 발명의 측정 장치에 대한 개략도.

제 3 도는 pH-FET의 사시도.

제 4 및 5 도는 소경관의 실시예를 도시한 단면도.

제 6 및 7 도는 본 발명의 장치에 대한 측정 방법을 도시하는 개략도.

제 8 도는 셀의 소경부에 대한 확대 단면도.

제 9 도는 pH-FET의 소스 전위 및 이 변화 속도의 시간적 변화를 도시한 그래프.

제 10, 11 및 13 도는 아날라이트 농도와 pH 응답 곡선의 관계를 도시한 그래프.

제 12 도는 pH 감응면과 소경관 내벽면의 거리와 소스전위간의 관계를 도시한 그래프.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : pH 전극 2 : pH 감응면

3 : 고상 4 : 기질 용액

6 : 소경관 11 : 셀

14 : pH 전극 15 : 비교 전극

본 발명은 아날라이트(anaℓyte) 물질의 측정 방법 및 장치에 관한 것으로, 특히 면역 반응을 이용하여 생체시료와 같은 다성분계에 미량 포함하는 특정 물질을 정량적으로 측정하는데 적합한 측정 방법 및 장치에 관한 것이다. 비록 본 발명이 이하 임상 검사에 있어서 미량 생체 물질의 측정에 대해서만 설명되었더라도, 본 발명의 장치 및 방법은 약학, 생물학, 동물학, 식물학, 농학 및 화학과 같은 여러 분야에 적용 가능하다.

생체의 생리 활성에 관여하는 물질은 일반적으로 미량이지만, 아직도 이들 물질중 대부분이 생체에는 매우 중요한 역할을 한다. 그러므로 이와같은 미량 생리 활성 물질을 정량적으로 측정하는 것이 의학 및 생화학 등의 생물관련분야에서는 중요하며, 이러한 것을 위한 여러 방법이 제안되어 있으며 실용화되어 있다. 이들중, 효소, 방사성 동위 원소, 화학 발광 물질 등을 표식으로서 사용하는 아날라이트 리셉터 시스템의 측정 방법이 널리 사용되어져 왔다. 아날라이트 리셉터형 측정은 우선 측정대상 물질인 아날라이트와 특이적으로 결합하는 제 1 리셉터를 고정화된 고상을 시료 용액과 표식 제 2 리셉터 또는 표식 아날라이트(이하 이것의 표식체를 콘쥬게이트라 칭함)와 동시에, 또한 연속적으로 접촉시켜 아날라이트 리셉터 반응을 실행시킨후, 반응 혼합물을 세정하여 상기 고상상에 남아있는 콘쥬게이트의 양을 측정함에 의해 시료용액중의 아날라이트의 양을 측정하는 것이다. 이러한 경우에 있어서, 표식으로서 라디오 아이소토프 및 효소등의 증감 작용이 큰 물질이 사용된다. 리셉터에 관해서 아날라이트가 항원 또는 햅튼일 때는 이것에 대한 특이 항체가, 또는 아날라이트가 항체일때는 이의 항체에 대한 항원성 물질이, 아날라이트가 DNA 또는 RNA 일때는 이것에 상보적인 DNA 또는 RNA가, 아날라이트가 리간드(ℓigand) 일때는 이에 대한 리셉터가 각각 이용된다. 이와같은 측정방법의 대표적 실시예로서 불균일법 EIA, 소위 Enzyme ℓinked Immuno Sorvent Assay(EℓISA)이 공지되어 있다.

EℓISA에 있어서는, 시료 용액중의 측정 대상 물질을 얻기 위하여 측정 대상 아날라이트와 특이적 결합을 하는 리셉터를 시험관, 마이크로 플레이트 등에 고정시킴으로써 얻어진 고상이 이용되며 시그날 증감용의 표식으로서 효소가 이용된다. 예를들어 측정 대상 아날라이트가 항원인 경우, 샌드위치법-EℓISA은 상기 항원에 결합하는 제 2 항체(제 2 리셉터)에 효소를 표식한다. 또한 경합법-EℓISA는 표식 물질로서 효소 표식 된 항원을 사용한다. 반면에 측정 대상 아날라이트가 항체인 경우, 샌드위치법-EℓISA는 리셉터로서 항원을 이용하며, 제 2 리셉터로서 효소 표식된 다른 항원을 이용한다. 경합법 시스템은 항원에 대해 측정 대상인 항체와 경합하는 항체를 선택하여 리셉터로서 항원을 이용하며, 이와같이 선택된 항체를 효소로 표식한다. 세정후에, 상기 표식으로서 이용된 효소에 대한 기질 용액과, 필요하다면, 발색시약을 고상과 접촉시킴으로써 기질 용액의 분해 반응에 따라 시스템의 광학적 성질이 변화되므로, 이의 변화가 관찰된다.

기질 용액의 광학적 성질의 변화를 관찰하는 목적으로 여러 방법이 사용되어져 있다. 이들중, 흡광 광도계, 형광 광도계 및 화학 발광 광도계와 같은 광기기를 사용하는 방법들이 있다(예를들어, 도꾜, 아가꾸 쇼인에서 발표된 이시가와, 가와이 및 미야이씨의 효소 면역 측정법(1982)을 참조).

또한, 다른 방법으로서 기질 용액과 대조 기질 용액을 대비시켜 기질 용액의 색의 다증을 육안으로 관찰하여 미량 아날라이트 물질의 존재를 판정하는 것이 있다(예를들어 특개소 제 60-128369호 참조).

그러나, 광기기를 사용하는 상기 광학적 측정 시스템은 통상 안정한 광원, 고강도의 광도계, 정밀한 광학계 증폭회로 등을 필요로 하므로 고가이며, 대형이고, 복잡한 설비를 요구한다. 또한, 측정할 때 특수한 기술을 필요로 하므로 전문적인 기술자가 측정에 참가해야만 한다.

반면에, 직접 관찰하는 방법은 정량적인 측정방법이며, 색 변화의 판단에 관찰자의 주관 및 개인차가 생기기 쉽다.

따라서, 본 발명의 목적은 이와같은 종류의 측정방법의 결점을 개량하며, 관찰자의 주관에 의한 판정기준의 불명확함을 제거하여 기질 용액의 분해 반응을 객관적으로, 또한 높은 검출 정밀도로 측정하는 미량 아날라이트 물질의 측정 방법 및 장치를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 광학적 측정 시스템에 비해 훨씬 간단한 측정 시스템을 갖는 미량 아날라이트 물질의 측정 방법 및 장치를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 훈련되지 않는 조작자에 의해 사용 가능하든가 또는 검진 목적을 위해 신속하게 결정할 필요가 있을 때에 상기 분야 또는 그 이외에 있어서의 의료 종사자에 의해 사용 적합한 간단한 미량 아날라이트 물질의 측정 장치를 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 중소 규모의 병원, 임상실험실 또는 환자의 베드 사이드(bed side)에서 사용할 수 있는 소형이며 저가인 미량 아날라이트 물질의 측정 장치를 제공하는데 있다.

본 발명의 측정 방법은 아날라이트 리셉터 반응을 마친 고상과 기질 용액을 접촉시켜, 기질 용액의 분해 반응에 따라 기질 용액의 pH 변화를 이용한 미량 아날라이트 물질의 측정 방법이며, 상기 고상을 기질 용액의 pH 변화를 측정하는 pH 전극의 pH 감응면과 간극이 1mm 이하로 되도록 대면 배치하여 상기 간극내에 있어서의 기질 용액의 pH 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는 미량 아날라이트 물질의 측정 방법이다.

또한 본 발명의 측정 장치는 아날라이트 리셉터 반응을 마친 고상과 기질 용액을 접촉시켜 기질 용액의 분해 반응에 따라 기질 용액의 pH 변화를 이용한 미량 아날라이트 물질의 측정 장치에 있어서 a) 기질 용액의 입구와 출구를 갖는 셀과, b) 상기 셀내에 수용된 pH 전극과 c) 상기 셀내에 기질 용액을 제공하는 펌프와, d) 측정 대상 물질인 아날라이트와 특이적으로 결합하는 제 1 리셉터를 고정시킨 고상에 시료 용액과 표식 제 2 리셉터, 또는 표식 아날라이트를 접촉 반응시켜 세정한 고상을 셀내에 수용하는 수단 및 e) 셀내에 수용된 고상의 표면과 pH 전극의 pH 감응면을 그 간극이 1mm 이하로 되도록 대면 배치하는 고상 위치 결정 수단으로 된 것을 특징으로 하는 미량 아날라이트 물질의 측정 장치이다.

본 발명의 측정 방법에서는, 제 1 도에서 도시된 바와같이, 아날라이트 리셉터 반응과 세정을 마친 표면에 콘쥬게이트를 포함한 아날라이트 리셉터 복합체(5)가 흡착된 고상(3)을 pH 전극(1)의 pH 감응면(2)과의 간극 d가 통상 100nm 이하인 전자 화학 이중층의 깊이로까지 감소되어 1mm 이하로 되도록 대면 배치시켜, 상기 협소한 간극으로 실질적으로 봉입시킨 기질 용액(4)의 분해 반응에 따른 pH 변화를 직접 측정하는 것이다.

종래, pH 전극을 검출 수단으로서 이용하는 아날라이트 리셉터 시스템의 측정 장치는, 흡광 광도계 또는 형광 광도계를 검출 수단으로 하는 것에 비해서 검출 한계가 훨씬 떨어지기 때문에 실용적이 아닌 것으로 고려되고 있지만, 본 발명자는 pH 전극의 pH 감응면과 아날라이트 리셉터 반응을 마친 고상의 간극을 1mm 이하로 설정함에 의해, 의외로 종래의 검출 수단을 이용한 것과 동등의 높은 검출 정도가 얻어지는 것을 발견하였다.

본 발명의 기본적인 조작은 우선(1) 리셉터 고정화된 표면을 갖는 고상(3)을 준비하며, (2) 상기 고상을 아날라이트 용액 및 콘쥬게이트 용액과 반응시켜, 고상 표면에 아날라이트 리셉터 복합체(콘쥬게이트를 포함) (5)를 형성시키며, (3) 상기 고상을 세정하여 유리 아날라이트 및 유리 콘쥬게이트를 제거시키며, (4) 상기 고상의 표면을 pH 전극 (1)의 pH 감응면(2)보다 1mm 이하의 거리에 배치하며, (5) 단계 (4)의 전 또는 다음에 고상과, pH 전극의 pH 감응면간의 적어도 이 간극에 기질 용액을 도입시키며, (6) 고상 표면에 흡착한 콘쥬게이트(5)에 의해 기질 용액을 분해하여 이때 기질 용액의 pH 변화를 pH 전극으로 측정한다.

본 발명의 보다 명확한 기술 및 수반되는 여러 장점들은 첨부된 도면을 참조하여 이하의 상세한 설명에서 보다 쉽사리 이해할 수 있을 것이다.

이하 본 발명의 적합한 실시예를 도면을 참조하여 기술하고자 한다. 비록 실시예에서는 고상으로서 원통형의 소경관을 사용하지만, 다음의 실시예의 장치는 본 발명을 제한시키는 것은 아니다.

제 2 도는 본 발명의 측정 장치에 대한 단면도이며, 이와같은 장치는 기질 용액의 입구(12) 및 출구(13)를 갖는 셀(11), 상기 셀(11)내에 수용된 pH 전극(14) 및 비교 전극(15), 셀내에 기질 용액을 공급하는 펌프(20), 내벽에 리셉터를 고정한 소경관(6)을 셀(11)내에 수납하는 수단(9) 및 소경관의 내벽 표면과 pH 전극 (14)의 pH 감응면(16)과의 간극을 1mm 이하로 설정하는 위치 결정 수단(도시되지 않음)으로 구성되어 있다. (21)은 기질 용액의 저장소이다.

셀(11)은 상하부에 원통상의 대경부, 중간부에 원통상의 소경부를 가지며 대경부의 양 단부는 개구되어 있다. 하부 대경부에 기질 용액의 입구(12)가, 상부 대경부에 기질 용액의 출구(13)가 설치되어 있다. 셀의 하단 구멍은 pH 전극(14) 및 비교 전극(15)을 셀내에 수용하기 위한 전기 절연 수지로 이루어진 캡(10)으로 밀폐되어 있다. 셀 자체는 플라스틱, 무기 유리 또는 금속으로 제조될 수 있다. (19)는 pH 전극 및 비교 전극을, pH 전극을 작동하며 판독하는 전기 회로(도시되지 않음)에 연결시키는 코넥터이다.

상기 셀(11)내에 수용된 pH 전극(14)으로서 종래부터 가장 많이 이용되어진 소위 유리 전극 이외에, 예를들어 pH 감응성 전계 효과 트랜지스터(이하, "pH-FET"로서 참조) 산화 파라디움/피라디움 와이어 등의 표면 산화 금속형 전극, 프로톤 리셉터를 포함하는 폴리염화비닐로 이루어진 pH 감응성 중합체막을 금속선 또는 탄소선에 코팅시켜 얻어진 코팅 와이어형 pH 전극 등 각종의 미소 pH 전극을 이용할 수 있다. 그러나, pH-FET가 아닌 다른 전극은 후술될 바와같은 문제를 갖게 된다.

소직경을 갖는 유기 pH 전극은 유도 노이즈가 증대하는 경향이 있으며, 표면 산화 금속형 pH 전극은 소직경화가 용이하지만 장기간 동안 수중 수명에는 문제가 있으며, 코팅 와이어형 pH 전극도 소직경화가 용이하지만 선형 응답 영역이 협소하며 수중 수명이 짧다는 단점이 있다.

반면에, pH-FET는 (1) 소경화가 용이하며, (2) 소경화된 때라도 유도 노이즈가 작으며, (3) IC 기술로 제조되므로, 특성 변화가 작으며 pH 감응성 표면(게이트)을 미소화시킬 수 있으며, (4) pH 변화에 대한 응답이 매우 빠르며 응답 곡선에서 히스테리스가 남아있지 않으며, (5) pH 변화에 대응하는 선형 응답 영역이 넓으며, (6) 수중의 보존 수명이 반영구적이며, 시간에 따른 pH 감도 등의 특성 변화가 작다는 등의 우수한 특성을 가져 본 발명의 장치에서 사용하기에 최적이다. pH-FET 형으로서는 (i) 전주절연형(특공소 57-43863호 참조), (ii) pH 접합 분리형(실공소 58-5245호 참조), (iii) SOS형(특개소 59-48646호 참조)등의 여러형이 공지되어 있다. 이러한 pH-FET 장치중 어느것이라도 제 3 도에서 도시된 바와같이 다음의 기본적인 구조를 갖는 한은 본 발명에서 사용될 수 있다. 즉 (1) pH 감응성면(게이트)(28)이 장치의 선단부(29)상에 제공되며, (2) 선단부(29)는 리셉터를 고정화시키는 소경관내로 삽입될 수 있는 크기, (3) 선단부(29)의 길이는 1 내지 10mm 적합하게는 1 내지 3mm이며, (4) 상, 하 및 측면의 모든 표면은 외부 용액과 전기적으로 절연된다.

pH-FET 장치의 말미부(41)상에는 리드 와이어의 본딩 패드(40)가 설치되어 있지만 이 말미부의 형상에 대해서는 제약이 없다.

pH-FET 장치의 선단부의 크기에 관해서는 통상 내경 0.8mm 이하의 리셉터를 고정화하는 소경관내로 상기 선단부가 들어가도록 하는 것이 적합하다. 이와같이 예를들어 내경 0.53mm의 소경관에서는 장치의 선단부로서 0.45mm 이하의 폭 및 0.20mm이하의 두께를 갖으면 충분하다. 장치 선단부의 길이에 관해서는, 만약 10mm 이상이면 절단되기 쉬우며 소경관의 리셉터 고정부의 길이가 크게 된다. 만약 1mm 이하의 길이이면, 소경관내로 삽입된 선단부의 길이는 너무 짧게 되어, 소경관의 효소 반응이 소경관 외의 용액에 영향을 받기 쉬우므로 적합하지가 않다. 장치 선단부는 자신으로서 외부 용액과 전기 절연되어야만 한다. 전주 절연형의 상기 pH-FET에 있어서, 장치 선단부의 전주가 이산화실리콘, 질화실리콘 등의 층으로 절연된다. 접합 분리형의 pH-FET에 있어서는 전기 절연은 pn 접합으로 달성된다(센서 기술, 1986년 5월 임시 간행물 참조). 또한 SOS 형의 pH-FET에 있어서, 장치의 하면은 사파이어 기판에 의해서 또한 상면 및 측면은 질화실리콘 등으로 절연되어 있다.

본 발명에서 사용된 pH-FET는 25℃에 있어서 40 내지 60mV/pH보다 적합하게는 50 내지 60mV/pH의 pH 감도를 갖는 것이 적합하다. pH 감응막으로서는 질화실리콘, 산화 알루미늄 및 산화 탄탈륨 등의 수중에서 높은 안정성을 갖는 물질인 것이 적합하며, 이들중 산화 탄탈륨 및 산화 알루미늄은 수중 안정성, pH응답 특성등에 관해서 적합하다. 산화 탄탈륨의 pH 감응막으로된 pH-FET는 본 발명에서 사용된 pH 전극에 최적이다.

사용된 pH-FET가 극히 저 노이즈 레벨(통상 일정 pH에서 0.05mV 이하)을 갖는 것이 적합하다. 이 때문에, 상호 콘덕턴스는 적합하게는 적어도 50μV 보다 적합하게는 적어도 100μV, 가장 적합하게는 적어도 150μV 이상의 것을 사용하는 것이 바람직하다. pH-FET의 소자 선단부와 외부 전극을 실온의 생리 식염수에 침수시켜 pH-FET의 노이즈 전극과 외부 전극간에 3V의 전압이 인가될 때 발생된 누설 전류는 적합하게 30nA 이하, 보다 적합하게는 10nA 이하이다. 만일 상호 콘덕턴스가 50μV 이하이거나 상기 누설 전류가 30nA 이상이면, 측정시에 노이즈가 크게 발생된다.

비교 전극(15)으로서, 포화 염화 제 1 수은 전극 및 은-염화 은 전극등의 액정 접합형 비교 전극, 이온 불감응성 막의 게이트를 구비한 전계 효과 트랜지스터(특공소 58-25221호 참조), 또는 이온 불감응성 막을 금속선 또는 탄소선에 코팅한 코팅 와이어 비교 전극을 이용할 수 있으며, 이들중 액정 접합 비교 전극은 높은 신뢰성으로 적합된다. 이러한 비교 전극은 제 2 도에서 도시된 바와같이, pH 전극의 pH 감응면과 액정 접합할 수 있는 셀의 대경 하단부내에 적합하게 설치된다. 비교 전극은 또한 셀과 액정 접합을 하는 셀의 외부의 임의 위치에서 설치될 수 있다.

소경관(6)은 셀내로 수용하기 위한 수단(9)으로서, 손으로 간단히 셀내로 관을 삽입하여도 좋지만, 예를들어, 소경관(6)을 선단에서 보유한 보유 소자(30) 및 보유 소자(30)의 다른 단을 통해 수직으로 삽입된 나사(31)를 구비한 제2도에서 도시된 시스템을 이용할 수 있다. 스테핑 모터(도시되지 않음)에 의해 구동된 나사(31)의 회전으로 보유 소자가 상향 또는 하향으로 자동이동된다. 또한 보유 소자(30)를 상향 및 하향으로 이동시키기 위해 다른 공지된 기구를 사용할 수 있다.

소경관(6)의 위치 결정 수단으로서는 소경관의 내벽면과 pH 전극(14)의 pH 감응면(16)과의 간극을 조정하는 공지의 기구를 사용할 수 있다. 예를들어, 셀(11)의 소경부의 내경을 소경관의 외경보다 약간 크게 함으로써 셀(11)의 소경부를 소경관의 가이드로서 할 수 있다. 상기 소경관의 위치 결정 수단을 이용함으로써, 소경관(6)의 내벽면과 pH 전극의 pH 감응면간의 거리를 1.0mm 이하로, 적합하게는 0.5mm 이하로 설정할 수 있다. 만일 거리가 1.0mm를 초과하면, 기질 용액의 pH 변화속도는 신속하게 감소되어, 실제로 높은 검출 감도를 달성하는 것은 불가능하다.

소경관(6)은 pH 전극의 pH 감응면을 완전히 삽입하기에 충분히 긴 정도의 길이를 가져야만 된다. 이와같이, 예를들어 1.5mm의 길이를 갖는 pH 감응면의 pH 전극에서, 소경관의 리셉터 고정부는 길이가 통상 적어도 3mm이다. 소경관은 리셉터 고정부가 상기 조건을 만족하는 동안은 어떠한 형상이라도 갖을 수 있다. 소경관의 한 실시예가 제 4 도에서 도시된다. 제 4 도에서 도시된 소경관(22)은 피페트(pipet) 팁 형상으로 되어 있으며 소경부(23) 및 대경부(24)로 구성된다. 대경부는 피페티를 수용하기 위한 테이퍼를 제공하며, 소경부(23)의 말단의 내벽(23-1)상에 리셉터가 고정되어 있다. 제 5 도에서는 소경관의 다른 실시예를 도시한다. 여기서, 소경관(22)은 또한 피페트팁 형상으로 되어 있으며, 소경부의 내벽(25)상에 요철 영역을 설치하여 표면적을 크게 하며, 선단부(25-1)에 리셉터가 고정되어 있다. 대경부는 제 4 도에서와 같이 동일한 방법으로 피페터를 수용하기 위한 테이퍼로서 작용한다. 소경관의 내벽의 이러한 표면적 확대는 검출감도를 증가시켜 인큐베이션(incubation)기간을 단축시킬 수 있다.

이들 소경관에서 사용될 수 있는 재질로서는, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라 플루오로에틸렌, 폴리염화비닐, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리비닐알콜, 에틸렌비닐 알콜 공중합체 등의 폴리오레핀계 중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리부틸렌 테레프탈레이트 등의 폴리에스터계 중합체, 폴리디메틸시로크세인 등의 폴리시로크세인계 중합체, 6-나일론 및 6,6-나일론 등의 폴리아미드계 중합체, 폴리카보네이트계 중합체, 셀룰로이즈 아세테이트 및 니트로셀룰로이즈 등의 셀룰로이즈계 중합체 및 각종 무기 유리를 사용할 수 있다.

표 1에서는 이러한 소경관상에 리셉터를 고정화시킨 물질 및 측정된 항목의 실시예를 도시한다.

[표 1]

본 발명에 있어서의 콘쥬게이트용 표식 효소와 기질 용액의 결합으로서는, 효소 반응에 의해 기질 용액의 pH가 크게 변화하는 표식 효소/기질 용액의 결합을 이용하는 것이 필요하다. 이와같은 결합의 실시예로서는 트리아실글리세롤 리파제/트리아실글리세롤, 아세틸에스테라제/초산 에스테르, 아세틸콜린 에스테라제/아세틸콜린, 글루코노락토나제/글루코노라크톤, 알칼리포스포타제/p-니트로페놀린산, 알릴설파타제/알릴설파이트, 우레아제/요소 및 바르비트라제/바르비트레이트 등의 가수 분해 효소 및 이들 기질의 조합, 글루코스 옥사이다제/글루코스, 콜린 옥사이다제/콜린 및 카테콜-1,2-디옥시게나제/카테클 등의 산화 환원 효소 및 이들 기질 용액의 조합 등을 들 수 있다. 상기 중에서도, 우레아제/요소, 트리아실글리세롤 리파제/트리아실글리세롤 및 글루코스 옥사이다제/글루코스 등의 결합이 안정하며 활성이 높은 효소가 입수하기 쉬우며 저가이며 순도 높은 기질 용액의 입수가 가능하므로 실용상 적합하다. 특히 효소 반응에 따른 pH 변화가 큰 것을 고려하여 우레아제/요소의 결합이 적합하다.

지금부터 본 발명의 장치를 이용한 측정 방법을 1스텝 샌드위치 방법에 의해 항원 측정 경우에 대하여 설명하기로 한다. 경합법 또는 2 스텝 샌드위치 방법에서는, 조작이 약간 다르지만 장치의 구성은 동일하므로 설명은 생략하기로 한다. 먼저 소경관(6)의 내벽면에 리셉터를 고정한다. EℓISA에서 이용된 종래의 방법도 적용 가능하다. 예를들어, 리셉터가 물리적 흡착으로 고정화할때는, 우선 소경관을 충분히 세정시킨 후, 리셉터인 제1항체의 용해된 완충 용액을 소경관의 내부로 도입시켜 0℃ 내지 40℃의 온도에서 일정 시간동안 정치한다. 이때 리셉터 용액중에 소경관의 선단부만을 침수시킬 수 있다. 이러한 경우에 리셉터 용액중에 침수된 소경관의 선단부의 외벽과 내벽의 양방에 리셉터가 흡착되지만, 이것이 측정에 악영향을 주지는 않는다. 다음에 소경관을 완충 용액으로 세정시킨 후, 블로킹 처리를 행한다. 블로킹 처리는 상기 세정후의 소경관을 예를들면 소형철 알부민, 송아지 혈청 알부민, 각종 동물 형청, 각종 이무노글로부린 또는 계면활성제 등으로 처리함으로써 행해진다. 블로킹 처리는 리셉터 고정화부는 물론 시료 용액 또는 콘쥬게이트 용액과 접촉이 일어나는 부분 전체에 행할 필요가 있다.

다음에, 블로킹 처리후의 소경관의 선단부를 소정량의 표식 제2항체를 함유한 시료 용액에 침수시켜, 소정 시간 동안 인큐베이션한다. 이러한 처리에 의해 소경관 내벽상에 제1항체-항원-표식 제2항체의 샌드위치형 항원-항체 복합체가 형성된다.

다음에 세정 처리후에, 상기 샌드위치를 형성하는데 관계치 않는 유리 측정 대상 항원, 유리 표식된 제2항체 및 유리항원-표식 제2항체의 복합체를 소경관의 내벽면으로부터 제거된다. 이러한 인큐베이션 및 세정 처리에 의해서, 소경관의 내벽면에는 시료 용액중의 측정 대상 항원의 농도에 대응하는 양으로 표식 효소를 함유하는 샌드위치형 항원-항체 복합체가 고정화되어 있다.

반면에, 제 6 도에서 도시된 바와같이, 셀에서는, 기질 용액(17)을 저장소(21)로부터 펌프(20)를 통해 셀내로 공급하며 출구(13)로부터 오버플로우되어, pH 전극(14)의 pH 감응면(16) 및 비교 전극(15)을 세정한다. 셀내의 액정 레벨은 pH 전극의 pH 감응면의 선단부 이상에 있다. (33)은 유출물 저장소이다.

효소 반응을 시작하기 위해서는 제 7 도에서 도시된 바와같이, 인큐베이션 및 세정후에 소경관(6)을 소경관 수납 수단(도시되지 않음)에 의해 셀의 상단 구멍에서부터 셀내로 삽입하여, pH 전극의 pH 감응면을 상기 소경관에서 완전히 밀폐시킬 수 있다. 상기 처리동안, 공급 펌프(20)는 정지시키는 것이 적합하다. 제 8 도에서는 소경관(6)을 셀(11)내에 수납시킬 때의 셀의 소경부 주변에 대한 상세를 도시한다. 이후, 상기 소경관내에서 기질의 분해 반응이 진행되어, 반응에 따라 pH 변화가 측정된다. pH 변화의 속도로부터 표식 제2항체의 효소 활성, 즉 시료 용액중의 항원 농도가 측정된다.

소경관(6)을 셀내로 삽입시킬 때 중요한 것은, 제 8 도에서 도시된 바와 같이, 소경관(6)의 하단을 pH 전극의 수지부(35)의 선단에 가능한한 근접하게 설치하는 것이다. 효소 활성을 측정할 때에는 소경관의 내외의 기질 용액이 서로 혼합되지 않는 것이 적합하다. 이 때문에, pH 전극의 수지부(35)의 외경을 소경관(6)의 외경과 거의 동일하게 하여, 수지부(35)는 셀의 소경부(18) 내측에 고정화한다. 다음에 효소 활성이 측정될때는, 소경관(6)은 수지부(35)에 그 선단부가 접촉할 때까지 위로부터 하향 삽입된다. 이와 같은 절차에 의해서, 소경관(6)의 하단 구멍은 pH 전극(14)의 수지부(35)에 의해 적합하게 막혀져, 소경관내의 기질 용액을 격리시킬 수 있다. 이러한 경우에 pH 전극의 pH 감응성면(16)을 비교 전극(15)과 전기적 액정 접합을 유지하는 것이 필요하며, 이러한 액정 접합은 수지(35)의 상단면 및 소경관(6)의 하단부상의 적은 요철부로부터 생겨나는 미소한 간극을 통해 충분히 보증된다.

본 발명의 다른 특징들은 이하 실시예에 대한 설명으로부터 명백해질 것이다.

[실시예]

소경관을 고상으로서, pH-FET를 검출 수단으로서 구비하는 EℓISA 장치를 사용하여 인간-IgG를 측정하였다.

[EℓISA 장치의 제조]

제 2 도에서 도시된 셀을 사용하였다. pH 전극(14)으로서는 특공소 57-43863호에서 기술된 방법으로 제조된 전주 절연 pH-FET를 사용하였으며, 이 pH-FET의 게이트에는 탄탈륨 산화물이 pH 감응막으로서 증착되었다. pH-FET는 길이 5.5mm, 너비 0.45mm 및 두께 0.15mm의 전체 크기를 가지며 이의 선단부로부터 하향으로 0.8mm 연장하여 게이트 (pH 감응면)가 제공되었다. pH-FET는 게이트를 포함하여 1.5mm의 선단 길이가 수지부 외부에서 노출되도록 수지부(35)에서 고정되었다. 수지부 0.60mm의 외경을 가졌다. pH-FET의 감응면과 소경관의 내면간의 간극의 최대치 d는 (0.53-0.15)/2=0.19mm 이었다. 반응셀의 소경부의 내경을 0.65mm로, 길이를 15mm로 하였다. 은/염화은형의 비교 전극(15)의 액정 접합형이 사용되었다. 페리스타형의 펌프(20)가 사용되었으며 유속을 1mℓ/분으로 설정하였다.

사용된 pH-FET의 pH 감도 및 상호 콘덕턴스는 37℃에서 57.3mV/pH 및 380μV이었다. pH-FET는 동작은 드레인 전압 4볼트 및 드레인 전류 100μA에서 정전류 회로에 접속시킴으로써 동작되었다. pH-FET의 출력 신호로서는, 액정 접합 비교 전극에 기준된 소스 전위(이하 "소스 전위"라 칭함)가 측정 및 기록되었다.

[소경관에 리셉터 항체의 고정화]

리셉터로서 항 인간-IgG(sheep)이 선택되어 소경관에 다음과 같이 하여 고정화되었다. 소경관으로서 제 4 도에서 도시된 소경부의 내경이 0.53mm의 메디키트(Medikit) 주식회사제의 폴리테트라플루오로에틸렌으로 제조된 캔눌라(상품명 하피카스 Z)가 사용되었다. 캔눌라의 소경부의 길이는 25mm, 대직경부의 내경은 4mm, 외경은 6mm, 길이는 20mm이었다. 항 인간-IgG의 50μg/mℓ PBS 용액(pH : 7.0)이 준비되어 상기 용액중에 상기 캔눌라의 선단 10mm 부분을 4°하에서 24시간 동안 침수시킴으로써, 이 부분의 내외벽상에서 항 인간-IgG가 물리적으로 흡착되었다. 다음에 항 인간-IgG가 이와 같이 흡착된 캔눌라의 내외벽을 0.05%의 계면 활성제(상품명 Tween-20)를 함유한 PBS 용액(pH : 7.0)으로 세정하였다. 세정한 후에, 캔눌라의 전체 소경부의 내외벽을 1%의 소혈청 알부민(BSA) 및 0.05% Tween-20을 함유한 PBS 용액중에 실온에서 1시간 동안 침수시켜 이와 같이 불로킹 처리를 행하였다.

[효소 표식 항체 준비]

표식 효소로서 콩으로 분리 정제된 우레아제(시그마사제 타잎 C-3)가 사용되었으며, 아비딘-비오틴법으로 항 인간-IgG(goat)를 다음과 같이 결합하였다. 우선, 1mg/mℓ의 우레아제, 1mM의 EDTA를 함유한 0.1M 중탄산나트륨 완충 용액(pH : 8.3)을 준비하였다. 또한 비오틴-N-하이드로시석시마이드의 1mg/mℓ DMSO 용액을 준비하였다. 1mℓ의 우레아제 용액과 비오틴-N-하이드로시석시마이드 용액 5μℓ을 실온에서 4시간 동안 반응시켜 우레아제에 비오틴을 첨가하였다. 반응후에, 반응 혼합물은 PD-칼럼(파마시아사제)으로 겔 크로마토그래피하여 소량의 비오틴-우레아제를 얻었다. 이와 같이 얻어진 소량을 1% BSA, 0.05% Tween-20, 1mM EDTA 및 0.01% NaN₃를 함유한 PBS 용액(pH : 4, 이하 이 용액이 자주 사용되며 "희석 버퍼"로 칭함)으로 희석시켜 25㎍/mℓ 용액을 얻었다.

다음에, 아비딘-D(Vector사) 및 비오틴-항 인간-IgG(Tago사)를 동일하게 희석 버퍼로 희석하여 7.6㎍/mℓ 및 6.9㎍/mℓ의 용액을 얻었다. 이와같이 얻어진 비오틴-우레아제, 아비딘-D 및 비오틴-항 인간-IgG의 용액을 1:1:1의 용적비로 혼합시켜 우레아제 표식 항 인간-IgG의 희망 용액을 얻었다. 이후 이 용액은 "콘쥬게이트 용액"으로 칭한다.

[인간-IgG에 대한 검량선의 준비]

다음에 본 발명의 EℓISA 장치의 성능을 시험하기 위해 인간-IgG에 대한 검량선을 준비하였다. 우선, 소정량의 인간-IgG가 상기 희석 버퍼에 용해되어 인간 IgG 용액을 얻었다. 다음에 이와 같이 얻어진 인간-IgG 용액을 상기 준비된 콘쥬게이트 용액과 동량으로 혼합하였다. 한편, 항 인간-IgG가 고정화된 소경관을 블로킹 용액에서 꺼내 PBS-Tween-20 용액으로 세정하였다. 상기 인간-IgG-콘쥬게이트의 혼합 용액을 소경내로 흡인시켜 실온하에서 30분 동안 인큐베이션한 후 PBS-Tween-20 용액으로 세정을 하였다.

기질 용액으로서 0.1M 요소, 1mM 염화암모늄 및 0.15M 염화나트륨을 함유한 용액을 준비하여 이 용액을 제 2 도에서 도시된 저장소(21)에 도입시키며, 펌프(20)를 동작시켜 셀(11)내로 기질 용액을 공급하고 셀의 출구(13)로부터 오버플로우시켰다. 이 시점으로부터 pH-FET의 소스 전위 및 이의 변화 속도가 기록되었다. 제 9 도에서는 기록의 한 실시예를 도시한다. 제 9 도에서, △V는 반응전의 기질 용액에 대한 소스 전위를 기준으로 한때의 반응에 의한 소스 전위의 변화 속도분이며 실선으로 도시되어 있다. d△V/dt는 시간 미분이며 점선으로 도시된다. 제 9 도의 시간 A에서 펌프(20)를 정지시켰다. 시간 B에서 상기 인큐베이션-세정 후 소경관을 제 7 도에서 도시된 바와 같이 셀의 소경부내로 삽입시켰다. 이 삽입 시점은 0(제로)로 한다. 이후 바로, 소경관내에서는 요소가 암모니아 및 이산화탄소로 분해 반응을 시작하여, 기질 용액의 pH는 알칼리측 또는 소스 전위가 감소되는 방향으로 변화된다. 반응중에, △V의 변화 속도는 시간 M에서 최대로 된다. 시간 C에서, 소경관을 셀에서 꺼내며 동시에 공급 펌프를 동작시킴으로써, 소스 전위 및 이의 시간 미분이 당장 초기값으로 복원된다.

이와 같은 처리를 하여, 각종 농도의 인간-IgG 용액에서 pH 응답곡선이 측정되며 이 결과로부터 제 10 및 11 도에서 도시된 두 종류의 검량선이 작성되었다. 제 10 도에서는 소경관 삽입 후 5분후에서 △V와 인간-IgG의 농도와의 관계를 도시한다. 제 11 도에서는 d△V/dt의 최대치(제 9 도의 시간 M에서 d△V/dt, 소위 피크 속도)와 인간-IgG의 농도간의 관계를 도시한다. 제 10 및 11 도의 검량선에서, 검출 하한 농도는 약 1ng/mℓ이다. 제 10 도를 제 11 도와 비교하면, 제 10 도에서는 100ng/mℓ 정도인 △V가 포화되어 있는 것에 비하여 제 11 도에서는 이러한 경향은 찾아볼 수 없다. 이러한 것은 소경관 삽입후 5분 후의 △V를 이용하는 것보다 소위 피크 속도를 이용하는 편이 1개의 검량선에서 측정 가능 범위가 넓게 되는 것을 시사하고 있다.

[실시예 2 내지 8 및 비교 실시예 1 내지 3]

리셉터를 고정시킨 소경관의 내경을 0.53에서 3.0mm의 범위에서 변화시켜 pH 응답곡선의 변화를 검토한 것을 제외하고는 실시예 1이 반복되었다. 이러한 목적을 위하여, 셀의 소경부의 내경 ℓ 및 수지부(35)의 직경 a의 다른 것을 제작하여, 이것에 외경 ℓ₁, 내경 ℓ₂의 리셉터 고정화 소경관을 사용하여 EℓISA 측정을 행하였다. 이때 ℓ-a=0.05mm, a=ℓ₁및 ℓ₁-ℓ₁≒0.16mm의 관계가 보존되도록 하였다. 여기서 pH-FET의 pH 감응면과 소경관의 내면간의 간격의 최대치 d는 d=(ℓ₂-0.15)/2로 표시된다.

이와 같은 반응셀 및 소경관을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 10ng/mℓ 인간-IgG 용액을 측정대상 용액으로서 pH 응답곡선을 측정하였다. 이 결과로부터 리셉터 고정화 소경관의 내경과, 효소 반응 개시 5분 후에 있어서의 pH-FET의 출력 관계를 구하며 표 2 및 제 12 도에서 도시된다. 표 2는 또한 상기 pH-FET 감응면과 소경관의 내벽면간의 간극 d를 표시한다. 제 12 도로부터 알 수 있듯이, 소경관의 내경이 작을수록 동일한 인간-IgG 농도에 대한 pH-FET의 출력은 크게 된다. 소경관의 내경이 적어도 2.20mm 이상인 경우, 즉 간극 d가 적어도 1.0mm 이상인 경우에는 약 5분정도의 반응 시간으로는 pH 변화를 거의 알 수 없다. 소경관의 내경이 2.2mm 이하인 경우에는 수 mV에서 수십 mV까지 충분히 검출 가능한 출력을 얻을 수 있다. 또한 내경이 0.8mm 또는 그 이하인 경우, 즉 간극 d가 0.20mm 이하인 경우에는, 적어도 45mV 이상의 큰 출력을 얻을 수 있다.

[표 2]

[실시예 9]

실시예 1에서와 같이 고상으로서 소경관을, 검출 수단으로서 pH-FET를 사용하여 알파-페토프로테인을 측정하였다.

실시예 1에서와 같이 50㎍/mℓ PBS 용액(pH : 7.0)으로 폴리테트라플루오로에틸렌 캔눌라상에서 항 AFP 폴리클로날 항체(Dako)를 흡착하였다. 실시예 1에서와 같은 동일한 방법으로 세정 및 블로킹 처리를 실행하였다.

실시예 1에서와 같이 아비딘-비오틴법으로 우레아제 콘쥬게이트된 항체의 준비를 위해 항 AFP 모노클로날 항체(니뽕 바이오테스트 레보러토리)가 사용되었다.

이들 고상 및 콘쥬게이트된 항체를 이용하면, 실시예 1에서와 같이 AFP에 대한 검량선을 작성하며 그 결과가 제 13 도에서 도시되었다. 제 13 도로부터 명백한 바와 같이, 약 10ng/mℓ의 AFP는 본 발명의 방법으로 쉽사리 측정될 수 있다.

명백하게, 본 발명의 여러 변형 및 수정이 가능하다. 그러므로 첨부된 특허청구의 범위내에서 본 발명은 여기서 특정 기술된 것과는 달리 실행될 수 있다는 것에 주목된다.

Claims (7)

1. 시료 용액중에 존재하는 아날라이트 물질의 양을 측정하기 위한 방법으로서, (i) 고상에 결합된 아날라이트 리셉터 반응을 마친 생성물과 기질 용액을 접촉시키는 단계와, (ii) 상기 간극에 있어서의 상기 기질 용액의 pH 변화를 측정하는 단계를 구비하고 있고, 상기 기질 용액은 상기 생성물 반응의 함수로서 상기 기질 용액의 pH를 변화시킬 수 있으며, 상기 고상은 pH 전극의 pH 감응면과의 간극이 1mm 이하가 되도록 대면 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 아날라이트 리셉터 반응은 항원-항체 반응인 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 생성물과 기질 용액의 반응은 효소 반응이며, 상기 생성물은 효소로 표식되는 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정방법.
4. 고상과 결합된 아날라이트 리셉터 반응의 생성물을, 상기 생성물과의 반응에 따라 시료 용액중에 아날라이트 물질의 양을 측정하는데 사용된 상기 기질 용액의 pH를 변화시키는 기질 용액을 함유한 용액과 접촉시켜 시료 용액중에 존재하는 아날라이트 물질의 양을 측정하기 위한 장치로서, a) 상기 기질 용액에 대한 입구 수단 및 출구 수단을 갖는 셀 수단, b) 상기 셀내에서 수용된 pH 전극, c) 상기 기질 용액을 상기 셀내로 공급하기 위한 펌프 수단, d) 측정 대상 물질인 아날라이트와 특이적으로 결합하는 제 1 리셉터를 고정화시킨 고상에, 시료 용액과 표식 제 2 리셉터, 또는 표식 아날라이트를 접촉 반응시켜 세정된 고상을 셀내에 수납하는 수단 및 (e) 셀내에 수납된 고상 표면과 pH 전극의 pH 감응면을 이들 간극이 1mm이하로 되도록 대면 배치시키는 고상 위치 결정 수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정장치.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 pH 전극은 콘덕턴스가 적어도 50μV 이상이며 pH 감도가 25℃에서 40 내지 60mV/pH인 pH 감응 전계 효과 트랜지스터인 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정장치.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 고상은 내경이 2.0mm 이하인 소경관을 구비하며, 상기 소경관의 내벽상에서 상기 아날라이트와 특이적으로 결합하는 제 1 리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정장치.
7. 제 4 항에 있어서, 상기 아날라이트 리셉터 반응은 항원-항체 반응이며 상기 표식 제 2 리셉터 또는 표식 아날라이트는 효소로 표식되는 것을 특징으로 하는 아날라이트 물질의 측정장치.

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