JPS60173458A - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は種々の生体試料中の特定成分を迅速、かつ容易
に定量することのできるバイオセンサに関するものであ
る。

従来例の構成とその問題点 近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のバ
イオセンサが開発され、特に臨床検査分野への応用か試
みられている。検査項目及び検体数が増加している現在
、迅速に精度よく測定できるバイオセンサが望まれてい
る。

グルコースセンサに例をとると、糖尿病の増加が激しい
今ト１、面液中の血糖値を測定し管理するには、以前の
ように面液を遠心分離し面漿にして測定するのでは非常
に時間がかかるため、全面で測定できるセンサか要求さ
れている。簡易型としては、尿検査の時に使用されてい
る検査紙と同様に、ステインク状の支持体に糖（グルコ
ース）にのみ反応する酵素および酵素反応時又は酵素反
応の生成物により変化する色素を含有する担体を設置し
たものがある。この担体に血液を添加し、一定時間後の
色素の変化を目又は光により測定する１１式であるが、
血液中の色素による妨害が大きく精度は低い。

そこで、第１図のような多層式の分析担体が開発されて
いる。透明な支持体１の−Ｆに試薬層２、展開層３、防
水層４、濾過層５が順に積層した構造となっている。血
液サンプルを上部から廊下すると、まず濾過層５により
血液中の赤血球、血小板などの固形成分が除去され、防
水層４（ｒ（ある小孔４ａから展開層３へ均一に浸透し
、試薬層２において反応が進行する。反応終了後、透明
な支持体１を通して矢印の方向から光をあて、分光分析
により基質濃度を測定する方式である。従来の簡易なス
ティック状の担体にくらべ、複雑な構造であるが、血球
除去などにより精度は向−トした。しかし、血液の浸透
および反応に時間がかかるため、サンプルの乾燥を防ぐ
防水層４が必要となったり、反応を速めるために高温で
インキュベートする必要があり、装置および担体が複雑
化するという問題がある。

最近、酵素反応と電極反応を結びつけて基質濃度を測定
するバイオセンサが開発されている。グルコースセンサ
に例をとると、第２図のように、グルコースオキ／ダー
ゼ固定化電極６を容器７に入れ、緩衝液８で満たし、ス
ターテ９で撹拌している中に試料液を添加する。グルコ
ースオキシダーゼ固定化電極６には定電圧が印加されて
おり、試料中のグルコースと反応して生成した過酸化水
素を検知して電流が流れグルコース濃度が測定できる。

この方式を用いれば、血液中の色素なとに妨害されず迅
速に測定できる。しかし、撹拌装置が不可欠なためアワ
が発生したり液の乱れが精度に影響するという問題があ
った。又希釈しているため、緩衝液の量や試料の添加量
に精度が要求され操作が複雑化する不都合があった。

発明の目的 本発明は、−に記の問題点を克服し、生体試料中の特定
成分を簡易に、迅速かつ精度よく測定できるバイオセン
サを得ることを目的とする。

発明の構成 本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上に少なくとも
測定極と対極からなる電極系を有し、前記電極系を少な
くとも酸化還元酵素および酸化還元酵素と共役する酸化
型色素を含有してなる反応層と多孔性を有する２濾過層
で被覆したことを特徴とする。

本発明の・・イオセンザを用いることにより、生体試←
１の測定を簡易に、精度よく測定することができる。

実施例の説明 本発明の〕・イオセンザの１つとして、グルコースセン
ダーを例（・′こ説明する。第３図にグルコースセンサ
の一実施例の模式図を示す。塩化ビニル（可脂からなる
絶縁性の基板１０に白金を埋め込み、測定極１１と対極
１２とする。前記電極系を覆うように、ナイロン不織布
１３を設置する。このナイロン不縁布１３は、酸化還元
酵素としてグルコースオキ／ダーゼ１４と酸化還元酵素
と共役する酸化型色素としてフェリシアン化カリウム１
５を、溶解含浸後乾燥状態で担持（２ている。このナイ
ロン不織布１３の上部に、多孔性（孔径１　）ｒｒｎ、
　）のポリカーボネートからなる濾過層１６を設置する
。

このセンサに＋ｆｎ液を添加すると、江ｉ過層により赤
１■球などの大きな分子が濾過され、ナイロン不織布１
３からなる反応層において血液中のグルコースがグルコ
ースオキ／ダーゼ１４により酸化される際、フェリ／ア
ン化カリウム１５が共役して還元されフェロシアン化カ
リウムか生成する。このフェリシアン化カリウムを、対
極１２を基準に測定極１１の電位をＯＶから１−〇、６
Ｖ斗で０．１７７秒の速度で掃引することにより酸化す
る。この時間られる酸化電流は、フェロ／アン化カリウ
ムの濃度に比例し、フェロシアン化カリウムは基質濃度
に比例して生成するため、酸化電流を測定することによ
り基質であるグルコースの濃度が検知できる。ｊ！７ら
れた電流値は、グルコースの標準液で測定したところ、
８００ｍＶｄＨでグルコースの濃度とよい直線性を示し
た。酵素と酸化型色素からなる反応層および濾過層は、
測定毎に交換したが、標準液および血液のサンプル両方
において再現性は良好であった。又、血液の添加量を２
０〜１４０７１／の範囲で変化させたが、酸化型色素及
び酵素量が充分なため、添加量に関係なく一定の値を示
した。

ｐ渦層１６として、ポリカーボネートの多孔体を用いる
ことにより、血液中の血球や粘性の物質があらかじめ濾
過でき、電極の汚れを少なくすることができた。白金は
非常に安定な材料なので電極には最適である。しかし、
沖渦層がないと、長期間使用しているうちに電極−Ｆに
血球が付着し、得られる電流値が低下するため、電極を
アルコールで洗浄する必要かあったが、濾過層により電
極を水洗だけで応答が再現性よく保持できるようになっ
た。又、ポリカーボネートの多孔体を界面活性剤として
例えばポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテ
ル（商品名ニトリトンＸ）（７）１％溶液中に浸漬後乾
燥して使用すると、血液の濾過かすみやかになり、再現
性がさらに向上した。

血液はかなり粘度があるため、濾過速度が遅いという問
題点があったが、界面活性剤で処理した濾過層を用いる
ことにより、濾過かすみやかになり、すばやく均一に酵
素および色素と反応でき、サンプル添加後１分程度とい
う短時間に反応が完結した。界面活性剤を使用しない場
合は、反応が完結する捷でに血液添加後１分３０秒程度
必要とするので、測定の迅速化に大きな効果があった。

測定極および対極に白金を用いて２電極系で測定する場
合は、対極の面積を測定極のそれより十分太きくした方
が、対極の分極が少なくなり、良好な応答が得られた。

又、対極を銀塩化銀にすると、電位は安定し、対極の面
積も小さくできるため小型化が可能になった。

第４図のように、塩化ビニル樹脂の基板１０にそれぞれ
白金を埋め込み、測定極１１．対極１２および参照極１
７からなる３電極で電極系を構成した。参照極を用いた
３電極とすることにより、電位が安定して、応答再現性
が向−ヒした。捷た、上記に述べた様に対極面積を大き
くする必要もなくなり小型化できた。電極系を形成する
には上記のように白金を樹脂に埋めこんでもよいが、基
板−ヒに蒸着法あるいはスパッタ法により白金層を形成
して電極系を構成することもできる。

酸化型色素及び酵素より々る反応層は、試料液をすみや
かに吸収し酵素反応をおこ々わせることがてきるように
、親水性の多孔体膜であることが望捷しい。たとえば、
ろ紙やノζルプの不織布、セラミックの多孔体、ガラス
の多孔体などを用いると、試料液が均一にすばやく浸透
し再現性も良好であった。さらに、ナイロン不織布にお
いて、前記の界面活性剤で処理したものは、処理しなか
ったものより試料液の浸透がすみやかであり、測定の迅
速化に効果があった０ 酵素と酸化型色素を細かく粉砕混合後、加圧した成形体
を反応層とすると、血液の液体成分により酵素および酸
化型色素がすみやかに溶は均一に混合するため、反応の
迅速化に大きく貢献した。

寸だ、酸化型色素と酵素を加圧成形する際、結着剤とし
て、８１０２などを少量混合すると、成形体の強度が増
すので取り扱いが簡易と寿る。結着剤としでは、酵素反
応及び電極反応に無関係で親水性のものが適している。

酸化型色素および酵素は、なるべく血液の液体成分に速
く溶ける状態におくことが望ましい。そこで、酸化型色
素の水溶液をナイロン不織布に含浸後、熱風乾燥すると
、真空乾燥したものより非常に細かい結晶となり、液体
にとけやすくなった。

又、酸化型色素の水溶液を浸漬したナイロン不織布を、
エタノールのような水に対する溶解度の大きい有機溶媒
中に浸漬後真空乾燥すると、さらに細かい結晶を担持す
ることかできた。酵素は熱など（で弱いため、含浸後真
空乾燥を行なった。

そこで、第６図の構成からなるセンサを試みた。

電極系は第４図と同様で、その上にポリカーボネート多
孔体膜からなる濾過層１６、次にグルコースオキシダー
ゼ１４を担持したナイロン不織布１８、その上部にフェ
リシアン化カリウム１５を含浸後エタノールに浸漬し乾
燥して担持したナイロン不縁布１９を設置する。なお、
ポリカーボネート多孔体膜およびナイロン不織ｔ１１は
、あらかじめ前記の界面活性剤で処理した。

このセンサに血液を添加すると、すみやかにナイロン不
織布の層に浸透し、フェリシアン化カリウム１５とグル
コースセンダーゼ１４が溶解して反応か進みなから、血
液の液体成分のみ沖渦層１６を通過し電極系に至る。フ
ェリシアン化カリウムを細かい結晶状態で担持しである
ので、すみやかに溶解し酵素と共役して反応でき、反応
時間が約１分間以内と短縮できた。沖渦層は、第５図の
ように電極上においても、反応層のＬ部においてもよい
。又、色素■−１持層１９と酵素担持層１８ではさんで
もよい。液の浸透は、沖渦層が反応層の下に設置した時
が一番早くＩシ一応時間が短かかった。しかし、反応層
のＦ部に１濾過層を設置すると、先に血液中の固体成分
が２濾過てきるので、反応層において血球などによる妨
害がないため、スムーズに反応が進むという利点があり
、高精度であった。沖渦層としては、不織布、化学繊維
１紙（沖紙）、ガラスの多孔体々どが考えられるが、血
球の有形成分を沖別するには約２〜３ｐｍ以下の孔径を
有するメンブランフィルタ−が必要となる。

そこで、メンプランフィルター−一層又は、それに前記
の不織布、化学繊維、紙なとを積層しても１：い０ 界面活性剤としては、前記の例の他に、ポリオキ／エチ
レングリセリンｎ旨１１ｂ酸エステル、ポリオキンエチ
レンアルキルエーテル、ホリエチレングリコール脂肪酸
エステルなども使用できる。界面活性剤により、沖渦層
たけでなく色素及び酵素も処理しておくことにより、沖
過および浸漬速度が１すます速くなり、反応も速くてき
る。

色素としては、上記に用いたフェリンアン化カリウムが
安定に反応するので適しているか、Ｐ−ベンゾキノンを
使えば、反応速度が早いので高速化に適している。又、
２，６−ジクロロフェノールｌインドフェノール、メチ
レンブルー、フェナジンメトサルフェート、β−ナフト
キノン４−スルホン酸カリウムなども使用できる。

なお、上記実施例におけるセンサはグルコースに限らず
、アルコールセンサやコレステロールセンサなど、酸化
Ｇ元酵素の関与する系に用いることができる。又、酵素
は固定化した状態で担持することにより長期保存におい
ても安定に活性を維持することができる。

発明の効果 本発明のセンサによ打ば、直接試１′−１液を含浸させ
て微量の特定成分を簡易に、しかも迅速に精度よく測定
することができる。寸だ、沖渦層により、電極を長門間
安定に保持できる。さら（ｌζ、Ｗ商店１’ｌＥ剤によ
り浸透が速くなり１叉応時間か短縮できる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は従来のグルコースセン−リ−の構成
を示す略図、第３図、第４図及び第６図はイ〈発明の実
施例であるグルコースセンサの模式図である。 １０　基板、１１　測定極、１２　対極、１３　多孔体
（反応層）、１４　酵素、１６色素、１６　沖渦層、１
７　参照極。 代理人の氏名　弁理士　中　尾　敏　男　ほか１８第　
３　図

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）絶縁性の基板上に、少なくとも測定極と対極から
   なる電極系を設け、この電極系を酸化還元酵素および酸
   化還元酵素と共役する酸化型色素を含有する反応層およ
   び多孔性を有する濾過層で被覆したバイオセンサ。・
2. （２）前記濾過層か界面活性剤により処理されている特
   許請求の範囲第１項記載の・・イオセンザ。
3. （３）測定極が白金である特許請求の範囲第１項記載の
   バイオセンサ。
4. （４）　対極か白金又は銀塩化銀である特許請求の範囲
   第１項記載のバイオセンサ。
5. （５）反応層および濾過層が親水性の多孔体膜である特
   許請求の範囲第１項記載のバイオセンサ。
6. （６）酸化還元酵素及び色素が上記多孔体膜に乾燥状態
   で保持されている特許請求の範囲第６項記載のバイオセ
   ンサ〇