JPH0430543B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血液中の特定成分を迅速、かつ容易
に定量することのできるバイオセンサに関するも
のである。

従来例の構成とその問題点 近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した
種々のバイオセンサが開発され、特に臨床検査分
野への応用が試みられている。検査項目及び検体
数が増加している現在、迅速に精度よく測定でき
るバイオセンサが望まれている。

グルコースセンサに例をとると、糖尿病の増加
が激しい今日、血液中の血糖値を測定し管理する
には、以前のように血液を遠心分離し血漿にして
測定するのでは非常に時間がかかるため、全血で
測定できるセンサが要求されている。簡易型とし
ては、尿検査の時に使用されている検査紙と同様
に、ステイツク状の支持体に糖（グルルコース）
にのみ反応する酵素および酵素反応時又は酵素反
応の生成物により変化する色素を含有する担体を
設置したものがある。この担体に血液を添加し、
一定時間後の色素の変化を目又は光により測定す
る方式であるが、血液中の色素による妨害が大き
く精度は低い。

そこで、第１図のような多層式の分析担体が開
発されている。透明な支持体１の上に試薬層２、
展開層３、防水層４、過層５が順に積層した構
造となつている。血液サンプルを上部から滴下す
ると、まず過層５により血液中の赤血球、血小
板などの固形成分が除去され、防水層４にある小
孔４ａから展開層３へ均一に浸透し、試薬層２に
おいて反応が進行する。反応終了後、透明な支持
体１を通して矢印の方向から光をあて、分光分析
により基質濃度を測定する方式である。従来の簡
易なステイツク状の担体にくらべ、複雑な構造で
あるが、血球除去などにより精度は向上した。し
かし、血液の浸透および反応に時間がかかるた
め、サンプルの乾燥を防ぐ防水層４が必要となつ
たり、反応を速めるために高温でインキユベート
する必要があり、装置および担体が複雑化すると
いう問題がある。

最近、酵素反応と電極反応を結びつけて基質濃
度を測定するバイオセンサが開発されている。グ
ルコースセンサに例をとると、第２図のように、
グルコースオキシダーゼ固定化電極６を容器７に
入れ、緩衝液８で満たし、スターラ９で攪拌して
いる中に試料液を添加する。グルコースオキシダ
ーゼ固定化電極６には定電圧が印加されており、
試料中のグルコースと反応して生成した過酸化水
素を検知して電流が流れグルルコース濃度が測定
できる。この方式を用いれば、血液中の色素など
に妨害されず迅速に測定できる。しかし、攪拌装
置が不可欠なためアワが発生したり、液の乱れが
精度に影響するという問題があつた。又希釈して
いるため、緩衝液の量や試料の添加量に精度が要
求され操作が複雑化する不都合があつた。

発明の目的 本発明は、上記の問題点を克服し、血液中の特
定成分を簡易に、迅速かつ精度よく測定できるバ
イオセンサを得ることを目的とする。

発明の構成 本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上に少
なくとも測定極と対極からなる電極系を有し、前
記電極系を少なくとも酸化還元酵素および酸化還
元酵素と共役する酸化型色素を含有してなる反応
層と多孔性を有する過層で被覆し、反応層と
過層の少なくとも一方に抗凝血剤を担持したこと
を特徴とする。

本発明のバイオセンサを用いることにより、血
液中の特定成分の測定を簡易に、精度よく測定す
ることができる。

実施例の説明 本発明のバイオセンサの１つとして、グルコー
スセンサを例に説明する。第３図にグルコースセ
ンサの一実施例の模式図を示す。塩化ビニル樹脂
からなる絶縁性の基板１０に白金を埋め込み、測
定極１１と対極１２とする。前記電極系を覆うよ
うに、ナイロン不織布１３を設置する。このナイ
ロン不織布１３は、酸化還元酵素としてグルコー
スオキシダーゼ１４と酸化還元酵素と共役する酸
化型色素としてフエリシアン化カリウム１５を、
溶解含浸後乾燥状態で担持している。このナイロ
ン不織布１３の上部に、多孔性（孔径1μm）のポ
リカーボネートからなる過層１６を設置する。

そして過層１６には抗凝血剤であるフツ化ナ
トリウム溶液を含浸後乾燥して担持させた。

このセンサに血液を滴下して含浸させると、
過層により赤血球などの大きな分子が過され、
ナイロン不織布１３からなる反応層において血液
中のグルコースがグルコースオキシダーゼ１４に
より酸化される際、フエリシアン化カリウム１５
が共役して還元されフエロシアン化カリウムが生
成する。このフエロシアン化カリウムを、対極１
２を基準に測定極１１の電位を0Vから＋0.5Vま
で0.1V／秒の速度で掃引することにより酸化す
る。この時得られる酸化電流は、フエロシアン化
カリウムの濃度に比例し、フエロシアン化カリウ
ムは基質濃度に比例して生成するため、酸化電流
を測定することにより基質であるグルコースの濃
度が検知できる。得られた電流値は、グルコース
の標準液で測定したところ、800mg／dlまでグル
コースの濃度とよい直線性を示した。酵素と酸化
型色素からなる反応層および過層は、測定毎に
交換したが、標準液および血液のサンプル両方に
おいて再現性は良好であつた。又、血液の添加量
を20μ〜140μまで変化させたが、酸化型色素
及び酵素量が充分なため、添加量に関係なく一定
の値を示した。

過層１６として、ポリカーボネートの多孔体
を用いることにより、血液中の血球や粘性の物質
があらかじめ過でき、電極の汚れを少なくする
ことができた。過層がないと、長期間使用して
いるうちに電極上に血球が付着し、得られる電流
値が低下するため、電極をアルコールで洗浄する
必要があつたが、過層により電極を水洗だけで
応答が再現性よく保持できるようになつた。又、
ポリカーボネートの多孔体を界面活性剤で処理す
ることにより親水性をもたせることができる。界
面活性剤として例えばポリエチレングリコールア
ルキルフエニルエーテル（商品名：トリトンＸ）
の１％溶液中に浸漬後乾燥して使用すると、血液
の過がすみやかになり、再現性がさらに向上し
た。

さらに、過層１６には抗凝血剤を担持してい
るので血液がわずか10秒で過できた。血液は粘
性が高いため過に時間がかかりすぎると凝血が
始まり過層を通過できなくなるという問題が従
来はあつたが、抗凝血剤を用いることにより過
がすみやかになり、常に安定に測定でき、測定の
迅速化にも大きな効果があつた。

測定極および対極に白金を用いて２電極系で測
定する場合は対極の面積を測定極のそれより十分
大きくした方が、対極の分極が少なくなり、良好
な応答が得られる。又、対極を銀塩化銀にする
と、電位は安定する。

第４図のように、塩化ビニル樹脂からなる基板
１０に白金を埋め込み、測定極１１、対極１２、
および参照極１７からなる３電極で電極系を構成
した。参照極を用いた３電極とすることにより、
２電極に比較して、応答再現性が向上した。ま
た、上記に述べた様に対極面積を大きくする必要
もなくなり小型化できた。又、白金を基板上にス
パツタ法や蒸着法により白金層を形成して電極系
とすることも可能である。

酸化型色素及び酵素よりなる反応層は、試料液
をすみやかり吸収し酵素反応をおこなわせること
ができるように、親水性の多孔体膜であることが
望ましい。たとえば、ろ紙やパルプの不織布、セ
ラミツクやガラスの多孔体などを用いると、試料
液が均一にすばやく浸透し再現性も良好であつ
た。さらに、ナイロン不織布において、前記の界
面活性剤で処理したものは、処理しなかつたもの
より試料液の浸透がすみやかであり、測定の迅速
化に効果があつた。

酵素と酸化型色素を細かく粉砕混合後、加圧
（200Kg／cm²）した成形体を反応層とすると、血液
の液体成分によりすみやかに溶け均一に混合する
ため、反応の迅速化に大きく貢献した。また、酸
化型色素と酵素を加圧成形する際、結着剤とし
て、SiO₂などを少量混合すると、成形体の強度
が増すので取り扱いが簡易となる。結着剤として
は、酵素反応及び電極反応に無関係で親水性のも
のが適している。

酸化型色素および酵素は、なるべく血液の液体
成分に速く溶ける状態におくことが望ましい。そ
こで、酸化型色素の溶液をナイロン不織布に含浸
後、熱風乾燥すると、真空乾燥したものより非常
に細かい結晶となり、液体にとけやすくなつた。
又、酸化型色素の溶液を浸漬したナイロン不織布
を、エタノールのような水に対する溶解度の大き
い有機溶媒中に浸漬後真空乾燥すると、さらに細
かい結晶を担持することができた。酵素は熱など
に弱いため、含浸後真空乾燥を行なつた。

そこで、第５図の構成からなるセンサを試み
た。電極系は第４図と同様で、その上にポリカー
ボネート多孔体膜からなる過層１６、次にグル
コースオキシダーゼ１４を担持したナイロン不織
布１８、その上部にフエリシアン化カリウム１５
を含浸後エタノールに浸漬し乾燥して担持したナ
イロン不織布１９を設置する。なお、ポリカーボ
ネート多孔体膜およびナイロン不織布は、あらか
じめ前記の界面活性剤で処理し、抗凝血剤である
フツ化ナトリウムを含浸後乾燥して担持した。上
記のように酵素の担持層１８と酸化型色素の担持
層１９と分離した反応層にすることによりそれぞ
れ血液に溶けやすい状態に担持できる。

このセンサに血液を添加すると、抗凝血剤によ
り凝血することなく、すまやかにナイロン不織布
の層に浸透し、フエリシアン化カリウム１５とグ
ルコースオキシダーゼ１４が溶解して反応が進み
ながら、血液の液体成分のみ過層１６を通過し
電極系に至る。フエリシアン化カリウムを細かい
結晶状態で担持してあるので、すみやかに溶解し
酵素と共役して反応でき、反応時間が約１分間以
内と短縮できた。過層は、第５図のように電極
上においても、反応層の上部においてもよい。
又、色素担持層１９と酵素担持層１８ではさんで
もよい。液の浸透は、過層が反応層の下に設置
した時が一番早く反応時間が短かかつた。

さらに、過層が下にある場合は抗凝血剤を担
持しなくても、反応層のみに担持するだけで速や
かに血液が過され、工程の簡易化に効果があつ
た。

しかし、反応層の上部に過層を設置すると、
先に血液中の固体成分が過できるので、反応層
において血球などによる妨害がないため、スムー
ズに反応が進むという利点があり、高精度であつ
た。

過層としては、不織布，化学繊維，紙（
紙），ガラスの多孔体などが考えられる。血球を
過するためには孔径が２〜3μm以下であること
が必要である。血球過が可能な均一な孔径のメ
ンブランフイルターやガラスの多孔体が適してい
る。

色素としては、上記に用いたフエリシアン化カ
リウムが安定に反応するので適しているが、Ｐ−
ベンゾキノンを使えば、反応速度が早いので高速
化に適している。又、２，６−ジクロロフエノー
ルインドフエノール、メチレンブルー、フエナジ
ンメトサルフエート、β−ナフトキノン４−スル
ホン酸カリウムなども使用できる。

抗凝血剤としては、フツ化ナトリウムが安定で
取扱いも簡易なため適しているが、ヘパリンやク
エン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸も血
液過を迅速におこなわせるのに有用であつた。

なお、上記実施例におけるセンサはグルコース
に限らず、アルコールセンサやコレステロールセ
ンサなど、酸化還元酵素の関与する系に用いるこ
とができる。又、酵素は固定化した状態で担持す
ることにより長期保存においても安定に活性を維
持することができる。

発明の効果 本発明のセンサによれば、直接血液を含浸させ
て微量の特定成分を簡易に、しかも迅速に精度よ
く測定することができる。また、過層により、
電極を長期間安定に保持できる。さらに、抗凝血
剤を担持することにより、血液を凝血させること
なくすみやかに過させ、反応時間を短縮するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は従来のグルコースセンサの
構成を示す図、第３図，第４図及び第５図は本発
明の実施例であるグルコースセンサの模式図であ
る。 １０……基板、１１……測定極、１２……対
極、１３……多孔体（反応層）、１４……酵素、
１５……色素、１６……過層、１７……参照
極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 絶縁性の基板上に、少なくとも測定極と対極
   からなる電極系を設け、この電極系を酸化還元酵
   素および酸化還元酵素と共役する酸化型色素を含
   有する反応層および多孔性の過層で被覆すると
   ともに、前記反応層および過層の少なくとも一
   方に抗凝血剤を担持させたバイオセンサ。 ２ 測定極が白金である特許請求の範囲第１項記
   載のバイオセンサ。 ３ 対極が白金又は銀塩化銀である特許請求の範
   囲第１項記載のバイオセンサ。 ４ 反応層および過層が親水性を有する多孔体
   膜である特許請求の範囲第１項記載のバイオセン
   サ。 ５ 酸化還元酵素、色素および抗凝血剤が多孔体
   膜に乾燥状態で保持されている特許請求の範囲第
   ４項記載のバイオセンサ。 ６ 電極系が測定極、対極及び参照極の３電極で
   構成され、いずれの電極も白金である特許請求の
   範囲第１項記載のバイオセンサ。