JPH058776B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々の生体試料中の特定成分を迅速
に、かつ精度よく容易に定量することのできるバ
イオセンサに関するものである。

従来例の構成とその問題点 近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した
種々のバイオセンサが開発され、特に臨床検査分
野への応用が試みられている。検査項目及び検体
数が増加している現在、迅速に精度よく測定でき
るバイオセンサが望まれている。

グルコースセンサに例をとると、糖尿病の増加
が激しい今日、血液中の血糖値を測定し管理する
には、以前のように血液を遠心分離し血漿にして
測定するのでは非常に時間がかかるため、全血で
測定できるセンサが要求されている。簡易型とし
ては、尿検査の時に使用されている検査紙と同様
に、ステイツク状の支持体に糖（グルコース）に
のみ反応する酵素および酵素反応時又は酵素反応
の生成物により変化する色素を含有する担体を設
置したものがある。この担体に血液を添加し、一
定時間後の色素の変化を目又は光により測定する
方式であるが、血液中の色素による妨害が大きく
精度は低い。

そこで、第４図のような多層式の分析担体が開
発されている。透明な支持体１の上に試薬層２、
展開層３、防水層４、過層５が順に積層した構
造となつている。血液サンプルを上部から滴下す
ると、まず過層５により血液中の赤血球、血小
板などの固形成分が除去され、防水層４にある小
孔から展開層３へ均一に浸透し、試薬層２におい
て反応が進行する。反応終了後、透明な支持体１
を通して矢印の方向から光をあて、分光分析によ
り基質濃度を測定する方式である。従来の簡易な
ステイツク状の担体にくらべ、複雑な構造である
が、血球除去などにより精度は向上した。しか
し、血液の浸透および反応に時間がかかるため、
サンプルン乾燥を防ぐ防水層４が必要となつた
り、反応を速めるために高温でインキユベートす
る必要があり、装置および担体が複雑化するとい
う問題がある。

発明の目的 本発明は、上記の問題点を克服し、生体試料中
の特定成分を簡易に、迅速かつ精度よく測定でき
るバイオセンサを得ることを目的とする。

発明の構成 本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板に少な
くとも測定極と対極からなる電極系を形成し、こ
の電極系の上部に空間を設け、さらにその上部に
少なくとも酸化還元酵素を含有する多孔体を設置
したことを特徴とする。

このバイオセンサを用い、前記多孔体に試料液
を添加し、試料液と多孔体に含有されている酵素
と電子受容体とを反応させ、還元された電子受容
体を電極系で検知することにより試料液中の基質
濃度を測定する。

本発明のバイオセンサを用いることにより、電
極の内部液や希釈液を必要とせず生体試料を単に
多孔体に含浸させるだけで精度よく簡易に測定す
ることができる。

実施例の説明 本発明のバイオセンサの１つとして、グルコー
スセンサを例に説明する。第１図にグルコースセ
ンサの一実施例の模式図を示す。塩化ビニル樹脂
からなる絶縁性の基板６に深さ0.2mmの溝７を設
け、溝７の底に白金を埋めこみ測定極８とし、さ
らに銀塩化銀を埋めこみ対極９とした。溝７を覆
うようにナイロン不織布１０を設置した。このナ
イロン不織布１０は、酸化還元酵素としてグルコ
ースオキシダーゼ１１を溶解含浸後乾燥状態で担
持している。

このセンサにグルコースを含むサンプル液を添
加すると、ナイロン不織布１０においてサンプル
中のグルコースがグルコースオキシダーゼ１１に
より酸化される際、電子受容体としてサンプル中
の溶存酸素および空気中の酸素が消費され、過酸
化水素が生成する。この過酸化水素を対極９を基
準に測定極８の電位を0Vから＋1.0Vまで0.1V／
秒で掃引することにより酸化する。この時得られ
た酸化電流値のピーク値はグルコースの標準液で
測定したところグルコースの濃度300mg／dlまで
グルコースの濃度に比例した値が得られた。サン
プル液が血液の場合も同様に直線性が得られた。

対極９の銀塩化銀のかわりに白金を用いても測
定できたが、電位を安定させるためには、測定極
８の白金の露出面積の２倍以上は必要であつた。

次にグルコースセンサの他の一実施例の模式図
を第２図に示す。塩化ビニル樹脂からなる絶縁性
の基板６に深さ0.1mmの溝７を設け、溝７の底に
白金を埋め込み、測定極８、対極９、さらに参照
極１２とした。溝７を覆うようにナイロン不織布
１０を設置した。このナイロン不織布１０には、
酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼ１
１、および酸化還元酵素と共役する酸化型色素と
してフエリシアン化カリウム１３をいずれも、そ
れぞれ溶解含浸後乾燥して担持している。このセ
ンサにグルコースを含むサンプル液を添加する
と、ナイロン不織布１０においてサンプル中のグ
ルコースがグルコースオキシダーゼ１１と反応す
る際、フエリシアン化カリウム１３が還元されて
フエロシアン化カリウムが生成する。このフエロ
シアン化カリウムを、参照極１２を基準に測定極
８の電位を0Vから＋0.2Vまで0.1V／秒で掃引す
ることにより酸化する。得られた電流のピーク値
は、グルコースの濃度に比例し、グルコースの標
準液で測定すると500mg／dlと高濃度までよい直
線性が得られた。サンプル液が血液の場合も同様
に直線性が得られた。参照極１２をさらに設ける
ことにより電位が安定し、測定極８と対極９の面
積が同じでも安定に測定できた。第２図に示した
センサと同じ大きさで、溝７のないものについて
グルコースの標準液で測定したところ、溝７のあ
るセンサに比べて得られる電流値が10％〜15％小
さくなり、再現性も劣つていた。ナイロン不織布
１０が直接測定極８にふれるため、電極面積が小
さくなり電流値が小さくかつばらついてくる原因
と考えられる。

電極系の上部に空間を設けるには、前記のよう
に基板に溝のような凹部を設けてもよいし、ある
いは第３図に示す様に基板の上にスペーサー１４
を設けてナイロン不織布が少なくとも測定極８に
直接接触しないようにしてもよい。空間をできる
だけ小さくすることにより、血液などの試料の添
加量も少なくすることができた。グルコースオキ
シダーゼ１１とフエロシアン化カリウム１３を高
濃度に担持したところ、血液の添加量を30μlから
150μlまで変化させても添加量に関係なく一定の
酸化電流値を示した。

前記に示した電子受容体として酸素を用いる構
成にすれば、サンプル液中の溶存酸素の濃度およ
び空中の酸素が溶ける速度が限られているため、
基質が高濃度の場合は測定できないという欠点が
あつた。しかし、酸素のかわりに酸化型の色素を
高濃度に担持することにより、高濃度の基質濃度
のサンプルも測定が可能となつた。上記に用いた
フエリシアン化カリウムが安定に反応するので適
している。Ｐ−ベンゾキノンを使えば、反応速度
が早いので高速化に適している。又、２，６−ジ
クロロフエノールインドフエノール、メチレンブ
ルー、フエナジンメトサルフエート、β−ナフト
キノン４−スルホン酸カリウムなども使用でき
る。

電極系を形成するには、上記のように白金を樹
脂に埋めこんでもよいが、基板上に蒸着法あるい
はスパツタ法により白金層を形成して電極系を構
成することもできる。

酸化還元酵素を含有する多孔体は、試料液をす
みやかに吸収し酵素反応をおこなわせることがで
きるように、親水性の多孔体であることが望まし
い。たとえば、ろ紙やパルプの不織布、セラミツ
クの多孔体、ガラスの多孔体などを用いると、試
料液が均一にすばやく浸透し再現性も良好であつ
た。さらに、ナイロン不織布にポリエチレングリ
コールアルキルフエニルエーテル（商品名；トリ
トン×）などの界面活性剤を希釈した溶液に浸漬
して乾燥したものを用いると血液などの浸透がい
ちだんとすみやかになつた。

酸化還元酵素の担持方法としては、水溶液にし
て多孔体に含浸後乾燥させるだけでなく、多孔体
に水溶液を含浸後、エタノールのような水に対す
る溶解度の大きい有機溶媒中に浸漬後真空乾燥す
るとさらに細かい結晶が担持され試料にとけやす
く、反応時間が短くなつた。又酵素を細かく粉砕
後SiO₂のような結着剤を加えて加圧成形しても
よい。

なお、上記実施例におけるセンサは血中のグル
コースの他に果汁中のグルコース等も測定でき、
又グルコースに限らず、酵素をかえることにより
アルコールセンサやコレステロールセンサなど、
酸化還元酵素の関与する系に用いることができ
た。又、酵素は固定化した状態で担持することに
より長期保存においても安定に活性を維持するこ
とができた。

発明の効果 本発明のセンサによれば、直接試料液を含浸さ
せるだけで、微量の特定成分を簡易に、しかも迅
速に精度よく測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は本発明の実施例
のグルコースセンサの模式図、第４図は従来のグ
ルコースセンサの模式図である。 １……支持体、２……試薬層、３……展開層、
４……防水層、５……過層、６……基板、７…
…溝、８……測定極、９……対極、１０……多孔
体、１１……酵素、１２……参照極、１３……色
素、１４……スペーサー。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 絶縁性の基板に少なくとも測定極と対極から
   なる電極系を設け、この電極系を少なくとも酸化
   還元酵素を含有する多孔体によつて空間部分を介
   して覆つたバイオセンサ。 ２ 電極系が、測定極、対極及び参照極からなる
   特許請求の範囲第１項記載のバイオセンサ。 ３ 測定極が白金である特許請求の範囲第１項記
   載のバイオセンサ。 ４ 対極が白金又は銀塩化銀である特許請求の範
   囲第１項記載のバイオセンサ。 ５ 多孔体が親水性の多孔体である特許請求の範
   囲第１項記載のバイオセンサ。 ６ 酸化還元酵素が多孔体に乾燥状態で保持され
   ている特許請求の範囲第５項記載ののバイオセン
   サ。 ７ 多孔体が酸化型色素を乾燥状態で担持してい
   る特許請求の範囲第５項記載のバイオセンサ。