JPH0481141B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々の生体試料中の特定成分を迅速
にかつ精度よく容易に定量することのできるバイ
オセンサに関するものである。

従来例の構成とその問題点 近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した
種々のバイオセンサが開発され、特に臨床検査分
野への応用が試みられている。検査項目及び検体
数が増加している現在、迅速に精度よく測定でき
るバイオセンサが望まれている。

グルコースセンサに例をとると、糖尿病の増加
が激しい今日、血液中の血糖値を測定し管理する
には、以前のように血液を遠心分離し血漿にして
測定するのでは非常に時間がかかるため、全血で
測定できるセンサが要求されている。簡易型とし
ては、尿検査の時に使用されている検査紙と同様
に、ステイツク状の支持体に糖（グルコース）に
のみ反応する酵素および酵素反応時又は酵素反応
の生成物により変化する色素を含有する担体を設
置したものがある。この担体に血液を添加し、一
定時間後の色素の変化を目又は光により測定する
方式であるが、血液中の色素による妨害が大きく
精度は低い。

そこで、第３図のような多層式の分析担体が開
発されている。透明な支持体１の上に試薬層２、
展開層３、防水層４、過層５が順に積層した構
造となつている。血液サンプルを上部から滴下す
ると、まず過層５により血液中の赤血球、血小
板などの固形成分が除去され、防水層４にある小
孔から展開層３へ均一に浸透し、試薬層２におい
て反応が進行する。反応終了後、透明な支持体１
を通して矢印の方向から光をあて、分光分析によ
り基質濃度を測定する方式である。従来の簡易な
ステイツク状の担体にくらべ、複雑な構造である
が、血球除去などにより精度は向上した。しか
し、血液の浸透および反応に時間がかかるため、
サンプルの乾燥を防ぐ防水層４が必要となつた
り、反応を速めるために高温でインキユベートす
る必要があり、装置および担体が複雑化するとい
う問題がある。

発明の目的 本発明は、上記の問題点を克服し、生体試料中
の特定成分を簡易に、迅速かつ精度よく測定でき
るバイオセンサを得ることを目的とする。

発明の構成 本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板に測定
極と対極および参照極からなる電極系を設け、こ
の電極系の上部に空間を設け、さらにその上部に
酸化還元酵素および酸化還元酵素と共役する酸化
型色素を含有する多孔体および多孔性の過層を
設置したことを特徴とする。

このバイオセンサを用い、前記過層に試料液
を添加し、過層を透過して多孔体に達した試料
液と多孔体に含有されている酵素及び酸化型色素
を反応させ、還元された前記色素を電極系で検知
することにより試料液中の基質濃度を測定するも
のである。

本発明のバイオセンサを用いることにより、電
極の内部液や希釈液を必要とせず、生体試料を単
に多孔体および過層に含浸させるだけで精度よ
く簡易に測定することができる。

実施例の説明 本発明のバイオセンサの１つとして、グルコー
スセンサを例に説明する。第１図にグルコースセ
ンサの一実施例の模式図を示す。塩化ビニル樹脂
からなる絶縁性の基板６に深さ0.2mmの溝７を設
けた。この溝７の底に白金を埋めこみ、測定極
８、対極９、参照極１０とした。溝７を覆うよう
にナイロン不織布１１とポリカーボネートの膜１
４を設置した。このナイロン不織布１１は酸化還
元酵素としてグルコースオキシダーゼ１２および
これと共役する酸化型色素としてフエリシアン化
カリウム１３を溶解含浸後乾燥状態で担持してい
る。ポリカーボネートの多孔体膜１４は孔径1μ
ｍの膜を使用した。

このセンサに血液を添加すると、ポリカーボネ
ートの多孔体膜１４により血液を液体成分のみ
過される。次にナイロン不織布１１において、血
中のグルコースがグルコースオキシダーゼ１２に
より酸化される際、フエリシアン化カリウム１３
が還元されてフエロシアン化カリウムがグルコー
スの濃度に応じて生成する。このフエロシアン化
カリウムを、参照極１０を基準に測定極８の電位
を0Vから＋0.2Vまで0.1V／秒で掃引することに
より酸化する。得られた電流のピーク値は、グル
コースの濃度に比例し、グルコースの標準液で測
定すると500mg／dlと高濃度までよい直線性が得
られ、血液においても従来法と比較したところよ
い相関が得られた。酵素と酸化型色素からなる多
孔体１１と過層１４は測定毎に交換したが、グ
ルコースの標準液および血液のサンプル両方にお
いて再現性は良好であつた。又、血液の添加量を
20〜140μまで変化させたが、酸化型色素及び
酵素量が充分なため、添加量に関係なく一定の値
を示した。

参照極１０の白金を銀塩化銀にするとさらに電
位が安定して再現性が向上した。

第１図に示したセンサと同じ大きさで、溝７の
ないものについて、グルコースの標準液で測定し
たところ、溝７のあるセンサに比べて得られる電
流値が10〜15％小さくなり再現性も劣つていた。
ナイロン不織布１１が直接測定極８にふれるため
電極面積が小さくなり、電流値が小さくかつばら
ついてくる原因と考えられる。

電極系の上部に空間を設けるには、前記のよう
に基板に溝のような凹部を設けてもよいし、基板
の上に第２図のようにスペーサー１５を設けてナ
イロン不織布１１が直接電極、少なくとも測定極
８に接触しないようにしてもよい。空間をできる
だけ小さくすることにより、血液などの試料の添
加量も少なくすることができる。

電極系を形成するには、上記のように白金を樹
脂に埋めこんでもよいが、基板上に蒸着法あるい
はスパツタ法により白金層を形成して電極系を構
成することもできる。

過層１４として、ポリカーボネートの多孔体
を用いることにより、血液中の血球や粘性の物質
があらかじめ過でき、電極の汚れを少なくする
ことができる。過層がないと、長期間使用して
いるうちに電極上に血球が付着し、得られる電流
値が低下するため、電極をアルコールで洗浄する
必要があつたが、過層により電極を水洗するだ
けで応答が再現性よく保持できるようになつた。
又多孔体の孔径は約3μｍ以内のものが上記目的
に有効であつた。さらに、ポリカーボネートの多
孔体を界面活性剤として例えばポリエチレングリ
コールアルキルフエニルエーテル（商品名；トリ
トンＸ）の１％水溶液中に浸漬後乾燥して使用す
ると血液の過がすみやかになり、再現性がさら
に向上した。血液はかなり粘度があるため、過
速度が遅いという問題点があつたが、界面活性剤
で処理した過層を用いることにより、過がす
みやかになり、すばやく均一に酵素および色素と
反応でき、サンプル添加後１分程度という短時間
に反応が完結した。界面活性剤を使用しない場合
は、反応が完結するまでに血液添加後１分30秒程
度必要とするので、測定の迅速化に大きな効果が
あつた。

界面活性剤としては、前記の例の他に、ポリオ
キシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレング
リコール脂肪酸エステルなども使用できた。界面
活性剤により、過層でけでなく色素及び酵素も
処理しておくことにより、過および浸漬速度が
遅くなり迅速に測定できるようになつた。

酸化型色素及び酵素よりなる反応層は、試料液
をすみやかに吸収し酵素反応をおこなわせること
ができるように、親水性の多孔体であることが望
ましい。たとえば、ナイロン不織布の他に紙や
パルプの不織布、セラミツクの多孔体あるいはガ
ラスの多孔体などを用いると、試料液が均一にす
ばやく浸透し再現性も良好であつた。さらに、上
記多孔体膜において、前記の界面活性剤で処理し
たものは、処理しなかつたものより試料液の浸透
がすみやかであり、測定の迅速化に効果があつた
過層は電極上においても、反応層の上部におい
てもよい。液の浸透は、過層が反応層の下に設
置した時が一番速く、反応時間も短かかつた。し
かし、反応層の上部に過層を設置すると、先に
血液中の固体成分が過できるので、反応層にお
いて血球などによる妨害がないため、スムーズに
反応が進むという利点があり、高精度であつた。
過層としては、不織布、化学繊維、紙（紙）
などが考えられるが、血球の有形成分を別する
には3μｍ以下の孔径を有するメンブランフイル
タを用いることにより完全に血球をとり除くこと
ができた。又メンブランフイルター層に前記の不
織布、化学繊維、紙などを積層して段階的に過
することもできた。

酸化還元酵素および酸化型色素の担持方法とし
ては、水溶液にして多孔体に含浸後乾燥させるだ
けではなく、多孔体に水溶液を含浸後、エタノー
ルのような水に対する溶解度の大きい有機溶媒中
に浸漬後真空乾燥するとさらに細かい結晶が担持
され試料にとけやすく、反応時間が短くなつた。
又酸化還元酵素および酸化型色素を細かく粉砕後
SiO₂のような結着剤を加えて加圧成形してもよ
い。

色素としては、上記実施例に用いたフエリシア
ン化カリウムが水に対する溶解度が大きく試料液
にすみやかに溶解し、又乾燥状態で保存しても安
定であるなど適している。又、ｐ−ベンゾキノン
を使えば、反応速度が大きいので高速化に適して
いる。さらに、これ以外の酸化型色素として、
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール、
メチレンブルー、フエナジンメトサルフエート、
β−ナフトキノン４−スルホン酸カリウムなども
使用できた。

なお、上記実施例におけるセンサは血中のグル
コースの他に果汁中のグルコース等も測定でき、
又、グルコースに限らず酸化還元酵素としてアル
コールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、
コレステロールオキシダーゼ等を用いることによ
り、アルコールセンサやコレステロールセンサ、
鮮度センサに応用することができた。又、酸化還
元酵素は固定化して用いることもでき、長期保存
においても安定に活性を維持することができた。

発明の効果 本発明のセンサによれば、直接試料液を含浸さ
せるだけで微量の特定成分を簡易に、しかも迅速
に精度よく測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の実施例のグルコ
ースセンサの模式図、第３図は従来のグルコース
センサの模式図である。 １……支持体、２……試薬層、３……展開層、
４……防水層、５……過層、６……基板、７…
…溝、８……測定極、９……対極、１０……参照
極、１１……多孔体、１２……酵素、１３……色
素、１４……過層、１５……スペーサー。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 絶縁性の基板に測定極と対極および参照極か
   らなる電極系を設け、この電極系を酸化還元酵素
   および酸化還元酵素と共役する酸化型色素を含有
   する多孔体と多孔性の過層によつて空間部を介
   して覆つたバイオセンサ。 ２ 前記過層が界面活性剤により処理されてい
   る特許請求の範囲第１項記載のバイオセンサ。 ３ 測定極が白金である特許請求の範囲第１項記
   載のバイオセンサ。 ４ 対極が白金又は銀塩化銀である特許請求の範
   囲第１項記載のバイオセンサ。 ５ 多孔体が親水性であり、酸化還元酵素および
   酸化型色素が乾燥状態で保持されている特許請求
   の範囲第１項記載のバイオセンサ。