JP2009222459A - 酸化還元蛋白質を固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体とその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】メディエーターを用いることなくヒドロゲナーゼ等の酸化還元蛋白質を水素−プロトンの酸化還元反応の触媒として用いることができ、しかも、水素発生等の水素−プロトン酸化還元反応を高効率に行うことが可能な電極材料と、それを用いた水素発生デバイス等を提供する。
【解決手段】複数本の単層カーボンナノチューブが導体基板上に配置され、かつ、導体基板面に対して所定方向に配向した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体であって、当該バルク構造体の内部空間に、ヒドロゲナーゼ等の酸化還元蛋白質が固定化されていることを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を用いた新規な電極材料とその用途に関するものである。

水素−プロトンの酸化還元反応を触媒する蛋白質であるヒドロゲナーゼ（H₂ase）は、高い電気／水素変換効率を有するため、水素生産や水の電気分解用の電極材料として注目されてきた。

また、熱や酸素に対して十分な安定性を有するヒドロゲナーゼが発見されており、ヒドロゲナーゼ生成菌の培養技術、ヒドロゲナーゼの分離精製技術も確立されている。近年では、ヒドロゲナーゼの電極への固定化技術等が研究されており、たとえば、電極上にヒドロゲナーゼをLagmuir-Blodgett膜として固定化する技術等が提案されている（特許文献１参照）。
特開２００２−２１４１９０号公報

しかしながら、従来の技術では、ヒドロゲナーゼとの電子授受や、それに伴う水素発生を行うためには、メチルビオロゲン（MV）等の分子メディエーターを用いる必要があった。

すなわち、ヒドロゲナーゼにおける水素の酸化還元に作用する活性部位は局在化していると考えられており、電極とヒドロゲナーゼとの直接的な電子授受は困難であったことから、電極とヒドロゲナーゼとの間の電子授受を仲介するメディエーターが不可欠であった。

そこで本発明は、このような従来技術の問題点を解消し、メディエーターを用いることなくヒドロゲナーゼ等の酸化還元蛋白質を水素−プロトンの酸化還元反応の触媒として用いることができ、しかも、水素発生等の水素−プロトン酸化還元反応を高効率に行うことが可能な電極材料と、それを用いた水素発生デバイスを提供することを課題としている。

本発明は、上記の課題を解決するものとして、以下のことを特徴としている。

第１：複数本の単層カーボンナノチューブが導体基板上に所定間隔で配置され、かつ、導体基板面に対して所定方向に配向した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体であって、当該バルク構造体の内部空間に、酸化還元蛋白質が固定化されていることを特徴とする配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。

第２：酸化還元蛋白質がヒドロゲナーゼであることを特徴とする上記第１の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。

第３：単層カーボンナノチューブは導体基板上に所定間隔で配置されていることを特徴とする上記第１または第２の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。

第４：導体基板上に配置された単層カーボンナノチューブの嵩密度が0.02〜0.2 g/cm³
であることを特徴とする上記第１から第３のいずれかの配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。

第５：上記第１から第４のいずれかの配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体からなることを特徴とする電極材料。

第６：上記第５の電極材料を用いて形成された電極を備えることを特徴とする水素発生デバイス。

第７：上記第５の電極材料を用いて形成された電極を備えることを特徴とする定電位電解式水素センサ。

上記のとおりの本発明によれば、メディエーターを用いることなくヒドロゲナーゼ等の酸化還元蛋白質を水素−プロトンの酸化還元反応の触媒として用いることができ、しかも、水素発生等の水素−プロトン酸化還元反応を高効率に行うことが可能である。

本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

本発明に用いられる配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体は、複数本の単層カーボンナノチューブが、導体基板上に配置され、かつ、導体基板面に対して所定方向に、好ましくは導体基板面に対して垂直に配向したものである。すなわち、当該バルク構造体は、導体基板上に単層カーボンナノチューブの集合体が植設されたものである。このような配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体として、具体的には、国際公開第２００６／０１１６５５号パンフレットに記載のものを用いることができる。

配向した単層カーボンナノチューブの集合体は、適宜に密度を嵩高く製造することができ、その隙間に異物質を含浸することができるため、好適である。

本発明に用いられる配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体において、単層カーボンナノチューブは、純度が好ましくは98 mass％以上、より好ましくは99 mass％以上、特に好ましくは99.9 mass％以上である。ここで、純度は後述のＣＶＤ法により得られた生成物中のカーボンナノチューブの質量％（mass％）であり、たとえば蛍光Ｘ線を用いた元素分析の結果より計測できる。

単層カーボンナノチューブの比表面積は、未開口のものでは、好ましくは600〜1300 m²/g、より好ましくは800〜1200 m²/gであり、開ロしたものでは、好ましくは1600〜2500 m²/g、より好ましくは1800〜2300 m²/gである。

単層カーボンナノチューブの高さ（長さ）は、好ましくは10μm〜1 mm、より好ましくは50μm〜500μmである。

単層カーボンナノチューブのサイズ（径）は、ある程度の分布、たとえば0.8〜6 nmの
範囲内で分布を有していてもよく、中心サイズは、たとえば1〜4 nmである。

導体基板上に配置された単層カーボンナノチューブの嵩密度は、好ましくは0.02〜0.2 g/cm³である。単層カーボンナノチューブの密度を当該範囲内とすることで、1〜10 nm程度のサイズの蛋白質を配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の内部空間まで導入することができる。

また、単層カーボンナノチューブを導体基板上に所定間隔で配置する場合、導体基板上における単層カーボンナノチューブの配置間隔は、好ましくは5〜50 nm、より好ましくは5〜20 nmである。このような配置間隔とすることで、1〜10 nm程度のサイズの蛋白質を配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の内部空間まで導入することができる。

導体基板上に所定間隔で植設された複数の単層カーボンナノチューブからなる集合体の基板面方向の面積は、特に制限はないが、たとえばmmサイズ、あるいはcmサイズとすることができる。

なお、本発明に用いられる配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体は、その機能を阻害しない範囲で、２層カーボンナノチューブやそれ以上の多層カーボンナノチューブを含んでいてもよい。

本発明に用いられる配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体は、国際公開第２００６／０１１６５５号パンフレットに記載の方法で製造することができる。具体的には、成長基板上にパターニングされた金属触媒の存在下に、反応雰囲気に水蒸気等の酸化剤を添加し、低級炭化水素等の原料炭素源を供給し、所定の温度、圧力条件下において化学気相成長（ＣＶＤ）法により単層カーボンナノチューブを成長させることにより、基板面に対して所定方向に配向するように複数の単層カーボンナノチューブを生成させることができる。

金属触媒は、リソグラフィー技術等を用いて導体基板上にパターニングされる。金属触媒の具体例としては、塩化鉄薄膜、スパッタで作製された鉄薄膜、鉄−モリブデン薄膜、アルミナ−鉄薄膜、アルミナ−コバルト薄膜、アルミナ−鉄−モリブデン薄膜などが挙げられる。

本発明の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体に使用する導体基板としては、単層カーボンナノチューブを成長させるのに用いた上記の成長基板を使用してもよいが、この成長基板とは別途の導体基板を使用して、成長基板から単層カーボンナノチューブ集合体を取り当該別途の導体基板に単層カーボンナノチューブ集合体を移設するようにしてもよい。

導体基板の具体例としては、炭素、鉄、ニッケル、クロム、モリブデン、タングステン、チタン、アルミニウム、マンガン、コバルト、銅、銀、金、白金、ニオブ、タンタル、鉛、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、インジウム、ガリウム、批素、インジウム、燐、アンチモン等の金属およびこれらの合金などが挙げられる。

単層カーボンナノチューブは、生体物質との親和性が良好な炭素から構成されており、また、優れた導電性材料として使用することも可能である。本発明では、上記の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の内部空間に酸化還元蛋白質を導入し、酸化還元を効率よく行うデバイスの設計が可能な構造体としている。

酸化還元蛋白質の具体例としては、水素−プロトンの酸化還元反応を触媒する蛋白質であるヒドロゲナーゼ（H₂ase）を挙げることができる。たとえば、硫黄細菌Thiocapsa roseopericinaの生産するH₂aseを用いることができる。

配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体にヒドロゲナーゼ等の酸化還元蛋白質を固定化する際には、配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を蛋白質溶液に接触させればよく、毛管現象により自然に配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の内部空間まで酸化還元蛋白質を導入できる。

本発明の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体は、高い電気／水素変換効率を有するヒドロゲナーゼが内部空間に固定化されており、水素−プロトンの酸化還元反応のための電極材料として好適に使用できる。

特に、後述の実施例に実証されているように、本発明の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を電極材料として用いた水素発生デバイスは、高い水素発生効率を有している。これは、図１にも示すように、導電基板を通じて電極に単層カーボンナノチューブ終端が揃って接続されているため電子伝達効率が高く、かつ、配向した単層カーボンナノチューブの間隙にヒドロゲナーゼが侵入し、適切な密度で配置された配向単層カーボンナノチューブが、ヒドロゲナーゼの機能を損なうことなく、ヒドロゲナーゼを包み込むように接触する。そのため、ヒドロゲナーゼとの活性部位に近接したカーボンナノチューブを通じて、カーボンナノチューブとヒドロゲナーゼの間の電子授受が効率良く行われ、水素発生が可能となる。

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん、以下の例示によって発明が限定されることはない。

＜実施例１＞配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体へのH₂aseの固定化
3.8 mg/mlのH₂aseを含む50 mMリン酸緩衝液(pH 6.8) 100μlを、5 mm×5 mm×300μmの配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体（導体基板：シリコン基板、単層カーボンナノチューブの嵩密度 0.03 g/cm³、平均配置間隔 16 nm）に滴下し、4 ℃で24時間放置した。

24時間放置後の緩衝液中におけるH₂ase濃度はゼロであり、投入した全てのH₂aseが配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体に吸着、固定化されたと考えられる。緩衝液は、毛管現象により配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の単層カーボンナノチューブ間に浸透し、これにより配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体は膨潤した。この膨潤により、H₂aseが単層カーボンナノチューブ間に導入されたものと考えられる。
＜実施例２＞電極の作製
実施例１で得られた、H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体をグラッシー炭素電極に固定化した。炭素電極への固定化は、図２に示す２種類の方法で行った。

第１の方法では、H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を炭素電極の端面に配置し、その上からニトロセルロース膜でバルク構造体を押さえ込み、炭素電極の外周部にニトロセルロース膜を挟んでＯリングを装着した。これにより、バルク構造体を炭素電極の端面に接触させた状態で固定化した。

第２の方法では、H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の底面を炭素電極の端面に導電性の両面テープで貼り付け、これにより、バルク構造体を炭素電極の端面に接触させた状態で固定化した。
＜実施例３＞電気化学的水素発生
図３に示す構成の水素発生デバイスを作製した。この水素発生デバイスは、50 mMリン酸緩衝液(pH 6.8)を収容したチャンバーを備えており、チャンバーには、実施例２で作製した、H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体（以下、SWNT-F：Single Wall Carbon Nano Tube-Forestとも標記する。）を炭素電極に固定化したH₂ase固定化SWNT-F-炭素電極（作用極）、水素濃度測定用の水素電極、Ag/AgCl参照極、およびPt線（対極）の４電極が配置されている。なお、H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極には、H₂ase固定化SWNT-Fをニトロセルロース膜によって炭素電極上に保持したものを用いた。

このような構成を備えた水素発生デバイスにより電気化学的水素発生を試みた。電位印可等の制御は BAS 100B electrochemical analyzer を用いて行った。

−700 mVの定電位を印可した時の溶液中水素濃度の変化を図４に示す。同図に示されるように、H₂ase固定化SWNT-Fを用いた電極（図中H₂ase-SWNT-F）によって、顕著な溶液中水素濃度の上昇が確認された。

従来、H₂aseは、メチルビオロゲン（MV）等の分子メディエーターを用いない場合は、電子授受とそれに伴う水素発生を行うことができなかったが、本実施例では、H₂aseをSWNT-Fに直接吸着、固定化することによって、カーボンナノチューブ表面から酵素への接電子伝達が可能であることが示された。

水素発生速度は3.03 nmol/min/mg H₂aseであった。本発明者等は、過去に電極上にH₂aseを４層のLagmuir-Blodgett膜として固定化し、溶液中に1.6 mMのMVを添加した状態で水素発生を試みたが、その時に得られた速度は最大でも約0.08 nmol/min/mg H₂aseであった。この結果と比較しても非常に高い水素発生効率が得られていることが分かる。
＜実施例４＞
H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極として、カーボンテープを用いてH₂ase固定化SWNT-Fを炭素電極上に保持したものを用いた以外は、実施例３と同様にして電気化学的水素発生を試みた。水素発生速度は3.32 nmol/min/mg H₂aseであった。
＜実施例５＞
H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極として、シルバーテープを用いてH₂ase固定化SWNT-Fを炭素電極上に保持したものを用いた以外は、実施例３と同様にして電気化学的水素発生を試みた。水素発生速度は3.68 nmol/min/mg H₂aseであった。
＜実施例６＞
H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極として、導電性樹脂材料を用いてH₂ase固定化SWNT-Fを炭素電極上に保持したものを用いた以外は、実施例３と同様にして電気化学的水素発生を試みた。水素発生速度は6.10 nmol /min/mg H₂aseであった。
＜比較例１〜３＞
H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極に代えて、溶液中にH₂aseを添加したもの（比較例１）、H₂aseを粉末状のSWNTと混合し、電極上にキャストしたもの（比較例２）、H₂aseを固定化しないSWNT-Fを用いたもの（比較例３）を使用した以外は、実施例３と同様にして電気化学的水素発生を試みた。その結果を図４に示す。

同図に示されるように、比較例１（H₂ase）および比較例２（H₂ase-SWNT）の場合では、水素濃度の上昇は実施例３と比較して１／１０以下であった。比較例３（SWNT-F）の場合では、水素濃度の上昇はみられなかった。

この結果は、構造体を形成していないSWNTでは、これを混合するだけでは電極−SWNT間、SWNT−H₂ase間の双方の電子伝達の効率が低く、一方SWNT-Fの場合は電極にSWNT終端が揃って接続されており電子伝達効率が高く、かつH₂aseがSWNT-Fの間隙に侵入し、SWNT-Fのナノチューブ表面を３次元的に有効に利用することが可能になっているために高い水素発生効率が得られることによると考えられる。
＜実施例７＞
高い電位印可により水の電解が起こり、水素濃度は上昇する。電解を避けて、適正な水素発生を評価するための印可電圧を検討した結果が図５，図６である。図５はH₂ase固定化SWNT-F電極を用いた場合、図６はH₂aseの固定化されていないSWNT-F電極を用いた場合の結果を示している。

図５に示されるように、H₂ase固定化SWNT-F電極を用いた場合には、−600 mVでも水素濃度の上昇が確認された。これに対して、H₂aseが固定化されていない場合には、図６に示すように−800 mV以下の印可電圧では電解による水素発生が確認されなかった。これらの結果より、H₂aseによる触媒作用によって水素発生が行われていることが分かる。
＜実施例８＞ 配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体への蛋白質固定化の解析
配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体への蛋白質の固定化について調査した。H₂aseは量が限られるため、酸化還元蛋白質としてチトクロムc（cytc）を用いた。図７は、配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体に対して各濃度のcytc溶液を接触させた時の蛋白質吸着量を示すグラフである。

同図に示されるように、最大で400 μgのcytcが吸着された。この時の充填率は、配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の内部に存在する空間容積と、cytc分子占有体積から計算される細密充填量より、充填率約1％と見積もられた。

図８は、FITC標識cytcを吸着した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の共焦点蛍光像（スケール10 μm）である。バルク構造体表面から約20 μmの深さまで蛍光が観察され、蛋白質がバルク構造体内部まで導入されていることが明らかとなった。
＜実施例９＞
H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極は定電位電解式水素センサとしての応用が可能である。実施例６で作製された電極を作用極、Ag/AgCl電極を参照極として用い、電解質液として20 mM KClを含む50 mM リン酸緩衝液を使用した。98 mVの定電位を印可し、水素ガスを液中に注入することによって、電流値の変化を測定した。その結果、0.945 % 水素ガスで20.5 nA、99.99 % 水素ガスで63.8 nAの電流増加が観察された（図９）。

H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を電極とした水素−プロトンの酸化還元反応を説明する図である。 H₂aseを固定化した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体を炭素電極への固定化する方法を説明する図である。 H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極を用いた電気化学的水素発生装置の概略構成を示した図である。 H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極等を用いた場合における電気化学的水素発生の経時変化を示すグラフである。 H₂ase固定化SWNT-F電極を用いた場合における印可電圧と電気化学的水素発生の関係を示すグラフである。 H₂aseの固定化されていないSWNT-F電極を用いた場合における印可電圧と電気化学的水素発生の関係を示すグラフである。 cytc濃度と配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体への吸着量との関係を示すグラフである。 FITC標識cytcを吸着した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体の共焦点蛍光像（スケール10 μm）である。 H₂ase固定化SWNT-F-炭素電極の定電位電解式水素センサとしての電流応答を示すグラフである。

Claims (7)

1. 複数本の単層カーボンナノチューブが導体基板上に配置され、かつ、導体基板面に対して所定方向に配向した配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体であって、当該バルク構造体の内部空間に、酸化還元蛋白質が固定化されていることを特徴とする配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。
2. 酸化還元蛋白質がヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。
3. 単層カーボンナノチューブは導体基板上に所定間隔で配置されていることを特徴とする請求項１または２に記載の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。
4. 導体基板上に配置された単層カーボンナノチューブの嵩密度が0.02〜0.2 g/cm³である
   ことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の配向単層カーボンナノチューブ・バルク構造体からなることを特徴とする電極材料。
6. 請求項５に記載の電極材料を用いて形成された電極を備えることを特徴とする水素発生デバイス。
7. 請求項５に記載の電極材料を用いて形成された電極を備えることを特徴とする定電位電解式水素センサ。