WO2018012692A1 - 바이오 센서 및 그의 제작 방법 - Google Patents

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WO2018012692A1
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biosensor
glucose
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김광복
심윤보
박한결
송연주
조성제
조철호
김동민
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삼성전자 주식회사
부산대학교 산학협력단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G61/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carbon-to-carbon link in the main chain of the macromolecule
    • C08G61/12—Macromolecular compounds containing atoms other than carbon in the main chain of the macromolecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Definitions

  • the present disclosure relates to a biosensor and a method for manufacturing the biosensor, and more particularly, to a biosensor and a method for manufacturing the biosensor that can ensure reproducibility even with continuous measurement.
  • Quantitative determination of analytes in biological fluids is useful for the diagnosis and treatment of physiological abnormalities. For example, the amount of glucose (blood glucose) should be checked periodically in diagnosing and preventing diabetes.
  • An electrochemical biosensor is an apparatus for measuring the amount of a substance to be measured by detecting an electrochemical signal through an enzyme reaction with a substance to be measured by using an enzyme electrode having an enzyme fixed to an electrode.
  • the biosensor can measure the amount of the substance to be measured in various ways.
  • the blood glucose measurement may vary depending on the proficiency of the blood collection method. There was a problem that it was impossible to detect the change in concentration perfectly.
  • the minimally invasive biosensor can be inserted into the subcutaneous tissue instead of blood vessels, thereby avoiding direct contact with the blood. Therefore, the biosensor is made of a biocompatible material and can be operated for several days, and can be inserted by the patient without the operation of a specialist There was an advantage.
  • the present disclosure is devised to solve the above-described problem, and an object of the present disclosure relates to a biosensor and a method of manufacturing the biosensor capable of ensuring reproducibility even with continuous measurement.
  • the electrode a polymer structure disposed on the electrode and formed of poly-5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (pTTCA), wherein an enzyme is combined with pTTCA in the polymer structure. It exists in a covalent state.
  • pTTCA poly-5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid
  • the biosensor according to the present disclosure may further include an AuZn oxide layer disposed between the electrode and the polymer structure.
  • the enzyme has an amine group, the amine group of the enzyme and the carboxyl group of pTTCA can form the covalent bond.
  • the enzyme may be selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, hexokinase, glutamic oxaloacetic transaminase, and glutamine pyruvic transaminase.
  • the biosensor according to the present disclosure may further include a support disposed under the electrode, and the electrode may have a needle shape disposed in a vertical direction with respect to the support.
  • the method of manufacturing a biosensor according to an embodiment of the present disclosure monomers formed by covalent bonding between 5,2 ': 5', 2 "-terthiophen-3'-carboxylic acid (TTCA) and an enzyme Producing and polymerizing the monomers on an electrode to deposit a polymer layer on the electrode.
  • the method of manufacturing the biosensor according to the present disclosure further includes coating the electrode surface with an Au-Zn oxide layer, and depositing a polymer layer on the electrode includes:
  • the monomers can be polymerized on an electrode coated with a zinc alloy oxide layer.
  • the enzyme comprises an amine group
  • the step of producing the monomers the TTCA of the TTCA using EDC (1-Ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-hydroxysuccinimide) Activating a carboxyl group to form a covalent bond between the carboxyl group of the TTCA and the amine group of the enzyme.
  • the enzyme may be selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, hexokinase, glutamic oxaloacetic transaminase, and glutamine pyruvic transaminase.
  • the electrode In the depositing of the polymer layer on the electrode, the electrode may be immersed in a solution containing the monomers, and a voltage may be applied to the electrode to polymerize the monomers on the electrode by electropolymerization.
  • FIG. 1 is a view for explaining a biosensor according to an embodiment of the present disclosure
  • Figure 2 shows the chemical structure of 5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (5,2 ': 5,2" -terthiophene-3'-carboxylic acid) (TTCA).
  • 3 is a diagram showing a monomer formed by covalent bonding of TTCA and an enzyme
  • FIG. 4 is a view for explaining a biosensor according to another embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a view for explaining a biosensor manufacturing method according to an embodiment of the present disclosure.
  • SEM scanning electron microscope
  • FIG. 7 is a view for explaining a manufacturing process of a biosensor according to an embodiment of the present disclosure.
  • 8A to 8B are cyclic voltammetry curves for concentration changes in measurement of (A) H 2 O 2 and (B) glucose using a polymer-enzyme electrode according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 9 is a result of experiments of optimization conditions for AuZnOx layer formation and oxidation, and specifically, at a voltage (a) and scan rate (b), AuZn oxidation potential (c), and oxidation time (d) for AuZn layer formation.
  • a voltage (a) and scan rate (b) AuZn oxidation potential (c)
  • d oxidation time
  • FIG. 10 shows the results of experiments on the optimization of polymer-enzyme electrode fabrication. Specifically, GOx concentration (a), TTCA concentration (b), number of injections for polymerization (c), injection rate (d), glucose detection potential ( experiments with optimization conditions for
  • AA Ascorbic acid
  • AP Alcoholophen
  • DA Dopamine
  • UA User acid
  • 13A is a graph showing reproducibility of a sensor by measuring a plurality of times using a biosensor according to an embodiment of the present disclosure
  • 13B is a graph showing stability by measuring glucose continuously for 3 days using a biosensor according to an embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a biosensor 100 according to an embodiment of the present disclosure.
  • the biosensor 100 is a device capable of measuring a target material by an electrochemical method using a biological material, for example, an enzyme, having a specific recognition ability with respect to the material to be analyzed.
  • a biological material for example, an enzyme
  • biosensor it may be variously called as a sensor, a measuring device, and a measuring device. And depending on the measurement object, it can be called various names such as hydrogen peroxide sensor, glucose sensor, blood sugar sensor.
  • the movement of electrons is generated by biochemical oxidation and reduction reactions occurring on the electrode surface of the biosensor 100, and the concentration of the target substance in the sample can be measured by monitoring the current generated by the movement of the electrons.
  • the biosensor 100 may include a working electrode and a counter electrode (or counter or counter / reference electrode). Alternatively, the biosensor 100 may include a working electrode, a counter electrode, and a separate reference electrode.
  • the working electrode is an electrode to which an enzyme is immobilized, and may be referred to as an electrode to which an enzyme is immobilized or an enzyme electrode.
  • FIG. 1 illustrates a configuration of an electrode to which an enzyme is fixed among various electrodes of the biosensor 100, and illustrates a cross-sectional view.
  • the biosensor 100 may include an electrode 110 on which the polymer structure 111 is deposited.
  • the electrode when the biosensor 100 is implemented as a continuous blood glucose measurement sensor, the electrode is illustrated as having a needle shape to invade the skin, but is not necessarily limited to such a shape, and may have various shapes according to a measurement environment. Can have.
  • the electrode 110 may be made of a metal or an alloy such as carbon, gold, platinum, silver, copper, palladium, or the like.
  • the polymer structure 111 is disposed on the electrode 110 and includes an enzyme therein. Specifically, in the polymer structure 111, the enzyme may be present inside the polymer structure 111 by a covalent bond (polymer-enzyme) between the polymer and the enzyme.
  • the polymer structure 111 is 5,2 ': 5', 2 "-terthiophene-3'-carboxylic acid (5,2 ': 5,2" -terthiophene-3'-carboxylic acid) (hereinafter, TTCA) and a monomer (TTCA-enzyme) formed by covalent bonding of an enzyme.
  • TTCA tetrachloro-3'-carboxylic acid
  • TTCA-enzyme a monomer formed by covalent bonding of an enzyme.
  • the polymer structure 111 may be obtained by poly-5,2 ': 5', 2 "-thiophene-3'-.
  • pTTCA carboxylic acid
  • pTTCA -Enzymes the enzyme is covalently bonded to pTTCA inside the polymer structure 111 (pTTCA -Enzymes).
  • the enzyme includes an amine group, and a covalent bond is formed between the amine group of the enzyme and the carboxyl group of pTTCA.
  • TTCA is a polymer monomer having excellent physical, chemical, mechanical, and electrical properties, the structure of which is shown in FIG. 2, and the monomer formed by covalent bonding of TTCA and an enzyme is shown in FIG. 3. Since the monomer formed by covalent bonding of TTCA and an enzyme has electrical conductivity, it can be polymerized by electropolymerization.
  • the polymerized monomer covalently bonded to the enzyme enables the enzyme to be strongly immobilized in the polymer structure 111 as a covalent bond, so that the enzyme is released to the outside even in the long term use of the biosensor 100. Can be prevented.
  • the polymer and the enzyme can be fixed to the electrode at the same time.
  • TTCA terthiophene benzoic acid
  • DTPBA dithienylpyrrol benzoic acid
  • the polymer structure 111 is a polymerized TTBA-enzyme monomer
  • the structure is a shape in which the enzyme is covalently bonded to the poly-TTBA inside the structure formed of poly-TTBA.
  • DTPBA DTPBA is used, the polymer structure 111 is a polymerized DTPBA-enzyme monomer, the structure is a shape in which the enzyme is covalently bonded to the poly-DTPBA inside the structure formed of poly-DTPBA.
  • the enzyme may be selected according to the substance to be detected from various enzymes having an amine group.
  • the enzyme may be a glucose oxidase (GOx), a glucose dehydrogenase (GDH), a hexokinase (Hexokinase). , Glutamic oxaloacetic transaminase, and glutamine pyruvic transaminase, but may be selected from the group consisting of, but not limited thereto.
  • glucose when the substance to be detected is glucose, when the glucose oxidase immobilized on the polymer structure 111 reacts with glucose, it is oxidized to gluconic acid.
  • glucose when glucose is oxidized, glucose can be quantified by measuring an electric current due to the transfer of electrons generated when oxygen or an oxidized medium is changed to hydrogen peroxide or a reduced medium, and then oxidized and returned to its original oxidized form.
  • the biosensor may further include an alloy oxide layer disposed between the electrode 110 and the polymer structure 111.
  • the alloy oxide layer may be made of a metal selected from the group consisting of copper, cobalt, gold, platinum, and zinc.
  • the alloy oxide layer disposed between the electrode 110 and the polymer structure 111 may be a gold-zinc alloy layer.
  • electrodeposition may be performed in a solution containing two or more different metal ions, and the electrodeposited metal layer may be immersed in PBS and oxidized using amperometry. .
  • the alloy oxide layer When the alloy oxide layer is introduced to the surface of the electrode 110, the surface area of the electrode is increased, so that the sensitivity may be improved.
  • the alloy oxide layer exhibits excellent electrochemical catalytic properties for hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) produced by the reaction of glucose with glucose oxidase when measuring glucose.
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • FIG. 4 illustrates a biosensor according to an embodiment of the present disclosure in which other electrodes are arranged together with the electrode (operating electrode) to which the enzyme is fixed.
  • 4 is a conceptual view illustrating a state where the electrodes of the biosensors are viewed from above.
  • the biosensor 200 may include a plurality of working electrodes 210, a plurality of counter electrodes 220, a plurality of reference electrodes 230, and a supporter 240 supporting the electrodes. .
  • the working electrode 210 may be an electrode to which an enzyme is fixed, as described with reference to FIG. 1.
  • the counter electrode 220 may be formed of an electrode material having high electrical conductivity since the counter electrode 220 has an opposite polarity with respect to the working electrode and serves as a path for current between the electrodes.
  • Each of the plurality of counter electrodes 220 may be made of a metal or an alloy such as, for example, carbon, gold, platinum, silver, copper, palladium, and the like as the working electrode.
  • the reference electrode 230 allows a constant potential to be applied to the working electrode and prevents current from flowing toward the electrode due to the high impedance.
  • the reference electrode 230 may be, for example, a standard hydrogen electrode (SHE), a calomel (Hg / Hg 2 Cl 2 ) electrode, and a silver-silver chloride (Ag / AgCl) electrode. Since they have a relatively constant potential difference, a constant electrode potential can be applied.
  • the biosensor 200 may be for measuring the blood glucose level, in this case, the working electrode 210, the counter electrode 220 and the reference electrode 230 may have a needle shape to be inserted into the skin.
  • the above-described needle-shaped electrodes may be disposed in the vertical direction with respect to the supporter 240.
  • the supporter 240 is formed of a flexible material such as rubber so that the needle-shaped electrodes can be inserted into the skin well.
  • the supporter 240 may have a band shape to facilitate wearing the biosensor 200 on a body part such as an arm.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating a method of manufacturing a biosensor according to an embodiment of the present disclosure.
  • a conductive monomer having a carboxyl group such as terthiophene benzoic acid (TTBA), dithienylpyrrol benzoic acid (DTPBA), or the like may be used.
  • TTBA terthiophene benzoic acid
  • DTPBA dithienylpyrrol benzoic acid
  • EDC and NHS may be used to activate the carboxyl group of TTBA to form a covalent bond between the carboxyl group of TTBA and the amine group of the enzyme.
  • DTPBA EDC and NHS can be used to activate the carboxyl group of DTPBA to form a covalent bond between the carboxyl group of DTPBA and the amine group of the enzyme.
  • Examples of enzymes including amine groups that can be used here include glucose oxidase, glucose dehydrogenase, hexokinase, glutamic oxaloacetic transaminase, and glutamine pyruvic transaminase.
  • the produced monomers are polymerized on the electrode to deposit a polymer layer on the electrode (S520).
  • the produced monomers are conductive, they can be polymerized through electropolymerization.
  • the monomers may be polymerized on the electrode by immersing the electrode in a solution containing the monomer and applying a voltage to the electrode through potential injection.
  • the polymer layer may be deposited only on the electrode to which the voltage is applied by selectively applying a voltage only to the electrode to be the working electrode.
  • the polymer layer may be deposited by cyclic voltammetry (CV).
  • the polymer layer can be easily and easily deposited only on the electrode to be the working electrode in the electrode array including several electrodes, and the polymer layer can be deposited on the electrode at one time without going through a plurality of processes. Therefore, there is an advantage that the process can be simplified.
  • the electrode before depositing the polymer layer, the electrode may be coated with an alloy oxide. This is to prevent contamination of the electrode surface from impurities other than the substance to be measured, and to increase the surface area in order to increase the measurement sensitivity.
  • an alloy layer may be formed on the surface of the electrode by dipping the electrode in a solution in which the metal salt is dissolved and applying a voltage.
  • NPV normal pulse voltammetry
  • the metal include copper, cobalt, gold, platinum, and zinc, and specific examples may include forming an alloy layer of gold and zinc on the surface of an electrode by pulse voltammetry.
  • the electrode After forming the alloy layer, the electrode can be immersed in a buffer solution, such as a PBS solution, to oxidize the alloy layer at a constant voltage using amperometry.
  • a buffer solution such as a PBS solution
  • the oxidized alloy layer has a structure with a large surface area, and thus the measurement sensitivity can be improved.
  • the biosensor described above can reduce the interference to Cl ⁇ ions and improve glucose detection sensitivity due to the introduction of the metal alloy oxide layer and the pTTCA-enzyme layer. In addition, it is very stable even for repeated measurements, which has the effect of allowing continuous measurements in the skin.
  • a microneedle array electrode as shown in the SEM photograph of FIG. 6 is prepared.
  • the length and width of the needle-shaped electrode is very small size of about 700 ⁇ m and 100 ⁇ m, so there is little pain even when invaded into the skin.
  • the pain is less, and the problem of secondary infection can be overcome.
  • the microneedle is made of SUS (steel use stainless) and is plated with Au (see 710 of FIG. 7).
  • SUS / AU microneedle array electrode
  • NPV pulse-ammeter
  • the SUS / Au / AuZnOx electrode was manufactured by sequentially washing with ethanol and distilled water and drying with cold wind (see 720 of FIG. 7).
  • TTCA conductive polymer monomer
  • GOx glucose oxidase
  • the prepared SUS / Au / AuZnOx electrode was added to the mixed solution prepared in step 3) to form a conductive polymer-enzyme layer by cyclic voltammetry. That is, the polymer and the enzyme are deposited at the same time.
  • the electropolymerization conditions of the conductive polymer-enzyme layer are in the range of 0.0-1.7 V scan, the scan rate is 100 mV / s and the number of scans is 5 times. Scanning was performed (10 cycles) in a 0.1 M PBS solution (pH 7.4) until a stable cyclic voltammogram was obtained.
  • the electrode on which the polymer-enzyme layer was deposited was washed with acetonitrile / 3rd distilled water (1: 1) mixed solvent and distilled water, and then dried by cold air.
  • the electrode on which the conductive polymer-enzyme layer was formed was once dipped in a 0.7% Nafion solution, coated with a Nafion polymer membrane, and dried for 4 hours in a CaCl 2 atmosphere to prepare a blood glucose sensor (see 730 of FIG. 7). ).
  • the principle of detecting glucose with a blood glucose sensor is to indirectly quantify the glucose concentration by measuring the current generated by the oxidation of H 2 O 2 generated by the reaction of GOx with glucose by the Au / AuZnOx layer. Therefore, the reactivity with respect to the H 2 O 2 concentration was investigated with the electrode prepared in Example 1.
  • 8A is a cyclic voltammogram curve according to H 2 O 2 concentration using an electrode on which a polymer-enzyme layer (pTTCA-GOx) prepared according to Example 1 is formed.
  • the concentration of H 2 O 2 was tested by preparing 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0 mM in 0.1M PBS (pH 7.4) solution.
  • H 2 O 2 oxidation current increased at about 400 mV.
  • 8B is a cyclic voltammetry curve according to glucose concentration using an electrode on which a polymer-enzyme layer (pTTCA-GOx) prepared according to Example 1 is formed. Glucose concentrations are 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0, 20.0 mM. The oxidation current by glucose was observed to increase at about 350 mV. This means that as the concentration of glucose increases, the concentration of the reaction product H 2 O 2 also increases proportionally.
  • Electrodeposition was carried out at -0.8, -1.0, -1.2, -1.5, and -1.8 V for the electrodeposition voltage of AuZn layer on SUS / Au using NPV (normal pulse voltammetry).
  • the oxidation current due to glucose increased from -0.8 V to -1.5 V, but the oxidation current decreased after -1.5 V (FIG. 9A).
  • the electrodeposition voltage of AuZn was optimized at -1.5 V.
  • the largest glucose oxidation current value was shown at 50 mV / s (FIG. 9B). Optimization experiments for oxide film formation of AuZn using time-phase current method. Oxidation current for the largest glucose at oxidation voltage of 1.5 V (Fig. 9 (c)) and oxidation time at 200 seconds (Fig. 9 (d)). Showed.
  • Figure 10 (a) is an optimization experiment for the GOx concentration when preparing a mixed solution of monomer (TTCA) and enzyme (GOx), by changing only the GOx concentration to 3, 4, 5, 6, 7, 9 mg / mL Several mixed solutions were prepared, and glucose measurements were made using the glucose sensor. Referring to (a) of FIG. 10, the oxidation current of glucose was increased until the GOx concentration was 3 to 6 mg / mL, and then the oxidation current was decreased at the concentration thereafter. Therefore, the concentration of GOx was optimized to 6 mg / mL.
  • TTCA monomer
  • GOx enzyme
  • FIG. 10 is an optimization experiment for TTCA concentration when preparing a mixed solution of monomer (TTCA) and enzyme (GOx).
  • concentration of TTCA is 0.5 mM or more, the oxidation current of glucose decreases.
  • concentration of TTCA in preparing a mixed solution of monomers and enzymes was optimized to 5 mM.
  • (C) and (d) of FIG. 10 are optimization experiments on the number of scans and the scan speeds of TTCA-GOx monomers during electropolymerization by cyclic current voltage method.
  • the number of scans and the scan speed during electropolymerization are important factors affecting the thickness of pTTCA-GOx, and thus have a great influence on glucose sensitivity.
  • the glucose glucose current value was the highest in the blood glucose sensor fabricated with the number of 5 injections (see FIG. 10 (c)) and the scan rate of 100 mV / s (see FIG. 10 (d)).
  • FIG. 10 (e) shows an optimization experiment on the potential for glucose detection using time-phase current method.
  • the detection voltage range was 200-600 mV and the oxidation current value increased up to 400 mV and then decreased from the potential 500 mV. Therefore, glucose detection voltage using time-current method was optimized to 400 mV.
  • FIG. 11 shows glucose oxidation currents in the presence of ascorbic acid (AA, 100 ⁇ M), Acetaminophen (AP, 100 ⁇ M), Dopamine (DA, 100 ⁇ M), and Uric acid (UA 100 ⁇ M) blockers.
  • AA ascorbic acid
  • AP Acetaminophen
  • DA Dopamine
  • Uric acid Uric acid
  • a gold electrode-based glucose sensor has a problem in that various anions are easily adsorbed onto the gold electrode.
  • Cl ⁇ ions are most strongly adsorbed on the surface of gold, inhibiting the oxidation of hydrogen peroxide produced by glucose and enzymatic reactions. Therefore, the metal alloy oxide (AuZnOx) film was formed to reduce the amount of Cl ⁇ ions adsorbed on the metal surface and to improve the sensitivity of glucose. Therefore, the effect on Cl - ion was evaluated by using a blood glucose sensor deposited AuZnOx.
  • the Au-based sensor had little reactivity to glucose.
  • AuZn multi-metal alloy
  • AuZnOx multi-metal alloy oxide
  • the sensitivity to glucose is reduced by 10.5 and 2.7 times, respectively.
  • the extent to which the sensitivity to glucose when the metal alloy had an oxide (AuZnOx) layer formed was much smaller.
  • Cl ⁇ ions can be prevented from adsorbing onto the metal surface, thereby preventing a decrease in sensitivity to glucose.
  • the glucose sensitivity of AuZnOx-based sensor in the solution containing Cl - ions is 4 times higher than that of AuZn-based sensor.
  • FIG. 12 is a calibration curve for measuring glucose concentration by time-phase ammeter using Au / AuZnOx / pTTCA-GOx based microarray needle sensor. 12 was measured with three microneedle array sensor in the range of glucose concentration 100 ⁇ M to 50 mM. Two calibration curves were obtained at low concentrations (100 ⁇ M to 5 mM) and high concentrations (5 to 50 mM) and the detection limit was 92 ⁇ M.
  • Glucose concentration 0.5 One 5 10 20 30 40 50 Average current value 0.31 0.65 2.78 3.69 5.59 7.54 9.17 10.76 Absolute standard deviation 0.04 0.05 0.07 0.07 0.06 0.06 0.2 0.21 Coefficient of variation 13.2 7.3 2.4 1.9 1.0 0.73 2.18 1.93
  • Figure 13a is the result of monitoring the sensitivity change of glucose when measured 10 times with the same sensor. At this time, the concentration of glucose is 10 mM. As a result of 10 measurements, the average current value and the coefficient of variation were 3.69 ⁇ 0.07 ⁇ A and 1.9%, indicating very good repeatability stability.
  • Figure 13b is the result of measuring the sensor hourly while soaking for 3 days in a PBS (pH 7.4) / 0.1 M NaCl solution containing 10 mM of glucose. As can be seen from Figure 13b, a very stable result was obtained without a significant effect on the change in the sensitivity of glucose for 3 days. That is, the microarray needle-based blood glucose sensor according to the present disclosure may be used as a sensor for continuously detecting glucose from body fluid by attaching to the skin with minimal invasion.

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Abstract

바이오 센서가 개시된다. 본 바이오 센서는, 전극 및 전극 상에 배치되며 폴리-5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(pTTCA)으로 형성된 고분자 구조체를 포함하며, 고분자 구조체 내부에 효소가 pTTCA와 공유결합된 상태로 존재한다.

Description

바이오 센서 및 그의 제작 방법
본 개시는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 대한 것으로, 더 상세하게는 연속적인 측정에도 재현성을 보장할 수 있는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 대한 것이다.
생물학적 유체(biological fluids)에서 분석물(analyte)의 정량 결정은 생리학적 이상의 진단 및 치료에 유용하다. 예를 들면, 당뇨병을 진단하고 예방하는 데 있어서 글루코오스(혈당 : blood glucose)의 양을 주기적으로 체크해야 한다.
종래엔 전기화학적 방법을 이용한 바이오 센서가 주로 이용되었다. 전기화학적 바이오 센서는 효소를 전극에 고정한 효소 전극을 이용하여, 측정 대상 물질과의 효소 반응을 통한 전기화학적 신호를 검출해내는 방법으로 측정 대상 물질의 양을 측정하는 장치이다.
바이오 센서는 다양한 방식으로 측정 대상 물질의 양을 측정할 수 있는데, 그 중 채혈이 요구되는 방식에선, 채혈 방식의 숙련도에 따라 혈당 측정치가 달라질 수 있다는 점, 단속적인 측정 몇 번으로 혈중 측정 대상 물질의 농도 변화를 완벽하게 감지해내기는 불가능하다는 문제가 있었다.
이에 따라 최근엔 채혈을 하지 않고도 정확하게 측정 대상 물질의 농도를 모니터링할 수 있는 장치가 개발되었고, 대표적으로 바이오 센서 자체를 완전히 체내에 이식시키는 완전 이식형과, 피하조직에 삽입 가능한 바늘 모양 센서를 삽입하는 최소 침습(minimally invasive) 방식이 있었다.
한편, 최소 침습 방식의 바이오 센서는 혈관 대신 피하 조직에 삽입됨으로써 혈액과의 직접 접촉을 피할 수 있으므로, 생체적합 재료로 제작되어 수일 동안 동작할 수 있으며, 전문가의 수술 없이 환자에 의해서도 삽입될 수 있다는 장점이 있었다.
이러한 최소 침습 방식의 바이오 센서로 체액에서 글루코오스를 측정할 경우 체액에 존재하는 염화이온 (Cl-)등의 방해 물질로 인해 글루코오스의 수치가 부정확하게 측정되는 문제가 있다. 또한, 피부에 지속적으로 삽입된 상태로 존재하기 때문에 장기간 사용에 따라 효소가 전극에서 체액으로 이탈되는 문제가 발생하여 부정확한 수치가 측정되는 문제가 있었다.
따라서, 방해 물질에 의한 영향을 최소화하면서 효소가 전극에 잘 고정되어 있어 연속적 측정에도 우수한 재현성을 보일 수 있는 바이오 센서의 개발이 요구되었다.
본 개시는 상술한 문제를 해결하기 위해 고안된 것으로, 본 개시의 목적은, 연속적인 측정에도 재현성을 보장할 수 있는 바이오 센서 및 바이오 센서의 제작 방법에 관한 것이다.
이상과 같은 목적을 달성하기 위한 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서는, 전극; 및 상기 전극 상에 배치되며 폴리-5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(pTTCA)으로 형성된 고분자 구조체를 포함하며, 상기 고분자 구조체 내부에 효소가 pTTCA와 공유결합된 상태로 존재한다.
이 경우, 본 개시에 따른 바이오 센서는 상기 전극과 상기 고분자 구조체 사이에 배치된 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer)을 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 효소는 아민기를 가지며, 상기 효소의 아민기와 pTTCA의 카르복실기가 상기 공유결합을 형성할 수 있다.
한편, 상기 효소는, 글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제, 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
한편, 본 개시에 따른 바이오 센서는 상기 전극 하부에 배치된 지지체를 더 포함하고, 상기 전극은 상기 지지체를 기준으로 수직 방향으로 배치된 니들 형상을 가질 수 있다.
한편, 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 제작방법은, 5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(TTCA)과 효소 간의 공유결합으로 형성된 단량체들을 생산하는 단계 및 상기 단량체들을 전극 상에서 중합시켜 상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계를 포함한다.
이 경우, 본 개시에 따른 바이오 센서의 제작방법은 상기 전극 표면을 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer)으로 코팅하는 단계를 더 포함하며, 상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계는, 상기 금-아연 합금 산화물층으로 코팅된 전극 상에서 상기 단량체들을 중합시킬 수 있다.
한편, 상기 효소는 아민기를 포함하며, 상기 단량체들을 생산하는 단계는, EDC(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 상기 TTCA의 카르복실기를 활성화시켜, 상기 TTCA의 카르복실기와 상기 효소의 아민기 간의 공유결합을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 상기 효소는, 글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제, 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
한편, 상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계는, 상기 단량체들이 포함된 용액에 상기 전극을 담그고, 상기 전극에 전압을 인가하여 상기 단량체들을 전기중합법(Electropolymerization)으로 상기 전극 상에서 중합시킬 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 도면,
도 2는 5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(5,2′:5,2″-terthiophene-3′-carboxylic acid)(TTCA)의 화학구조를 도시한 도면,
도 3은 TTCA와 효소가 공유 결합하여 형성된 단량체를 도시한 도면,
도 4는 본 개시의 또 다른 실시 예에 따른 바이오 센서를 설명하기 위한 도면,
도 5는 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서 제작 방법을 설명하기 위한 도면,
도 6은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 마이크로 니들 전극의 SEM(Scanning electron microscope) 이미지,
도 7은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서의 제작 공정을 설명하기 위한 도면,
도 8a 내지 도 8b는 본 개시의 일 실시 예에 따른 고분자-효소 전극을 이용한 (A) H2O2와 (B) 글루코오즈의 측정시 농도 변화에 대한 순환전압전류 곡선.
도 9는 AuZnOx layer 형성 및 산화를 위한 최적화 조건을 실험한 결과로서, 구체적으로, AuZn 층 형성을 위한 전압(a) 및 주사 속도(b), AuZn 산화 전위(c) 및 산화 시간(d)에 대한 최적화 조건을 실험한 결과,
도 10은 고분자-효소 전극 제작의 최적화 조건을 실험한 결과로서, 구체적으로 GOx 농도(a), TTCA 농도(b), 중합을 위한 주사 횟수(c), 주사 속도(d), 글루코오스 검출 전위(e)에 대한 최적화 조건을 실험한 결과,
도 11은 AuZnOx/pTTCA-GOx/Nafion으로 개질된 센서 동작시, AA(Ascorbic acid), AP(Acetaminophen), DA(Dopamine), UA(Uric acid)에 대한 방해 영향을 설명하기 위한 도면,
도 12는 AuZnOx/pTTCA-GOx/Nafion으로 개질된 센서 동작시, 글루코오스 농도에 따른 검정 곡선,
도 13a은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 이용하여 복수 회 측정하여 센서의 재현성을 보여주는 그래프, 그리고
도 13b는 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 이용하여 3일 동안 연속적으로 글루코오스를 측정하여 안정성을 보여주는 그래프이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 개시를 더욱 상세하게 설명한다. 그리고 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단된 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 그리고 후술 되는 용어들은 본 개시에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관계 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 또한, 첨부된 도면은 본 개시의 이해를 돕기 위하여 실제 축척대로 도시된 것이 아니라 일부 구성요소의 치수가 과장되게 도시될 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서(100)를 설명하기 위한 도면이다.
바이오 센서(100)는 분석하고자 하는 물질에 대해 특이적 인식 능력을 갖는 생물학적 물질, 예를 들어 효소를 이용하여, 전기화학적 방법으로 대상물질을 측정할 수 있는 기구이다. 바이오 센서라는 용어를 사용하였으나, 센서, 측정장치, 측정기구 등 다양하게 불릴 수 있다. 그리고 측정 대상에 따라 과산화수소 센서, 글루코오스 센서, 혈당 센서 등 다양한 이름으로 불릴 수 있다.
바이오 센서(100)의 전극 표면에서 일어나는 생화학적 산화, 환원 반응에 의하여 전자의 이동이 발생하고, 이러한 전자의 이동에 의하여 발생하는 전류를 모니터링함으로써 시료 내의 대상물질의 농도를 측정할 수 있다.
바이오 센서(100)는 작동 전극(working electrode) 및 상대 전극(counter electrode)(또는 상대/기준 전극(counter or counter/reference electrode))을 포함할 수 있다. 또는, 바이오 센서(100)는 작동 전극, 상대 전극, 및 분리된 기준 전극을 포함할 수 있다.
작동 전극은 효소가 고정되어 있는 전극으로, 효소가 고정된 전극 또는 효소 전극이라 명명될 수 있다. 도 1은 바이오 센서(100)의 여러 전극 중 효소가 고정된 전극의 구성을 설명하기 위한 것으로서, 단면도를 도시한 것이다.
도 1을 참고하면, 바이오 센서(100)는 고분자 구조체(111)가 증착된 전극(110)을 포함할 수 있다.
도 1에선 바이오 센서(100)가 연속 혈당 측정 센서로 구현된 경우, 전극이 피부 내부로 침습 가능하도록 니들 형상을 가진 것으로 도시하였으나, 반드시 이러한 형상에 한정되는 것은 아니며, 측정 환경에 맞게 다양한 형상을 가질 수 있다.
전극(110)은 예컨대 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등의 금속 또는 합금으로 이루어진 것일 수 있다.
고분자 구조체(111)는 전극(110) 상에 배치된 것으로, 내부에 효소를 포함한다. 구체적으로, 고분자 구조체(111)에선 고분자와 효소의 공유 결합(고분자-효소)으로 효소가 고분자 구조체(111) 내부에 존재할 수 있다.
고분자 구조체(111)는, 5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(5,2′:5,2″-terthiophene-3′-carboxylic acid)(이하, TTCA)와 효소가 공유결합되어 형성된 단량체(TTCA-효소)를 중합시켜 얻을 수 있다. 이에 따라, 고분자 구조체(111)는 폴리-5,2':5',2"-싸이오펜-3'-카르복실산(poly-5,2′:5,2″-terthiophene-3′-carboxylic acid)(이하, pTTCA)으로 형성되고, 고분자 구조체(111) 내부에 효소가 pTTCA와 공유결합된 상태(pTTCA-효소)로 존재한다.
효소는 아민기(amine group)를 포함하며, 효소의 아민기와 pTTCA의 카르복실기(Carboxyl group) 간에 공유결합이 형성된다.
TTCA는 물리적, 화학적, 기계적 및 전기적 특성이 우수한 고분자 단량체로서, 그 구조는 도 2에 도시하였고, TTCA와 효소가 공유결합되어 형성된 단량체는 도 3에 도시하였다. TTCA와 효소가 공유결합되어 형성된 단량체는 전기 전도성을 가지므로, 전기 중합법(Electropolymerization)을 통해 중합시킬 수 있다.
도 3에 도시된 것과 같이 효소가 공유 결합된 단량체를 중합시키면 고분자 구조체(111) 내부에 효소가 공유 결합으로 강하게 고정될 수 있게 되므로, 바이오 센서(100)의 장기적 사용에도 효소가 외부로 이탈되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 고분자와 효소를 동시에 전극에 고정시킬 수 있게된다.
한편, TTCA 이외에도, 카르복실기를 가지는 전도성 고분자(conducting polymer)의 단량체가 고분자 구조체(111)를 형성하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 터싸이오펜 벤조익 에시드(terthiophene benzoic acid)(TTBA), 디싸이에닐 피롤 벤조익 에시드(di-thienylpyrrol benzoic acid)(DTPBA) 등이 사용될 수 있다. TTBA가 사용되는 경우, 고분자 구조체(111)는 TTBA-효소 단량체가 중합된 것으로, 그 구조는 폴리-TTBA로 형성된 구조 내부에 효소가 폴리-TTBA와 공유 결합된 상태로 존재하는 형상이다. DTPBA가 사용되는 경우, 고분자 구조체(111)는 DTPBA-효소 단량체가 중합된 것으로, 그 구조는 폴리-DTPBA로 형성된 구조 내부에 효소가 폴리-DTPBA와 공유 결합된 상태로 존재하는 형상이다.
효소는 아민기를 가진 다양한 효소 중에서, 검출하고자 하는 물질에 맞게 선택될 수 있으며, 예컨대, 효소는 글루코오스산화효소(glucose oxidase, GOx), 글루코오스탈수소화효소(glucose dehydrogenase, GDH), 헥소키나아제(Hexokinase), 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(Glutamic-oxaloacetic transaminase), 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제(Glutamic-pyruvic transaminase)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예로, 검출하고자 하는 물질이 글루코오스인 경우, 고분자 구조체(111)에 고정된 글루코오스 산화효소와 글루코오스가 반응하면 글루코닉산(gluconic acid)으로 산화된다. 그리고 글루코오스가 산화될 때 산소 또는 산화된 매개체가 과산화수소 또는 환원된 매개체로 바뀌고, 다시 산화되어 원래의 산화된 형태로 되돌아올 때 발생하는 전자의 이동에 의한 전류를 측정하여 글루코오스를 정량할 수 있다.
본 개시의 또 다른 실시 예에 따르면, 바이오 센서는 전극(110)과 고분자 구조체(111) 사이에 배치된 합금 산화물층을 더 포함할 수 있다. 합금 산화물층은 구리, 코발트, 금, 백금, 아연으로 이루어진 군에서 선택된 금속으로 이루어질 수 있다. 구체적인 예로, 전극(110)과 고분자 구조체(111) 사이에 배치된 합금 산화물층은 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer)일 수 있다.
합금 산화물층을 전극(110) 표면에 형성하기 위해, 서로 다른 2 이상의 금속 이온을 함유한 용액에서 전기 증착(electrodeposition)을 수행하고, 전기 증착된 금속층을 PBS에 담궈서 amperometry를 이용하여 산화시킬 수 있다.
합금 산화물층을 전극(110) 표면에 도입하게 되면, 전극의 표면적이 증가하게 되므로, 감도가 향상될 수 있다. 또한, 합금 산화물층은 글루코오스 측정시, 글루코오스와 글루코오스 산화 효소와의 반응으로 생성된 과산화 수소(H2O2)에 대해 우수한 전기화학적 촉매 특성을 나타낸다. 또한, 불순물에 의해 전극 표면이 오염되는 것을 방지해 바이오 센서의 감도를 향상시킬 수 있다. 예컨대, 혈액 내 글루코오스를 측정하는 경우, Cl- 등의 이온이 전극 표면에 흡착되어는 글루코오스의 측정 감도가 떨어지는 문제가 발생할 수 있는데, 전극 표면의 합금 산화물층에 의해 이와 같은 이온 불순물이 부착되는 것을 방지할 수 있다.
도 4는 상술한 효소가 고정된 전극(작동 전극)과 함께 다른 전극들이 배열된 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 도시한 것이다. 도 4는 바이오 센서의 전극들이 배치된 면을 위에서 바라본 모습을 도시한 개념도이다.
도 4를 참고하면, 바이오 센서(200)는 복수의 작동 전극(210), 복수의 상대 전극(220) 및 복수의 기준 전극(230) 및 각 전극들을 지지하는 지지체(240)를 포함할 수 있다.
작동 전극(210)은 도 1을 참고하여 설명한, 효소가 고정된 전극일 수 있다.
상대 전극(220)은 작동 전극에 대해 반대 극성을 가지며 전극 간의 전류의 통로가 되므로 전기전도성이 큰 전극물질로 조성될 수 있다. 복수의 상대 전극(220) 각각은 작동 전극과 마찬가지로 예컨대 탄소, 금, 백금, 은, 구리, 팔라듐 등의 금속 또는 합금으로 이루어진 것일 수 있다.
기준전극(230)은, 작동 전극에 일정한 전위가 인가되도록 하며 높은 임피던스에 의하여 이 전극 쪽으로는 전류가 흐르지 않게 된다. 기준 전극(230)은 예컨대 표준수소전극(standard hydrogen electrode, SHE), 칼로멜(Calomel, Hg/Hg2Cl2)전극, 은-염화은(Ag/AgCl) 전극일 수 있다. 이들은 비교적 일정한 전위차를 가지므로 일정한 전극 전위를 인가할 수 있다.
한편, 바이오 센서(200)는 혈당량 측정을 위한 것일 수 있고, 이 경우, 피부 내부로 삽입될 수 있도록 작동 전극(210), 상대 전극(220) 및 기준 전극(230)은 니들 형상일 수 있다.
지지체(240)를 기준으로 수직방향으로 상술한 니들 형상의 전극들이 배치될 수 있다. 특히, 바이오 센서(200)가 혈당량 측정을 위해 피부에 부착되어 있을 필요가 있는 경우, 지지체(240)는 고무와 같은 플렉서블한 재료로 형성되어 니들 형상의 전극들이 피부 내부로 잘 삽입될 수 있도록 한다. 지지체(240)는 바이오 센서(200)를 팔과 같은 신체 부위에 착용하기 용이하도록 밴드 형상일 수 있다.
도 5는 본 개시의 일 실시 예에 따른 바이오 센서를 제작하는 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 5를 참고하면, 5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(TTCA)과 효소 간의 공유결합으로 형성된 단량체들을 생산한다(S510).
구체적으로, EDC(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 TTCA의 카르복실기를 활성화시켜, TTCA의 카르복실기와 효소의 아민기 간의 공유결합을 형성할 수 있다.
TTCA 이외에도, 터싸이오펜 벤조익 에시드(terthiophene benzoic acid)(TTBA), 디싸이에닐 피롤 벤조익 에시드(di-thienylpyrrol benzoic acid)(DTPBA) 등과 같은 카르복실기를 가진 전도성 단량체가 사용될 수 있다. TTBA가 사용되는 경우, EDC 및 NHS를 이용하여 TTBA의 카르복실기를 활성화시켜 TTBA의 카르복실기와 효소의 아민기 간의 공유결합을 형성할 수 있다. DTPBA가 사용되는 경우, EDC 및 NHS를 이용하여 DTPBA의 카르복실기를 활성화시켜 DTPBA의 카르복실기와 효소의 아민기 간의 공유결합을 형성할 수 있다.
여기서 사용될 수 있는 아민기를 포함한 효소의 예는, 글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제, 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 등이 있다.
그리고 생산된 단량체들을 전극 상에서 중합시켜 상기 전극에 고분자층을 증착한다(S520).
생산된 단량체들은 전도성을 가지므로, 전기중합법(Electropolymerization)을 통해 중합될 수 있다.
구체적으로, 단량체들이 포함된 용액에 전극을 담그고, 전위주사를 통해 전극에 전압을 인가하여 단량체들을 전극 상에서 중합시킬 수 있다. 특히, 바이오 센서에는 상술한 것처럼 여러 전극이 존재하므로, 이 단계에선 작동 전극이 될 전극에만 선택적으로 전압을 인가함으로써 전압이 인가된 전극에만 고분자층을 증착할 수 있다.
이 경우, 순환 전류전압법(Cyclic voltammetry, CV)으로 고분자층을 증착할 수 있다.
상술한 방식에 따르면, 여러 전극을 포함한 전극 어레이에서 작동 전극이 될 전극에만 선택적으로 용이하게 고분자층을 증착할 수 있으며, 또한 다수의 공정을 거치지 않고 한 번에 전극 상에 고분자층을 증착할 수 있으므로 공정이 간소화될 수 있다는 장점이 있다.
한편, 고분자층을 증착하기 전에, 전극은 합금 산화물로 코팅 처리될 수 있다. 이는, 측정 대상 물질 이외의 불순물로부터의 전극 표면 오염을 방지하기 위한 것이며, 측정 감도를 높이기 위해 표면적을 넓히기 위한 것이다.
구체적으로, 금속염이 용해된 용액에 전극을 담그고 전압을 인가하여 전극 표면에 합금 층을 형성할 수 있다. 이 경우, 펄스 전압전류법(Normal pulse voltammetry, NPV)이 이용될 수 있다. 그리고 사용될 수 있는 금속의 예로는, 구리, 코발트, 금, 백금, 아연 등이 있으며, 구체적인 예로, 펄스 전압전류법으로 금과 아연의 합금 층(AuZn layer)을 전극 표면에 형성할 수 있다.
합금 층을 형성한 이후, 전극을 완충 용액, 예컨대 PBS 용액에 담가서 amperometry를 이용하여 일정 전압에서 합금 층을 산화시킬 수 있다. 산화된 합금 층은 표면적이 넓은 구조를 가지게 되며, 따라서 측정 감도가 향상될 수 있다.
상술한 바이오 센서는 금속 합금 산화물층과 pTTCA-효소 층의 도입으로 인해 Cl- 이온에 대한 방해를 감소시키고, 글루코오스 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 더욱이, 반복 측정에도 매우 안정하여 피부 속에서도 연속 측정이 가능하다는 효과가 있다.
이하에선 구체적인 실시 예 및 실험 예를 통해 본 개시를 설명하도록 한다. 다만, 아래의 실시 예 및 실험 예는 본 개시의 이해를 돕기 위한 예시 목적일 뿐, 아래의 실시 예 및 실험 예에 의해 본 개시가 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1> 마이크로 어레이 니들 전극 기반의 혈당 센서 제작
제작 과정은 도 6 내지 도 7을 참고해 설명하도록 한다. 먼저, 도 6의 SEM 사진과 같은 마이크로 니들 어레이 전극을 준비한다. 도 6에 도시된 것처럼, 니들 형태의 전극의 길이와 폭은 약 700μm와 100 μm로 매우 작은 크기이므로, 피부로 침습되더라도 통증이 거의 없다. 따라서 란셋으로 혈액을 채취하는 방식과 비교하여, 통증이 덜하고, 또한, 2차 감염의 문제가 극복될 수 있다.
마이크로 니들은 SUS(steel use stainless)로 구성되며 금(Au)이 도금된 것이다(도 7의 710 참조). 마이크로 니들 어레이 전극(SUS/AU) 위에 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer)을 형성시키기 위해, 각 30mM의 Gold(Ⅲ) chloride trihydrate와 Zinc chloride를 증류수에 녹인 precursor 용액을 준비한다. 상기 용액에서 펄스 전압전류법 (Normal pulse voltammetry, NPV)을 이용하여 주사 속도 200 mV/s으로 0 에서 -1.0 V 까지 주사하여 금-아연 합금층(AuZn layer)을 형성한 후 0.1 M (PBS, pH 7.4) 용액에서 담가서 amperometry를 이용하여 1.5 V에서 200초 동안 산화시켰다. 그리고 에탄올과 증류수로 순차적으로 세척하고 찬 바람으로 건조하여 SUS/Au/AuZnOx 전극을 제작한다(도 7의 720 참조).
그리고 전도성 고분자 단량체 (TTCA)와 글루코오스산화효소(GOx) 혼합 용액을 다음과 같이 준비하였다.
1) 1 mM TTCA 단량체를 acetonitrile/0.1 M TBAP에 녹인다.
2) 글루코오스산화효소(GOx) 12 mg/mL 와 10 mM EDC/NHS와 함께 증류수에 녹이고 4 hr 동안 상온에서 반응시킨 용액을 준비한다.
3) 상기 두 용액을 혼합하여 최종 농도가 0.5 mM TTCA, 6 mg/mL GOx 되도록 하고, 상온에서 2 hr 반응시켜 TTCA의 카르복실기와 GOx의 아민기간의 공유결합을 형성시킨다.
상기 3) 단계에서 만들어진 혼합용액에 상기 제작된 SUS/Au/AuZnOx 전극을 넣고 순환 전류전압법으로 전도성 고분자-효소 층을 형성시킨다. 즉, 한 번에 고분자와 효소를 동시에 증착시킨다. 구체적으로, 전도성 폴리머-효소 층의 전기 중합 조건은 주사 범위 0.0 - 1.7 V, 주사 속도는 100 mV/s, 주사 횟수는 5회이다. 0.1 M PBS 용액 (pH 7.4)에서 안정한 순환전압전류 곡선을 얻을 때까지 주사 (10 cycle) 하였다. 이후 고분자-효소 층이 증착된 전극을 acetonitrile/3차 증류수 (1:1)의 혼합 용매와 증류수로 세척 후 찬 바람으로 건조했다. 전도성 고분자-효소 층이 형성된 전극을 0.7 % 나피온 용액에 1회 딥핑(dipping)하여 나피온 고분자 막으로 코팅하고, CaCl2 분위기에서 4시간 동안 건조하여 혈당 센서를 제작하였다(도 7의 730 참조).
<시험 예 1> 혈당 센서의 전기화학적 특성
혈당 센서로 글루코오스를 검출하는 원리는, GOx와 글루코오스의 반응을 통해 생성된 H2O2가 Au/AuZnOx 층에 의해서 산화되어 발생하는 전류 측정을 통해 글루코오스 농도를 간접적으로 정량하는 것이다. 따라서 상기 실시 예 1을 통해 제조된 전극으로 H2O2 농도에 대한 반응성을 조사하였다. 도 8a는 상기 실시 예 1에 따라 제작된 폴리머-효소 층(pTTCA-GOx)이 형성된 전극을 이용한 H2O2 농도에 따른 순환전압전류 곡선이다. H2O2의 농도는 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0 mM을 0.1M PBS (pH7.4) 용액에 제조하여 실험하였다. H2O2 농도가 증가함에 따라 약 400 mV에서 H2O2 산화 전류가 증가하였다. 도 8b는 상기 실시 예 1에 따라 제작된 폴리머-효소 층(pTTCA-GOx)이 형성된 전극을 이용한 글루코오스 농도에 따른 순환전압전류 곡선이다. 글루코오스 농도는 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0, 20.0 mM 이다. 글루코오스에 의한 산화 전류는 약 350mV 에서 증가하는 것을 관찰되었다. 이는 글루코오스의 농도가 증가함에 따라 반응 생성물인 H2O2 농도도 비례적으로 증가하는 것을 의미한다.
<시험 예 2> 혈당 센서 제작의 최적화 조건 규명.
금속 전극 (SUS/Au)의 표면적을 증가시키고 산화막을 형성함으로 Cl-의 영향을 감소시켜 글루코오스의 감도를 높이기 위한 최적화 실험 (전기화학적 전착 전압, 주사 속도, 산화 전위, 전착 시간)을 수행하였다 (도 9). 이 실험에 사용된 글루코오스의 농도는 10 mM 이다. NPV(normal pulse voltammetry)을 이용한 SUS/Au 위에 AuZn 층의 전착 전압에 대한 최적화 실험으로서, 각 -0.8, -1.0, -1.2, -1.5, -1.8 V 에서 전착(electrodeposition)하였다. -0.8 V 에서 -1.5 V 까지 글루코오스에 의한 산화 전류가 증가하였으나 -1.5 V 이후에는 산화 전류가 감소하는 현상을 관찰하였다(도 9의 (a)). 따라서 AuZn의 전착 전압은 -1.5 V 에서 최적화되었다. AuZn를 전착 시의 주사 속도와 관련하여, 50 mV/s 에서 가장 큰 글루코오스 산화 전류 값을 보였다(도 9의 (b)). 시간대 전류법을 이용한 AuZn의 산화막 형성을 위한 최적화 실험으로 산화 전압은 1.5 V에서(도 9의 (c)), 산화 시간은 200 초에서(도 9의 (d)) 가장 큰 글루코스에 대한 산화 전류를 보였다.
도 10의 (a)는 단량체(TTCA)와 효소(GOx)의 혼합 용액 제조 시의 GOx 농도에 대한 최적화 실험으로서, GOx 농도만을 3, 4, 5, 6, 7, 9 mg/mL로 변화시켜가며 여러 개의 혼합 용액을 제조하고, 이를 가지고 각각 혈당 센서를 제작하여 글루코오스 측정 실험을 한 것이다. 도 10의 (a)를 참고하면, GOx 농도가 3 에서 6 mg/mL인 경우까지 글루코오스의 산화 전류가 증가하다가 그 이후 농도에서는 산화 전류가 감소하는 현상을 보였다. 따라서 GOx의 농도는 6 mg/mL로 최적화하였다.
도 10의 (b)는 단량체(TTCA)와 효소(GOx)의 혼합 용액 제조 시의 TTCA 농도에 대한 최적화 실험으로서, TTCA의 농도가 0.5 mM 이상인 경우에서는 글루코오스의 산화 전류가 감소하는 현상을 보이므로, 단량체와 효소의 혼합 용액 제조 시의 TTCA의 농도는 5 mM로 최적화하였다.
도 10의 (c)와 (d)는 순환전류전압 법으로 TTCA-GOx 단량체를 전기중합시의 주사 횟수와 주사 속도에 대한 최적화 실험을 진행한 것이다. 전기중합시의 주사 횟수와 주사 속도는 pTTCA-GOx의 두께에 영향을 미치는 중요한 인자이므로, 글루코오스 감도에 큰 영향을 미친다. 결과적으로 5회의 주사 횟수(도 10의 (c) 참조)와 100 mV/s의 주사속도(도 10의 (d) 참조)로 제작된 혈당 센서에서 가장 큰 글루코오스 산화 전류 값을 보였다.
도 10의 (e)는 시간대-전류법을 이용하여 글루코오스 검출을 위한 전위에 대한 최적화 실험을 진행한 것이다. 검출 전압 범위는 200 - 600 mV 조건에서 실시하였으며 400 mV 까지 산화 전류 값이 증가하다가 그 이후 전위인 500 mV 부터 감소하였다. 따라서 시간대-전류법을 이용한 글루코오스 검출 전압은 400 mV로 최적화하였다.
<시험 예 3> 글루코오스 측정시의 방해물질들에 의한 영향 평가
도 11은 Ascorbic acid (AA, 100μM), Acetaminophen (AP, 100 μM), Dopamine (DA, 100 μM), Uric acid (UA 100 μM) 방해물질들이 존재하였을 때의 글루코오스 산화 전류를 측정한 것이다. 구체적으로, 금-아연 산화물층/pTTCA에 Gox가 공유결합된 고분자 구조 층/네피온 코팅층(AuZnOx/pTTCA-GOx/Nafion)을 가진 전극을 포함한 마이크로 어레이 니들 센서를 사용하여 시간대 전류법으로 상기 방해 물질들이 존재시 글루코오스의 신호 변화를 관찰하였다. AP의 경우만 약 11 % 정도 글루코오스의 감도 저하를 관찰되고 나머지 AA, DA, UA 의 경우에는 5 % 이하로서, 글루코스 검출 신호에 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 관찰되었다.
일반적으로 금 전극 기반의 글루코오스 센서의 경우 다양한 음이온들이 금 전극에 쉽게 흡착된다는 문제가 있다고 알려졌다. 특히 Cl- 이온이 금 표면에 가장 강하게 흡착되어, 글루코오스와 효소 반응으로 생성된 과산화수소의 산화 반응을 억제한다. 따라서 금속 합금 산화물 (AuZnOx) 막을 형성시킴으로써 Cl- 이온이 금속 표면에 흡착되는 양을 줄이고, 글루코오스의 감도를 향상시키고자 하였다. 따라서 AuZnOx가 증착된 혈당 센서를 이용하여 Cl- 이온에 대한 영향을 평가하였다. 다중 금속 합금 (AuZn)과 다중 금속 합금 산화막 (AuZnOx) 기반의 센서를 이용하여 0.1 M PBS (pH7.4) 용액에 Cl- 이온 (0.1 M)의 유무에 따른 글루코오스의 감도를 비교 결과를 아래 표 1에 나타내었다.
Without 0.1 M saline With 0.1 M saline
AuZn AuZnOx AuZn AuZnOx
Sensitivity(μA/mM) 1.16 1.23 0.11 0.43
Cl- 이온이 존재시 Au 기반의 센서는 글루코오스에 대한 반응성이 거의 없었다. 다중 금속 합금 (AuZn)기반의 센서와 다중 금속 합금 산화물 (AuZnOx) 기반의 센서의 경우, 글루코오스에 대한 감도가 각각 10.5 배와 2.7 배 감소하다. 즉, 금속 합금이 산화물(AuZnOx) 층이 형성되었을 경우의 글루코오스에 대한 감도가 감소하는 폭이 훨씬 작은 것을 관찰하였다. 이는 다중 금속 합금에 산화막을 형성함으로써 Cl- 이온이 금속 표면에 흡착을 방지하여 글루코오스에 대한 감도 저하를 막을 수 있음을 의미한다. 결과적으로 Cl- 이온이 존재하는 용액에서 AuZnOx 기반의 센서의 글루코스 감도가 AuZn 기반의 센서에 비해 4 배 향상됨을 알 수 있었다.
<시험 예 4> 시간대-전류법을 이용한 글루코오스 검출
도 12는 Au/AuZnOx/pTTCA-GOx 기반의 마이크로 어레이 니들 센서를 이용하여 시간대 전류법으로 글루코오스 농도를 측정한 것에 대한 검정곡선이다. 도 12는 글루코오스 농도 100 μM 부터 50 mM의 구간에서 3개의 마이크로 니들 어레이 센서로 측정하였다. 저농도 (100 μM 내지 5 mM)와 고농도 (5 내지 50 mM)구간에서 두 개의 검정곡선을 얻었으며 검출한계는 92 μM이었다. 저농도와 고농도 구간에서 검량 곡선의 상관 관계식은 각각 I(μA) = (1.909 ± 0.043) + (0.180 ± 0.002) [C] (mM)과 I(μA) = (0.082 ± 0.025) + (0.534 ± 0.013) [C] (mM)이며 두 관계식의 상관 계수(correlation coefficient)는 0.99이다. 글루코오스 농도 구간의 평균 전류 값, 절대표준편차, 변동계수(평균 전류 값에 대한 절대표준편차의 퍼센트 값)는 아래 표 2에 나타내었다.
Glucose concentration (mM)
0.5 1 5 10 20 30 40 50
평균전류값 0.31 0.65 2.78 3.69 5.59 7.54 9.17 10.76
절대표준편차 0.04 0.05 0.07 0.07 0.06 0.06 0.2 0.21
변동계수 13.2 7.3 2.4 1.9 1.0 0.73 2.18 1.93
<시험 예 5> 글루코오스 측정에 대한 재현성 평가
SUS/Au/AuZnOx/pTTCA-GOx 센서의 글루코오스 검출 안정성 및 재현성에 대해서 실험하였다. 도 13a는 동일한 센서로 10회 측정시 글루코오스의 감도 변화를 모니터링한 결과이다. 이때, 글루코오스의 농도는 10 mM이다. 10 회 측정 결과, 평균 전류 값과 변동계수는 3.69 ± 0.07 μA와 1.9 %로 매우 우수한 반복 측정 안정성을 확인할 수 있었다. 도 13b는 센서를 10 mM의 글루코오스가 포함되어 있는 PBS (pH 7.4)/0.1 M NaCl 용액에 3일 동안 담근 상태에서 시간별로 측정한 결과이다. 도 13b를 보면 알 수 있듯이, 3일 동안 글루코오스의 감도의 변화에 큰 영향이 없이 매우 안정한 결과를 얻었다. 즉, 본 개시에 따른 마이크로 어레이 니들 기반의 혈당 센서는 실제 피부에 최소 침습으로 부착되어 체액으로부터 연속적으로 글루코오스를 검출하기 위한 센서로 사용될 수 있다.
이상에서는 본 개시의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 개시는 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 개시의 요지를 벗어남이 없이 당해 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 개시의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어 져서는 안 될 것이다.

Claims (10)

  1. 바이오 센서에 있어서,
    전극; 및
    상기 전극 상에 배치되며 폴리-5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(pTTCA)으로 형성된 고분자 구조체;를 포함하며,
    상기 고분자 구조체 내부에 효소가 pTTCA와 공유결합된 상태로 존재하는, 바이오 센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전극과 상기 고분자 구조체 사이에 배치된 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer);을 더 포함하는, 바이오 센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 아민기를 가지며, 상기 효소의 아민기와 pTTCA의 카르복실기가 상기 공유결합을 형성하는, 바이오 센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 효소는,
    글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제, 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택되는 바이오 센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전극 하부에 배치된 지지체;를 더 포함하고,
    상기 전극은 상기 지지체를 기준으로 수직 방향으로 배치된 니들 형상을 갖는 바이오 센서.
  6. 바이오 센서의 제작방법에 있어서,
    5,2':5',2"-터싸이오펜-3'-카르복실산(TTCA)과 효소 간의 공유결합으로 형성된 단량체들을 생산하는 단계; 및
    상기 단량체들을 전극 상에서 중합시켜 상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계;를 포함하는 바이오 센서의 제작방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 전극 표면을 금-아연 합금 산화물층(AuZn oxide layer)으로 코팅하는 단계;를 더 포함하며,
    상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계는,
    상기 금-아연 합금 산화물층으로 코팅된 전극 상에서 상기 단량체들을 중합시키는 바이오 센서의 제작방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 효소는 아민기를 포함하며,
    상기 단량체들을 생산하는 단계는,
    EDC(1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 상기 TTCA의 카르복실기를 활성화시켜, 상기 TTCA의 카르복실기와 상기 효소의 아민기 간의 공유결합을 형성하는 단계를 포함하는 바이오 센서의 제작방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 효소는,
    글루코오스산화효소, 글루코오스탈수소화효소, 헥소키나아제, 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제, 및 글루타민 피루빅 트랜스아미나제로 이루어진 군에서 선택되는 바이오 센서의 제작방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 전극에 고분자층을 증착하는 단계는,
    상기 단량체들이 포함된 용액에 상기 전극을 담그고, 상기 전극에 전압을 인가하여 상기 단량체들을 전기중합법(Electropolymerization)으로 상기 전극 상에서 중합시키는 바이오 센서의 제작방법.
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