JP6577402B2 - ヘマトクリット値測定用電極を備えたバイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、ヘマトクリット値測定用電極（以下、単にヘマトクリット用電極という）を備えたバイオセンサに関する。

自己血糖測定機器で用いるバイオセンサでは全血中のヘマトクリット値によって電流応答値が変わり、血糖値の真値から乖離した測定結果が得られることが問題となっている（ヘマトクリット影響）。このヘマトクリット影響に関して、特許文献１では、真値からの乖離値を小さくするため、自己血糖測定機器で交流を印加してヘマトクリット値を測定し補正する方法が開示されている。また、特許文献２では、ヘマトクリット値の影響を受けないようにするために、分離膜を用いて全血中から血漿のみを抜き取って血糖値を測定する方法が開示されている。

しかし、特許文献１では、電圧の交流印加により、装置の電力負担が大きくなることや、ヘマトクリット測定のノイズが高いことによる過補正により、精度が劣ることが問題であった。また、特許文献２では、センサ中に分離膜が必要なため、センサ構造が複雑になることや、血液検体中の血球以外の脂質等に由来する検体の粘性の影響により、分離膜による血球分離能力にばらつきがあるなどの問題があった。

特開2013-061336号公報 特許第4341032号明細書

上記のような問題に対し、本発明は、簡便に血液試料のヘマトクリット値を測定し、その値により補正することで正確に血液試料中のグルコースなどの測定対象物質の濃度を測定できるシステムと方法を提供することを目的としている。

本発明の一側面は、上述した目的を達成するために、以下の構成を採用する。
すなわち、本発明の一側面は、表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサに関する。導電性高分子は水溶性の導電性高分子であることが好ましく、導電性高分子がポリアニリンであることがより好ましい。

本発明の他の側面の一つは、上記ヘマトクリット用電極と、作用電極、対電極、参照電極を備えたバイオセンサに関する。ここで、作用電極が酵素電極であることが好ましく、酵素が酸化還元酵素であることがより好ましい。

また、本発明の他の側面の一つは、上記ヘマトクリット用電極と、作用電極、対電極、参照電極を備えたバイオセンサに血液試料を供給する工程、
作用電極に０〜４００ｍＶの電圧を印加して流れる第一の電流値を検出し、検出された第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出する工程、
ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの電圧を印加して流れる第二の電流値を検出する工程、
前記測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリッ
ト値で補正する工程、を含む
血液試料中の測定対象物質の濃度測定方法に関する。

また、本発明の他の側面の一つは、上記ヘマトクリット用電極と、作用電極、対電極、参照電極を備えたバイオセンサと、
バイオセンサの作用電極とヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
作用電極に第一の電圧を印加して流れる第一の電流値と、ヘマトクリット用電極に第二の電圧を印加して流れる第二の電流値とを検出する、検出部と、
前記第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出し、測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリット値で補正する、演算部と、
前記補正された測定対象物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置に関する。

また、本発明の他の側面の一つは、表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサに血液試料を供給する工程、
ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの電圧を印加して流れる電流値を検出する工程、を含む
血液試料中のヘマトクリット値の測定方法に関する。

また、本発明の他の側面の一つは、表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサと、
バイオセンサのヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
ヘマトクリット用電極に電圧を印加して流れる電流値を検出する、検出部と、
前記電流値からヘマトクリット値を算出する、演算部と、
前記ヘマトクリット値を出力する出力部、とから構成される測定装置に関する。

本発明によれば、血液試料のヘマトクリット値を簡便かつ正確に検出することが可能になり、その値で補正することで、精度の高い血糖値など血液試料中の測定対象物質の濃度の測定が可能になる。

図１は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの構造を模式的に示す図である。 図２は、本発明の測定装置の一態様を示す模式図である。 図３は、本発明の測定装置を用いた測定プログラムの一態様を示すフローチャート図である。 図４は、本発明の一実施形態に係るバイオセンサを用いて様々なヘマトクリット値を有する血液試料のサイクリックボルタンメトリー解析を行った結果を示す図である。 図５は、ヘマトクリット用電極に２００ｍＶの電圧を印加したときのヘマトクリット値と電流の関係を示すグラフである。 図６は、各ヘマトクリット値における、酵素電極に流れる電流値とグルコース濃度の関係を示す図である。

（ヘマトクリット用電極）
本発明におけるヘマトクリット用電極は、表面に導電性高分子が物理吸着により結合したものである。導電性高分子は架橋剤を介さずに電極表面に物理的に吸着している。すなわち、本発明におけるヘマトクリット用電極においては、導電性高分子はファンデルワール
ス力などの非共有結合により、電極表面に吸着している。

（電極）
ヘマトクリット用電極は、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウム（Pd）のような金属材料、またはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。ヘマトクリット用電極は、例えば、絶縁性基板上に形成される。絶縁性基板は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。ヘマトクリット用電極及び絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。

（導電性高分子）
ヘマトクリット用電極の表面に物理吸着されている導電性高分子としては、ポリアニリン、ポリピロール、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））、ポリアクリルアミドスルホネート、ポリビニルスルホネート又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。この中では水に溶解して水溶液を形成できる導電性高分子が好ましく、ポリアニリンがより好ましい。
これら導電性高分子の市販品として、ポリアニリンとして、例えば、「ＡｑｕａＰＡＳＳ０１−ｘ」（三菱レイヨン株式会社製）等がある。ポリピロールとして、例えば、「ＳＳＰＹ」（３−メチル−４−ピロールカルボン酸エチル）（化研産業株式会社製）等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」（東ソー有機化学株式会社製）等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー１００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー３００」（ティーエーケミカル社製）等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン（ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート））として、例えば、「ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）等がある。

（ヘマトクリット用電極の作製方法）
ヘマトクリット用電極は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板の片面に、電極として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
次に、電極上に導電性高分子の層が形成される。まず、導電性高分子の溶液（試薬）が調製される。溶液（試薬）は、電極の表面に滴下される。溶液（試薬）が電極上で乾燥により固化することで、電極上に導電性高分子が吸着されたヘマトクリット用電極を得ることができる。

なお、ヘマトクリット用電極は、導電性高分子以外の成分を含んでもよいが、その場合でも架橋剤は含まないようにする。

（バイオセンサ）
本発明のバイオセンサは、本発明のヘマトクリット用電極を含む。

本発明のバイオセンサは、本発明のヘマトクリット用電極と対電極のみを含むものであってもよいが、本発明のバイオセンサのより好ましい態様は、本発明のヘマトクリット用電極とともに、対電極、作用電極（酵素電極）、参照電極を含む。
ヘマトクリット用電極と対で使用される対電極としては、バイオセンサの対電極として一
般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀／塩化銀電極を用いることができる。
また、後述の作用電極（酵素電極）と対で使用される参照電極も、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜した金属電極などとすることができる。

次に、作用電極（酵素電極）について説明する。
（酵素電極の構成）
酵素電極は、電極上に、酵素、上述の導電性高分子、架橋剤、さらに、必要に応じて導電性粒子などを含む検知層を配置することで作製することができる。

（酵素電極）
酵素電極は、ヘマトクリット用電極と同様に、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウムのような金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。電極は、例えば、絶縁性基板上に形成される。絶縁性基板は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック）、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極をなす電極材料及び絶縁性基板の材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。電極及び絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。

（検知層）
酵素電極の検知層は、電極と接触し、酵素と、ヘマトクリット用電極の項で説明した導電性高分子と、架橋剤と、を含んでおり、導電性粒子などその他の成分を含んでもよいが、電子メディエータを含んでいないことが好ましい。

（酵素）
酵素は、測定対象物質によって適宜選択されるが、例えば、酸化還元酵素が挙げられる。例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、Ｄ−又はＬ−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、１７Ｂヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール１７Ｂデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。

また、酸化還元酵素は、触媒サブユニット及び触媒ドメインとして、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ（PQQG
DH）が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つシトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ（Cy-GDH）、グルコースオキシダーゼ（GOD）が挙げられる。
また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニット若しくは、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達サブユニットとしては、例えば、電子授受の機能を持つヘムを有するサブユニット挙げられる。このヘムを有するサブユニットを含む酸化還元酵素としては、シトクロムを含むものが挙げられ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼや、PQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。
また、電子伝達ドメインを含む酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh)が挙げられる。さらに、電子伝達ドメインは、電子授受の機能を持つヘムを有するシトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、"QHGDH" (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH)）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（Glucose-3-Dehydrogenase）（G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、上述したシトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質、及びシトクロムを含むドメインの例示であるPQQGDHのシトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。また、酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子受容体の機能を持つヘムを有するシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。

（架橋剤）
架橋剤の種類として、具体的には、アルデヒド基含有化合物として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、シンナムアルデヒド、ニコチアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジプアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。カルボジイミド基含有化合物として、ヘキサメチレンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、１，１２−ジイソシアネートドデカン、ノルボルナンジイソシアネート、２，４−ビス−（８−イソシアネートオクチル）−１，３−ジオクチルシクロブタン、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどが挙げられる。またカルボジイミド基含有化合物はカルボジライトＶ−０２、カルボジライトＶ−０２−Ｌ２、カルボジライトＶ−０４、カルボジライトＶ−０６、カルボジライトＥ−０２、カルボジライトＥ−０２、カルボジライトＶ−０１、カルボジライトＶ−０３、カルボジライトＶ−０５、カルボジライトＶ−０７、カルボジライトＶ−０９（何れも商品名、日清紡績株式会社製）などとして市販されている。マレイミド基含有化合物として、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート、Ｎ−スクシニミジル−２−マレイミド酢酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミド酪酸、Ｎ−スクシニジル−６−マレイミドヘキサン酸、Ｎ-スクシニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スクシニジル−４−マレイミドメチル安息香酸、Ｎ−スクシニジル−３−マレイミド安息香酸、Ｎ-スクシニジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ−スルホスクシニジル−４−マレイミドフェニル−４−酪酸、Ｎ,Ｎ’−オキシジメチレン−ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｏ−フェニレン-ジマレイミド、Ｎ,Ｎ’−ｍ−フェニレン−ジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−p−フェニレン-ジマ
レイミド、Ｎ,Ｎ’−ヘキサメチレン−ジマレイミド、Ｎ−スクシニジルマレイミドカルボン酸などが挙げられる。また、サンフェルＢＭ−Ｇ（三新化学工業株式会社製）などの市販品も挙げられる。オキサゾリン基含有化合物として、２，２’−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−メチレン− ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−トリメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−テトラメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ヘキサメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−オクタメチレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−エチレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、２，２’−ｐ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（２−オキサゾリン）、２，２’−ｍ−フェニレン−ビス−（４，４’−ジメチル−２−オキサゾリン）、ビス−（２−オキサゾリニルシクロヘキサン）スルフィド、ビス−（２−オキサゾリニルノルボルナン）スルフィドなどのオキサゾリン化合物。また、付加重合性オキサゾリン化合物として２−ビニル−２−オキサゾリン、２−ビニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−４−メチル−２−オキサゾリン、２−イソプロペニル−５−エチル−２−オキサゾリンなどが挙げられ、これらの１種もしくは２種以上の化合物を重合または共重合したものを使用可能である。またオキサゾリン基含有化合物は、エポクロスＷＳ−５００、エポクロスＷＳ−７００、エポクロスＫ−１０１０Ｅ、エポクロスＫ−１０２０Ｅ、エポクロスＫ−１０３０Ｅ、エポクロスＫ−２０１０Ｅ、エポクロスＫ−２０２０Ｅ、エポクロスＫ−２０３０Ｅ、エポクロスＲＰＳ−１００５、エポクロスＲＡＳ−１００５ (いずれも株式会社日本触媒社製)、ＮＫリンカーＦＸ(新中村化学工業株式会社製)などとして市販されている。エポキシ基含有化合物として、具体的には、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、などが挙げられ、これらの化合物を２種以上併用して用いることもできる。またエポキシ基含有化合物は、デナコールＥＸ−６１１、デナコールＥＸ−６１２、デナコールＥＸ−６１４、デナコールＥＸ−６１４Ｂ、デナコールＥＸ−５１２、デナコールＥＸ−５２１、デナコールＥＸ−４２１、デナコールＥＸ−３１３、デナコールＥＸ−３１４、デナコールＥＸ−３２１、デナコールＥＸ−８１０、デナコールＥＸ−８１１、デナコールＥＸ−８５０、デナコールＥＸ−８５１、デナコールＥＸ−８２１、デナコールＥＸ−８３０、デナコールＥＸ−８３２、デナコールＥＸ−８４１、デナコールＥＸ−８６１、デナコールＥＸ−９１１、デナコールＥＸ−９４１、デナコールＥＸ−９２０、デナコールＥＸ−１４５、デナコールＥＸ−１７１（いずれも商品名、ナガセケムテックス株式会社製）、ＳＲ−ＰＧ、ＳＲ−２ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧ、ＳＲ−８ＥＧＳ、ＳＲ−ＧＬＧ、ＳＲ−ＤＧＥ、ＳＲ−４ＧＬ、ＳＲ−４ＧＬＳ、ＳＲ−ＳＥＰ（いずれも商品名、阪本薬品工業株式会社製）、エポライト２００Ｅ、エポライト４００Ｅ、エポライト４００Ｐ（いずれも共栄社化学株式会社製）、などとして市販されている。架橋剤の種類は、上記化合物、市販品に限定されず、アルデヒド基、マレイミド基、カルボジイミド基、オキサゾリン基、エポキシ基の少なくとも１つの官能基を含む化合物であってもよい。また架橋剤の形態も限定されず、モノマー、ポリマーの何れの形態であってもよい。

（導電性粒子）
酵素電極の検知層はさらに導電性粒子を含むことが好ましい。導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，ケッチェンブラック（登録商標）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、フラーレンから選択される微粒子（炭素微粒子）の１種以上を含有することができる。

なお、酵素電極の検知層の表面は、セルロースアセテートのような外層膜によって被覆されてもよい。外層膜の原料としては、その他、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン等が挙げられる。

（酵素電極の作製方法）
酵素電極は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板の片面に、電極として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。

次に、電極上に検知層が形成される。すなわち、酵素，導電性高分子、架橋剤および導電性粒子を含有する溶液（試薬）が調製される。溶液（試薬）は、電極の表面に滴下される。溶液（試薬）が電極上で乾燥により固化することで、電極上に検知層が形成された酵素電極を得ることができる。

酵素電極を用いることにより、血液試料中に含まれる測定対象物質の濃度を測定することができる。ここで、測定対象物質としては酵素電極を用いた測定方法によって測定可能な物質であれば特に制限されないが、生体由来の物質であって疾患や健康状態の指標となりうる物質であることが好ましく、例えば、グルコースやコレステロールなどが挙げられる。

酵素電極を用いて測定されるのは、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流であることが好ましい。これは、酵素と測定対象物質との反応によって、該酵素から電極へ電子が移動する際に生じる電流であり、時間に依存しない定常電流であり、好ましくは電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流である。

（バイオセンサの製造法）
以下、図１を参照して本発明のバイオセンサＡの製造法について説明するが、これは一態様に過ぎず、本発明のバイオセンサの製造法はこれには限定されない。
まず、絶縁性基板５に導電性カーボンインクなどで４つの電極パターンを印刷する。このうちの１つに導電性高分子を含む溶液を添加し、ヘマトクリット用電極１とする。また、他の１つは、酵素、導電性高分子、架橋剤および導電性粒子を含む溶液を添加し、酵素電極３とする。さらに、他の１つは、銀/塩化銀溶液を添加して参照電極４とする。残りの電極はそのまま対電極２として用いる。そして、これらの電極の一部が露出し、反応部６を形成するように、絶縁性樹脂を基板上にスクリーン印刷して絶縁層５を形成させる。

（血液試料中の測定対象物質の測定方法）
本発明の血液試料中の測定対象物質の濃度測定方法は、上記ヘマトクリット用電極と、作用電極、対電極、参照電極を備えたバイオセンサに血液試料を供給する工程、
作用電極に第一の電圧を印加して流れる第一の電流値を検出し、検出された第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出する工程、
ヘマトクリット用電極に第二の電圧を印加して流れる第二の電流値を検出する工程、
前記測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリット値で補正する工程、を含む。

第二の電圧としては、１００〜３００ｍＶの定電圧であるが、１５０〜２５０ｍＶが好ま
しく、２００ｍＶが特に好ましい。
第一の電圧としては、０〜４００ｍＶの定電圧であるが、１００〜３００ｍＶが好ましく、１００〜２００ｍＶがより好ましい。
作用電極へ印加する第一の電圧とヘマトクリット用電極へ印加する第二の電圧は異なる値の電圧でもよいが、１００〜３００ｍＶの同じ値の電圧であることが好ましい。１００〜３００ｍＶの同じ値の電圧を印加することで、電圧印加が容易になる。
なお、作用電極への第一の電圧の印加と、ヘマトクリット用電極への第二の電圧の印加は同時に行うことが好ましいが、時間差で行ってもよい。

ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの定電圧を印加した時の電流はヘマトクリット値と正の相関関係を有する。
したがって、あらかじめ、１００〜３００ｍＶの定電圧を印加した時のヘマトクリット用電極に流れる電流値と試料のヘマトクリット値との関係を求めておけば、ヘマトクリット用電極に流れる電流値から、測定に使用した血液のヘマトクリット値がわかる。なお、ヘマトクリット用電極に流れる電流の測定は電圧印加から３〜６０秒に行うことが好ましい。

一方、酵素電極に０〜４００ｍＶの定電圧を印加することにより、測定対象物質の濃度に比例した電流が流れるので、その電流値からグルコースなどの測定対象物質の濃度の値（仮の値）がわかる。なお、酵素電極に流れる電流の測定は電圧印加から３〜６０秒に行うことが好ましい。

そして、測定対象物質の濃度と酵素電極に流れる電流値の関係と、それにヘマトクリット値が与える影響をあらかじめ求めておけば、ヘマトクリット値で補正することにより、正しいグルコースなどの測定対象物質の濃度が測定できる。
なお、あらかじめヘマトクリット用電極に流れる電流値とヘマトクリット値の関係がわかっていれば、ヘマトクリット値を算出することなく、ヘマトクリット用電極に流れる電流値で測定対象物質の濃度の値を補正してもよい。

（血液試料中のヘマトクリット値の測定方法）
本発明の血液試料中のヘマトクリット値の測定方法は、表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサに血液試料を供給する工程、ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの電圧を印加して流れる電流値を検出する工程、を含む。あらかじめ、各測定対象物質濃度における、１００〜３００ｍＶの定電圧を印加した時のヘマトクリット用電極に流れる電流値とヘマトクリット値の関係を求めておけば、上記仮の濃度値とヘマトクリット用電極に流れる電流値から、測定に使用した血液のヘマトクリット値がわかる。

（血液試料中の測定対象物質の測定装置）
次に、図面を用いて、本発明の測定装置Ｂについて説明する。ここでは、バイオセンサとしてグルコースセンサを使用したグルコース測定装置について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。
本発明の測定装置は、上記バイオセンサと、
バイオセンサの作用電極とヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
作用電極に第一の電圧を印加して流れる第一の電流値とヘマトクリット用電極に第二の電圧を印加して流れる第二の電流値とを検出する、検出部と、
前記第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出し、測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリット値で補正する、演算部と、
前記補正された物質の濃度を出力する出力部とから構成される。

図２は、測定装置Ｂ内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ１８，ポテンショスタット１９，電力供給装置１１が、筐体内に収容された基板２０上に設けられている。
制御コンピュータ１８は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access Memory）,ＲＯＭ（Read Only Memory））のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、出力部１０、制御部１２、演算部１３及び検出部１４を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ１８は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいてもよい。

制御部１２は、電圧印加のタイミング，印加電圧値などを制御する。
電力供給装置１１は、バッテリ１６を有しており、制御部コンピュータ１８やポテンショスタット１９に動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置１１は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット１９は、作用電極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部１２によって制御され、端子ＣＲ，Ｗを用いて、グルコース電極（酵素電極）１７の対電極（参照電極）と作用電極との間、およびヘマトクリット用電極２１の対電極と作用電極との間に所定の電圧を印加し、端子Ｗで得られる作用電極の応答電流をそれぞれ測定し、測定結果を検出部１４に送る。

演算部１３は、グルコース電極で検出された電流値からグルコースの濃度を、ヘマトクリット用電極で検出された電流値からヘマトクリット値を（ヘマトクリット用電極に流れる電流値で補正する場合は省略可）、それぞれ求めるための演算を行い、さらに、グルコースの濃度を第二の電流値または演算部において第二の電流値に基づいて算出されるヘマトクリット値で補正し、得られた値を記憶する。出力部１０は、表示部ユニット１５との間でデータ通信を行い、演算部１３による測定対象物質の濃度の演算結果を表示部ユニット１５に送信する。表示部ユニット１５は、例えば、測定装置Ｂから受信されたグルコース濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面に表示することができる。

図３は、制御コンピュータ１８によるグルコース濃度測定処理の例を示すフローチャートである。制御コンピュータ１８のＣＰＵ（制御部１２）は、グルコース濃度測定の開始指示を受け付けると、制御部１２は、ポテンショスタット１９を制御して、グルコース電極とヘマトクリット用電極それぞれに上記所定の電圧を印加し、それぞれ応答電流の測定を開始する（ステップＳ０１）。なお、測定装置へのセンサの装着の検知を、濃度測定開始指示としてもよい。

次に、ポテンショスタット１９は、電圧印加によって得られる応答電流、すなわち、グルコース電極での応答電流と、ヘマトクリット用電極での応答電流を測定し、検出部１４へ送る（ステップＳ０２）。

演算部１３は、電流値に基づいて演算処理を行い、グルコース濃度とヘマトクリット値（ヘマトクリット用電極に流れる電流値で補正する場合は省略可）を算出する（ステップＳ０３）。例えば、制御コンピュータ３の演算部１３は、グルコース濃度の計算式またはグルコース濃度の検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてグルコース濃度を算出する。また、制御コンピュータ３の演算部１３は、ヘマトクリット用電極の電流値とヘマトクリット値の関係を示す計算式または検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてヘマトクリット値を算出する。
さらに、演算部１３は前記グルコース濃度を前記ヘマトクリット値で補正して、補正後のグルコース値を算出する（ステップＳ０４）。例えば、制御コンピュータ３の演算部１３
は、ヘマトクリット値とグルコース濃度の関係を示す計算式または検量線データを予め保持しており、これらの計算式または検量線を用いてグルコース濃度を補正する。

出力部１０は、補正後のグルコース濃度の算出結果を、表示部ユニット１５との間に形成された通信リンクを通じて表示部ユニット１５へ送信する（ステップＳ０５）。その後、制御部１２は、測定エラーの有無を検知し（ステップＳ０６）、エラーがなければ測定を終了し、グルコース濃度を表示部に表示する。エラーがあればエラー表示をした後に、図３のフローによる処理を終了する。

（ヘマトクリット値の測定装置）
本発明のヘマトクリット値の測定装置は、表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサと、
バイオセンサのヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
ヘマトクリット用電極に電圧を印加して流れる電流値を検出する、検出部と、
前記電流値からヘマトクリット値を算出する、演算部と、
前記ヘマトクリット値を出力する出力部、とから構成される。

以下、バイオセンサの実施例について説明する。

＜電極作製＞
下地電極材料として、導電性カーボンインクを用い、スクリーン印刷手法にてポリエチレンテレフタレート基材（東レ製E-22）（長さ５０ｍｍ、幅５ｍｍ、厚み２５０μｍ）の一方の表面にパターンニング印刷を行い、４電極パターンを形成した。このうちの１つの電極をそのまま対電極とし、もう１つの電極上には銀塩化銀インク（BAS社製）を塗布し、８０℃で２０分乾燥させ、銀塩化銀電極を形成し、参照電極とした。
さらに、残りの２つの電極には後述する試薬溶液をそれぞれに塗布し、100℃の乾燥炉で2時間乾燥させることで、それぞれ、ヘマトクリット用電極および酵素電極（作用電極）とした。

なお、パターンニング印刷で４電極パターンを形成したのち、各電極に試薬を塗布する前に、これらの電極の一部が露出するような窓を備えるように、絶縁性樹脂ポリエステルインク（アサヒ化学研究所製 UVFシリーズ）を、前記電極上にスクリーン印刷して絶縁層を形成させた。
最後に、両面テープで厚み規制された親水性フィルムを貼り付けキャピラリーを形成することでセンサを得た。

（試薬溶液）
以下のような試薬溶液を調製し、上記ヘマトクリット用電極および酵素電極（作用電極）用に使用した。
＜酵素電極用検知層溶液＞
ケッチェンブラック（三菱カーボンブラック製） １．２０％
導電性高分子：スルホン化 ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ、
三菱レイヨン株式会社製） ０．４０％
オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700（日本触媒）６．０％
酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ） ４．５ｍｇ／ｍＬ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．８） １０ｍＭ
スクロース ０．５％
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。

＜ヘマトクリット用電極用検知層溶液＞
導電性高分子：スルホン化 ポリアニリン水溶液（商品名：ａｑｕａＰＡＳＳ−０１ｘ、三菱レイヨン株式会社製） ０．４０％

（サイクリックボルタンメトリー）
サイクリックボルタンメトリー波形を調べることによりバイオセンサのヘマトクリット用電極の応答特性を評価した。サイクリックボルタンメトリー波形は、試料供給部（反応部）にグルコース濃度が0mg/dLでヘマトクリット値がそれぞれ２０％、４２％、７０％の全血を導入した後に、掃引速度を20mV/secとし、印加電圧が-800mV→＋800mVとなるように掃引し、掃引時の応答電流を測定することにより調べた。図４は、測定により得られたサイクリックボルタンメトリー波形である。
その結果、200mV近辺では電流値がヘマトクリット値によって変わることが分かった。
200mVの電流値とヘマトクリット値の関係を図５に示す。
このように、200mVの電流値はヘマトクリット値に正に相関することが分かった。
導電性高分子が血球の電子を受け取り、電極へと受け渡すことにより、ヘマトクリット値に相関した電流が流れることが考えられた。

なお、導電性高分子を加えない場合や架橋剤で固定化した場合は、２００ｍＶにおける電流値はヘマトクリット値による違いは見られなかった（データは示さず）。

図６に、別途求めた各ヘマトクリット値における、酵素電極に流れる電流値とグルコース濃度の関係を示す。
ヘマトクリット用電極に流れる電流値からヘマトクリット値を算出し、この値と、酵素電極に流れる電流値とから、ヘマトクリット値で補正されたグルコース濃度を算出することができる。

Ａ・・・バイオセンサ
１・・・ヘマトクリット用電極
２・・・対電極
３・・・酵素電極
４・・・参照電極
５・・・基板
６・・・絶縁層
７・・・反応部
Ｂ・・・測定装置
１０・・・出力部
１１・・・電力供給装置
１２・・・制御部
１３・・・演算部
１４・・・検出部
１５・・・表示部ユニット
１６・・・バッテリ
１７・・・グルコースセンサ
１８・・・制御コンピュータ
１９・・・ポテンショスタット
２０・・・基板
２１・・・ヘマトクリット用電極
ＣＲ、Ｗ・・・端子

Claims (16)

1. 金属材料または炭素材料の表面に導電性高分子が物理吸着によりコートされたヘマトクリット用電極を備えたバイオセンサ。
2. 導電性高分子が架橋剤を用いずに物理吸着によりコートされた、請求項１に記載のバイオセンサ。
3. 導電性高分子が水溶性の導電性高分子である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
4. 導電性高分子がポリアニリンである、請求項３に記載のバイオセンサ。
5. さらに、作用電極、対電極、参照電極を備えた、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
6. 作用電極が酵素電極である、請求項５に記載のバイオセンサ。
7. 酵素電極が、酵素、導電性高分子および架橋剤を含む試薬層を有する、請求項６に記載のバイオセンサ。
8. 前記試薬層がさらに導電性粒子を含む、請求項７に記載のバイオセンサ。
9. 酵素が酸化還元酵素である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
10. 酸化還元酵素が、糖類の酸化還元酵素である、請求項９に記載のバイオセンサ。
11. 請求項５〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサに血液試料を供給する工程、
    作用電極に０〜４００ｍＶの電圧を印加して流れる第一の電流値を検出し、検出された第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出する工程、
    ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの電圧を印加して流れる第二の電流値を検出する工程、
    前記測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリ
    ット値で補正する工程、を含む
    血液試料中の測定対象物質の濃度測定方法。
12. 測定対象物質がグルコースである、請求項１１に記載の濃度測定方法。
13. 請求項５〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサと、
    バイオセンサの作用電極とヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
    作用電極に第一の電圧を印加して流れる第一の電流値と、ヘマトクリット用電極に第二の電圧を印加して流れる第二の電流値とを検出する、検出部と、
    前記第一の電流値から測定対象物質の濃度を算出し、測定対象物質の濃度を第二の電流値または第二の電流値から算出されるヘマトクリット値で補正する、演算部と、
    前記補正された測定対象物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
14. 測定対象物質がグルコースである、請求項１３に記載の測定装置。
15. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサに血液試料を供給する工程、
    ヘマトクリット用電極に１００〜３００ｍＶの電圧を印加して流れる電流値を検出する工程、を含む血液試料中のヘマトクリット値の測定方法。
16. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサと、
    バイオセンサのヘマトクリット用電極に電圧印加を制御する、制御部と、
    ヘマトクリット用電極に電圧を印加して流れる電流値を検出する、検出部と、
    前記電流値からヘマトクリット値を算出する、演算部と、
    前記ヘマトクリット値を出力する出力部、とから構成される測定装置。