JP2017173317A - 電気化学式バイオセンサを用いた物質の測定方法及び測定装置 - Google Patents
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Abstract
Description
絶縁性基板と、該絶縁性基板上に形成された2以上の電極を含む電極系であって、少なくとも1つの電極が酸化還元酵素を含む電極系、とを含む電気化学測定セル内に測定対象物質を含む試料を導入する工程と、
第一の電圧を電極系に印加する第一の電圧印加工程と、
第二の電圧を電極系に印加する第二の電圧印加工程と、
前記第一の電圧印加工程において、酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる前記酸化還元酵素の量に依存する第一のシグナルを取得する工程と、
前記第二の電圧印加工程において、前記試料中の測定対象物質の量に依存する第二のシ
グナルを取得する工程と、
前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中の測定対象物質の濃度を決定する工程、を含む。
ここで、前記第一の電圧が、前記酸化還元酵素の還元電位以下の電圧であり、前記第二の電圧が、前記酸化還元酵素の酸化電位以上の電圧であることが好ましい。
また、あらかじめ第二のシグナルのレベル域毎に作成された前記第一のシグナルと前記第二のシグナルの検量線を用い、前記第一のシグナルの測定値の、当該検量線からの乖離度から補正係数を算出し、前記第二のシグナルの測定値を前記補正係数で補正し、補正された第二のシグナルの値に基づいて物質濃度を決定することが好ましい。
前記第二のシグナルは電荷移動律速電流であることが好ましく、電荷移動律速電流は、電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流であることが好ましく、下記式(2)で表されることがより好ましい。
また、酸化還元酵素がピロロキノリンキノンまたはフラビンアデニンジヌクレオチドを含むか、ヘムを含むサブユニットまたはドメインを有することが好ましい。
より具体的には、前記酸化還元酵素がグルコース酸化活性を有する酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼであり、測定対象物質がグルコースであることが好ましい。
絶縁性基板と、該絶縁性基板上に形成された2以上の電極を含む電極系であって、少なくとも1つの電極が酸化還元酵素を含む電極系、とを含む電気化学測定セルを含むバイオセンサと、
バイオセンサへの第一の電圧印加および第二の電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの第一及び第二の電圧印加により得られる、第一及び第二のシグナルを検出する、検出部と、
前記前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中に含まれる物質の濃度を決定する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置、
とから構成される。
測定装置は、測定対象物質がグルコースであり、酸化還元酵素がグルコース酸化活性を有する酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼであることが好ましい。
第一の電圧を電極系に印加する第一の電圧印加工程と、
第二の電圧を電極系に印加する第二の電圧印加工程と、
前記第一の電圧印加工程において、酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる前記酸化還元酵素の量に依存する第一のシグナルを取得する工程と、
前記第二の電圧印加工程において、前記試料中の測定対象物質の量に依存する第二のシグナルを取得する工程と、
前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中に含まれる物質の濃度を決定する工程、を含む。
試料は測定対象物質を含む試料であれば特に制限されないが、生体試料が好ましく、血液、尿などが挙げられる。
作用電極は例えば、絶縁性基板上に電極材料を配置し、得られた電極の近傍に少なくとも酸化還元酵素を含む試薬層を配置させることによって得ることができる。
電極は、例えば、カーボンのような炭素材料を用いて形成される。或いは、金(Au)、白金(Pt)、銀(Ag)、パラジウム(Pd)、ルテニウム(Ru)のような金属材料を用いることもできる。
絶縁性基板は、例えば、ポリエーテルイミド(PEI)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレン(PE)のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂(プラスチック)、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。
電極及び絶縁性基板の大きさ、厚さは適宜設定可能である。
酸化還元酵素は、測定対象物質を酸化還元しうる酵素であればよいが、触媒サブユニット及び触媒ドメインとして、ピロロキノリンキノン(PQQ)、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)のうち少なくとも一方を含むことができる。例えば、PQQを含む酸化還元酵素として、PQQグルコースデヒドロゲナーゼ(PQQGDH)が挙げられ、FADを含む酸化還元酵素として、FADを含んだαサブユニットを持つシトクロムグルコースデヒドロゲナーゼ(CyGDH)、グルコースオキシダーゼ(GOD)が挙げられる。
なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は1〜2nmと云われている。よって、酵素から電極への電子移動が損なわれないように酵素を配置することが重要である。
ては、水溶性のものが好ましく、ポリアニリン、ポリエチレンジオキシチオフェン等が挙げられ、代表例として、三菱レイヨン製スルホン化ポリアニリン水溶液(商品名 アクアパス)が挙げられる。
次に、電極上に酵素試薬層が形成される。まず、酸化還元酵素と導電性粒子や導電性高分子を含む溶液が調製され、該溶液は、電極の表面に滴下される。該溶液が電極上で乾燥により固化することで、電極上に酵素試薬層が形成された作用電極を得ることができる。
本発明のバイオセンサを用いた物質の測定方法では、電気化学測定セル内に物質を含む試料を導入した後、第一および第二の電圧を電極系に印加し、第一および第二のシグナルを取得する。
ここで、第一の電圧は、作用電極に使用された酸化還元酵素の還元電位以下の電圧であることが好ましい。酸化還元酵素の還元電位以下の電圧を印加することにより、試料中の物質濃度には依存せず、酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる酸化還元酵素の量に依存する第一のシグナル、すなわち、第一の電流値(還元電流値)が得られる。
一方、第二の電圧は、作用電極に使用された酸化還元酵素の酸化電位以上の電圧であることが好ましい。酸化還元酵素の酸化電位以上の電圧を印加することにより、試料中の物質濃度に依存する第二のシグナル、すなわち、第二の電流値(酸化電流値)が得られる。
例を挙げると、酸化還元酵素がCyGDHの場合、第一の電圧としては、−0.01、−0.03、−0.05、−0.08または−0.10V〜−0.20、−0.25、−0.30、−0.35または−0.40の範囲とすることができ、−0.01〜−0.4Vが好ましく、さらに−0.1〜−0.2Vがより好ましく、第二の電圧としては、0.01、0.02、0.03、0.04または0.05V〜0.40、0.50、0.60、0.70または0.80Vの範囲とすることができ、0.01〜0.8Vが好ましく、さらに0.05〜0.4Vがより好ましい。
質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流が好ましい。ここで、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流とは、酸化還元酵素と測定対象物質との反応によって、該酵素から電極へ電子が移動する際に生じる電流であり、時間に依存しない定常電流であり、好ましくは電気二重層の充電による過渡電流発生後の定常電流である。
また、第一のシグナルの測定は、第一の電圧印加後、1〜5秒後に行うことが好ましく、第二のシグナルの測定は、第二の電圧印加後、3〜60秒に行うことが好ましい。
なお、作用電極への第一の電圧の印加と第二の電圧の印加、およびそれに基づく第一のシグナルおよび第二のシグナルの測定は、全く独立に行ってもよい。例えば、下記の通り、第一のシグナルの値は試料中の測定対象物質の量に依存しないので、第一の電圧の印加と第一のシグナルの測定は測定対象物質を含む試料が存在しない状態で先に行い、後に、第二の電圧の印加と第二のシグナルの測定を測定対象物質を含む試料を存在させた状態で行ってもよい。
なお、あらかじめ酸化電流値から測定対象物質の濃度(仮の値)を求めておき、それを還元電流値で補正して測定対象物質の濃度(補正後)を求めてもよいし、酸化電流値を還元電流値で補正し、酸化電流値(補正後)に基づいて測定対象物質の濃度(補正後)を求めてもよい。
次に、図面を用いて、本発明の測定装置2について説明する。ここでは、バイオセンサとしてグルコースセンサを使用したグルコース測定装置について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。
本発明の測定装置は、上記バイオセンサと、
バイオセンサへの第一の電圧印加および第二の電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの第一及び第二の電圧印加により得られる、第一及び第二のシグナルを検出する、検出部と、
前記前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中に含まれる物質の濃度を決定する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される。
制御コンピュータ3は、ハードウェア的には、CPU(中央演算処理装置)のようなプロセッサと、メモリ(RAM(Random Access Memory),ROM(Read Only Memory))のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体(例えばROM)に記憶されたプログラムをRAMにロードして実行することによって、出力部20、制御部22、演算部23及び検出部24を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ3は、半導体メモリ(EEPROM,フラッシュメモリ)やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいてもよい。
電力供給装置21は、バッテリ26を有しており、制御部コンピュータ3やポテンショスタット3Aに動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置21は、筐体の外部に置くこともできる。
ポテンショスタット3Aは、作用電極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部22によって制御され、端子CR,Wを用いて、グルコースセンサ(酵素電極)4の対電極(参照電極)と作用電極との間に所定の電圧(第一及び第二の電圧)を印加し、端子Wで得られる作用電極の応答電流(第一及び第二の電流)を測定し、測定結果を検出部24に送る。
なお、上記第二の電流値と第一の電流値の関係を示す計算式または検量線データは、各グルコース濃度域ごとに用意されていることが好ましい。例えば、グルコース濃度0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mg/dLのそれぞれにおいて上記計算式または検量線データが用意されており、前記第二の電流値から最も近い検量線を選択し、その検量線における第二の電流値に対する第一の電流値の理論値と実測値の乖離を評価し、その乖離度に基づいて補正係数を算出し、第二の電流値を補正する。なお、上記第二の電流値と第一の電流値の関係を示す計算式または検量線データを用意するグルコース濃度域は上記に限らず、5mg/dL毎や、10mg/dL毎等、任意に設定できる。
の電流値からグルコースの濃度(仮の値)を求めるための演算を行い、その後、グルコースの濃度(仮の値)を第一の電流値で補正してもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の態様に限定はされない。
以下、バイオセンサの実施例について、グルコースセンサを用いて説明する。
グルコースセンサの構造の一例を図1に示す。
グルコースセンサ1は、図1に示されるように、カバー板10、スペーサー11および基板12を有している。
カバー板10には穴部13が設けられており、スペーサー11には穴部13に連通するとともに先端開口部14aが開放した細幅なスリット14が設けられている。カバー板10およびスペーサー11が基板12の上面12aに積層された状態では、スリット14によりキャピラリー15が規定されている。このキャピラリー15は、スリット14の先端開口部14aおよび穴部13を介して外部と連通している。先端開口部14aは試料液導入口15aを構成しており、この試料液導入口15aから供給された試料液は、毛細管現象により穴部13に向けてキャピラリー15内を進行する。
基板12の上面12aには、第1電極16、第2電極17、および試薬層18が設けられている。
第1および第2電極16,17は、全体として基板12の長手方向に延びており、それらの端部16a,17aが基板12の短手方向に延びている。基板12の上面12aは、第1および第2電極16,17の端部16a,16b,17a,17bが露出するようにして絶縁膜19により覆われている。
試薬層18は、第1および第2電極16,17の端部16a,17a間を橋渡すようにして設けられている。この試薬層18は、グルコースデヒドロゲナーゼを含んでいる。
より具体的には、グルコースセンサは以下の方法で作製した。
下地電極材料として、導電性カーボンインク(アサヒ化学研究所製FTUシリーズ)を用い、このインクをスクリーン印刷手法にてポリエチレンテレフタレート基材(東レ製E-22)(長さ50mm、幅5mm、厚み250μm)の一方の表面にパターンニング印刷を行い、2電極パターンを形成した。一方の電極上に銀塩化銀インク(BAS社製)を塗布し、80℃で20分乾燥させ、銀塩化銀電極を形成し、対極とした。
電極上に、シトクロム含有グルコースデヒドロゲナーゼ(CyGDH)、導電性粒子(カーボンブラック:ケッチェンブラックKJB)、導電助剤としての導電性高分子(ポリアニリン)およびバインダー(オキサゾリン基含有水溶性ポリマー)含む酵素試薬を調製し、電
極上に0.04μL滴下し、100℃で30分乾燥することで、酵素試薬層を形成した。酵素試薬の最終濃度は以下の通りである。
<酵素試薬の処方>
・KJB:0.4wt%
・酵素(CyGDH):7mg/mL
・リン酸Na緩衝液:10mM pH7
・バインダー(オキサゾリン基含有水溶性ポリマーEPOCROS WS-700、日本触媒製)5.0%(w/v)
・ポリアニリン(アクアパス、三菱レーヨン製)0.2%(w/v)
下記の方法でキャピラリーを形成した。
前記、酵素試薬層を形成した下地電極に、両面テープおよび親水性フィルムを貼付し、キャピラリーを形成しセンサとした。
以下の方法でグルコース濃度を測定する。
電極系に-0.14Vから-0.2Vへのステップ電圧を5秒間印加し、還元電流を検出した。電圧印加後4秒値をサンプリングし、酵素の還元電流値とした。
(1)の終了後、5秒間の開回路を設け、その後電極系に0.07Vの電圧を15秒間印加し、グルコース濃度に依存する酸化電流を検出した。電圧印加後、10秒値をグルコース濃度を決定するための酸化電流値とした。
複数の製造ロットのセンサに600mg/dLのグルコースを含む全血サンプルを添加し、上記(1)、(2)に従って還元電位、次いで酸化電位を印加し、還元電流および酸化電流の測定を行った。その結果を図2及び図3に示す。なお、図3においては、(1)の自己キャリブレーションの測定結果を省略した図になっている。還元電流値および酸化電流値はセンサごとでばらつきがあることがわかる。
(3-1)センサごとに計測した還元電流値と酸化電流値をプロットし、還元電流値と酸化電流値(10秒値)の相関性を示す検量線を作成する(例えば、図4)。
(3-2)(3-1)であらかじめ作成した還元電流値と酸化電流値の相関性を示す検量線を用い、還元電流の実測値の当該検量線からの乖離度から補正係数を計算する。
(3-3)酸化電流の実測値に(3-2)で計算した補正係数を乗じ、グルコース濃度を決定す
るための酸化電流値(補正後)とし、この値に基づいてグルコース濃度(補正後)を算出する。
すなわち、酸化還元酵素の電子伝達部位である、βサブユニットのヘム由来の還元反応測定により酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる酵素量(酵素活性)を反映する補正係数を算出する。具体的には、ヘムの酸化還元電位よりネガティブな電位でヘムの還元反応電流を測定しセンサ間差を捉える。これにより、酵素と電極材料の結合状態が把握でき、酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる酵素量の把握が可能になる。その後、あらかじめ作成した、自己キャリブレーション検量線からの、自己キャリブレーション結果の乖離を計算することにより、補正係数を計算し、これをグルコースの測定結果に乗じることで、個々のセンサ毎の補正が可能になる。また、本自己キャリブレーションの方法は、酵素の酸化還元電位を既知の方法で把握することで、他の基質の測定にも適応が可能である。
さらに、本補正方法は、センサの製造時における製造ロットの評価にも適応できる。つまり、製造ロット内でサンプリングしたセンサについて自己キャリブレーションを実施することにより、センサについて製造ロット毎の平均補正係数数を算出し、ロット補正係数の一部とすることができる。これにより、センサを用いて測定する毎に自己キャリブレーションを実施せずとも、簡易的な測定値の補正が可能になる。
10・・・カバー板
11・・・スペーサー
12・・・基板
13・・・穴部
14・・・スリット
15・・・キャピラリー
16・・・第1
電極
17・・・第2電極
18・・・試薬層
19・・・絶縁膜
2・・・測定装置
20・・・出力部
21・・・電力供給装置
22・・・制御部
23・・・演算部
24・・・検出部
25・・・表示部ユニット
26・・・バッテリ
3・・・制御コンピュータ
3A・・・ポテンショスタット
3a・・・基板
CR、W・・・端子
4・・・グルコースセンサ
Claims (11)
- 絶縁性基板と、該絶縁性基板上に形成された2以上の電極を含む電極系であって、少なくとも1つの電極が酸化還元酵素を含む電極系、とを含む電気化学測定セル内に測定対象物質を含む試料を導入する工程と、
第一の電圧を電極系に印加する第一の電圧印加工程と、
第二の電圧を電極系に印加する第二の電圧印加工程と、
前記第一の電圧印加工程において、酸化還元反応および電極との電子授受に寄与しうる前記酸化還元酵素の量に依存する第一のシグナルを取得する工程と、
前記第二の電圧印加工程において、前記試料中の測定対象物質の量に依存する第二のシグナルを取得する工程と、
前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中の測定対象物質の濃度を決定する工程を含む、バイオセンサを用いた測定方法。 - 第一の電圧が、前記酸化還元酵素の還元電位以下の電圧であり、
第二の電圧が、前記酸化還元酵素の酸化電位以上の電圧であることを特徴とする、請求項1に記載の測定方法。 - あらかじめ作成された前記第一のシグナルと前記第二のシグナルの検量線を用い、前記第一のシグナルの測定値の、当該検量線からの乖離度から補正係数を算出し、前記第二のシグナルの測定値を前記補正係数で補正し、補正された第二のシグナルの値に基づいて物質濃度を決定することを特徴とする、請求項1または2に記載の測定方法。
- 第二のシグナルが電荷移動律速電流である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の測定方法。
- 酸化還元酵素がピロロキノリンキノンまたはフラビンアデニンジヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の測定方法。
- 酸化還元酵素がヘムを含むサブユニットまたはドメインを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の測定方法。
- 酸化還元酵素がグルコース酸化活性を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の測定方法。
- 酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の測定方法。
- 第一の電圧が−0.1〜−0.2Vであり、第二の電圧が0.05〜0.8Vである、請求項8に記載の測定方法。
- 絶縁性基板と、該絶縁性基板上に形成された2以上の電極を含む電極系であって、少なくとも1つの電極が酸化還元酵素を含む電極系、とを含む電気化学測定セルを含むバイオセンサと、
バイオセンサへの第一の電圧印加および第二の電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの第一及び第二の電圧印加により得られる、第一及び第二のシグナルを検出する、検出部と、
前記前記第一のシグナルにより、前記第二のシグナルを補正し、試料中に含まれる物質の濃度を決定する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。 - 前記物質がグルコースであり、酸化還元酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項10に記載の測定装置。
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