DE60036633T2 - Mutierte Luciferase - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Protein, insbesondere auf mutierte Luciferase-Enzyme, die im Vergleich mit dem entsprechenden Wildtyp-Enzym unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, auf DNA, die diese Proteine codiert, auf die Verwendung dieser Enzyme in Assays sowie auf Testkits, die diese Enzyme enthalten.
  • Leuchtkäfer-Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin in Gegenwart von ATP, Mg2+ und molekularem Sauerstoff mit dem Ergebnis der Erzeugung von Licht. Diese Reaktion hat eine Quantenausbeute von etwa 0,88. Die Eigenschaft der Lichtemission führte zu ihrer Anwendung bei einer Vielzahl luminometrischer Assays, bei denen die ATP-Niveaus gemessen werden. Zu den Beispielen für solche Assays gehören diejenigen, die auf der Beschreibung in EP-B-680515 und WO 96/02665 beruhen, jedoch werden auch zahlreiche andere Assays routinemäßig in Labors verwendet.
  • Luciferase ist direkt aus den Körpern von Insekten erhältlich, insbesondere von Käfern wie Leuchtkäfern oder Glühwürmchen. Zu den Beispielen für spezielle Species, aus denen Luciferasen erhalten wurden, gehören die japanischen Genji- oder Keike-Leuchtkäfer, Luciola cruciata und Luciola lateralis, der osteuropäische Leuchtkäfer Luciola mingrelica, der nordamerikanische Leuchtkäfer Photinus pyralis und das Glühwürmchen Lampyris noctiluca.
  • Da jedoch zahlreiche der Gene, die diese Enzyme codieren, geklont und sequenziert wurden, können sie auch unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechnologie erzeugt werden. Rekombinante DNA-Sequenzen, welche die Enzyme codieren, werden zur Transformierung von Mikroorganismen wie E. coli verwendet, die dann das gewünschte Enzymprodukt exprimieren.
  • Die Farbe des durch diese Enzyme emittierten Lichts, wenn sie in Assays im Labor verwendet werden, ist im Großen und Ganzen ähnlich. Es wäre von Nutzen, wenn die Wellenlänge geändert werden könnte, entweder, um eine leichtere Erfassung durch den speziellen Detektor zu ermöglichen, oder, um in Systemen anwendbar zu sein, in denen mehrere Reporter-Moleküle erforderlich sind, zum Beispiel, um unterschiedliche Ereignisse innerhalb der gleichen Probe zu überwachen. Ein Weg zur Unterscheidung von Reporter-Molekülen besteht darin, Luciferase-Moleküle zu verwenden, die bei unterschiedlichen Wellenlängen Licht emittieren. Dies kann durch Verwendung von Reporter-Molekülen erzielt werden, die Luciferasen umfassen, die von unterschiedlichen Species von Leuchtkäfern oder Glühwürmchen abgeleitet sind. Eine alternative Strategie besteht allerdings darin, unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechnologie mutierte Luciferasen zu erzeugen, um so eine Änderung in der Wellenlänge des Signals zu erzeugen. Beispiele für solche Mutanten sind in WO 95/18853 angegeben.
  • Die Wärmestabilität von Wildtyp-Luciferasen und Luciferasen vom Rekombinationstyp ist allerdings so, dass sie ihre Aktivität sehr rasch verlieren, wenn sie Temperaturen von mehr als etwa 30°C und insbesondere mehr als 35°C ausgesetzt werden. Diese Instabilität verursacht Probleme, wenn das Enzym bei hoher Umgebungstemperatur verwendet oder gelagert wird oder wenn das Assay unter Reaktionsbedingungen mit hoher Temperatur durchgeführt wird, zum Beispiel, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen.
  • Mutierte Luciferasen mit erhöhter Thermostabilität sind aus EP-A-524 448 und WO 95/25798 bekannt. Die erste Druckschrift davon beschreibt eine mutierte Luciferase mit einer Mutation in Position 217 der japanischen Leuchtkäfer-Luciferase, insbesondere durch Ersatz eines Threoninrests durch einen Isoleucinrest. Die zweitgenannte Druckschrift beschreibt mutierte Luciferasen mit einer Ähnlichkeit von mehr als 60% mit Luciferase von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, bei denen jedoch der dem Rest 354 von Photinus pyralis oder dem Rest 356 der Luciola-Species entsprechende Aminosäurerest so mutiert ist, dass er von Glutamat verschieden ist und insbesondere einen anderen Rest als Glutamat, Aspartat, Prolin oder Glycin darstellt.
  • Das gleichzeitig anhängige britische Patent GB 2 345 913 und die davon abgeleitete internationale Patentanmeldung WO 00/24878 beschreiben weitere derartige Mutanten. In diesem Fall sind Proteine beschrieben, die Luciferase-Aktivität besitzen und eine Ähnlichkeit von mindestens 60% mit Wildtyp-Luciferase aufweisen, wie etwa dem Enzym von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, die jedoch Mutationen an verschiedenen Positionen im Protein aufweisen, zu denen, unter anderem, gehören:
    • a) der Aminosäurerest, der dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 216 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entspricht, oder
    • b) der Aminosäurerest, der dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 234 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entspricht, oder
    • c) der Aminosäurerest, der dem Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 297 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entspricht.
  • WO 01/20002 beschreibt die Anwendung der gerichteten Evolution zur Auffindung von mutierten Luciferasen mit mehrfachen Mutationen, die verbesserte Eigenschaften aufweisen.
  • Von den Anmeldern wurde festgestellt, dass durch Mutation (oder Einführung) einer Aminosäure an einer unterschiedlichen Position innerhalb des Luciferase-Proteins große Verschiebungen in der Wellenlänge des emittierten Lichts erzielt werden können und/oder das Enzym verbesserte Thermostabilität aufweist. Darüber hinaus kann der Photonenfluss des emittierten Lichts verbessert werden, wodurch das Enzym für In-vivo-Assays, bei denen die Glühkinetik verhindert ist, oder für In-vitro-Assays besser geeignet wird, bei denen CoA oder andere 'die Glühkinetik induzierende' Verbindungen nicht vorliegen.
  • Die vorliegende Erfindung gibt ein rekombinantes Protein mit Luciferase-Aktivität und einer Ähnlichkeit von mindestens 90% mit einer Wildtyp-Luciferase von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia miyako oder Phrixothrix (Eisenbahnwürmer – vgl. Biochem. 38 (1999) 8271–8279) an, wobei in der Sequenz des Enzyms der Aminosäurerest, der dem Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase so mutiert ist, dass das Luciferase-Enzym befähigt ist, Licht bei einer im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase unterschiedlichen Wellenlänge zu emittieren, und/oder im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase erhöhte Thermostabilität aufweist, und wobei die Ähnlichkeit unter Anwendung eines Alignment-Algorithmus, wie er von Lipman und Pearson definiert wurde (1985, Science 227: 1435–1441), mit den Parametern ktup = 1, Gap-Penalty = 4 und Gap-Länge der Gap-Penalty = 12 bestimmt ist.
  • Biolumineszierende Enzyme von Species, die das Substrat D-Luciferin (4,5-Dihydro-2-[6-hydroxy-2-benzothiazolyl]-4-thiazolcarbonsäure) verwenden können, um Lichtemission zu erzeugen, können die Basis der mutierten Enzyme der Erfindung bilden.
  • Im Einzelnen sind die Luciferasen Enzyme, die aus dem Enzym von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis erhältlich sind. Bei den Enzymen von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis befindet sich der geeignete Aminosäurerest in Position 359 in der Sequenz.
  • Die Sequenzen sämtlicher verschiedenen Luciferasen zeigen, dass sie hoch konservativ sind, wobei ein signifikanter Grad der Ähnlichkeit zwischen ihnen vorliegt. Dies bedeutet, dass entsprechende Bereiche bei den Enzymsequenzen durch Prüfung der Sequenzen zur Ermittlung der am meisten ähnlichen Bereiche leicht zu bestimmen sind. Entsprechende Säuren können unter Bezug auf L. Ye et al., Biochim. Biophys. Acta 1339 (1997) 39–52 leicht bestimmt werden; diese Publikation zeigt die Sequenzen der Enzyme zusammen mit ihrer Nummerierung, wobei dieses Nummerierungssystem in Verbindung mit der vorliegenden Anmeldung zu verwenden ist.
  • Was die mögliche Änderung des dem Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechenden Aminosäurerests betrifft, besitzen die meisten Wildtyp-Sequenzen einen sauren Rest (Asparaginsäure oder Glutaminsäure) in dieser Position. Eine Ausnahme hierzu liegt bei einigen Formen der Luciferase von Photuris pennsylvanica vor, bei welcher der entsprechende Rest (356) der nichtpolare Rest Valin ist, oder bei einigen Formen der Luciferase von Phrixothrix, bei denen die entsprechende Position in PvGR V354 oder in PhRE L355-Leucin ist. Daher ist die als Ersatz der Aminosäure in dieser Position verwendete Aminosäure allgemein von Asparaginsäure, Glutaminsäure, Valin oder Leucin verschieden.
  • In den meisten Fällen wird daher ein saurer Aminsäurerest durch einen nicht-sauren Rest, einschließlich basischer Aminosäuren wie Lysin oder Arginin, nichtpolarer Aminosäuren wie Leucin, Valin oder Isoleucin und ungeladener polarer Aminosäuren wie Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Phenylalanin, Serin, Tryptophan oder Threonin ersetzt. Er kann insbesondere durch eine ungeladene polare Aminosäure wie Tyrosin, Asparagin, Serin oder Threonin ersetzt werden. Besonders bevorzugte Aminosäurereste zur Substitution in dieser Position sind Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan, wobei Tyrosin am meisten bevorzugt ist. Allgemein ausgedrückt führen aromatische Reste in dieser Position zu den größten Verschiebungen und können auch zur Thermostabilität beitragen.
  • Wenn Wildtyp-Sequenzen nicht-saure Aminosäurereste in dieser Position aufweisen, werden sie geeigneterweise zu davon verschiedenen nicht-sauren Resten mutiert.
  • Es wurde festgestellt, dass durch Mutieren des Enzyms in dieser Weise die Wellenlänge des durch die Luciferase emittierten Lichts verschoben wird, in manchen Fällen bis zu 50 nm zum roten Ende des Spektrums hin. Dementsprechend emittiert die D357Y-Mutante von Photinus pyralis-Luciferase Licht bei einer Wellenlänge von etwa 612 nm im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym, das Licht einer Wellenlänge von 562 nm emittiert.
  • Eine Wellenlängenverschiebung von 50 nm besitzt ein beträchtliches Potential zum Einsatz in Assay-Anwendungen, da eine Verschiebung dieser Größe spektral leicht definiert werden kann. Unterschiedlich gefärbte Luciferasen könnten als Reporter-Moleküle bei Untersuchungen zur Gen-Expression angewandt werden, was die gleichzeitige Überwachung mehr als eines Gens ermöglicht, wie zum Beispiel in WO 95/18853 beschrieben ist. Die Bestimmung von mehreren zu analysierenden Substanzen könnte auch mit Luciferase als Markierung durchgeführt werden.
  • Die Tatsache, dass das Licht in diesem Fall eine dunkelrote Farbe besitzt, ist für die Methodologie von Assays besonders günstig. Eine rote Mutante könnte von Nutzen sein, wenn eine Lösung auf ATP analysiert wird, die Pigmente oder andere Verbindungen enthält, die kürzere Lichtwellenlängen absorbieren können. So würde zum Beispiel eine rot gefärbte Lösung rotes Licht nicht absorbieren. Zu den Beispielen für rot gefärbte Lösungen, die häufig Gegenstand solcher Analysen sind, gehören Blutproben oder eine Lösung eines Kulturmediums von eukaryotischen Zellen, das einen rot gefärbten pH-Indikator enthalten kann.
  • Bei der Verwendung eines Gemischs von colorimetrischen Mitteln wie Luciferasen kann die Fähigkeit der Erzeugung eines tiefroten Signals hilfreich sein, insbesondere, wenn ein anderes Mittel in der Probe ein grünes Signal erzeugt. Eine Photomultiplier-Röhre, die bei der Photokathoden-Spektralanalyse verwendet wird, kann so eingestellt werden, dass sie entweder einen oder beide Peaks erfasst, die in einer einzigen Probe erzeugt werden. Anders ausgedrückt ist es möglich, zwischen dem Photonenfluss von einer roten Emissionsquelle und dem von einer grünen Emissionsquelle in der gleichen Probe zu unterscheiden.
  • Es wurde ferner festgestellt, dass die Wellenlängenverschiebung durch das Vorliegen des Cofaktors Coenzym A (CoA) beeinflusst werden kann. Dieses Merkmal führt zu der Möglichkeit, dass dieses Enzym in einem Assay für den Cofaktor verwendet werden könnte.
  • Wie weiter unten beschrieben wird, wurde der Einfluss des Cofaktors Coenzym A auf das In-vitro-Spektrum von emittiertem Licht untersucht. Mit höher werdender Konzentration an Coenzym A ändert sich die spektrale Verteilung, und bei den höchsten Konzentrationen an CoA wird das Spektrum durch Wellenlängen im Bereich von 590–630 nm mit einem ausgeprägten Peak bei 610 nm dominiert.
  • Daher wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Assay zur Bestimmung des Vorliegens von CoA in einer Probe angegeben, wobei das Assay umfasst:
    Zugabe von Luciferase wie oben beschrieben zusammen mit anderen Reagentien, die zur Durchführung einer Luciferase-/Luciferin-Reaktion erforderlich sind, zu einer Probe, von der vermutet wird, dass sie CoA enthält, Messung der Wellenlänge des von der Probe emittierten Lichts und Korrelieren der Messung mit dem Vorliegen oder Nicht-Vorliegen von CoA.
  • Ein solches Assay kann sich bei der Erfassung des Wachstumszustands oder der Aktivität von Zellen eignen, zum Beispiel von Mikroorganismen oder eukaryotischen Zellen.
  • So ist zum Beispiel die Konzentration von CoA in Zellen von E. coli relativ hoch und variiert beträchtlich mit dem Stoffwechselzustand. Die mutierten Enzyme der Erfindung können dazu verwendet werden, den Stoffwechselzustand eines Organismus zu überwachen, insbesondere die Konzentration von CoA in vivo, da die Wellenlänge der Emission von der CoA-Konzentration abhängt. Solche Assays können in Situationen besonders günstig sein, in denen CoA ein wichtiger primärer Metabolit bei der Herstellung von Antibiotika ist (z. B. bei Streptomyceten). Die cellulären CoA-Konzentrationen sind ferner auch ein wichtiger Indikator der Fettsäure-Biosynthese und variieren mit dem Hungerzustand der Zelle. Bei einer Reihe von Stoffwechselerkrankungen wie Carcinogenese und Diabetes treten Anomalien bei den Fettsäuremetaboliten und dementsprechend unübliche CoA-Niveaus auf. Die Assays der Erfindung können bei der Diagnose solcher Zustände Verwendung finden. So können zum Beispiel die CoA-Niveaus an einer Probe aus dem Zellinneren, wie etwa aus einer Blutprobe, von einem Patienten dadurch bestimmt werden, dass die Wellenlänge des von einer Luciferase der Erfindung, die in dem Assay verwendet wird, emittierten Lichts gemessen wird. Dieses Ergebnis kann mit dem Ergebnis verglichen werden, das von einer Probe von gesunden Zellen erhalten wurde, um zu ermitteln, ob sich die Wellenlänge änderte und somit ein geändertes CoA-Niveau vorliegt. Dies kann ein Hinweis für einen Krankheitszustand bei dem Patienten sein. Die Zellen werden vor dem Assay unter Verwendung eines bekannten Lysemittels in geeigneter Weise lysiert.
  • Es wird angenommen, dass der Aminosäurerest in Position 357 entscheidend mit der Bindungsstelle des Coenzyms A assoziiert ist. Bei der Konturierung der Oberfläche des Luciferase-Enzyms (unter Verwendung der SYBL-Proteinmodellierungssoftware, Tripos Ltd.) bis zu einer Auflösung von 1 Angström (Å) wurde eine kleine polare Tasche festgestellt. Diese Tasche scheint durch die Reste H310, E354 und D357 ausgekleidet zu sein und misst 8 bis 10 Å. In der Ansicht von der Oberseite des Moleküls erscheint diese Tasche als Teil einer größeren Tasche, die durch die Reste H310, E354, D357 und I232 ausgekleidet ist. Die Reste H310 und E354 scheinen eine Brücke über dem Einschnitt zu bilden, was zum Aussehen von zwei kleineren Taschen führt (vgl. 8).
  • Ohne durch eine Theorie gebunden zu sein, scheint es möglich, dass die überbrückenden Reste flexibel genug sein können, um sich voneinander zu lösen, wenn sich das Enzym in Lösung befindet, und eine größere Tasche zu bilden (etwa 12 Å tief und etwa 8 Å breit), was eine Bindung von CoA erlaubt. Dies ist mit den Energieberechnungen konsistent.
  • Wenn Zellen von E. coli,, die Mutanten von Leuchtkäfer-Luciferase der Erfindung exprimieren, mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen kultiviert wurden, wurden Änderungen im In-vivo-Spektrum des emittierten Lichts festgestellt. Das Umschalten von einem reichen Medium (LB) zu einem definierten Minimalmedium mit entweder Acetat oder Glucose als einziger Kohlenstoffquelle führte zu Verschiebungen des emittierten Lichts zu längeren Wellenlängen und zu einer Verringerung des Beitrags von kürzeren Wellenlängen. Hierdurch kann sich ein weiteres Mittel zur Kontrolle der Wellenlänge des emittierten Lichts für Assay-Zwecke ergeben.
  • Es wurde festgestellt, dass die Mutation der Position 357 im Protein zu erhöhter Thermostabilität führt.
  • Das Protein kann weitere Mutationen in der Sequenz enthalten, sofern die Luciferase-Aktivität des Proteins nicht zu sehr beeinträchtigt wird. Die Mutationen fördern geeigneterweise die Eigenschaften des Enzyms oder machen es für den angestrebten Zweck in irgendeiner Weise besser geeignet. Dies kann bedeuten, dass sie zu den Eigenschaften erhöhter Thermostabilität und/oder der Farbverschiebung und/oder zu einer Änderung des Wertes Km der Enzyme für ATP führen. Beispiele für Mutationen, die zu Farbverschiebungen führen, sind in WO 95/18853 beschrieben. Mutationen, welche die Km-Werte beeinflussen, sind zum Beispiel in WO 96/22376 und der internationalen Patentanmeldung WO 98/46729 beschrieben.
  • Es wurde festgestellt, dass die Wirkungen von Mutationen allgemein hinsichtlich der Änderungen in den Eigenschaften additiv sind.
  • Die mutierten Luciferasen der Erfindung können andere spezifische Mutationen enthalten, welche die Thermostabilität im Vergleich zur Wildtyp-Luciferase erhöhen. Insbesondere liegt mindestens eine der folgenden Mutationen vor:
    • (a) Der der Aminosäure 354 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest (356 in der Luciferase von Luciola) ist mutiert;
    • (b) der der Position 215 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest (217 in der Luciferase von Luciola) ist eine unterschiedliche hydrophobe Aminosäure, oder
    • (c) der dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 216 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (d) der dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 234 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (e) der dem Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 297 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (f) der der Aminosäure 14 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 16 der Luciferase von Luciola mingrelica oder dem Rest 17 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (g) der der Aminosäure 35 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 37 der Luciferase von Luciola mingrelica oder dem Rest 38 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (h) der dem Aminosäurerest 105 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 106 der Luciferase von Luciola mingrelica, dem Rest 107 der Luciferase von Luciola cruciata oder von Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (i) der dem Aminosäurerest 234 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 236 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (j) der dem Aminosäurerest 420 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 422 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest,
    • (k) der dem Aminosäurerest 310 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Rest 312 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest
    ist von der Aminosäure verschieden, die in der entsprechenden Wildtyp-Sequenz vorliegt,
    und wobei das Luciferase-Enzym im Vergleich zu einem Enzym mit der Aminosäure der entsprechenden Wildtyp-Luciferase an dieser Position erhöhte Thermostabilität besitzt.
  • Daher sind bevorzugte Beispiele für Proteine der Erfindung mutierte Wildtyp-Luciferasen, bei denen mehr als eine Aminosäure, zum Beispiel bis zu 100 Aminosäurereste, bevorzugt nicht mehr als 40 Aminosäuren, und noch bevorzugter bis zu 30 Aminosäuren, von der Aminosäure an der entsprechenden Position im betreffenden Wildtyp-Enzym verschieden sind.
  • Somit umfasst bei einer Ausführungsform das Protein der Erfindung Luciferase von Photinus pyralis, in der, zusätzlich zu der Mutation in Position 357, wie oben beschrieben, mindestens eine der folgenden Mutationen vorliegt:
    • (a) Der der Aminosäure 354 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Glutamat verschieden;
    • (b) der der Position 215 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist eine hydrophobe Aminosäure, die von Alanin verschieden ist;
    • (c) der dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Threonin verschieden;
    • (d) der dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Isoleucin verschieden;
    • (e) der dem Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Phenylalanin verschieden;
    • (f) der der Aminosäure 14 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Phenylalanin verschieden;
    • (g) der der Aminosäure 35 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Leucin verschieden;
    • (h) der dem Aminosäurerest 105 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Alanin verschieden;
    • (i) der dem Aminosäurerest 234 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Asparaginsäure verschieden;
    • (j) der dem Aminosäurerest 420 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Serin verschieden;
    • (k) der dem Aminosäurerest 310 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Histidin verschieden.
  • Alternativ umfasst das Protein der Erfindung das Protein der Luciferase-Sequenz des Enzyms von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, bei dem, zusätzlich zur Mutation in Position 359, wie oben beschrieben, mindestens eine der folgenden Mutationen vorliegt:
    • (a) Der der Aminosäure 356 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist von Glutamat verschieden;
    • (b) der der Position 215 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest ist eine hydrophobe Aminosäure, die von Alanin oder Threonin verschieden ist;
    • (c) der dem Rest 216 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Sequenzen auf der Basis von Glycin (für Sequenzen auf der Basis von Luciola mingrelica) oder Asparagin (für Luciola cruciata oder Luciola lateralis) verschieden;
    • (d) der dem Rest 234 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Serin verschieden;
    • (e) der dem Rest 297 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Leucin verschieden;
    • (f) der der Aminosäure 16 der Luciferase von Luciola mingrelica, Aminosäure 17 von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Phenylalanin verschieden;
    • (g) der dem Rest 37 der Luciferase von Luciola mingrelica oder dem Rest 38 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Lysin verschieden;
    • (h) der dem Aminosäurerest 106 der Luciferase von Luciola mingrelica oder dem Aminosäurerest 107 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Glycin verschieden;
    • (i) der dem Aminosäurerest 236 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Glycin verschieden;
    • (j) der dem Rest 422 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Threonin verschieden;
    • (k) der dem Aminosäurerest 312 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von Sequenzen auf der Basis von Threonin (für Sequenzen auf der Basis von Luciola mingrelica) oder auf der Basis von Valin (für Luciola cruciata oder Luciola lateralis) verschieden.
  • Die speziellen ersetzten Aminosäuren, die zu einer erhöhten Thermostabilität führen, können in jedem Fall nach Routineverfahren ermittelt werden, wie später erläutert wird. In jedem Fall können unterschiedliche Substitutionen zu erhöhter Thermostabilität führen. Die Substitution kann durch gerichtete Mutagenese von DNA vorgenommen werden, die native oder geeignete mutierte Proteine codiert, wie fachkundigen Personen leicht verständlich wird. Die Erfindung ist in diesem Fall mit der Identifizierung der Positionen verknüpft, die mit der Thermostabilität in Verbindung stehen.
  • Es kann jedoch allgemein wünschenswert sein, eine Wildtyp-Aminosäure durch eine Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften zu ersetzen. So können hydrophile Aminosäurereste in manchen Fällen bevorzugt durch hydrophobe Aminosäurereste ersetzt werden und umgekehrt. In ähnlicher Weise können saure Aminosäurereste durch basische Reste ersetzt werden.
  • Das Protein kann beispielsweise ein Protein mit Luciferase-Aktivität und einer Ähnlichkeit von mindestens 60% mit Luciferase-Enzym von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis umfassen, wobei in der Sequenz des Enzyms mindestens eine der folgenden Mutationen vorliegt:
    • (a) der dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 216 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist mutiert und ist im Fall der Luciferase von Photinus pyralis von Threonin verschieden, oder
    • (b) der dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 234 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist mutiert und ist im Fall der Luciferase von Photinus pyralis von Isoleucin verschieden, oder
    • (c) der dem Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 297 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist mutiert und ist zum Beispiel im Fall der Luciferase von Photinus pyralis von Phenylalanin verschieden, und das Luciferase-Enzym besitzt im Vergleich zur Wildtyp-Luciferase erhöhte Thermostabilität.
  • Im Hinblick auf die mögliche Änderung des dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechenden Aminosäurerests wird die polare Aminosäure Threonin günstigerweise durch eine nichtpolare Aminosäure wie Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan oder Cystein ersetzt. Ein besonders bevorzugter Ersatz des Threoninrests, der dem Rest 214 in Photinus pyralis entspricht, ist Alanin. Ein noch bevorzugterer Ersatz ist Cystein. Unterschiedliche polare Reste wie etwa Asparagin können allerdings in dieser Position auch die Thermostabilität des entsprechenden Enzyms erhöhen, das in dieser Position Threonin aufweist. Zu weiteren Aminosäuren, die bei Luciferase-Enzymen vom Wildtyp in dieser Position auftreten, gehören Glycin (Luciola mingrelica, Hotaria parvula), Asparagin (Pyrophorus plagiophthalamus, GR, YG, YE und OR, Luciola cruciata, Luciola lateralis, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia miyako, Photuris pennsylvanica LY, KW, J19) und Serin (Phrixothrix). Diese Aminosäurereste können vorteilhaft durch nichtpolare oder unterschiedliche nichtpolare Seitenketten wie etwa Alanin und Cystein ersetzt werden.
  • Was die mögliche Änderung des dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechenden Aminosäurerests anlangt, wird die nichtpolare Aminosäure Isoleucin günstigerweise durch eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure wie Alanin, Glycin, Valin, Leucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan oder Cystein ersetzt. Zu weiteren Aminosäuren, die bei Wildtyp-Sequenzen in dieser Position vorkommen, gehören Serin und Asparagin. Diese polaren Reste werden günstigerweise durch nichtpolare Reste ersetzt, wie sie oben angegeben wurden. Ein besonders bevorzugter Ersatz für den dem Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 234 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechenden Rest in dieser Gruppe ist Alanin.
  • Änderungen des dem Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 297 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechenden Aminosäurerests können ebenfalls die Thermostabilität des Proteins beeinflussen (dies entspricht Position 292 in der Luciferase von Phrixothrix). Im Allgemeinen ist die Aminosäure in dieser Position eine nichtpolare Aminosäure wie Phenylalanin oder Leucin. Diese Aminosäuren werden günstigerweise durch unterschiedliche nichtpolare Aminosäuren ersetzt. So wird zum Beispiel bei Photinus pyralis die nichtpolare Aminosäure Phenylalanin geeigneterweise durch eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure wie Alanin, Leucin, Glycin, Valin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Tryptophan oder Cystein ersetzt. Ein besonders bevorzugter Ersatz des Phenylalanin-Rests, der dem Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, ist Leucin.
  • Eine Mutation an dem Aminosäurerest, welcher der Aminosäure 14 der Luciferase von Photinus pyralis oder der Aminosäure 16 oder 17 in der Luciferase von Luciola (13 in der Luciferase von Phrixothrix) entspricht, ist ebenfalls möglich. Dieser Aminosäurerest (der üblicherweise Phenylalanin ist, jedoch auch Leucin, Serin, Arginin oder in manchen Fällen auch Tyrosin sein kann) wird günstigerweise durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt, insbesondere eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure, wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin oder Tryptophan, bevorzugt durch Alanin.
  • Eine Mutation an dem Aminosäurerest, welcher der Aminosäure 35 der Luciferase von Photinus pyralis oder dem Aminosäurerest 37 in der Luciferase von Luciola mingrelica (38 bei anderen Luciola spp.) entspricht, kann ebenfalls wirksam sein. Diese Aminosäure variiert bei den Wildtyp-Enzymen; sie kann in dieser Position Leucin (Photinus pyralis) umfassen, jedoch auch Lysin, Histidin, Glycin, Alanin, Glutamin und Asparaginsäure. Der Aminosäurerest in dieser Position wird günstigerweise durch einen nichtpolaren Aminosäurerest oder eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure wie Alanin, Valin, Phenylalanin, Isoleucin, Prolin, Methionin oder Tryptophan ersetzt. Eine bevorzugte Aminosäure in dieser Position ist Alanin, wo es sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet.
  • Mutationen an der Aminosäure, die Position 14 der Sequenz von Photinus pyralis entspricht, und/oder eine Mutation an dem Aminosäurerest, welcher der Aminosäure 35 der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, stellen vorzugsweise nicht die einzigen Mutationen in dem Enzym dar. Sie sind günstigerweise von anderen Mutationen begleitet, wie sie oben definiert wurden, insbesondere Mutationen an den Positionen, die den Positionen 214, 395 oder 232 der Luciferase von Photinus pyralis entsprechen.
  • Änderungen des Aminosäurerests, der dem Rest 105 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 106 der Luciferase von Luciola mingrelica oder dem Rest 107 von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entspricht (102 bei Phrixothrix), können ebenfalls von Einfluss auf die Thermostabilität des Proteins sein. Allgemein ist die Aminosäure an dieser Position eine nichtpolare Aminosäure wie Alanin oder Glycin oder Serin bei Phrixothrix. Diese Aminosäuren werden günstigerweise gegen unterschiedliche nichtpolare Aminosäuren ausgetauscht. So wird beispielsweise bei Photinus pyralis die nichtpolare Aminosäure Alanin geeigneterweise durch eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure ersetzt, wie etwa durch Phenylalanin, Leucin, Glycin, Valin, Isoleucin, Prolin, Methionin oder Tryptophan. Ein besonders bevorzugter Ersatz des dem Rest 105 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechenden Alaninrests ist Valin.
  • Änderungen des Aminosäurerests, der dem Rest 234 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 236 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis (231 bei Phrixothrix) entspricht, können die Thermostabilität des Proteins ebenfalls beeinflussen. Die Aminosäure in dieser Position ist allgemein Asparaginsäure oder Glycin und in manchen Fällen Glutamin oder Threonin. Diese Aminosäuren werden günstigerweise durch nichtpolare oder unterschiedliche nichtpolare Aminosäuren ersetzt, soweit erforderlich. So wird beispielsweise der Aminosäurerest Asparaginsäure bei Photinus pyralis günstigerweise durch eine nichtpolare Aminosäure wie Alanin, Leucin, Glycin, Valin, Isoleucin, Prolin, Methionin oder Tryptophan ersetzt. Ein besonders bevorzugter Ersatz des dem Rest 234 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechenden Phenylalanin-Rests ist Glycin. Wenn in dieser Position ein nichtpolarer Aminosäurerest wie Glycin vorliegt (zum Beispiel in der Luciferase von Luciola), kann er durch eine unterschiedliche nichtpolare Aminosäure ersetzt werden.
  • Änderungen des Aminosäurerests, der dem Rest 420 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 422 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis (417 bei Phrixothrix grün und 418 bei Phrixothrix rot) entspricht, kann ebenfalls von Einfluss auf die Thermostabilität des Proteins sein. Die Aminosäure in dieser Position ist allgemein die ungeladene polare Aminosäure Serin oder Threonin oder Glycin. Diese Aminsäuren werden günstigerweise durch unterschiedliche nicht-geladene polare Aminosäuren ersetzt. So kann zum Beispiel das Serin bei Photinus pyralis durch Asparagin, Glutamin, Threonin oder Tyrosin ersetzt werden, insbesondere durch Threonin.
  • Änderungen des Aminosäurerests, der dem Rest 310 in der Luciferase von Photinus pyralis und dem Rest 312 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entspricht, können ebenfalls die Thermostabilität des Proteins beeinflussen. Der Aminosäurerest in dieser Position variiert bei den bekannten Luciferase-Proteinen und ist Histidin in der Luciferase von Photinus pyralis, Pyrocoelia miyako, Lampyris noctiluca und einigen Formen von Photuris pennsylvanica, Threonin in der Luciferase von Luciola mingrelica, Hotaria parvula und Phrixothrix (wo es sich um die Aminosäure 307 handelt), Valin in der Luciferase von Luciola cruciata und Luciola lateralis und Asparagin bei einigen Luciferasen von Pyrophorus plagiophthalamus. Dementsprechend ist die Aminosäure in dieser Position allgemein eine hydrophile Aminosäure, die gegen einen davon verschiedenen Aminosäurerest ausgetauscht werden kann, der die Thermostabilität des Enzyms erhöht. Ein besonders bevorzugter Ersatz für den Histidin-Rest, der dem Rest 310 in der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, ist Arginin.
  • Andere Mutationen können ebenfalls im Enzym vorliegen. So ist beispielsweise bei einer bevorzugten Ausführungsform in dem Protein auch die Aminosäure in einer Position, die der Aminosäure 354 der Luciferase von Photinus pyralis (356 in der Luciferase von Luciola) entspricht, von Glutamat geändert, insbesondere in eine Aminosäure, die von Glycin, Prolin oder Asparaginsäure verschieden ist. Die Aminosäure in dieser Position ist günstigerweise Tryptophan, Valin, Leucin, Isoleucin oder Asparagin, jedoch handelt es sich hierbei bevorzugt um Lysin oder Arginin. Diese Mutation ist in WO 95/25798 beschrieben. Es wurde festgestellt, dass hydrophobe Reste in dieser Position die Wellenlängenverschiebung des Enzyms erhöhen. Das Vorliegen einer großen hydrophoben (V oder I), polaren (N) oder positiv geladenen (K oder R) Aminosäure in Position 354 erhöht die Thermostabilität.
  • Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist in dem Protein auch die Aminosäure in der Position, die der Aminosäure 217 in der Luciferase von Luciola (215 bei Photinus pyralis) entspricht, in eine hydrophobe Aminosäure geändert, insbesondere in Isoleucin, Leucin oder Valin, wie in EP-A-0 524 448 beschrieben ist.
  • Die Proteine der Erfindung sind rekombinante Luciferase-Enzyme. Sie können eine Ähnlichkeit von mindestens 90% mit Wildtyp-Sequenzen wie etwa denen der Enzyme von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis in dem Sinne aufweisen, dass mindestens 90% der in den Wildtyp-Enzymen vorliegenden Aminosäuren in den Proteinen der Erfindung vorliegen. Zu ähnlichen Proteinen dieses Typs gehören Allelvarianten, Proteine von anderen Insektenspecies sowie nach Rekombinationsverfahren erzeugte Enzyme. Sie können dadurch leicht identifiziert werden, dass sie durch Nucleinsäuren codiert werden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Sequenzen hybridisieren, die Wildtyp-Enzyme codieren. Solche Bedingungen sind Fachleuten dieses Gebiets geläufig und sind zum Beispiel veranschaulicht in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Allgemein ausgedrückt können Bedingungen mit geringer Stringenz definiert werden als 3×SSC bei etwa Umgebungstemperatur bis etwa 65°C, und Bedingungen hoher Stringenz können definiert werden als 0,1×SSC bei etwa 65°C. SSC ist die Bezeichnung eines Puffers mit 0,15 M NaCl und 0,015 M Trinatriumcitrat. 3×SSC bedeutet die dreifache Stärke wie SSC, usw.
  • Die Ähnlichkeit einer speziellen Sequenz mit den Sequenzen der Erfindung kann insbesondere durch Anwendung des Mehrfach-Alignment-Verfahrens bestimmt werden, das von Lipman und Pearson beschrieben wurde (Lipman, D. J., und Pearson, W. R. (1985) Rapid and Sensitive Protein Similarity Searches, Science, Band 227, Seiten 1435–1441). Die "optimierte" prozentuale Bewertung sollte mit den folgenden Parametern für den Lipman-Pearson-Algorithmus berechnet werden: ktup = 1, Gap-Penalty = 4 und Gap-Länge der Gap-Penalty = 12. Die Sequenzen, für welche die Ähnlichkeit zu bestimmen ist, sollten als "Testsequenz" verwendet werden, was bedeutet, dass die Grundsequenz für den Vergleich, wie etwa die Sequenz von Photinus pyralis oder irgendeine der anderen Sequenzen, die in Ye et al., supra, verzeichnet sind, zuerst in den Algorithmus eingegeben werden sollten.
  • Spezielle Beispiele für Proteine der Erfindung sind die Sequenz der Wildtyp-Luciferase mit einer oder mehreren Mutationen, wie oben ausgeführt.
  • Die Erfindung gibt ferner Nucleinsäuren an, welche die Luciferasen codieren, wie sie oben beschrieben wurden. Die Nucleinsäuren beruhen günstigerweise auf Wildtyp-Sequenzen, die auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Die geeignete Mutation zur Erzielung der angestrebten Mutation in der Aminosäuresequenz ist auf der Basis der Kenntnis des genetischen Codes leicht ersichtlich.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nucleinsäure ein synthetisches Gen. Das synthetische Gen wird günstigerweise so konstruiert, dass Codons, die bei hochexprimierten Genen von üblichen Expressionswirten wie E. coli selten auftreten, entfernt werden und gleichzeitig die Einführung von Codons, die bei Käfer-Luciferasen codierenden Genen selten auftreten, vermieden wird. Dieser Ansatz stellt sicher, dass das neue Gen eine Codon-Nutzung aufweist, die sowohl für das Expressionssystem von E. coli als auch das Expressionssystem des Insekts optimal ist.
  • So wurden zum Beispiel, wo es möglich war, die Codons für die Aminosäuren Arg, Leu, Ile, Gly und Pro in CGT oder CGC (Arg), CTG, CTT oder CTC (Leu), ATC oder ATT (Ile), GGT oder GGC (Gly) und CCG, CCA oder CCT (Pro) geändert, wodurch seltene Codons eliminiert wurden. Im Fall des synthetischen Gens, das später (SEQ ID NO 1) und in 14 erläutert ist, führte dies zu insgesamt 139 schweigenden Mutationen, die 62 neue, nicht-seltene Codons erzeugten (11% der Gesamtanzahl). Die in 14 dargestellten ersten 8 Nucleotide bilden einen Teil der Ribosomen-Bindungsstelle und codieren entsprechend nicht. Die codierende Sequenz beginnt mit dem Methionin-Rest, der mit einem nach oben gerichteten Pfeil bezeichnet ist. Diese codierende Sequenz und ähnliche Sequenzen mit naher Ähnlichkeit, z. B. Sequenzen, die eine Ähnlichkeit von mindestens 90% oder bevorzugt mindestens 95% aufweisen, bilden einen bevorzugten Aspekt der Erfindung.
  • Ein weiteres günstiges Merkmal, das bei der Erzeugung eines synthetischen Konstrukts angewandt werden kann, ist das Einbringen von neuen, nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen. Diese Stellen machen die Mutagenese, insbesondere die kombinatorische Kassetten-Mutagenese, des Gens einfacher und wirksamer. Es kann insbesondere günstig sein, nur einmal vorkommende Restriktionsstellen innerhalb der cDNA zu erzeugen, welche die Subdomäne B im Enzym codiert. Die zusätzliche Erzeugung einer nur einmal vorkommenden Restriktionsstelle am äußersten 3'-Ende des Gens zur Ermöglichung einfacher Fusionierungen und/oder die Entfernung der Peroxysom-Zielsequenz kann von Vorteil sein.
  • In dem nachstehend erläuterten Beispiel wurden neun neue, nur einmal vorkommende Restriktionsstellen eingebaut, zumeist im mittleren Drittel des Gens, und eine nur einmal vorkommende Hind III-Restriktionsstelle wurde am äußeren 3'-Ende des Gens erzeugt, um einfache C-terminale Fusionierungen zu erlauben (12).
  • Die Verwendung eines synthetischen Gens erlaubt schließlich die Einführung von Mutationen, um die Thermostabilität des Genprodukts zu erhöhen oder die Eigenschaften des Produkts nach Wunsch anderweitig zu modifizieren. So wurden zum Beispiel in dem nachstehend erläuterten Beispiel drei nicht-schweigende Mutationen gentechnisch erzeugt, um die Aminosäureänderungen T214C, E354K und D357F in das Polypeptid einzuführen, durch welche die Thermostabilität erhöht wird.
  • Die Nucleinsäuren der Erfindung werden günstigerweise in einen Expressionsvektor wie etwa ein Plasmid unter der Kontrolle von Kontrollelementen wie Promotoren, Enhancern, Terminatoren, etc., eingebracht. Diese Vektoren können dann zur Transformierung einer Wirtszelle, z. B. einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, wie etwa einer Pflanzenzelle oder einer Tierzelle, aber insbesondere einer prokaryotischen Zelle wie etwa E. coli, herangezogen werden, sodass die Zelle das gewünschte Luciferase-Enzym exprimiert. Die Kultivierung der so transformierten Zellen unter Anwendung von Bedingungen, die auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, führt zur Erzeugung des Luciferase-Enzyms, das dann aus dem Kulturmedium abgetrennt werden kann. Wenn es sich bei den Zellen um Pflanzenzellen oder tierische Zellen handelt, können Pflanzen oder Tiere aus diesen Zellen vermehrt werden. Das Protein kann dann aus den Pflanzen gewonnen werden, oder, im Fall von transgenen Tieren, können die Proteine aus der Milch gewonnen werden. Vektoren, transformierte Zellen, transgene Pflanzen und Tiere sowie Verfahren zur Herstellung von Enzymen durch Kultivierung dieser Zellen bilden sämtlich weitere Aspekte der Erfindung.
  • Die D357Y-mutierte Luciferase von Photinus pyralis wurde durch statistische Mutagenese erzeugt, wie später beschrieben wird. Es wurde festgestellt, dass die Einpunkt-Mutation D357Y eine große Farbverschiebung in der Wellenlänge des emittierten Lichts erzeugt und die Luciferase ferner eine höhere Thermostabilität besitzt als die Wildtyp-Luciferase. Weitere Untersuchungen ergaben, dass ein Bereich von Substitutionen an dieser Position zu einer guten Thermostabilität und/oder großen Farbverschiebungen führt.
  • Zu den speziellen Beispielen für mutierte Enzyme von Photinus pyralis, die in den Rahmen der Erfindung fallen, gehören folgende Mutanten:
    D357Y
    D357F
    D357W
    D357K
    D357N
    D357I
    E354I/D357Y
    E354V/D357Y
    E354C/D357Y
    E354R/D357Y
    E354S/D357Y
    E354N/D357Y
    E354K/D357M
    E354R/D357L
    E354W/D357W
    E354H/D357W
    E354R/D357F
    E354K/D357F
    E354S/D357F
    E354M/D357F
    E354A/D357R
    E354A/D357F
    E354T/D357Y
    E354A/D357N
    I351M/E354R/D357V
    E354S/D357V
    E354R/D357W
    E354R/D357M
    E354R/D357S
    E354N/D357S
    oder Äquivalente dieser Mutanten, wenn sie von Luciferasen anderer Species abgeleitet sind.
  • Die Mutationen zur Erzeugung der obigen Mutanten wurden durch gerichtete Mutagenese (PCR) oder kombinatorische Kassetten-Mutagenese in das Luciferase-Gen auf dem Plasmid pET23 eingeführt. Die zur PCR-Reaktion hinzugefügten Oligonucleotide zur Erzielung der relevanten Mutationen sind weiter unten angegeben.
  • Es war bereits früher berichtet worden, dass die Wirkungen von Punktmutationen an den Positionen 354 und 215 additiv sind. Die vorliegende Erfindung eröffnet die Möglichkeit der Kombination von drei oder mehr solcher Mutationen zur Erzielung hoher Thermostabilität in einem mutierten Enzym, das eine große Farbverschiebung aufweist.
  • Luciferase-Proteine der Erfindung lassen sich vorteilhaft bei beliebigen Biolumineszenz-Assays einsetzen, bei denen die Luciferase/Luciferin-Reaktion als Signalmittel ausgenutzt wird. In der Literatur sind zahlreiche derartige Assays bekannt. Die Proteine können daher in Kits eingebracht werden, die im Hinblick auf die Durchführung solcher Assays hergestellt werden, wahlweise mit Luciferin und beliebigen anderen Reagentien, die zur Durchführung des speziellen Assays erforderlich sind.
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezug auf die beigefügten schematischen Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
  • 1 ein logarithmisches Diagramm, das die prozentuale Restaktivität in Abhängigkeit von der Zeit der Inkubation bei 45°C für verschiedene Enzym-Mutanten gemäß der Erfindung zeigt;
  • 2 Spektralpeaks, die durch Inkubieren von E. coli-Zellen, die Luciferase-Enzyme exprimieren, in einem Citratpuffer mit D-Luciferin erhalten wurden, wobei das verwendete Enzym ist: (a) rekombinante Wildtyp-Luciferase von Photinus pyralis, (b) eine D357K-Mutante, (c) eine D357N-Mutante, (d) eine D357W-Mutante, (e) eine D357I-Mutante, (f) eine D357F-Mutante, (g) eine D357Y-Mutante und (h) eine Doppelmutante E354I + 357Y;
  • 3 ein Diagramm, das die prozentuale Restaktivität in Abhängigkeit von der Zeit für drei Enzym-Mutanten, E354I, D357Y und die Doppelmutante (DM) E354I + D357Y, zeigt;
  • 4 die Emissionsspektren (a) des rekombinanten Wildtyp-Enzyms und (b) der Doppelmutante (DM) E354I + D357Y;
  • 5 ein Diagramm, das den Abfall der Rate der Photonenemission von rekombinantem Wildtyp-Enzym (♦) rWT und einer Enzym-Mutante D357K (∎) zeigt;
  • 6 ein Bild einer Molekülmodellierung, das eine potentielle CoA-Bindungstasche innerhalb des Luciferase-Enzyms veranschaulicht;
  • 7 In-vivo-Biolumineszenzspektren, die von E. coli-Zellen emittiert werden, welche die Mutante D357Y der Luciferase von P. pyralis exprimieren (a) bei Kultivierung auf LB; (b) bei Kultivierung auf Minimalmedium mit Natriumacetat; (c) bei Kultivierung auf Minimalmedium mit Glucose;
  • 8 In-vivo-Biolumineszenzspektren, die von E. coli-Zellen emittiert werden, welche die Mutante E354K + D357M der Luciferase von P. pyralis exprimieren, (a) bei Kultivierung auf LB; (b) bei Kultivierung auf Minimalmedium mit Natriumacetat; (c) bei Kultivierung auf Minimalmedium mit Glucose;
  • 9 ein Diagramm, das die Wirkung von CoA auf die spektrale Verteilung von Licht zeigt, das von der Mutante D357Y der Luciferase von P. pyralis emittiert wird;
  • 10 ein Diagramm, das normierte Daten der Wirkung von CoA auf die spektrale Verteilung des Lichts zeigt, das von der Mutante D357Y der Luciferase von P. pyralis emittiert wird;
  • 11 ein Diagramm, das die Wirkung von CoA auf die spektrale Verteilung des Lichts zeigt, das von der Mutante E354I/D357Y der Luciferase von P. pyralis emittiert wird (11a)) und normierte Daten zeigt (11b));
  • 12 eine Veranschaulichung der Modifizierungen der Restriktionsstellen, die beim Aufbau eines synthetischen Luciferase-Gens verwendet wurden;
  • 13 eine Erläuterung von Konstrukten, die bei der Synthese eines Luciferase-Gens verwendet wurden;
  • 14 die cDNA-Sequenz (SEQ ID NO 1) des synthetischen Luciferase-Gens (einschließlich der Nucleotide 1–8, die einen Teil der Ribosom-Bindungsstelle bilden, jedoch nicht-codierend sind) und die codierte Aminosäuresequenz, die bei dem Methioninrest beginnt, der mit dem nach oben zeigenden Pfeil markiert ist (SEQ ID NO 2),
    und
  • 15 ein Diagramm zur Erläuterung der Thermostabilität von Mutanten einschließlich der Mutante, die durch das synthetische Gen codiert wird, bei 50°C.
  • Beispiel 1
  • Identifizierung und Charakterisierung einer Luciferase-Mutante
  • Es wurden zwei Bibliotheken von Luciferase des Leuchtkäfers (Photinus pyralis) hergestellt, die unter Anwendung der PCR mit bewusstem Fehlereinbau (M. Fromant et al., Anal. Biochem. (1995) 224, 347–353) erzeugt worden waren. Eine Bibliothek bestand aus Produkten der PCR mit bewusstem Fehlereinbau des Volllängengens luc, die in das T7-Expressionssystem pET23a kloniert worden waren (Novagen Inc., Madison, WI, USA). Eine zweite Bibliothek bestand aus PCR-Produkten mit bewußtem Fehlereinbau eines kurzen Abschnitts des luc-Gens, der die Aminosäuren 199–352 abdeckte und in den Vektor pBSK(+) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) kloniert worden war.
  • Die pET23a-Bibliothek wurde in dem E. coli-Stamm BL21 (DE3) (E. coli B F dem ompT hsdS (rB –mB –) galλ (DE3)) exprimiert.
  • Die pBSK(+)-Bibliothek wurde in E. coli-Zellen HB101 (supE44 ara14 galK2 lacY1 Δ(gpt-proλ) 62 rpsL20 (Strr) xyl-5 mtl-1 recA13 Δ(mrcC-mrr) HsdS– (r–m–)) exprimiert. pET23a und pBSK(+) tragen beide das Gen für β-Lactamase und verleihen den E. coli-Zellen, in denen das Plasmid vorliegt, Ampicillin-Resistenz.
  • Ein E. coli-Stamm wurde mit der erzeugten Bibliothek durch Elektroporation unter Verwendung eines E. coli-Pulsers von BIORAD transformiert und über Nacht bei 37°C auf LB-Agar kultiviert, der Ampicillin in einer Konzentration von 50 μg/ml enthielt. Die Zellen wurden auf Nylonmembranen (Osmonics, Minnetonka, Minnesota, USA) übertragen und mit Luciferin-Lösung (500 μM D-Luciferin, Kaliumsalz, in 100 mM Natriumcitratpuffer, pH 5,0) besprüht. Die Kolonien wurden unter Verwendung eines AlphaImagerTM 1200-Dokumentations- und Analysensystems (Flowgen, Lichfield, Staffordshire, UK) optisch untersucht. Dieses System integrierte die während einer spezifizierten Zeitperiode emittierte Biolumineszenz und erzeugte ein Bild des von den Kolonien emittierten Lichts. Die Helligkeit der Lumineszenz wurde als Hinweis auf die Thermostabilität der Luciferase herangezogen.
  • Die Kolonien wurden dann hinsichtlich der Thermostabilität einer Durchmusterung unterzogen. Die Kolonien wurden auf der Basis der Helligkeit des emittierten Lichts selektiert und zur weiteren Charakterisierung isoliert. Bei einigen Durchmusterungen wurden die E. coli-Kolonien vor der Durchführung der Durchmusterung 2 Stunden bei 42°C inkubiert, sodass die thermostabilen Mutanten selektiert werden konnten. Kolonien, die aus der primären Durchmusterung isoliert worden waren, wurden auf Nylonmembranen aufgebracht und ebenfalls über Nacht in LB-Medium, das Ampicillin enthielt, kultiviert. Die Flecken wurden mit Luciferin-Lösung besprüht und im AlphaImagerTM sichtbar gemacht. Diese sekundäre Durchmusterung trug dazu bei, Klone zur In-vitro-Analyse der Luciferase-Aktivität positiv zu identifizieren. E. coli-Klone, die Enzyme mit möglicher Thermostabilität exprimierten, wurden in vitro auf ihre Luciferase-Aktivität und Thermostabilität getestet. In-vitro-Assays hinsichtlich der Luciferase-Aktivität wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung des Promega-Luciferase-Assay-Systems (Promega Corporation, Madison, WI, USA) durchgeführt.
  • Die Luciferase-Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl rohem Zellextrakt zu 100 μl Promega-Luciferase-Assay-Cocktail (Verdünnung 1 zu 2) initiiert. Die resultierende Biolumineszenz wurde mit einem Biotrace M3-Luminometer gemessen.
  • Rohe Zellextrakte wurden hergestellt, wie in dem Technischen Bulletin Nr. 101 der Fa. Promega beschrieben ist. Aliquote von E. coli-Übernachtkulturen wurden in Zellkultur-Lysereagens (25 mM Trisphosphat pH 7,8, 2 mM Dithiothreit (DTT), 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X-100, 1,25 mg/ml hen-Lysozym) 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Das rohe Lysat wurde dann vor dem Test auf Eis aufbewahrt.
  • Die Eigenschaften der Enzyme wurden ferner in Untersuchungen zur zeitabhängigen Inaktivierung getestet. Eppendorf-Röhrchen, die 50 μl-Aliquote des rohen Zellextrakts enthielten, wurden bei einer gegebenen Temperatur in einem Wasserbad inkubiert. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden die Röhrchen entnommen und vor dem Test auf Eis gekühlt. Die Luciferase-Restaktivität wurde als Prozentsatz der ursprünglichen Aktivität ausgedrückt.
  • Logarithmische Diagramme der Abhängigkeit der prozentualen Restaktivität von der Inkubationszeit wurden aufgetragen und zur Berechnung der t½-Werte herangezogen. t½ ist die Zeit, in der das Enzym nach Inkubation bei einer gegebenen Temperatur 50% seiner ursprünglichen Aktivität verloren hat. t½-Werte (Zeit für die Verringerung der Aktivität auf 50% der ursprünglichen Aktivität) wurden bei 37°C in rohen Extrakten aus logarithmischen Diagrammen der prozentualen Restaktivität in Abhängigkeit von der Zeit (nicht dargestellt) ermittelt.
  • Plasmid-DNA aus E. coli-Klonen, welche nach Bestimmung wie oben die am meisten thermostabile Luciferase exprimierten, wurde sequenziert, um die Mutationen zu ermitteln, die für die Thermostabilität des Enzyms verantwortlich sind.
  • Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAGEN QIAprep Spin Miniprep-Kits (QIAGEN Ltd., Crawley, W. Sussex, UK) hergestellt, wobei nach dem Protokoll zur Verwendung einer Mikrozentrifuge (QIAprep Miniprep Handbook 04/98) verfahren wurde.
  • Sämtliche DNA-Sequenzierungen wurden von Babraham Technix, Cambridge, UK, mit einem ABI PRISMTM 377 DNA-Sequenzer und dem ABI PRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction-Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems) durchgeführt, der auf dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463–5467) beruht.
  • Als ein Ergebnis dieser Arbeiten wurde die neue Mutante D357Y identifiziert.
  • Die Kristallstruktur der Luciferase (E. Conti et al., Structure, 4 (1996) 287–298) zeigt, dass sich die Position 357 auf der Oberfläche des Proteins und nahe an der Position 354 befindet, die sowohl die Thermostabilität als auch die Spektraleigenschaften zu beeinflussen vermag. Dies deutet darauf hin, dass dieser Bereich hinsichtlich der Thermostabilität des Enzyms von Bedeutung sein könnte.
  • D357Y ist eine besonders thermostabile Mutante und stellt die thermostabilste Luciferase dar, die nur eine einzige Aminosäureänderung aufweist.
  • Beispiel 2
  • Gerichtete Mutagenese zur Erzeugung anderer 357-Mutanten
  • Zur Bewertung unterschiedlicher Mutationen in der Position 357 wurde eine gerichtete Mutagenese durchgeführt, wobei der Stratagene QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis-Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) verwendet wurde. Das Plasmid pPW601a J54 (PJW, MoD Report, 3/96) wurde bei allen gerichteten Mutagenesen eingesetzt. Sämtliche Produkte der Mutagenese-Reaktionen wurden in den E. coli-Stamm XL1-Blue (e14–(mcrA–) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F' proAB laclqZΔM15 Tn 10 (Tetr) Amy Camr]) transformiert.
  • Oligonucleotid-Primer wurden von Sigma-Genosys Ltd., Cambridge, UK, synthetisiert und wurden unter Verwendung eines intelligenten Dotiersystems konstruiert (A. R. Arkin et al., Biotechnology (1992) 10, 297–300, W. Huang et al., Anal. Biochem. 218, 454–457), das dazu verwendet wurde, degenerierte Oligonucleotid-Primer zu konstruieren, um Gruppen von möglichen Mutationen zu erzeugen, statt individuelle Primer für jeden Aminosäureersatz zu verwenden.
  • Auf diese Weise wurden Bibliotheken von Luciferase-Mutanten mit ersetzten Aminosäuren erzeugt.
  • Es wurden die nachstehenden Oligonucleotide (und ihre komplementären Partner) verwendet:
    Figure 00370001
  • Die Bibliotheken der Mutanten wurden wie oben hinsichtlich ihrer Thermostabilität durchgemustert. Die Anzahl der zu durchmusternden Kolonien wurde unter Verwendung der Gleichung (S. Climie et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18776–18779) N = [1n(1 – P)]/[1n((n – 1)/n)]berechnet, worin bedeuten:
    • N
    die Anzahl der durchzumusternden Kolonien,
    n
    die Anzahl der möglichen Codons in der Zielposition und
    P
    die Wahrscheinlichkeit, dass jedes Codon im Gemisch mindestens einmal zur Durchmusterung gewählt wird.
  • Die Berechnung war auf P = 0,95 bezogen. Die durch gerichtete Mutagenese erhaltenen Mutanten wurden auf ihre Luciferase-Aktivität getestet und in Untersuchungen zur zeitabhängigen thermischen Inaktivierung charakterisiert.
  • Mutanten, die auf diese Weise als günstig identifiziert worden waren, wurden in 400 ml LB-Medium, das Ampicillin enthielt, bis zu A260 ≈ 0,5 kultiviert. Die Luciferase-Expression wurde dann durch Zugabe von Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die Zellen wurden darauf bei 30°C unter Schütteln 3 Stunden inkubiert, wonach sie durch Zentrifugieren gewonnen wurden. Das resultierende Zell-Pellet wurde in 10 ml B-PERTM Protein Extraction-Reagens (Pierce Chemical Company, Rockford, USA), 1 mM DTT unter Erhalt eines rohen Extrakts resuspendiert, wobei nach dem B-PERTM-Protokoll zur Maxi-Scale-Extraktion des Bakterienproteins verfahren wurde. Zu der B-PERTM-Lösung wurde zur Inhibierung endogener Proteasen rekonstituierter Sigma Protease Inhibitor Cocktail (Produkt Nr. P8465, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) in einer Menge von 500 μl zugegeben. Das Zell-Lysat wurde dann 30 Minuten bei 30000 g zentrifugiert.
  • Der Überstand des rohen Extrakts wurde einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat unterzogen. Die Fraktion, die zwischen 30 und 55% Sättigung gefällt wurde, enthielt Luciferase-Aktivität. Dieses Material wurde in 0,5 ml Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT resuspendiert und für Untersuchungen der thermischen Inaktivierung und für spektrale Untersuchungen verwendet.
  • Die Ersetzungen D357L, T, V, W, R, I, S, K, N und F wurden eingeführt. Diese Mutanten wurden in Untersuchungen der rohen Extrakte zur thermischen Inaktivierung in vitro charakterisiert.
  • Die partiell gereinigten Extrakte wurden 1 zu 11 in folgendem Thermoinaktivierungspuffer verdünnt: 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,8, der 10% gesättigtes Ammoniumsulfat, 1 mM Dithiothreit und 0,2% BSA enthielt.
  • 110 μl-Aliquote der Proteinlösung wurden bei 40°C oder 45°C während festgelegter Zeitperioden inkubiert und vor dem Test auf Eis gekühlt. Dann wurde die Luciferase-Aktivität gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde, wobei Promega-Luciferase-Assay-Reagens (1 zu 2 verdünnt) verwendet wurde.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 sowie in 1 dargestellt. Die t½-Werte wurden an den rohen Extrakten bei 40°C (Tabelle 2) und bei 45°C (Tabelle 3) bestimmt.
  • Figure 00400001
  • Sämtliche Substitionen zeigten im Vergleich mit rekombinantem Wildtyp erhöhte Thermostabilität.
  • Beispiel 3
  • Änderungen in der Wellenlänge des emittierten Lichts
  • Es wurde ferner festgestellt, dass Aminosäureersetzungen in Position 357 die In-vivo-Spektren des vom Enzym emittierten Lichts beeinflussen. Ein Aliquot (250 μl) der E. coli-Zellkulturen wie in Beispiel 2 beschrieben wurde über Nacht bei 37°C kultiviert und dann in einer Mikrozentrifuge herunterzentrifugiert; der Überstand wurde entfernt. Zellen, die verschiedene Luciferase-Mutanten exprimierten, wurden in einem Citratpuffer (pH 5,0), der 150 μl D-Luciferin enthielt, inkubiert, und das von der In-vivo-Reaktion emittierte Licht wurde durch Messung der Emissionsspektren mit einem SPECTRAmax® Microplate-Spectrofluorometer (Molecular Devices Corp., Kalifornien, USA) gemessen. Starke Änderungen im Spektralpeak wie auch in der Verteilung der Wellenlängen wurden für die Mutanten 3357Y, F und I (2(a)–(g)) festgestellt. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefasst.
  • Zusätzlich wurde die In-vivo-Lumineszenz der Mutanten in einem dunklen Raum visuell geprüft. Die D357-Mutanten zeigten eine Vielzahl von Farben in ihren Lumineszenz-Spektren. Insbesondere D357Y, F und I zeigten signifikante Verschiebungen des emittierten Lichts zu längeren Wellenlängen.
  • In einigen Fällen (z. B. bei D357F) schien die Änderung in der Farbe der Lichtemission nicht nur durch eine Verschiebung in λmax, sondern auch durch unterschiedliche Beiträge von unterschiedlichen Wellenlängen des sichtbaren Lichts zu den Spektren bedingt zu sein. Tabelle 4
    Mutante λmax (nm) Abweichung vom rWT (nm)
    rWT 558 -
    D357K 556 –2
    D357N 558 0
    D357W 558 0
    D357I 606 +48
    D357F 611 +53
    D357Y 613 +55
  • Das rekombinante Wildtyp(rWT)-Enzym wurde zum Vergleich von λmax der In-vivo-Lichtemission von einigen der 357-Mutanten verwendet. D357Y, F und I zeigen beträchtliche Verschiebungen in ihren Maxima-Wellenlängen.
  • Beispiel 4
  • Enzymeigenschaften in Gegenwart oder bei Abwesenheit von CoA
  • D357Y wurde durch Ammoniumsulfat-Fällung, wie in Beispiel 1 beschrieben, partiell gereinigt. Dieses partiell gereinigte D357Y-Enzym (5 μl) wurde mit 150 μl Promega-Luciferase-Assay-Reagens gemischt. Ein weiteres Aliquot wurde mit einem äquivalenten Testpuffer gemischt, in dem kein CoA vorlag (25 mM Tris-Tricine, pH 7,8, 5,0 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 2 mM DTT, 470 μM D-Luciferin, 530 μM ATP). Die Emissionsspektren der beiden Reaktionen wurden gemessen und sind in den 9 und 10 dargestellt.
  • Die Spektren zeigen einen ausgeprägten Unterschied in der Biolumineszenzemission bei Abwesenheit und bei Vorliegen von CoA mit einer dramatischen Verschiebung λmax. Die Wirkung von CoA auf die Kinetik der Luciferase-Reaktion ist auch aus dem Unterschied in den RLU-Skalen ersichtlich (RLU – relative Lichteinheiten).
  • Dieser Unterschied in der Emission ermöglicht die Verwendung des Enzyms in einem Assay zur Erfassung des Vorliegens von CoA.
  • Beispiel 5
  • Herstellung und Eigenschaften einer Doppel-Mutante
  • Durch Anwendung der gerichteten Mutagenese, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde eine Doppel-Mutante E354I + D357Y konstruiert, um eventuelle kumulative Effekte hinsichtlich der Thermostabilität und der Farbe der Lichtemission zu untersuchen.
  • Die partiell gereinigte Doppel-Mutante E354I + D357Y wurde 1 zu 11 in einem Thermoinaktivierungspuffer verdünnt: 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,8, der 10% gesättigtes Ammoniumsulfat, 1 mM Dithiothreit und 0,2% BSA enthielt.
  • 110 μl-Aliquote der Proteinlösung wurden während festgesetzter Zeitperioden bei 45°C inkubiert und dann vor dem Test auf Eis gekühlt. Die Luciferaseaktivität wurde dann wie zuvor gemessen, wobei das Promega Luciferase Assay-Reagens (1 zu 2 verdünnt) verwendet wurde.
  • Die Doppelmutante zeigte eine ausgeprägte Erhöhung der Thermostabilität im Vergleich zu den individuellen Einfach-Mutanten E354I und D357Y (vgl. 3). Untersuchungen zur thermischen Inaktivierung an der partiell gereinigten Doppel-Mutante bestätigten die erhöhte Thermostabilität der Mutante, die bei Inaktivierung bei 45°C einen Wert t½ von 7,7 min ergab.
  • Es wurde festgestellt, dass die Doppel-Mutante eine erheblich tiefer rot gefärbte Lumineszenz als die individuellen Mutanten E354I und D357Y zeigt, was Additivität der Farbe der Lumineszenz erweist.
  • Die Emissionsspektren des rekombinanten Wildtyps und des rohen Extrakts der Doppel-Mutante E354I + D357Y wurden ebenfalls unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Testpuffers vermessen.
  • Die in vivo gemessenen Emissionsspektren ergaben einen Wert λmax von 611 nm. Das Spektrum wies allerdings einen größeren Beitrag der Lumineszenz aus dem roten Wellenlängenbereich auf, was zu dem tiefer roten Aussehen bei visueller Betrachtung führt. Die Emissionsspektren der rohen Extrakte zeigten eine deutliche Änderung der Form des Spektrums und eine Wellenlängenverschiebung von 44 nm in Bezug auf rWT (vgl. 4).
  • Das In-vivo-Emissionsspektrum der Doppel-Mutante zeigt sowohl eine Schärfung der Bandbreite für die Peak-Wellenlänge des emittierten Lichts (613 nm) als auch eine Abnahme des Beitrags der Lichtwellenlängen im Bereich von 540 bis 560 nm.
  • Der stark ausgeprägte Effekt dieser Mutationen zeigt die Bedeutung dieses Bereichs des Enzyms für die Farbe des Biolumineszenzlichts.
  • Beispiel 6
  • Verbesserter Photonenfluss
  • Es wurde festgestellt, dass die In-vivo-Biolumineszenz von E. coli-Zellen, welche die Mutante D357K exprimieren, gegenüber anderen Mutanten in dieser Position sehr hell ist. Die Flash-Kinetik dieses Enzyms wurde mit einem Luminometer analysiert, mit dem die Rate der Photonenemission in Abhängigkeit von der Zeit gemessen werden konnte. Aliquote von zellfreien Extrakten von E. coli, die das rekombinante Wildtyp-Enzym oder die Mutante D357 enthielten, wurden zu dem Luciferase-Assay-Gemisch zugegeben, das noch keinerlei Reagentien enthielt, die eine Leuchtkinetik hervorrufen könnten, wie z. B. Coenzym A. Die Abklingrate der Photonenemission wurde in Abhängigkeit von der Zeit (15 s) für die beiden Enzyme gemessen, wobei festgestellt wurde, dass sie bei der Mutante D357K signifikant langsamer ist (4). Anders ausgedrückt ergibt das mutierte Enzym eine Reaktionskinetik, die zumindest während der ersten 15 Sekunden der Reaktion in einem geringeren Ausmaß inhibiert wird als bei dem rekombinanten Wildtyp-Enzym.
  • Beispiel 7
  • Kombinatorische Kassetten-Mutagenese in den Positionen E354 und D357
  • Stufe 1
  • Konstruktion des Plasmids pPW601aJ54 zur Kassetten-Mutagenese
  • In das Gen luc im Plasmid pPW601aJ54 wurden zwei neue, nur einmal vorkommende Restriktionsstellen eingeführt, wobei zwei Paare synthetischer Oligonucleotide verwendet wurden (siehe unten). Innerhalb des Gens wurden durch insgesamt sechs schweigende Mutationen eine SpeI- und eine KpnI-Restriktionsstelle eingeführt, die 63 Basenpaare voneinander entfernt sind. Das Plasmid, das diese neuen Stellen enthält, wurde als pPW601aJ54SpeI/KpnI bezeichnet. Das Vorliegen und die Nähe dieser Restriktionsstellen ermöglicht die Anwendung der kombinatorischen Kassetten-Mutagenese zur Untersuchung der Wirkungen zufälliger Substitutionen an den Aminosäurepositionen 354 und 357 in der Primärsequenz der Leuchtkäfer-Luciferase.
  • Figure 00450001
  • Nucleotide, die durch Fettdruck angegeben sind, bilden die Endonuclease-Erkennungsstelle, wobei die in Großbuchstaben angegebenen Nucleotide die Position der zur Erzeugung der Stelle erforderlichen Punktmutationen angeben.
  • Stufe 2
  • Kassettenaufbau und Konstruktion der Bibliothek
  • Es wurden zwei synthetische Oligonucleotide synthetisiert, die bei der Reassoziierung eine doppelsträngige Kassette erzeugten, die nach Verdau an den neuen Restriktionsstellen direkt in das Plasmid pPW601aJ54SpeI/KpnI ligasiert werden konnte. Die Kassette war so aufgebaut, dass alle möglichen Kombinationen der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren in den Positionen 354 und 357 in der Primärsequenz eingeführt werden konnten.
  • Figure 00460001
  • 2 μg von jedem Oligonucleotid der Loop-Bibliothek wurden in einen Puffer eingemischt, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4 und 25 mM NaCl enthielt, und 3 min auf 100°C erhitzt. Diese Lösung wurde dann in einem Heizblock langsam auf < 50°C abgekühlt, um die komplementären Sequenzen zur Assoziierung zu bringen. Die assoziierten Oligonucleotide wurden dann in das Plasmid pPW601aJ54SpeI/KpnI ligasiert, das einem Verdau mit SpeI und KpnI unterzogen worden war. Aliquote aus der Ligasierungsreaktion wurden dann zur Transformierung von Zellen von E. coli HB101 durch Elektroporation herangezogen. Nach der Elektroporation wurden die transformierten Zellen auf LB-Agar-Platten ausplattiert, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Am folgenden Tag wurden 869 Kolonien willkürlich aus den Platten ausgesucht und zur Beimpfung von 1 ml LB, das Ampicillin enthielt, in quadratischen Platten mit 96 Vertiefungen (Beckman) verwendet. Die Platten wurden abgedeckt, und die Zellen wurden über Nacht unter Schütteln bei 37°C kultiviert.
  • Stufe 3
  • In-vivo-Durchmusterung der zufällig ausgewählten Klone
  • Am nächsten Morgen wurden 50 μl-Aliquote der Übernachtkulturen in stationärer Phase in zwei klare Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit Rundboden aus Kunststoff (Dynex) übertragen. Eine Platte wurde abgedeckt und auf einem erwärmten Block 8 Minuten inkubiert (Temperatur der Blockoberfläche 45°C), während die andere Platte auf 37°C gehalten wurde. Die In-vivo-Aktivität der Luciferase in den Zellen wurde dann von beiden Platten bei Raumtemperatur erfasst und aufgezeichnet, indem in die Vertiefungen 50 μl eines 10 mM Natriumcitratpuffers pH 5,0, der 0,5 mM D-Luciferin enthielt, gegeben wurden und die Platte dann in ein Bildaufnahmesystem mit Videokamera (Alpha Imager) verbracht wurde. Das durch die erwärmten Kulturen und die Kontrollkulturen emittierte Licht wurde über 1 bis 2 Minuten integriert, und das aufgenommene Bild wurde auf Thermopapierfilm aufgezeichnet.
  • 79 Kulturen, welche aufgrund der Bestimmung der Helligkeit des auf dem Film aufgezeichneten Bildes die größte Biolumineszenz zeigten, wurden für eine zweite Durchmusterungsrunde ausgewählt. Dieses Mal wurden die Kulturen vor dem Testen 16 Minuten auf dem Heizblock inkubiert. Von den 55 Klonen, die bei den Durch musterungen hinsichtlich der In-vivo-Thermostabilität ausgewählt worden waren, wurden 25 für die Spektralanalyse in vivo ausgewählt. Diese Klone wurden über Nacht in LB bei 37°C kultiviert; am nächsten Morgen wurden 200 μl der Übernachtkulturen zentrifugiert, und die E. coli-Zellpellets wurden in 150 μl 100 mM Natriumcitratpuffer pH 5,0, der 0,5 mM D-Luciferin enthielt, resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden dann in eine weiße Kunststoff-Mikrotiterplatte verbracht, und das von jeder der mutierten Luciferasen emittierte Emissionsspektrum der In-vivo-Biolumineszenz wurde mit einem Fluorometer des Typs Molecular Devices Spectramax mit einer Platte mit 96 Vertiefungen analysiert. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle 1 zusammengefasst.
  • Stufe 4
  • Identifizierung der Mutationen
  • Von den durch Durchmustern in vivo selektierten 25 Klonen wurde die Plasmid-DNA präpariert und unter Verwendung von genspezifischen Sequenzierungs-Primern sequenziert. Mutationen, die zu Aminosäureänderungen in den Positionen 354 und 357 in der Primärsequenz führten, wurden identifiziert. Eine Mutante enthielt ferner eine zusätzliche Mutation, die zu einem Aminosäureersatz in Position I351 führte (Tabelle 5). Tabelle 5
    Enzym-Mutante Mutationen Peak-Wellenlängen (nm)
    1 E354V/D357Y 614
    2 E354I/D357Y 612
    3 E354C/D357Y 612
    4 E354R/D357Y 600
    5 E354S/D357Y 612
    6 E354N/D357Y 608
    7 E354K/D357M 556, 606
    8 E354R/D357L 588
    9 E354W/D357W 610
    10 E354H/D357W 606
    13 E354S/D357F 610
    14 E354M/D357F 610
    15 E354A/D357R 556
    16 E354A/D357F 610
    17 E354T/D357Y 612
    18 E354A/D357N 560
    19 I351M/E354R/D357V 606
    20 E354S/D357V 556, 608
    21 E354R/D357W 600
    22 E354R/D357M 596
    23 E354R/D357S 592
    24 E354N/D357S 600
    rWT E354/D357 552
  • In der Tabelle bezeichnet rWT den rekombinanten Wildtyp.
  • Anhand der Thermostabilitätstests in vivo wurden eine Reihe mutierter Luciferasen selektiert. Die Mehrzahl dieser Luciferasen zeigen auch große Änderungen im In-vivo-Spektrum des emittierten Lichts, wobei viele Luciferasen größere Beiträge von längerwelligem Licht (> 580 nm) zeigen. Eine Reihe der Spektren zeigten ferner eine signifikante Verschmälerung der Bandbreite um einen einzelnen Peak von 610–614 nm.
  • Der Ersatz durch eine hydrophobe und eine aromatische Aminosäure bei E354 und D357, zum Beispiel als E354V bzw. D357Y, führt zur größten Änderung des In-vivo-Spektrums, das einen einzigen Peak kleiner Bandbreite bei etwa 612 nm zeigt.
  • Beispiel 8
  • Durchmustern hinsichtlich der Thermostabilität in vitro
  • Durch Lyse wurden zellfreie Extrakte der selektierten Klone hergestellt, und die Thermostabilität der Luciferase von jedem Extrakt wurde in einem Versuch der thermischen Inaktivierung ermittelt. 50 μl jedes Extrakts wurden in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben und in einem auf 45°C erwärmten Wasserbad 4, 9 und 16 Minuten inkubiert. Zum richtigen Zeitpunkt wurde das Aliquot entnommen, und die Restaktivität der Luciferase wurde gemessen. Tabelle 6 zeigt die prozentuale Restaktivität in Abhängigkeit von der Zeit für alle Enzymmutanten sowie für den rekombinanten Wildtyp. Tabelle 6
    Enzym Nr. (vgl. Tabelle 5) Prozentuale Restaktivität nach Inkubation bei 45°C
    0 min 4 min 9 min 16 min
    1 100 95 87 75,4
    2 100 99 84,7 67,7
    3 100 92 73 53,3
    4 100 94 89 71,4
    5 100 85 72,2 53
    6 100 93 84,8 71
    7 100 63,7 31 11,7
    8 100 58,6 19 4,9
    9 100 85,4 65,3 42,3
    10 100 65,5 27,8 10,6
    11 100 88,6 70 54
    12 100 90 69 52
    13 100 83 60,5 39
    14 100 80 61 39
    15 100 1,7 0,1 nb
    16 100 90 76 63
    17 100 91 78 60
    18 100 19 1,8 nb
    19 100 17 1,4 nb
    20 100 17 1,1 nb
    21 100 71 63 34
    22 100 80 40 21
    23 100 29 4 0,6
    24 100 28 4 0,4
    25 (D357K) 100 0,1 nb nb
    rWT 100 0,05 nb nb
  • In der Tabelle bedeutet "nb" "nicht bestimmt".
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Luciferasen mit der höchsten Thermostabilität diejenigen mit einer aromatischen Aminosäure in Position 357 (Y, F oder W) und einer großen hydrophoben (V oder I), polaren (N) oder positiv geladenen (K oder R) Aminosäure in Position 354 waren.
  • Beispiel 9
  • Wirkung der Wachstumsbedingungen auf das In-vivo-Spektrum des emittierten Lichts
  • Die Wirkung verschiedener Kohlenstoffquellen auf das Spektrum des von E. coli-Zellen BL21 (DE3), die mutierte Luciferasen D357Y oder E354K + D357M (oben Nr. 7) exprimieren, emittierten Lichts wurde untersucht.
  • Eine 50 ml-Kultur der Zellen wurde auf LB-Medium bis zur Mitte der logarithmischen Phase kultiviert und dann durch Zentrifugieren geerntet. Das Zellpellet wurde in 1 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert; ein 100 μl-Aliquot dieser Suspension wurde dann zur Inokulation von 5 ml frischem LB-Medium, M9-Minimalmedium + 2 mM Natriumacetat oder M9-Minimalmedium + 2 mM Glucose in einem 25 ml-Sterilin-Röhrchen verwendet. Die Kulturen wurden bei 37°C unter Schütteln weiter wachsen gelassen; nach 90 Minuten (D357Y) oder 120 Minuten (Enzym 7) wurde ein 200 μl-Aliquot der Zellen entnommen, zentrifugiert und in 150 μl 100 mM Natriumcitratpuffer pH 5,0, der 0,5 mM D-Luciferin enthielt, resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden dann in eine Mikrotiterplatte gegeben, und das von jeder der mutierten Luciferasen emittierte Emissionsspektrum der In-vivo-Biolumineszenz wurde mit einem Fluorometer des Typs Molecular Devices Spectramax mit einer Platte mit 96 Vertiefungen analysiert. Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 dargestellt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass das Umschalten von einem reichen Medium (LB-Medium) (7a, 8a) zu einem definierten Minimalmedium entweder mit Acetat (7b, 8b) oder mit Glucose (7c, 8c) als einziger Kohlenstoffquelle zu Verschiebungen des emittierten Lichts zu längeren Wellenlängen und zu einer Verringerung des Beitrags kürzerer Wellenlängen führte.
  • Beispiel 10
  • Reinigung und spektrale Charakterisierung der Wildtyp-Luciferase und von mutierten Luciferasen
  • Rekombinantes Wildtyp-Enzym von Photinus pyralis und die mutierten Luciferasen D357Y und E354I + D357Y wurden bis zur Homogenität gereinigt, um die Wirkung des Cofaktors Coenzym A auf das Spektrum der Biolumineszenzreaktion zu analysieren. Alle drei Luciferasen wurden als Fusionen an ein Kohlenhydrat-Bindungsmodul (CBM) mit 143 Aminosäuren aus dem anaeroben Pilz Piromyces equii gereinigt. Es war gezeigt worden, dass dieses CBM selektiv an mit Säure gequollener Cellulose und den löslichen Kohlenhydraten Galactomannan und Glucomannan bindet, was die Basis für ein einfaches, einstufiges Schema zur Affinitätsreinigung bildet.
  • Die an das CBM fusionierten Luciferasen können in rohen, zellfreien Extrakten an Cellulose gebunden, gewaschen und dann unter Verwendung löslicher Polysaccharide selektiv eluiert werden. Die in dieser Weise gereinigten Fusionsproteine wurden in Tests zur Messung der Wellenlänge des emittierten Lichts in Reaktionen verwendet, bei denen unterschiedliche Gehalte von Coenzym A vorlagen. Das Enzym (5 μl) wurde zu 100 μl des Testreagens, 25 mM Tris-Tricine pH 7,8, 5,0 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 530 μM ATP und 470 μM D-Luciferin, das verschiedene Mengen an Coenzym A enthielt, zugegeben. Die 9 bis 11 zeigen die Wirkung steigender Konzentrationen von Coenzym A auf das Spektrum des durch die gereinigten Luciferasen D357 und E354I + D357Y emittierten Lichts.
  • In-vivo-Assays des Spektrums des Biolumineszenzlichts, das durch E. coli-Zellen emittiert wird, die Leuchtkäfer-Luciferase exprimieren, die mit dem C-Terminus des Pilz-CBM fusioniert war, zeigten keine signifikanten Unterschiede gegenüber Zellen, die native Luciferase exprimieren. In ähnlicher Weise waren In-vitro-Assays des Spektrums des von einer kommerziellen Quelle gereinigter rekombinanter Luciferase (Promega) emittierten Biolumineszenzlichts identisch mit dem durch das Fusionsprotein emittierten Spektrum.
  • Die beobachteten Unterschiede stehen daher mit den Konzentrationen an CoA in Zusammenhang. Wenn die Konzentration an Coenzym A erhöht wird, ändert sich die spektrale Verteilung, und bei den höchsten Konzentrationen an CoA wird das Spektrum durch Wellenlängen im Bereich von 590 bis 630 nm mit einem herausragenden Peak bei 610 nm dominiert. Die spektrale Verschiebung ist bei der Doppel-Mutante am stärksten ausgeprägt, bei der eine signifikante Verschmälerung der Bandbreite um einen einzelnen Peak bei der Wellenlänge 610 nm vorliegt (11).
  • Beispiel 12
  • Herstellung einer synthetischen Photinus pyralis-Luciferase, die so mutiert ist, dass 214C/354K/357F vorliegt
  • Unter Anwendung der oben erläuterten Synthesestrategie wurde ein synthetisches luc-Gen konstruiert und aus Oligonucleotidpaaren zusammengebaut. Die Gensequenz war so konstruiert, dass eine Luciferase mit den Aminosäuren 214C, 354K und 357F erzeugt wurde.
  • 29 Paare von überlappenden synthetischen Oligonucleotiden wurden durch Sigma-Genosys Ltd. synthetisiert, durch PAGE gereinigt und in drei Konstrukte von etwa 550 bp (IDRIS 1, 2 und 3, 13) ligasiert. Jedes Konstrukt wurde dann separat in den Vektor pBSK(+) ligasiert, und die resultierenden Konstrukte wurden zur Transformierung von E. coli-Zellen XL1-Blue verwendet. Die Plasmid-DNA wurde aus Klonen, welche die zusammengebauten Inserts enthielten, präpariert und sequenziert, um die Unversehrtheit der ORFs zu bestätigen. Das Vorliegen von n-1 Oligonucleotiden (Nebenprodukte der Oligonucleotid-Synthese) in den Konstrukten komplizierte den Aufbauprozess. Durch DNA-Sequenzierung wurde ein einziges korrektes Konstrukt von IDRIS 2 identifiziert; die PCR wurde dazu herangezogen, ein Konstrukt von IDRIS 3 zu korrigieren, das eine einzige Basenpaar-Deletion am 5'-Ende des Konstrukts enthielt. Der Zusammenbau des vollständigen ORF wurde durch Ligasieren eines Gemischs von Plasmiden, die IDRIS 1 enthielten, mit IDRIS 2 und 3 erzielt.
  • Die ligasierte DNA wurde dann zur Transformation von E. coli-Zellen XL1-Blue herangezogen; Klone, die das aktive Enzym exprimierten, wurden unter Anwendung eines In-vivo-Assays selektiert. Einige Klone wurden selektiert und sequenziert, um das Vorliegen und die Unversehrtheit des synthetischen Gens luc mit der in 14 dargestellten Sequenz zu bestätigen. Der komplette ORF wurde als IDRIS (FA) bezeichnet.
  • Das synthetische Gen wurde in den Vektor pBSK(+) zwischen den Stellen BamH I and Sal I im Polylinker eingebaut. In dieser Position befindet sich das Gen nicht im Rahmen mit dem Alpha-Peptid und befindet sich in einem signifikanten Abstand vom lac-Promotor. Es wird allerdings genug Luciferase erzeugt, um eine vorläufige Charakterisierung des Enzyms zu ermöglichen. Rohe zellfreie Extrakte von E. coli-Zellen XL1-Blue, die IDRIS (FA) exprimieren, wurden aus Übernachtkulturen unter Anwendung des Promega-Lyseverfahrens hergestellt.
  • Dann wurde die Thermostabilität des Enzyms im Extrakt während 20 Minuten bei 50°C getestet und mit der Thermostabilität der thermostabilen Mutante E354I + D357Y verglichen. Die neue codonoptimierte Dreifach-Mutante besaß eine signifikant höhere Thermostabilität als die Mutante E354I + D357Y (15). SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. Rekombinantes Protein mit Luciferase-Aktivität und einer Ähnlichkeit von mindestens 90% mit einer Wildtyp-Luciferase von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca, Pyrocoelia miyako oder Phrixothrix, wobei in der Sequenz des Enzyms der Aminosäurerest, der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase so mutiert ist, dass das Luciferase-Enzym befähigt ist, Licht bei einer im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase unterschiedlichen Wellenlänge zu emittieren, und/oder im Vergleich zur entsprechenden Wildtyp-Luciferase erhöhte Thermostabilität aufweist, und wobei die Ähnlichkeit unter Anwendung eines Alignment-Algorithmus, wie er von Lipman und Paerson definiert wurde (1985, Science 227: 1435–1441), mit den Parametern ktup = 1, Gap-Penalty = 4 und Gap-Länge der Gap-Penalty = 12 bestimmt ist.
  2. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz der Wildtyp-Luciferase die Sequenz der Luciferase von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis ist.
  3. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz der Wildtyp-Luciferase die Sequenz der Luciferase von Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis, Hotaria parvula, Pyrophorus plagiophthalamus, Lampyris noctiluca oder Pyrocoelia miyako ist und der Aminosäurerest, der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entspricht, anders mutiert ist als zu Asparaginsäure oder Glutaminsäure.
  4. Rekombinantes Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest anders mutiert ist als zu Asparaginsäure, Glutaminsäure oder Valin.
  5. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, bei dem die Sequenz von Wildtyp-Luciferase die Sequenz der Luciferase von Phrixothrix ist und der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest anders mutiert ist als zu Leucin.
  6. Rekombinantes Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest zu Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Asparaginen, Glutamin, Serin oder Threonin mutiert ist.
  7. Rekombinantes Protein nach Anspruch 6, bei dem der Rest 357 in der Luciferase von Photinus pyralis entsprechende Aminosäurerest zu Tyrosin mutiert ist.
  8. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das im Vergleich zu Wildtyp-Luciferase mindestens eine der folgenden Mutationen aufweist: (a) Der Aminosäure 354 der Luciferase von Photinus pyralis oder Aminosäure 356 in der Luciferase von Luciola entsprechende Aminosäurerest ist mutiert; (b) der Position 215 in der Luciferase von Photinus pyralis oder Position 217 in der Luciferase von Luciola entsprechende Aminosäurerest ist eine unterschiedliche hydrophobe Aminosäure, oder (c) der Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 216 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (d) der Rest 232 in der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 234 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (e) der Rest 295 in der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 297 in der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (f) der Aminosäure 14 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 16 der Luciferase von Luciola mingrelica oder Rest 17 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (g) der Aminosäure 35 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 37 der Luciferase von Luciola mingrelica oder Rest 38 der Luciferase von Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (h) der dem Aminosäurerest 105 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 106 der Luciferase von Luciola mingrelica, Rest 107 der Luciferase von Luciola cruciata oder von Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (i) der dem Aminosäurerest 234 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 236 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (j) der dem Aminosäurerest 420 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 422 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest, (k) der dem Aminosäurerest 310 der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 312 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest ist von der Aminosäure verschieden, die in der entsprechenden Wildtyp-Sequenz vorliegt, und wobei das Luciferase-Enzym im Vergleich zu einem Enzym mit der Aminosäure der entsprechenden Wildtyp-Luciferase an dieser Position erhöhte Thermostabilität besitzt.
  9. Protein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Aminosäure 354 der Luciferase von Photinus pyralis (356 in der Luciferase von Luciola) entsprechende Aminosäurerest mutiert ist.
  10. Protein nach Anspruch 9, bei dem der Rest 214 in der Luciferase von Photinus pyralis oder Rest 216 der Luciferase von Luciola mingrelica, Luciola cruciata oder Luciola lateralis entsprechende Aminosäurerest zu einer unterschiedlichen hydrophoben Aminosäure mutiert ist, die der Gruppe Isoleucin, Leucin, Valin, Methionin, Tryptophan, Phenylalanin, Prolin, Cystein und Alanin angehört, insbesondere zu Isoleucin, Leucin oder Valin.
  11. Nucleinsäure, die eine Luciferase nach einem der vorhergehenden Ansprüche codiert.
  12. Nucleinsäure nach Anspruch 11, die ein synthetisches Gen enthält.
  13. Nucleinsäure nach Anspruch 11, bei der die Codon-Nutzung für einen speziellen Expressionswirt optimiert wurde und/oder nur einmal vorkommende Restriktionsstellen eingeführt wurden.
  14. Nucleinsäure nach Anspruch 11 oder 12, welche die Nucleotide 9-1661 des Sequenzprotokolls SEQ ID NO 1 oder eine Sequenz enthält, die eine Ähnlichkeit von mindestens 90% damit aufweist.
  15. Vektor, der eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 11 bis 14 enthält.
  16. Zelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 15 transformiert ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das die Kultivierung einer Zelle nach Anspruch 16 umfasst.
  18. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in einem Biolumineszenz-Assay.
  19. Kit, der ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthält.
  20. Kit nach Anspruch 19, der ferner Luciferin enthält.
  21. Assay zur Bestimmung des Vorliegens von CoA in einer Probe, wobei das Assay umfasst: Zugabe von Luciferase nach einem der obigen Ansprüche 1 bis 10 zusammen mit anderen Reagentien, die zur Durchführung einer Luciferase-/Luciferin-Reaktion erforderlich sind, zu einer Probe, von der zu vermuten ist, dass sie CoA enthält, Messung der Wellenlänge des von der Probe emittierten Lichts und Korrelieren der Messung mit dem Vorliegen oder Nichtvorliegen von CoA.
  22. Assay nach Anspruch 21 zur Anwendung bei der Diagnose von Diabetes.
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