EP1492877A2 - Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12 - Google Patents

Verbessertes verfahren zur herstellung von vitamin b12

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EP1492877A2
EP1492877A2 EP03745269A EP03745269A EP1492877A2 EP 1492877 A2 EP1492877 A2 EP 1492877A2 EP 03745269 A EP03745269 A EP 03745269A EP 03745269 A EP03745269 A EP 03745269A EP 1492877 A2 EP1492877 A2 EP 1492877A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
precorrin
chelatase
sirohydrochlorin
vitamin
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03745269A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin J. Warren
Evelyne Deery
Helen Leech
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1492877A2 publication Critical patent/EP1492877A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/42—Cobalamins, i.e. vitamin B12, LLD factor

Definitions

  • the present invention relates to an improved process for the production of vitamin B12, in which at least one enzyme of sirohaem synthesis is used.
  • vitamin B12 was indirectly discovered by its effects on the human body by George Minot and William Murphy (Stryer, L, 1988, In Biochemie, fourth edition, pp. 528-531, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg , Berlin, New York).
  • vitamin B12 could be purified and isolated for the first time, so that eight years later, in 1956, Dorothy Hodgkin's complex three-dimensional crystal structure was elucidated (Hodgkin, DC et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176 , 325-328 and Nature 178, 64-70).
  • vitamin B12 The naturally occurring end products of vitamin B12 biosynthesis are 5 - deoxyadenosylcobalamin (coenzyme B12) and methylcobalamin (MeCbl), while vitamin B12 by definition stands for cyanocobalamin (CNCbl), which is the form that is primarily manufactured and traded by industry.
  • CNCbl cyanocobalamin
  • vitamin B12 is the same for the designation of all three analog molecules.
  • B. megaterium was first described by De Bary over 100 years ago (1884). Although generally classified as a soil bacterium, B. megaterium can also be found in various other habitats such as sea water, sediments, rice, dried meat, milk or honey. It often occurs in the company of pseudomonas and actinomycetes. B. megaterium, like its close relative Bacillus subtilis, is a gram-positive bacterium and is characterized, among other things, by its relative nature pronounced, eponymous size of 2x5 ⁇ m, a G + C content of approx. 38% and a very pronounced ability to sporulate.
  • B. megaterium a group of microorganisms that are suitable for the biotechnological production of vitamin B12, such as. B. microorganisms of the genus Bacillus, Pseudomonas or Propionibacterium.
  • the object of the present invention is to further optimize the biotechnological production of vitamin B12 with microorganisms.
  • This object is achieved by a process for the improved production of vitamin B12, in which a culture is fermented, containing a microorganism in which at least the enzymes involved in the synthesis of sirohaem have uroporphyrinogen-Ill-methyltransferase and precorrin-2-dehydrogenase in their activity the corresponding endogenous enzyme activities are increased.
  • the invention also relates to a process for the improved production of vitamin B12, in which a culture is fermented, comprising a microorganism in which at least the enzymes involved in the sirohaem synthesis are uroporphyrinogen-ill-methyltransferase, sirohydrochlorin-iron chelatase and precorrin-2 - Dehydrogenase are increased in their activity compared to the corresponding endogenous enzyme activities.
  • the invention further relates to a process for the improved production of vitamin B12, in which a culture is fermented, comprising a microorganism in which at least the enzymes involved in the synthesis of sirohaem uroporphyrinogen-ill-methyltransferase, precorrin-2-dehydrogenase and the other Cobalamin synthesis involved enzyme Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase in their activity compared to the corresponding endogenous enzyme activities are increased.
  • the vitamin B12 formed can be processed from the fermentation medium. Measures to do this are part of common laboratory practice and will not be discussed further here.
  • it is a method in which at least one uroporphyrinogen III methyltransferase according to SEQ ID No. 2 and a precorrin-2 dehydrogenase according to SEQ ID No. 6 or their isoenzymes are increased compared to the corresponding endogenous enzyme activities.
  • a method is included in which at least one uroporphyrinogen III methyl transferase according to SEQ ID No. 2 and a sirohydrochlorine iron chelatase according to SEQ ID No. 4 and a precorrin-2-dehydrogenase according to SEQ ID No. 6 or their isoenzymes are increased compared to the corresponding endogenous enzyme activities.
  • the invention comprises a variant of a method in which at least one uroporphyrinogen-III-methyltransferase according to SEQ ID No. 2, a precorrin-2-dehydrogenase according to SEQ ID No. 6 and the Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase (CbiX) or their isoenzymes are increased compared to the corresponding endogenous enzyme activities.
  • the present invention thus relates to variants of a process for the improved production of vitamin B12, in which a culture is fermented, comprising a microorganism in which at least the enzymes involved in sirohaem synthesis, uroporphyrinogen-Ill-methyltransferase (sirA), precorrin-2 dehydrogenase (sirC), sirohydrochlorin-iron chelatase (sirB) and the enzyme sirohydrochlorin-cobalt chelatase (cbiX) involved in the synthesis of cobalamin are individually or in combination increased in their activity compared to the corresponding endogenous enzyme activities.
  • uroporphyrinogen-Ill-methyltransferase sirinogen-Ill-methyltransferase
  • precorrin-2 dehydrogenase precorrin-2 dehydrogenase
  • sirohydrochlorin-iron chelatase siro
  • Endogenous enzyme activity is to be understood as one that arises from the system (the basic genetic makeup) of the cell or organism (exists naturally) and is not caused by external influences or supply from outside, i.e. the level of the respective enzyme activity before genetic manipulation of the organism.
  • Isoforms are to be understood as enzymes with the same or comparable substrate and activity specificity, but which have a different primary structure.
  • the present invention further relates to modified forms of the enzymes mentioned.
  • Modified forms which are also encompassed according to the invention, are to be understood as enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the region of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made in the form of amino acid exchanges according to methods known per se.
  • a special embodiment variant of the present invention comprises variants of the polypeptides according to the invention, the activity of which is weakened or enhanced, for example, by amino acid exchanges compared to the respective starting protein.
  • Endogenous enzyme activity in the sense of the present invention is understood to mean the activity of an enzyme of the sirohaem or cobalamin synthesis that occurs naturally in a microorganism.
  • the synthesis of the sirohaem is based on the precursor uroporphyrinogen-III.
  • the reaction steps required for the conversion to the sirohaem and the biocatalysts involved are known to the person skilled in the art. In principle, these are biocatalysts with the following activities: Uroporphyrinogen-III- methyltransferase, sirohydrochlorin-iron chelatase or precorrin-2-dehydrogenase.
  • the enzyme with the activity of a sirohydrochlorine cobalt chelatase is an important biocatalyst.
  • the cbiX gene codes for the enzyme of the Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase.
  • the activities of uroporphyrinogen-Ill-methyltransferase are less than 0.25 units / mg raw cell extract, the precorrin-2-dehydrogenase is approx. 0.002 units / mg raw cell extract and for the chelating agents approx. 0.01 unit / mg raw cell extract.
  • One Umit is 1 nM of Precarrin-2 produced per hour, 1 nM of Sirohydrochlorin per minute and for the chelatases the consumption (i.e. disappearance) of 1 nM Sirohydrochlorin per minute.
  • Each of the enzymes mentioned can be encoded by a gene or, for example, encode a gene for a multifunctional gene product which combines the activity of two or all three of the aforementioned enzymes or any other conceivable combination.
  • the genes are already coding for the enzymes involved in the synthesis of sirohaem and cobalamin known.
  • the nomenclature of these genes and the corresponding gene products is varied.
  • sirohaem synthesis in Escherichia coli is catalyzed by the multifunctional protein sirohaem synthase, the gene of which is designated cysG.
  • two enzymes are specifically involved in sirohaem synthesis (uroporphyrinogen III methyl transferase and a dehydrogenase / chelatase), the genes of which are designated metl and met ⁇ .
  • Bacillus subtilis in turn, has three genes, namely ylnD, ylnE and ylnF, which code for the above-mentioned enzymes for sirohaem synthesis.
  • a variety of the enzymes of cobalamin synthesis are also known. Examples include sirohydrochlorine chelatase, which is an enzyme at the branching point of sirohaem and cobalamin synthesis.
  • sirohydrochlorine chelatase which is an enzyme at the branching point of sirohaem and cobalamin synthesis.
  • Salmonella it is called CbiK or CbiL.
  • CbiX Rhohydrochlorine chelatase
  • Bacillus megaterium it is known under the name CbiX (Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 335: 159-166).
  • sirohaem genes and the enzymes of sirohaem synthesis encoded by them are in the process according to the invention for the production of vitamin B12 suitable.
  • the present invention further relates to an isolated nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 containing the sirABC operon from Bacillus megaterium coding for enzymes of sirohaem synthesis.
  • nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 coding for the entire operon sIRABC or parts of it Nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 includes. Below the parts are the individual coding regions of the sequence according to SEQ ID No. 1 meant that can be used according to the invention individually or in all conceivable combinations, such as, for example, sirA, sirB, sirC, sirAB, sirAC, sirBC or sirABC. All possible combinations with genes of cobalamin synthesis are also conceivable, advantageously with a gene coding for sirohydrochlorine chelatase (cbiX) or parts thereof.
  • sirA, sirB, sirC, sirAB, sirAC, sirBC or sirABC All possible combinations with genes of cobalamin synthesis are also conceivable, advantageously with a gene coding for sirohydrochlorine chelatase (cbiX) or parts thereof.
  • an isolated nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or their alleles, coding from nucleotide 1-780 for a uroporphyrinogen III methyl transferase (sirA) according to SEQ ID No. 2 includes.
  • any combination of the said genes of sirohaem synthesis with the gene cbiX encoding a sirohydrochlorine chelatase and corresponding alleles is included.
  • an isolated nucleic acid or an isolated nucleic acid fragment is to be understood as a polymer from RNA or DNA which can be single or double-stranded and optionally contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
  • DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
  • alleles are to be understood as functionally equivalent, ie essentially equivalent nucleotide sequences.
  • Functionally equivalent sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code, still have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial, e.g. B.
  • functionally equivalent sequences include those which have a modified nucleotide sequence which gives the enzyme, for example, a desensitivity or resistance to inhibitors.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated sequence which continue to show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Also included here are so-called sense mutations, which can lead to the exchange of conserved amino acids at the protein level, but which do not lead to a fundamental change in the activity of the protein and are therefore function-neutral. This also includes changes in the nucleotide sequence that affect the N- or C-terminus of a protein at the protein level, but without significantly impairing the function of the protein. These changes can even have a stabilizing influence on the protein structure.
  • the present invention also encompasses, for example, nucleotide sequences which can be obtained by modifying the present invention
  • Nucleotide sequence resulting in corresponding derivatives. aim such a modification can e.g. B. the further limitation of the coding sequence contained therein or z. B. also the insertion of further restriction enzyme interfaces. Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • artificial DNA sequences are the subject of the present invention as long as they impart the desired properties, as described above.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins created using computer-aided programs (molecular modeling) or by in vitro selection. Coding DNA sequences obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host organism are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person familiar with molecular genetic methods by computer evaluations of other, already known genes of the organism to be transformed.
  • homologous sequences are to be understood as those which are complementary to and / or hybridize with the nucleotide sequences according to the invention.
  • Hybridizing nucleotide sequences in the sense of the invention are understood to mean oligonucleotides or polynucleotides which bind under standard hybridization conditions to the corresponding nucleotide sequence according to the invention.
  • standard hybridization conditions to the corresponding nucleotide sequence according to the invention.
  • Hybridization conditions are to be understood broadly and mean stringent and less stringent hybridization conditions. Such conditions are among others in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,).
  • hybridizing sequences essentially includes according to the invention similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA, which enter into a specific interaction (binding) with the nucleotide sequences according to the invention under standard hybridization conditions known per se. This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example, 10 to 30, preferably 12 to 15 nucleotides. According to the invention, this also includes so-called primers or probes.
  • the (5 'or upstream) and / or subsequent (3' or downstream) sequence regions preceding the coding regions are also included.
  • this includes sequence areas with a regulatory function. You can influence the transcription, the RNA stability or the RNA processing as well as the translation. Examples of regulatory sequences include a. Promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • the present invention further relates to a method of the aforementioned type, which is characterized in that the genes sirA coding for the enzymes of the sirohaem synthesis of nucleotide 1-780 according to SEQ ID No. 1 and sirC of nucleotide 1542-2150 according to SEQ ID No. 1, 3 or 5 are increasingly expressed and / or are present in an increased number of copies.
  • the genes sirA coding for the enzymes of the sirohaem synthesis of nucleotide 1-780 according to SEQ ID No. 1, sirB of nucleotide 761-1561 according to SEQ ID No. 1 or 3 and sirC of nucleotide 1542-2150 according to SEQ ID No. 1, 3 or 5 are increasingly expressed and / or are present in an increased number of copies.
  • a method is included in which the genes sirA coding for the enzymes of the sirohaem synthesis of nucleotide 1-780 according to SEQ ID No. 1, sirC of nucleotide 1542-2150 according to SEQ ID No. 1, 3 or 5 and the cbiX gene coding for the enzyme of cobalamin synthesis are expressed in an increased manner and / or are present in an increased number of copies.
  • the above variants are carried out by fermentation of a culture containing Bacillus megaterium.
  • the present invention also relates to the enzymes uroporphyrinogen III methyl transferase according to SEQ ID No. 2, sirohydrochlorine iron chelatase according to SEQ ID No. 4 and precorrin-2-dehydrogenase according to SEQ ID No. 6, which are encoded by the sIRABC operon or parts thereof from Bacillus megaterium.
  • the present invention further relates to modified forms of the enzymes mentioned.
  • Modified forms which are also encompassed according to the invention, are to be understood as enzymes in which there are changes in the sequence, for example at the N- and / or C-terminus of the polypeptide or in the range of conserved amino acids, but without impairing the function of the enzyme. These changes can be made in the form of amino acid exchanges according to methods known per se.
  • a special embodiment variant of the present invention comprises variants of the polypeptides according to the invention, the activity of which is weakened or enhanced, for example, by amino acid exchanges compared to the respective starting protein.
  • sirohydrochlorine iron chelatase according to the invention is distinguished according to SEQ ID No. 4 further characterized in that it additionally has a cobalt chelatase activity.
  • the enzyme according to the invention according to SEQ ID No. 4 with chelatase activity also accepts nickel, zinc, and copper ions.
  • vitamin B12 For the production of vitamin B12 according to the invention by biotechnological processes, at least the use of a sirohydrochlorin iron chelatase and / or a sirohydrochlorin cobalt chelatase in combination with other enzymes involved in sirohaem or cobalamin synthesis is conceivable in a suitable organism .
  • the metabolic flow can be controlled in favor of cobalamin by suitable fermentation conditions.
  • the fermentation conditions can be cultivation of the microorganism under aerobic, semi-anaerobic or anaerobic conditions. Furthermore, all conceivable variations of a shift from aerobic to anerobic conditions or vice versa are included.
  • a culture containing a microorganism of the genus Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia or Propionibacterium or a mixture of these microorganisms is fermented in the process according to the invention.
  • the Propionibacterium shermanii species can be used as the Propionibacterium.
  • a culture containing Salmonella typhimurium or Escherichia coli or Bacillus megaterium is preferably fermented in a method of the aforementioned type for producing vitamin B12.
  • Bacillus megaterium is economically very interesting because it has a number of advantages for use in the biotechnological production of various, industrially interesting products.
  • B. megaterium has no alkaline proteases, so that hardly any degradation was observed in the production of heterologous proteins.
  • B. megaterium effectively secretes products of commercial interest, such as e.g. B. is used in the production of ⁇ - and ß-amylase.
  • B. megaterium's size it is possible to accumulate high biomass before too high a population density leads to death.
  • B. megaterium is the fact that this species is able to produce products of high value and highest quality from waste and inferior substances. This possibility of metabolizing an enormously wide range of substrates is also reflected in the use of B.
  • B. megaterium as a soil detoxifier, which itself can break down cyanides, herbicides and persistent pesticides.
  • B. megaterium is completely non-pathogenic and does not produce toxins is of paramount importance, especially in food and cosmetic production. Because of these diverse advantages, B. megaterium is already used in a variety of industrial applications, such as the production of - and ß-amylase, penicillin amidase, the processing of toxic waste or the aerobic production of vitamin B12 (summarized in Vary, PS, 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
  • strains of the genus Bacillus, Salmonella, Propionibacterium, Escherichia or Pseudomonas or mixtures thereof can be used for the purposes of the present invention, in which at least the activities of the enzymes of sirohaem synthesis and optionally cobalamin synthesis are increased compared to the corresponding wild types .
  • These include, in particular, genetically modified microorganisms which have at least increased expression and / or increased number of copies of the nucleotide sequences coding for enzymes of sirohaem synthesis and possibly cobalamin synthesis compared to the corresponding wild types.
  • vitamin B12 production strains The use of vitamin B12 production strains is preferred.
  • Salmonella strain is the (genetically modified) strain AR3612 (Raux et al, 1996; J. Bacteriol., 178, (3): 753-767).
  • Organisms of the genus Propionibacteria have become the species Propionibacterium shermanii was found to be particularly suitable.
  • the Bacillus megaterium strain DSMZ 509 and all the usual B. megaterium strains which are suitable as vitamin B12 production strains are very particularly preferred.
  • vitamin B12 production strains are preferably to be understood as microorganism strains which have been modified by classic and / or molecular genetic methods in such a way that their metabolic flow increasingly runs in the direction of the biosynthesis of vitamin B12 or its progeny (metabolic engineering).
  • these production strains one or more genes and / or the corresponding enzymes, which are at crucial and correspondingly complex regulated key positions in the metabolic pathway (bottleneck), are changed or even deregulated.
  • the microorganisms which can be used according to the invention include all the known vitamin B12
  • strains preferably of the genus Bacillus or homologous organisms.
  • the strains advantageous according to the invention include in particular the strains of B. megaterium DSMZ 509 and DSMZ 2894.
  • strains can also be used for the production of vitamin B12 which, without the invention, would not be able to produce vitamin B12, e.g. B. Escherichia coli strains ER 185 or ER 171 (see Table 1 below).
  • E. coli is not able to synthesize vitamin B12 de novo because it lacks some enzymes, e.g. B. are present in Salmonella or Bacillus and have been lost in the course of evolution. However, it is possible to reintroduce these missing enzymes by transformation using a suitable plasmid comprising these genes. If you also use a cysG Strain, then the enzymes for converting uroporphyrinogen III to cobinamide are also present in E. coli.
  • Genetically modified bacterial strains which can be produced by classic mutagenesis or targeted molecular biological techniques and corresponding selection processes are also included according to the invention.
  • interesting starting points for targeted genetic engineering manipulation include Branches of the biosynthetic pathways leading to vitamin B12, through which the metabolic flow can be controlled in the direction of maximum vitamin B12 production.
  • Targeted modifications of genes involved in the regulation of the metabolism also include studies and changes in the regulatory areas before and after the structural genes, such as. B. the optimization and / or the exchange of promoters, enhancers, terminators, ribosome binding sites etc.
  • Also improving the stability of the DNA, mRNA or the proteins encoded by them, for example by reducing or preventing the degradation by nucleases or proteases is according to the invention includes.
  • the present invention further comprises a gene structure containing an isolated nucleotide sequence of the sir operon of the aforementioned type or parts thereof, and nucleotide sequences operatively linked thereto with a regulatory function.
  • a nucleotide sequence coding for a sirohydrochlorin coblate chelatase (cbiX) or parts thereof can additionally be contained in a gene structure of the aforementioned type.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or can be obtained by chemical synthesis.
  • any promoter which can control gene expression in the corresponding host organism is suitable as the promoter.
  • this can also be a chemically inducible promoter by means of which the expression of the genes underlying it in the host cell can be controlled at a specific point in time.
  • the ⁇ -galacosidase or arabinose system may be mentioned here as an example.
  • a gene structure is produced by fusing a suitable promoter with at least one nucleotide sequence according to the invention using common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2 nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York described.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the invention also includes a vector containing an isolated nucleotide sequence of the sir operon of the aforementioned type or parts thereof or a gene structure of the aforementioned type, as well as additional nucleotide sequences for selection, for replication in the host cell and / or for integration into the host cell genome. Examples of such additional sequences are described in the literature in large numbers and will not be further elaborated.
  • this also includes a vector which, in addition to the nucleotide sequences of the sir operon or parts thereof, contains a nucleotide sequence coding for a sirohydrochlorine coblate chelatase or parts thereof.
  • Suitable systems for the transformations and overexpression of the genes mentioned are, for example, the plasmids pACYC184 (New England Biolabs), pKK8668 (Pharmacia) and pWH1510 and pWH1520 as well as the plasmid-free overexpression strain B. megaterium WH320, which was described by Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599).
  • the systems mentioned are not limiting for the present invention.
  • the present invention further relates to a transgenic microorganism for use in a process for the production of vitamin B12 of the aforementioned type, which is characterized in that it encodes an increased expression and / or increased number of copies of a nucleotide sequence coding for a uroporphyrinogen ill-methyltransferase and Has precorrin-2-dehydrogenase.
  • transgenic microorganism for use in a process for the preparation of vitamin B12 of the aforementioned type, which is characterized in that it encodes an increased expression and / or increased number of copies of a nucleotide sequence coding for a uroporphyrinogen III-methyltransferase, sirohydrochlorin iron -chelatase and precorrin-2 dehydrogenase.
  • the present invention relates to a transgenic microorganism for use in a method for producing vitamin B12 of the aforementioned type, which it encodes an increased expression and / or increased number of copies of a nucleotide sequence coding for a uroporphyrinogen III methyl transferase, sirohydrochlorine cobalt chelatase and Has precorrin-2-dehydrogenase.
  • nucleotide sequence which encodes a multifunctional enzyme.
  • a nucleotide sequence can be expressed more strongly and / or be present in the transgenic microorganism in increased copy number, which codes for several enzymes of sirohaem synthesis, since it contains, for example, an operon or a gene cluster.
  • the transgenic microorganism according to the invention preferably contains at least one nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 containing the sirABC operon from Bacillus megaterium or parts thereof. Also advantageous is a transgenic microorganism which has an increased expression and / or increased number of copies of at least one isolated nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or their alleles coding from nucleotide 1-780 for a uroporphyrinogen-III-methyltransferase (sirA) according to SEQ ID No. 2, coding from nucleotide 761-1561 for a sirohydrochlorine iron chelatase (sirB) according to SEQ ID No.
  • sirA uroporphyrinogen-III-methyltransferase
  • sirB sirohydrochlorine iron chelatase
  • a transgenic microorganism according to the invention which has an increased expression and / or increased number of copies of at least one isolated nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or parts or alleles thereof and additionally an increased expression and / or increased number of copies of at least one nucleotide sequence coding for an enzyme the cobalamin biosynthesis, advantageously the sirohydrochlorine cobalt chelatase.
  • transgenic microorganism which parts of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1, wherein these parts are preferably expressed more and / or are present in an increased number of copies. These are preferably subregions of the type defined in more detail above, which have a coding function (sirA, sirB or sirC).
  • the partial sequences can be present individually or in any combination, as well as with regulatory sequences, such as Promoters, enhancers, terminators or the like can be operatively linked.
  • Combinations of the said sequences of the sir operon with sequences coding for enzymes of the cobalamin synthesis path, e.g. of the cbiX gene or parts thereof are also included according to the invention.
  • the present invention furthermore relates to a transgenic microorganism which, in replicating form, contains a gene structure according to the invention or a vector according to the invention.
  • a transgenic microorganism of the genus Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia or Propionibacterium is advantageous.
  • the transgenic microorganism according to the invention is preferably the species Bacillus megaterium, Escherichia coli or Salmonella typhimurium.
  • a Bacillus megaterium or Escherichia coli strain is fermented, the genes sirA, sirB or sirC or parts thereof are expressed individually or in combination and / or the gene cbiX or parts thereof in any conceivable combination, being opposite to the endogenous (naturally) existing activity of the enzymes of the sirohaem or cobalamin synthesis an increased enzyme activity is achieved.
  • the combination of the genes sIRAB, sirAC or sirABC or sirABcbiX, sirACcbiX or sirABCcbiX is advantageous.
  • the combination of the sirACcbiX genes is particularly preferred.
  • An equally advantageous variant of the present invention comprises a method in which a genetically modified Bacillus megaterium or Escherichia coli strain is fermented, the genes sirA, sirB or sirC or parts thereof individually or in combination and / or the gene cbiX or Parts of it are present in every conceivable combination compared to the genetically unmodified organism in an increased number of copies in the cell.
  • the number of copies can vary between 2 and several hundred and is achieved by introducing and replicating vectors or plasmids containing the aforementioned genes of sirohaem and possibly cobalamin synthesis in the transgenic cells.
  • the introduction of additional copies of the genes mentioned for sirohaem and possibly cobalamin synthesis into the genome of the transgenic organisms by homologous recombination is also included in the invention.
  • a combination of increasing the natural (endogenous) enzyme activity, increasing gene expression, increasing the number of gene copies, introducing the genes according to the invention or parts thereof, individually or in combination, into a microorganism, preferably a vitamin, is advantageous for increasing vitamin B12 productivity B12 production strain, particularly preferably of the species Bacillus megaterium.
  • the number of copies of the corresponding genes can be increased in order to achieve increased gene expression. Furthermore, the promoter and / or the regulatory region and / or the ribosome binding site, which is located upstream of the structural gene, are correspondingly changed so that expression takes place at an increased rate. Expression cassettes which are installed upstream of the structural gene act in the same way. With inducible promoters it is also possible to increase expression in the course of vitamin B12 production.
  • genes or gene constructs can either be present in plasmids with different copy numbers or can be integrated and amplified in the chromosome. Furthermore, the activity of the enzyme itself can also be increased or increased by preventing the breakdown of the enzyme protein.
  • an increased metabolic flow towards vitamin B12 can be achieved by changing the media composition and culture management.
  • vitamin B12 can be improved according to the invention by increasing the metabolic flow at key positions in the direction of vitamin B12 or corresponding precursors.
  • This can be done by fermentation engineering variants of the present method, such as fermentation under anaerobic conditions. Or fermentation takes place first under aerobic and then under anaerobic conditions.
  • a microorganism of the genus Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia or Propionibacterium is preferably used.
  • Bacillus megaterium, Escherichia coli or Salmonella typhimurium is particularly preferred.
  • B. megaterium is capable of an anaerobic lifestyle.
  • vitamin B12 production is higher under these conditions than under aerobic conditions.
  • the comparison of the vitamin B12 production of B. megaterium under aerobic and anaerobic growth conditions shows that the anaerobic vitamin B12 production in all strains investigated is at least 3 to 4 times higher than the aerobic vitamin B12 production (see FIGS. 1 to 3) and in particular 4). Further increases can be achieved by systematically optimizing the growth conditions and the composition of the culture medium and the bacterial strains used.
  • B. megaterium is fermented first aerobically and then anaerobically.
  • the transition from aerobic to anaerobic fermentation takes place in the exponential growth phase of the aerobically fermented cells. It is advantageous here if the transition from aerobic to anaerobic fermentation takes place in the middle or at the end, preferably at the end, of the exponential growth phase of the aerobically growing cells.
  • Anaerobic conditions both in the one-stage and in the two-stage fermentation of B. megaterium, are to be understood as those conditions which occur when the bacteria are transferred to anaerobic bottles after fermentation and fermented there.
  • the transfer to the anaerobic bottles takes place in particular in the two-stage process as soon as the aerobically grown bacterial cells are in the exponential growth phase. That is, after transfer to the anaerobic bottles, the bacteria consume the oxygen present there and no more oxygen is added.
  • These conditions can also be met with can be called semi-anaerobic.
  • the corresponding procedures are common laboratory practice and known to the person skilled in the art.
  • Oxygen supply is successively reduced so that semi-anaerobic conditions develop over time.
  • an aerobic cultivation pre-culture of the bacteria is not absolutely necessary.
  • the bacteria can also be grown under anaerobic conditions and then further fermented under semi-anaerobic or strictly anaerobic conditions. It is also conceivable that the inoculum is taken directly from the stock and used to produce vitamin B12 under anaerobic conditions.
  • vitamin B12 by means of Bacillus megaterium or Escherichia coli can be increased, for example, by adding at least cobalt to the culture medium.
  • the addition of, for example, betaine, methionine, glutamate, dimethylbenzimidazole or choline or their combinations also has an advantageous effect on vitamin B12 production.
  • the aforementioned compounds individually or their combinations in combination with cobalt can also be advantageous.
  • cobalt is strengthened, for example opposite Iron or magnesium ions, is built into common precursors of the biosynthetic pathway and thus, for example, the synthesis of sirohaem, hemoglobin or chlorophyll increases in favor of cobalamin (vitamin B12).
  • fermentation can also take place in a medium containing glucose as the C source.
  • a variant of the method according to the invention is also conceivable, in which the fermentation takes place in a medium containing glycerol as the C source.
  • This improved vitamin B12 production can be increased even further by converting the fermented Bacillus megaterium cells from aerobic growth conditions to anaerobic.
  • the use of a culture medium containing glycerol, cobalt and 5-aminolevulinic acid is advantageous.
  • By transferring the cultures from aerobic to anaerobic growth conditions a combination of high vitamin B 12 contents with high cell densities is possible.
  • the cultivation is advantageously carried out in a batch approach. Variants in which the fermentation takes place in a fed-batch approach or in continuous culture are also included according to the invention.
  • the present invention relates to the use of nucleotide sequences coding for the enzymes uroporphyrinogen-Ill-methyltransferase, sirohydrochlorin-iron chelatase, sirohydrochlorin-cobalt chelatase and precorrin-2-dehydrogenase individually or in combination for the production of vitamin B12.
  • the present invention furthermore relates to the use of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or parts thereof coding for the enzymes of sirohaem synthesis for the production of vitamin B12.
  • Object of the present invention. also includes the use of a gene structure according to the invention or a vector according to the invention for the production of vitamin B12.
  • the invention also relates to the use of the nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1 or parts thereof individually or in combination with the nucleotide sequence coding for the enzyme of the Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase or parts thereof or a gene structure of the kind according to the invention or a vector of the kind according to the invention for the production of a transgenic microorganism as previously explained.
  • This also includes the use of the nucleotide sequences according to the invention, a gene structure or a vector for the production of a vitamin B12 production strain, preferably of the genus Bacillus or Escherichia, particularly preferably of the species Bacillus megaterium or Escherichia. Equally included is the use of a transgenic microorganism, preferably of the Bacillus genus and particularly preferably of the Bacillus megaterium species, for the production of vitamin B12.
  • Chemicals and molecular biological agents Chemicals and molecular biological agents Chemicals, reagents, antibiotics and DEAE sephacels were obtained from Amersham-Pharmacia, growth media from Oxoid. Enzymes were obtained from Promega, Bioline or Invitrogen Life Technologies.
  • Bacterial strains, plasmids and primers All bacterial strains, plasmids and primers used in this work are listed in Tables 1, 2 and 3.
  • Titration reagent was KOH solution.
  • MgCI 2 20.0 mM titration reagent was NaOH solution.
  • the titration reagent was NaOH solution.
  • the titration reagent was NaOH solution.
  • Luria-Bertani Broth was used with complete medium as in Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning; a laboratory manual. 2 nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
  • Additives such as carbon sources, amino acids or antibiotics were either added to the media and autoclaved together or prepared as concentrated stock solutions in water and sterilized or sterile filtered. The substances were added to the autoclaved and cooled to below 50 ° C media. In the case of light-sensitive substances such as tetracycline, care was taken to incubate in the dark. The final concentrations commonly used were as follows:
  • Temperature-sensitive substances were sterile filtered, glassware was heat sterilized at 180 ° C for at least 3 h.
  • Aerobic bacterial cultures were incubated in baffled flasks at 37 ° C and a minimum speed of 180 rpm. The incubation times were varied according to the desired optical densities of the bacterial cultures. 5.3. Conditions for Bacillus megaterium growth Aerobic cultures were incubated in baffled flasks at 250 rpm and, unless otherwise stated, at 30 ° C for the best possible aeration. Anaerobic cultures were fermented in a volume of 100 ml in small anaerobic bottles at 30 ° C. and 100 rpm. In both cases, attention was paid to the use of qualitatively constant media, inoculation in a ratio of 1: 100 from overnight cultures, and the use of constant conditions for the overnight cultures.
  • the cell density of a bacterial culture was determined by measuring the optical density at 578 nm, it being assumed that an OD 578 of one corresponds to a cell number of 1 ⁇ 10 9 cells.
  • the strains Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 and DSMZ 2894 were used, for example, under anaerobic conditions in glucose-containing (LB full) medium and, at the end of the exponential growth phase, the vitamin B12 content in pmol / OD 578 was determined. At the same time, vitamin B12 production in the aerobic lifestyle was examined in the middle of the exponential growth phase. The results are shown in FIG. 4.
  • Vitamin B12 can be isolated in a manner known to those skilled in the art.
  • Aerobic ß. megafer / ⁇ / m cultures were in the middle of the exponential
  • Bacteriol., 178: 753-767) were incubated overnight on minimal medium containing methionine and cysteine at 37 ° C., scratched from the plate and at 40 ml of isotonic saline. After centrifugation, the cell sediment was resuspended in isotonic saline. The washed bacterial culture was carefully mixed with 400 ml of 47-48 ° C minimal medium agar containing cysteine. 10 ⁇ l of ß resuspended in deionized, sterile water and boiled in a water bath for 15 min. Megaterium samples were placed on the cooled plates and incubated at 37 ° C for 18 h.
  • the diameter of the grown salmonella colonies are then proportional to the content of vitamin B 12 in the applied ß. megaterium samples.
  • the content was determined by comparison with a calibration curve, made from the addition of 0.01, 0.1, 1, 10 and 40 pmol of vitamin B 12 . of vitamin B 2 in the examined samples. This standard method allows the detection of small amounts of vitamin B 12 in biological materials quickly and very reproducibly.
  • the determination of uroporphyrinogen III methyltransferase activity was determined on the basis of the conversion of uroporphinogen III to precorrin-2.
  • the production of Precorrin-2 was monitored by monitoring the fluorescence and Precorrin-2 after excitation at 380 nm and emission at 610 nm using a commercially available fluorometer.
  • One unit of enzyme activity is defined as 1 nM of Precorrin-2 produced per hour.
  • the activity of the chelating reaction for the cobalt insertion in sirohydrochlorin was determined by measuring the rate of decrease of the syrohydrochlorin fluorescence at ⁇ max of 376 nm using an extinction coefficient of 2.4 x 10 5 M “1 cm " 1 .
  • One unit of enzyme activity was determined as a decrease of 1 nM sirohydrochlorine per minute.
  • raw cell extracts containing between about 50 and 200 ⁇ g protein were reacted with sirohydrochlorin (50 ⁇ M) and cobalt (10 ⁇ M) with 50 mM Tris / HCl buffer at pH 8.
  • the dehydrogenase reaction was determined by forming syrohydrochlorin at ⁇ max of 376 nmm using an extinction coefficient of 2.4 ⁇ 10 5 M “1 cm ” 1 .
  • One unit of enzyme activity is defined as the production of 1 nM sirohydrochlorin per minute.
  • LB medium 50 ml LB medium were inoculated with 1 ml of an overnight culture of B. megaterium and incubated at 37 ° C. With an OD 578 of 1, the cells were centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C. for 15 minutes (RC 5B Plus, Sorvall) and resuspended in 5 ml of SMMP buffer. After adding lysozyme in SMMP buffer, the suspension was incubated at 37 ° C. for 60 min and protoplast formation was checked under a microscope.
  • the cell sediment was carefully resuspended in 5 ml of SMMP buffer and the centrifugation and washing step was carried out performed a second time. After adding 10% (v / v) glycerol, the protoplast suspension could now be portioned and frozen at -80 ° C.
  • 500 ⁇ l of the protoplast suspension were mixed with 0.5 to 1 ⁇ g DNA in SMMP buffer and 1.5 ml PEG-P solution was added. After incubation at Rt for 2 min, 5 ml of SMMP buffer were added, mixed gently and the suspension was centrifuged at 3000 rpm and Rt for 10 min (Centrifuge 5403, Eppendorf). Immediately afterwards, the supernatant was removed and the barely visible sediment was resuspended in 500 ⁇ l SMMP buffer. The suspension was incubated at 37 ° C. for 90 min with gentle shaking.
  • the sirABC operon was cloned by means of PCR. Genomic DNA from B. megaterium was prepared according to Sambrook et al., 1989 and the genes sirA, sirB and sirC were isolated from the genomic DNA using the primers according to Table 3 as follows: using the known sequence of the cobA gene coding for a methyltransferase, converting uroporphyrinogen-III to precorrin-2 (Robin et al., 1991, J. Bacteriol., 172 (15): 4893-6), primers were made complementary to the 3 'end of the gene sequence. These primers were in a vectorette system from Sigma-Genosys according to the method of Lilleberg et al.
  • primers were synthesized, with the help of which the three genes could be cloned individually and in combination in two different expression vectors.
  • PCR products from sirA, sirAB, sirABC and sirAC were produced and cloned into the EcoRI-BamHI site of pKK8668 (modification of plasmid pKK223.3) under the control of the tac promoter.
  • SirC was cloned as a BamHI-PstI fragment in pKK8668.
  • SirA, sirB and sirC were individually cloned as Ndel-BamHI fragments in pET14b (a T7 expression vector). This allows the corresponding proteins to be overexpressed with an N-terminal Histag.
  • Suitable plasmids for the transformation and overexpression of genes in B. megaterium are pWH1510 and pWH1520 and the plasmid-free overexpression strain B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599).
  • the control plasmid pWH1510 contains a spoVG-lacZ fusion in the interrupted xylA reading frame. SpoVG-lacZ denotes the fusion of a very strong ribosome binding sequence of a sporulation protein from B. subtilis (spoVG) with the gene coding for ⁇ -galactosidase (lacZ) from E. coli.
  • This plasmid is therefore ideally suited for the study of transformation efficiencies and
  • the plasmid pWH1520 acts as the actual cloning and expression vector. Both vectors have a tetracycline and an ampicillin resistance as well as the elements important for replication in E. coli and Bacillus spp. This makes them accessible for all techniques established in E. coli for descendants of the plasmid pBR322. Both vectors contain the B. megaterium xylA and xylR genes of the xyl operon with their regulatory sequences (Rygus, T. et al., 1991, Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulator / Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol.
  • XylA encodes xylose isomerase
  • xylR encodes a regulatory protein that exerts strong transcriptional control over xylA.
  • XylA is repressed in the absence of xylose.
  • xylose is added, there is an approx. 200-fold induction due to the depression of xylA.
  • a polylinker in the xylA reading frame With the help of a polylinker in the xylA reading frame, a fusion of genes with xylA is possible, which are then also under the strong transcriptional control of XylR. You can choose between the alternatives to form a transcription or translation fusion, since the xylA reading frame upstream of the polylinker is still completely intact.
  • SirB can act as sirohydrochlorin cobalt chelatase because it can restore vitamin B12 biosynthesis in the absence of cbiK.
  • the level of vitamin B12 formed is increased when SirC is also present.
  • Escherichia coli transformed according to the invention are therefore suitable for the production of vitamin B12.
  • E. coli 302 ⁇ a cysG-deficient strain without functional sirohaem synthase, which only grows on minimal medium when exogenous cysteine is added
  • plasmid pAR8766 pKK223.3 derivative containing cbiX from Bacillus megaterium plus cysG from E. coli ; Pharmacia; Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 1998, 335: 167-173
  • the plasmid pER179 pKK223.3 derivative, containing cobA gene from Pseudomonas denitrificans and cbiX gene from Bacillus megaterium; Pharmacia; Raux, E.
  • the genes were cloned separately into the vector pET14b under the control of the T7-inducible promoter T7. After transforming this
  • the proteins from the supernatant were purified according to standard methods and manufacturer's information using chromatography (metal
  • the Bacillus megaterium cbiX gene was derived from plasmid pAR8766, which contains the entire cop operon (Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 1998, 335: 167-173), as Sspl / SnaBI- Fraction isolated and cloned into the plasmid pKK223.3 (Pharmacia), resulting in the plasmid pAR8882. After transformation in E. coli 302 ⁇ a and addition of IPTG, the expression and purification took place analogously to the purification for SirA, SirB or SirC.
  • Escherichia coli is not able to synthesize vitamin B12 de novo because it lacks some enzymes that are required to convert precorrin-2 to cobinamide.
  • this ability can be restored in E. coli by inserting the missing cobalamin biosynthetic genes using a suitable plasmid.
  • a cysG strain is also used, all the enzymes for the conversion of uroporphyrinogen III to cobinamide are present again in the corresponding E. coli strain.
  • the need for enzymes for the synthesis of precorrin-2 and its oxidized product, sirohydrochlorin, in cobalamin biosynthesis was investigated. The following results show that vitamin B12 production is improved according to the invention in the presence of a precorrin-2 dehydrogenase.
  • CbiK is the cobalt chelatase from Salmonella enterica.
  • the E. coli cysG strain was transformed with a plasmid pER 185K D , which is a plasmid which contains all Salmonelle enterica cbi genes but has a deletion in the cbiK gene.
  • the E. coli were further cotransformed with another plasmid, which allows the investigation of the necessity of the genes coding for precorrin-II dehydrogenase. The following results were obtained:
  • CobA (representative of SirA), HemC and HemD were developed according to Raux et al. (1999, Bioorganic.Chem., 27: 100-118).
  • the mixture was mixed in 1 ml of 50 mM Tris / HCl pH8.
  • 0.1 mg SirB, 0.1 mg SirC, 0.5 mg NAD + and 21 ⁇ M CoCI 2 x6H 2 0 were added. This mixture was then incubated at 37 ° C. for 30 minutes and then analyzed by photospectrometry. As a control, spectra were run without SirB and SirC.
  • FIG. 7a shows that the synthesis of precorrin-2 in the coupled mixture containing PBG, HemC, HemD, CobA and SAM, after 20 minutes of incubation both in the presence and in the absence of NAD +, shows a spectrum with the specific spectrum for Precorrin-2 is comparable.
  • SirC a spectrum was obtained which corresponds to that of sirohydrochlorin with a maximum at 378 nm, comparable to the spectrum of the crude extract of E. coli pKK8668sirAC in FIG. 6.
  • a spectrum with an absorption maximum at 378 nm was also obtained by adding SirB and SirC (FIG. 7b). However, was When cobalt was added, a spectrum was obtained which had absorption maxima at 410 and 590 nm, which are equivalent to a spectrum of cobalt sirohydrochlorine. This means that SirB acts as a cobalt chelase.
  • E. coli ER 171 After transformation of E. coli ER 171 with the plasmid pKK8668 containing sirA (pKK8668sirA), the microorganism thus transformed was cultivated according to Example 5.3. As a control, the correspondingly non-transformed E. coli strain was cultivated under the same conditions. Gene expression was induced with IPTG and ALA at a concentration of 10 mg / l. The specific activity of the urophorphyrinogen III methyl transferase (sirA) was then determined by determining the precorrin-2 formed.
  • sirA urophorphyrinogen III methyl transferase
  • Precorrin-2 fluoresces and after excitation of the batch at 340 nm a clear emission of the fluorescent precorrin-2 can be measured at 600 nm (extinction coefficient: 8x10 5 M "1 L " 1 ).
  • the substrate Uroporphyrinogen-III does not fluoresce.
  • the urophorphyrinogen III methyl transferase activity was hardly measurable in the non-transformed E. coli strain.
  • an excess of the sirA-encoded enzyme Urophorphyrinogen-III-methyltransferase of at least 10 mg protein per liter of culture medium, with an enzyme activity of about 15,000 units per liter of culture medium, can be measured.
  • 1 unit corresponds to the production of 1 nmole Precorrin-2 per hour. Protein determination was carried out using the Protein Detection Kit (BioRad, Germany) based on the Bradford method (Anal. Biochem., 1989, 178, 263.268).
  • Bacillus megaterium strain DSMZ 509 was also transformed with the plasmid pKK8668 containing sirA (pKK8668sirA) and cultivated as described in Example 5.3.
  • the protein encoded by sirA is increasingly produced in the transformed B. megaterium strain, which is shown qualitatively by a red fluorescence of the cells as soon as the gene is expressed. Gene expression was induced with IPTG and ALA at a concentration of 10 mg / l.
  • B. megaterium strain had a specific activity of about 15,000
  • Urophorphyrinogen III methyl transferase measured (Bradford; Anal. Biochem., 1989, 178, 263.268). This resulted in an excess of SirA of 10 mg protein per liter of culture medium.
  • a clear emission of the fluorescent precorrin-2 can be measured at 600 nm (extinction coefficient: 8x10 5 M " V 1 ).
  • the substrate uroporphinogen-III does not fluoresce. This resulted in the non-transformed E. coli In the transformed E. coli strain, a specific enzyme activity of uroporphyrinogen-III-methyltransferase (SirA) of 2,500 units of precorrin-2 per liter of culture medium and a specific enzyme activity of precorrin-2-dehydrogenase (SirC) of 4,000 Units of Sirohydrochlorin per liter of culture medium can be determined.
  • SirA uroporphyrinogen-III-methyltransferase
  • SirC precorrin-2-dehydrogenase
  • sirohydrochlorin as an intermediate substance serves both as a substrate for the sirohaem-synthesizing enzyme encoded by sirB (sirohydrochlorin iron chelatase) and for cobalamin chelatase encoded by cbiX.
  • Figure 1 shows a comparison of the growth of ⁇ . megaterium DSMZ32 (wild type) at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.
  • Figure 2 shows a comparison of the growth of ⁇ . megaterium DSM509 at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.
  • Figure 3 shows a comparison of the growth of ⁇ . megaterium DSM2894 at 30 ° C under aerobic and anaerobic conditions. Anaerobic growth was measured with the addition of 10 mM nitrate (empty diamonds), 10 mM nitrite (empty triangles) and 10 mM fumarate (crosses). Fermentatives (empty circles) and aerobic growth (filled diamonds) took place in LB medium without additives. Samples were taken at the specified times and the optical density at 578 nm was determined.
  • Figure 4 shows the vitamin B ⁇ 2 production of ß. megaterium under aerobic and anaerobic growth conditions. The content of vitamin B 12 per cell mass was given in pmol / OD 578 for the wild-type strain ⁇ .
  • megaterium DSM32 aerobically grown (1) and anaerobically grown (2), for ß.
  • megaterium DSM2894 grown aerobically (5) and grown anaerobically (6).
  • Figure 5 shows an SDS-polyacrylamide gel from His-tagged, purified Sir A, SirB and SirC.
  • Lane 1 shows a molecular weight standard and lanes 2, 3 and 4 purified His-tagged protein SirA, SirB and SirC, respectively.
  • FIG. 6 shows a UV-Vis spectrum of accumulated pigments isolated from pKK8668SirA, pKK8668SirAB, pKK8668SirABC and pKK8668SirAC overexpressing bacterial strains of E. coli ER171, which were cultivated in the presence of ALA.
  • FIG. 7 shows UV-Vis spectra of in vitro accumulated pigments of a coupled Precorrin-2 enzyme batch with SirB and SirC.
  • FIG. 8 shows UV-Vis spectra of pigments of a coupled precorrin-2 enzyme batch accumulated in vitro with SirB and SirC with the addition of metals other than cobalt, namely Ni 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ and Fe 2+ .
  • the Absorption maxima of Ni 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ and Fe 2+ are 395 nm, 405 and 402 nm.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12, wobei eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-III ­methyltransferase und Precorrin-2-dehydrogenase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.

Description

Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12, bei dem wenigstens ein Enzym der Sirohaemsynthese eingesetzt wird.
Bereits in den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts wurde Vitamin B12 indirekt durch seine Wirkung auf den menschlichen Körper durch George Minot und William Murphy entdeckt (Stryer, L, 1988, In Biochemie, vierte Auflage, pp. 528-531 , Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, New York). Im Jahre 1948 konnte Vitamin B12 erstmals gereinigt und isoliert werden, so daß bereits acht Jahre später, im Jahre 1956, die Aufklärung seiner komplexen dreidimensionalen Kristallstruktur durch Dorothy Hodgkin gelang (Hodgkin, D. C. et al., 1956, Structure of Vitamin B12. Nature 176, 325-328 und Nature 178, 64-70). Die in der Natur vorkommenden Endprodukte der Vitamin B12-Biosynthese sind 5 - Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B12) und Methylcobalamin (MeCbl), während Vitamin B12 per Definition für Cyanocobalamin (CNCbl) steht, das die hauptsächlich von der Industrie hergestellte und gehandelte Form darstellt. In der vorliegenden Erfindung steht, wenn nicht speziell angegeben, Vitamin B12 einheitlich für die Bezeichnung aller drei analogen Moleküle.
Die Spezies B. megaterium wurde bereits vor über 100 Jahren (1884) das erste mal durch De Bary beschrieben. Obwohl generell als ein Bodenbakterium klassifiziert, läßt sich B. megaterium auch in diversen anderen Habitaten wie Seewasser, Sedimenten, Reis, getrocknetem Fleisch, Milch oder Bienenhonig nachweisen. Er tritt dabei oft in Begleitung von Pseudomonaden und Actinomyceten auf. B. megaterium ist, wie sein naher Verwandter Bacillus subtilis, ein Gram-postives Bakterium und zeichnet sich unter anderem aus durch seine relativ ausgeprägte, namengebende Größe von 2x5 μm, einem G+C-Gehalt von ca. 38 % und einer sehr ausgeprägten Fähigkeit zur Sporulation. Bereits geringste Mengen an Mangan im Wachstumsmedium genügen dieser Spezies, um eine vollständige Sporulation durchzuführen, eine Fähigkeit die nur noch vergleichbar ist mit der Sporulationseffizienz einiger thermophiler Bacillen. Aufgrund seiner Größe und seiner sehr effizienten Sporulation und Germination wurden vielfältige Untersuchungen der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge an B. megaterium durchgeführt, so daß mittlerweile mehr als 150 Gene in B. megaterium beschrieben sind, die an seiner Sporulation und Germination beteiligt sind. Physiologische Untersuchungen an B. megaterium (Priest, F. G. et al., 1988, A Numerical Classification of the Genus Bacillus, J. Gen. Microbiol. 134, 1847-1882) klassifizierten diese Spezies als obligat aerobes, Sporenbildendes Bakterium, das Urease-positiv und Voges-Proskauer-negativ ist und kein Nitrat reduzieren kann. Eine der herausragendsten Eigenschaften von B. megaterium ist seine Fähigkeit, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen für sich zu nutzen. So verwertet er eine sehr große Zahl von Zuckern und wurde z.B. in Korn-Sirup, Abfällen aus der Fleischindustrie und sogar in petrochemischen Abfällen gefunden. In Hinsicht auf diese Fähigkeit zur Metabolisierung eines äußerst breiten Spektrums von Kohlenstoffquellen, kann ß. megaterium ohne Einschränkung mit den Pseudomonaden gleichgesetzt werden (Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium). Für eine biotechnologische Herstellung von Vitamin B12 sind verschiedene Mikroorganismengruppen geeignet, wie z. B. Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Pseudomonas oder Propionibakterium.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die biotechnologische Herstellung von Vitamin B12 mit Mikroorganismen weiter zu optimieren. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von Vitamin B12, wobei eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase und Precorrin-2-dehydrogenase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von Vitamin B12, wobei eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase und Precorrin-2- dehydrogenase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur verbesserten Herstellung von Vitamin B12, wobei eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase, Precorrin-2-dehydrogenase und das an der Cobalamin- Synthese beteiligte Enzym Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Im Anschluß an die Fermentation kann das gebildete Vitamin B12 aus dem Fermentationsmedium aufbereitet werden. Maßnahmen dazu gehören zur gängigen Laborpraxis und werden hier nicht weiter ausgeführt.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren, bei dem wenigstens eine Uroporphyrinogen-III- methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2 und eine Precorrin-2- dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
In einer weiteren Variante ist ein Verfahren umfaßt, bei dem wenigstens eine Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2 und eine Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase gemäß SEQ ID No. 4 und eine Precorrin-2-dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechend endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Ferner umfaßt die Erfindung eine Variante eines Verfahrens, bei dem wenigstens eine Uroporphyrinogen-III-methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2, eine Precorrin-2-dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 und die Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase (CbiX) oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Varianten eines Verfahrens zur verbesserten Herstellung von Vitamin B12, bei dem eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase (sirA), Precorrin-2-dehydrogenase (sirC), Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase (sirB) sowie das an der Cobalamin- Synthese beteiligte Enzym Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase (cbiX) einzeln oder in Kombination in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
Unter einer endogenen Enzymaktivität ist eine solche zu verstehen, die aus der Anlage (der genetischen Grundausstattung) der Zelle oder des Organismus hervorgeht (natürlicher Weise vorliegt) und nicht durch äußere Einflüsse oder Zuführung von außen entstanden ist, d.h. das Niveau der jeweiligen Enzymaktivität vor der genetischen Manipulation des Organismus. Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner modifizierte Formen der genannten Enzyme.
Unter modifizierten Formen, die ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt sind, sind Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Terminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Unter endogener Enzymaktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung ist also die natürlicher Weise in einem Mikroorganismus vorkommende Aktivität eines Enzyms der Sirohaem- bzw. Cobalamin-Synthese zu verstehen. Die Synthese des Sirohaems erfolgt ausgehend von der Vorstufe Uroporphyrinogen-III. Die für die Umsetzung zum Sirohaem erforderlichen Reaktionsschritte und die daran beteiligten Biokatalysatoren sind dem Fachmann bekannt. Es handelt sich dabei prinzipiell um Biokatalysatoren mit folgenden Aktivitäten: Uroporphyrinogen-III- methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase oder Precorrin-2- dehydrogenase. Für die Umsetzung , zu Cobalamin (Vitamin B12) ist als wichtiger Biokatalysator das Enzym mit der Aktivität einer Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase zu nennen. Das Gen cbiX kodiert hierbei für das Enzym der Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase.
In wild typ, d.h. genetisch unveränderten Stämmen von Bacillus megaterium, Escherichia coli und Salmonella typhimurium sind die endogenen Enzymaktivitäten der Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase, Precorrin-2-dehydrogenase und Sirohydrochlorin-cobalt-chelatase so niedrig, daß sie kaum nachweisbar sind.
Im Rohzellenextrakt betragen die Aktivitäten der Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase weniger als 0,25 Units/mg Rohzellextrakt, der Precorrin- 2-dehydrogenase ca. 0,002 Units/mg Rohzellextrakt und für die chelatagen ca. 0,01 Unit/mg Rohzellextrakt. Hierbei ist ein Umit jeweils entsprechend 1 nM produziertes Precarrin-2 pro Stunde, 1 nM produziertes Sirohydrochlorin pro Minute und für die Chelatasen der Verbrauch (d.h. Verschwinden) von 1 nM Sirohydrochlorin pro Minute.
Demgegenüber weisen die transformierten Stämme erhöhte Aktivitäten auf (vgl. unten).
Dabei kann jedes der genannten Enzyme durch jeweils ein Gen kodiert sein oder beispielsweise ein Gen für ein multifunktionales Genprodukt kodieren, das die Aktivität von zwei oder allen drei der zuvor genannten Enzyme in sich vereint oder jede andere denkbare Kombination.
In einer Reihe von Mikroorganismen sind die Gene kodierend für die an der Synthese von Sirohaem und Cobalamin beteiligten Enzyme bereits bekannt. Die Nomenklatur dieser Gene und der entsprechenden Genprodukte ist vielgestaltig. So wird zum Beispiel die Sirohaemsynthese in Escherichia coli durch das multifunktionale Protein Sirohaemsynthase katalysiert, deren Gen mit cysG bezeichnet. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind zwei Enzyme spezifisch an der Sirohaemsynthese beteiligt (Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase sowie eine Dehydrogenase/ Chelatase), deren Gene mit metl und metδ bezeichnet werden. In Bacillus subtilis wiederum sind drei Gene, nämlich ylnD, ylnE und ylnF bekannt, die für die oben genannten Enzyme der Sirohaemsynthese kodieren.
Eine Vielzahl der Enzyme der Cobalaminsynthese sind ebenfalls bekannt. Beispielhaft sei Sirohydrochlorin-Chelatase genannt, die ein Enzym am Verzweigungspunkt der Sirohaem- und Cobalamin-Synthese darstellt. In Salmonella wird es mit CbiK oder CbiL bezeichnet. In Bacillus megaterium ist es unter dem Namen CbiX bekannt (Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 335: 159-166).
Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind auch bereits bekannte Sirohaem-Gene und die durch sie kodierten Enzyme der Sirohaemsynthese, ebenso wie die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und die sie kodierenden Enzyme sowie bereits bekannte Gene und durch sie kodierte Enzyme der Cobalaminsynthese in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 geeignet.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 enthaltend das sirABC-Operon aus Bacillus megaterium kodierend für Enzyme der Sirohaem-Synthese.
Erfindungsgemäß sind die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 kodierend für das gesamte Operon sirABC oder auch Teile der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 umfaßt. Unter den Teilen sind die einzelnen Kodierregionen der Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 gemeint, die jeweils einzeln oder in allen denkbaren Kombinationen, wie z.B. sirA, sirB, sirC, sirAB, sirAC, sirBC oder sirABC erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Denkbar sind hierbei auch alle möglichen Kombinationen mit Genen der Cobalaminsynthese, vorteilhafter Weise mit einem Gen kodierend für die Sirohydrochlorin-Chelatase (cbiX) oder Teilen davon.
In einer Variante der Erfindung ist eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele, kodierend von Nukleotid 1-780 für eine Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase (sirA) gemäß SEQ ID No. 2 umfaßt. Gleichermaßen sind eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder 3 oder deren Allele, kodierend von Nukleotid 761-1561 für eine Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase (sirB) gemäß SEQ ID No. 4 Gegenstand der vorliegenden Erfindung, sowie eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 oder deren Allele, kodierend von Nukleotid 1542-2150 für eine Precorrin-2-dehydrogenase (sirC) gemäß SEQ ID No. 6.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist jegliche Kombination der genannten Gene der Sirohaemsynthese mit dem Gen cbiX kodierend für eine Sirohydrochlorin-Chelatase sowie entsprechende Allele, umfaßt.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein. Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon- Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der
Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in- vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Unter hybridisierenden Nukleotidsequenzen im Sinne der Erfindung sind Oligo- oder Polynukleotide zu verstehen, die unter Standard-Hybrid i- sierungsbedingungen an die entsprechende erfindungsgemäße Nukleotidsequenz binden. Der Begriff Standard-
Hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente und weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Bedingungen sind unter anderem bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,) beschrieben. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten Standard-Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren der zuvor genannten Art, das sich dadurch auszeichnet, daß die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1 und sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1, 3 oder 5 verstärkt exprimiert und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen.
In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1 , sirB von Nukleotid 761-1561 gemäß SEQ ID No. 1 oder 3 und sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 verstärkt exprimiert und/oder liegen in erhöhter Kopienzahl vor. In einer besonders vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfaßt, bei dem die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1 , sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 und das für das Enzym der Cobalamin-Synthese kodierende Gen cbiX verstärkt exprimiert und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen.
Bevorzugterweise warden die obigen Varianten durch Fermentation einer Bacillus megaterium enthaltenden Kultur durchgeführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2, Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase gemäß SEQ ID No. 4 sowie Precorrin-2- dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6, die durch das sirABC-Operon oder Teile davon aus Bacillus megaterium kodiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner modifizierte Formen der genannten Enzyme.
Unter modifizierten Formen, die ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt sind, sind Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Ferner zeichnet sich die erfindungsgemäße Sirohydrochlorin-Eisen- chelatase gemäß SEQ ID No. 4 ferner dadurch aus, daß sie zusätzlich eine Cobaltchelatase-Aktitivät aufweist.
Neben Eisen und Cobalt werden von dem erfindungsgemäßen Enyzm gemäß SEQ ID No. 4 mit Chelatase-Aktivität auch Nickel-, Zink, und Kupfer-Ionen akzeptiert.
Entsprechende photospektrometrische Untersuchungen von Reaktionsansätzen, die diese Metallionen enthalten zeigten, daß SirB als Eisen-Chelatase und in-vitro auch als Cobalt-Chelatase agieren kann und darüber hinaus eine Reihe weiterer Metallo-isobacteriochlorine synthetisieren kann.
Bei einem Aminosäuresequenzvergleich von SirB und CbiX finden sich große Übereinstimmungen. Die Aktivitäten von SirB und CbiX sind vergleichbar. Allerdings weist CbiX im C-Teminus im Vergleich zu SirB eine ungewöhnliche Anhäufung von Histidin-Resten auf. Ferner konnte in Komplementationsstudien mit Cystein-auxotrophen Mutanten gezeigt werden, daß die aus Bacillus megaterium bekannte Sirohydrochlorin- Chelatase, kodiert durch das Gen cbiX, eine höhere Affinität zu Cobalt als zu Eisen aufweist.
Zur erfindungsgemäßen Herstellung von Vitamin B12 durch biotechnologische Verfahren ist somit wenigstens der Einsatz einer Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase und/oder einer Sirohydrochlorin-Cobalt- Chelatase in Kombination mit anderen an der Sirohaem- bzw. Cobalamin- Synthese beteiligten Enzyme, in einem geeigneten Organismus denkbar, wobei durch geeignete Fermentationsbedingungen der Stoffwechselfluß zu Gunsten von Cobalamin gesteuert werden kann.
Bei den Fermentationsbedingungen kann es sich um eine Kultivierung des Mikroorganismus unter aeroben, semi-anaeroben oder anaeroben Bedingungen handeln. Ferner sind alle denkbaren Varationen einer Verschiebung (shift) von aeroben zu aneroben Bedingungen oder umgekeht umfaßt.
Zur biotechnologischen Herstellung von Vitamin B12 wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Kultur enthaltend einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia oder Propionibakterium oder eine Mischung dieser Mikroorganismen fermentiert. Beispielsweise kann als Propionibakterium die Spezies Propionibacterium shermanii verwendet werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird in einem Verfahren der zuvor genannten Art zur Herstellung von Vitamin B12 eine Kultur enthaltend Salmonella typhimurium fermentiert oder Escherichia coli, oder Bacillus megaterium.
Der Einsatz von Bacillus megaterium ist wirtschaftlich sehr interessant, da er eine Reihe von Vorteilen für den Einsatz in der biotechnologischen Herstellung verschiedener, industriell interessanter Produkte aufweist.
Beispielsweise weist B. megaterium keine alkalischen Proteasen auf, so daß bei der Produktion heterologer Proteine kaum eine Degradation beobachtet wurde. Zudem ist bekannt, daß B. megaterium Produkte von kommerziellem Interesse effekiv sezerniert, wie dies z. B. bei der Produktion von α- und ß-Amylase ausgenutzt wird. Außerdem ist es mit B. megaterium durch seine Größe möglich, eine hohe Biomasse anzusammeln, bevor eine zu hohe Populationsdichte zum Absterben führt. Von größter Bedeutung bei der industriellen Produktion mittels B. megaterium erweist sich weiterhin der günstige Umstand, daß diese Spezies in der Lage ist, aus Abfällen und minderwertigen Stoffen Produkte hohen Wertes und höchster Qualität herzustellen. Diese Möglichkeit der Metabolisierung eines enorm breiten Substratspektrums spiegelt sich auch wieder in der Anwendung von B. megaterium als Bodendetoxifizierer, der selbst Cyanide, Herbizide und persistente Pestizide abzubauen vermag. Schließlich ist die Tatsache, daß B. megaterium vollkommen apathogen ist und auch keine Toxine produziert, insbesondere in der Lebensmittel- und Kosmetikproduktion von größter Wichtigkeit. Wegen dieser mannigfaltigen Vorzüge wird B. megaterium bereits heute in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen eingesetzt, wie der Produktion von - und ß- Amylase, Penicillin-Amidase, dem Aufbereiten toxischer Abfälle oder der aeroben Vitamin B12-Produktion (zusammengefaßt in Vary, P. S., 1994, Microbiology, 40, 1001-1013, Prime time for Bacillus megaterium).
Grundsätzlich können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Stämme der Gattung Bacillus, Salmonella, Propionibacterium, Escherichia oder Pseudomonas oder Mischungen davon eingesetzt werden, bei denen gegenüber den entsprechenden Wildtypen wenigstens die Aktivitäten der Enzyme der Sirohaem-Synthese und ggf. der Cobalamin-Synthese erhöht sind. Hierzu zählen insbesondere genetisch veränderte Mikroorganismen, die wenigstens eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl der Nukleotidsequenzen kodierend für Enyzme der Sirohaem-Synthese und ggf. der Cobalamin-Synthese im Vergleich zu den entsprechenden Wildtypen aufweisen.
Bevorzugt ist der Einsatz von Vitamin B12-Produktionsstämmen.
Besonders bevorzugt ist als Salmonella-Stamm der (genetisch veränderte) Stamm AR3612 (Raux et al, 1996; J. Bacteriol., 178, (3): 753-767). Für
Organismen der Gattung Propionibakterien hat sich die Spezies Propionibacterium shermanii als besonders geeignet herausgestellt. Ganz besonders bevorzugt sind der Bacillus megaterium Stamm DSMZ 509 sowie alle üblichen B. megaterium-Stämme, die als Vitamin B12- Produktionsstämme geeignet sind.
Unter Vitamin B12-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Mikroorganismen-Stämme zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Vitamin B12 oder dessen Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Zu den erfindungsgemäß einsetzbaren Mikroorganismen zählen hierbei sämtliche bereits bekannte Vitamin B12-
Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Bacillus oder homologer Organismen. Zu den erfindungsgemäß vorteilhaften Stämmen gehören insbesondere die Stämme von B. megaterium DSMZ 509 und DSMZ 2894.
Es können jedoch auch Stämme zur Produktion von Vitamin B12 eingesetzt werden, die ohne die Erfindung nicht in der Lage sind, Vitamin B12 zu produzieren, wie z. B. Escherichia coli Stämme ER 185 oder ER 171 (vgl Tabelle 1 unten). E. coli ist nicht in der Lage, Vitamin B12 de novo zu synthetisieren, da ihm einige Enzyme fehlen, die z. B. in Salmonella oder Bacillus vorhanden sind und im Laufe der Evolution verlorengingen. Es ist allerdings möglich, diese fehlenden Enzyme durch Transformation mittels eines geeigneten diese Gene umfassenden Plasmids wieder einzubringen. Verwendet man dabei ferner einen cysG Stamm, dann sind auch die Enzyme zur Umsetzung von Uroporphyrinogen III zu Cobinamid in E. coli vorhanden. , Es konnte gezeigt werden, (vgl. unten und Tabelle 4), daß durch erfindungsgemäße Erhöhung der Enzymaktivitäten bzw. hier Einbringung der Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-Chelatase und Precorrin-2-dehydrogenase die Vitamin B12 Synthese in E. coli verbessert bzw. ermöglicht wird.
Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenese oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. Interessante Ansatzpunkte zur gezielten gentechnischen Manipulation sind u.a. Verzweigungsstellen der zum Vitamin B12 führenden Biosynthesewege, durch die der Stoffwechselfluß gezielt in Richtung einer maximalen Vitamin B12-Produktion gesteuert werden kann. Gezielte Modifikationen von an der Regulation des Stoffwechesflusses beteiligten Genen schließt auch Untersuchungen und Veränderungen der regulatorischen Bereiche vor und hinter den Strukturgenen ein, wie z. B. die Optimierung und/oder den Austausch von Promotoren, Enhancern, Terminatoren, Ribosomenbindungsstellen etc. Auch die Verbesserung der Stabilität der DNA, mRNA oder der durch sie kodierten Proteine, beispielsweise durch die Verringerung oder Verhinderung des Abbaus durch Nukleasen bzw. Proteasen ist erfindungsgemäß umfaßt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Genstruktur enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz des sir-Operons der zuvor genannten Art oder Teile davon, sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion. Erfindungsgemäß kann in einer Genstruktur der zuvor genannten Art zusätzlich eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Sirohydrochlorin-Coblat-Chelatase (cbiX) oder Teile davon enthalten sein. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier das ß-Galakosidase- oder Arabinose-System genannt.
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Sambrook, J. et al., 1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind.
Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Erfindungsgemäß umfaßt ist auch ein Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz des sir-Operons der zuvor genannten Art oder Teile davon oder eine Genstruktur der zuvor genannten Art, sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszellgenom. Beispiele für solche zusätzlichen Sequenzen sind in der Literatur zahlreich beschrieben und werden nicht weiter ausgeführt.
Erfindungsgemäß ist damit auch ein Vektor umfaßt, der zusätzlich zu den genannten Nukleotidsequenzen des sir-Operons oder Teilen davon eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Sirohydrochlorin-Coblat-Chelatase oder Teile davon enthält.
Geeignete Systeme für die Transformationen und Überexpressionen der erwähnten Gene sind beispielsweise die Plasmide pACYC184 (New England Biolabs), pKK8668 (Pharmacia) sowie pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320, die bei Rygus, T. et al. (1991, Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599) beschrieben sind. Die genannten Systeme sind jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein transgener Mikroorganismus zum Einsatz in ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 der zuvor genannten Art, der sich dadurch auszeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer Nukleotidsequenz kodierend für eine Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase und Precorrin-2-dehydrogenase aufweist.
Ebenso ist ein transgener Mikroorganismus zum Einsatz in ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 der zuvor genannten Art umfaßt, der sich dadurch auszeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer Nukleotidsequenz kodierend für eine Uroporphyrinogen- lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase und Precorrin-2- dehydrogenase aufweist. Gleichermaßen betrifft die vorliegende Erfindung einen transgenen Mikroorganismus zum Einsatz in ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 der zuvor genannten Art, der er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer Nukleotidsequenz kodierend für eine Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Cobalt-chelatase und Precorrin-2-dehydrogenase aufweist.
Hierbei kann es sich um eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl beispielsweise einer Nukleotidsequenz handeln, die ein multifunktionelles Enzym kodiert. Gleichermaßen kann eine Nukleotidsequenz verstärkt exprimiert werden und/oder in erhöhter Kopienzahl in dem transgenen Mikroorganismus vorliegen, die für mehrere Enzyme der Sirohaemsynthese kodiert, da sie beispielsweise ein Operon oder Gencluster enthält.
Bevorzugt enthält der erfindungsgemäß transgene Mikroorganismus wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 enthaltend das sirABC-Operon aus Bacillus megaterium oder Teile davon. Vorteilhaft ist ebenso ein transgener Mikroorganismus, der eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl wenigstens einer isolierten Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele kodierend von Nukleotid 1-780 für eine Uroporphyrinogen-III-methyltransferase (sirA) gemäß SEQ ID No. 2, kodierend von Nukleotid 761-1561 für eine Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase (sirB) gemäß SEQ ID No. 4 und/oder kodierend von Nukleotid 1542-2150 für eine Precorrin-2-dehydrogenase (sirC) gemäß SEQ ID No. 6 umfaßt. Gleichermaßen vorteilhaft ist ein erfindungsgemäßer transgener Mikroorganismus, der eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl wenigstens einer isolierten Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile oder Allele davon enthält und zusätzlich eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl wenigstens einer Nukleotidsequenz kodierend für ein Enzym der Cobalamin-Biosynthese, vorteilhafter Weise der Sirohydrochlorin- Cobalt-Chelatase, aufweist.
Dies schließt ein, daß in einer Variante der vorliegenden Erfindung ein transgener Mikroorganismus Einsatz findet, der Teile der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 aufweist, wobei diese Teile bevorzugt verstärkt exprimiert werden und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen. Bevorzugt handelt es sich dabei um Teilbereiche der zuvor näher definierten Art, die kodierende Funktion (sirA, sirB oder sirC) besitzen. Dabei können die Teilsequenzen einzeln oder in beliebiger Kombination vorliegen, sowie mit regulatorischen Sequenzen, wie z.B. Promotoren, Enhancern, Terminatoren oder dergleichen operativ verknüpft sein. Kombinationen der genannten Sequenzen des sir-Operons mit Sequenzen kodierend für Enzyme des Cobalamin-Syntheseweges, z.B. des cbiX-Gens oder Teilen davon, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt.
Ferner ist ein transgener Mikroorganismus Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der in replizierender Form eine erfindungsgemäße Genstruktur oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Vorteilhaft ist ein transgener Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia oder Propionibakterium. Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäß transgenen Mikroorganismus um die Spezies Bacillus megaterium, Escherichia coli oder Salmonella typhimurium.
In einer vorteilhaften Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Bacillus megaterium- oder Escherichia coli-Stamm fermentiert, dessen Gene sirA, sirB oder sirC oder Teile davon einzeln oder in Kombination und/oder das Gen cbiX oder Teile davon in jeder denkbaren Kombination verstärkt exprimiert werden, wobei gegenüber der endogen (natürlicherweise) vorliegenden Aktivität der Enzyme der Sirohaem- bzw. Cobalamin-Synthese eine erhöhte Enzymaktivität erreicht wird. Vorteilhaft ist dabei die Kombination der Gene sirAB, sirAC oder sirABC oder sirABcbiX, sirACcbiX oder sirABCcbiX. Besonders bevorzugt ist die Kombination der Gene sirACcbiX.
In einer gleichermaßen vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren umfaßt, bei dem ein genetisch veränderter Bacillus megaterium- oder Escherichia coli-Stamm fermentiert wird, dessen Gene sirA, sirB oder sirC oder Teile davon einzeln oder in Kombination und/oder das Gen cbiX oder Teile davon in jeder denkbaren Kombination gegenüber dem genetisch nicht veränderten Organismus in erhöhter Kopienzahl in der Zelle vorliegen. Die Anzahl der Kopien kann zwischen 2 bis mehrere hundert variieren und wird durch das Einbringen und die Replikation von Vektoren bzw. Plasmiden enthaltend die zuvor genannten Gene der Sirohaem- und ggf. Cobalamin-Synthese in den transgenen Zellen erreicht. Auch das Einbringen von zusätzlichen Kopien der genannten Gene der Sirohaem- und ggf. Cobalamin-Synthese in das Genom der transgenen Organismen durch homologe Rekombination ist erfindungsgemäß umfaßt.
Vorteilhaft zur Steigerung der Vitamin-B12-Produktivität ist eine Kombination von Steigerung der natürlichen (endogenen) Enzymaktivität, Erhöhung der Genexpression, Erhöhung der Genkopienzahl, das Einbringen der erfindungsgemäßen Gene oder Teile davon, einzeln oder in Kombination, in einen Mikroorganismus, bevorzugt einen Vitamin B12- Produktionsstamm, besonders bevorzugt der Spezies Bacillus megaterium.
Zur Erzielung einer verstärkten Genexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der Vitamin B12-Produktion zu steigern.
Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden.
Ferner kann ein verstärkter Stoffwechselfluß in Richtung Vitamin B12 durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Ferner kann die Herstellung von Vitamin B12 erfindungsgemäß dadurch verbessert werden, daß der Stoffwechselfluß an Schlüsselpositionen verstärkt in Richtung von Vitamin B12 oder entsprechender Vorstufen geleitet wird. Dies kann durch fermentationstechnische Varianten des vorliegenden Verfahrens erfolgen, wie z.B. eine Fermentation unter anaeroben Bedingungen. Oder die Fermentation erfolgt zunächst unter aeroben und anschließend unter anaeroben Bedingungen. Bevorzugt wird dazu ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Salmonella, Pseudomonas, Escherichia oder Propionibakterium eingesetzt. Besonders bevorzugt ist Bacillus megaterium, Escherichia coli oder Salmonella typhimurium. B. megaterium ist zu einer anaeroben Lebensweise fähig. Außerdem ist unter diesen Bedingungen die Vitamin B12 Produktion höher, als unter aeroben Bedingungen. Der Vergleich der Vitamin B12 Produktion von B. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen ergibt, daß die anaerobe Vitamin B12 Produktion bei allen untersuchten Stämmen gegenüber der aeroben Vitamin B12 Produktion wenigstens um den Faktor 3 bis 4 gesteigert ist (vgl. Fig. 1 bis 3 und insbesondere 4). Weitere Steigerungen lassen sich durch eine systematische Optimierung der Wachstumsbedingungen und der Zusammensetzung des Kulturmediums sowie der eingesetzten Bakterienstämme erreichen.
Ferner ist es denkbar, daß in einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung B. megaterium zunächst aerob und anschließend anaerob fermentiert wird. In einer vorteilhaften Variante erfolgt der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der exponentiellen Wachstumsphase der aerob fermentierten Zellen. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn der Übergang von der aeroben zur anaeroben Fermentation in der Mitte oder am Ende, bevorzugt am Ende, der exponentiellen Wachstumsphase der aerob wachsenden Zellen erfolgt.
Unter anaeroben Bedingungen, sowohl in der einstufigen, als auch in der zweistufigen Fermentation von B. megaterium sind diejenigen Bedingungen zu verstehen, die eintreten, wenn die Bakterien nach aerober Anzucht in Anaerobierflaschen überführt und dort fermentiert werden. Der Zeitpunkt der Überführung in die Anaerobierflaschen erfolgt insbesondere bei dem zweistufigen Verfahren, sobald sich die aerob angezüchteten Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. D.h. nach der Überführung in die Anaerobierflaschen verbrauchen die Bakterien den dort vorliegenden Sauerstoff und es wird kein Sauerstoff mehr zugeführt. Diese Bedingungen können auch mit semi-anaerob bezeichnet werden. Die entsprechenden Vorgehensweisen sind gängige Laborpraxis und dem Fachmann bekannt.
Vergleichbare Bedingungen herrschen auch vor, wenn die Bakterien in einem Fermenter zunächst aerob kultiviert werden und dann die
Sauerstoffzufuhr sukzessive reduziert wird, so daß sich mit der Zeit semi- anaerobe Bedingungen einstellen.
In einer besonderen Variante der Fermentation können auch beispielsweise durch die Zugabe von Reduktionsmitteln zum
Kulturmedium strikt anaerobe Bedingungen geschaffen werden.
Generell ist für eine Fermentation unter anaeroben Bedingungen (ob nun semi-anaerob oder strikt anaerob), eine aerobe Anzucht (Vorkultur) der Bakterien nicht zwingend erforderlich. D. h. die Bakterien können auch unter anaeroben Bedinungen angezüchtet werden und anschließend unter semi-anaeroben oder strikt anaeroben Bedingungen weiter fermentiert werden. Denkbar ist auch, daß das Inocculum direkt aus der Stammhaltung entnommen und zur Herstellung von Vitamin B12 unter anaeroben Bedingungen eingesetzt wird.
Entsprechende Bedingungen und Verfahren im Rahmen des fachmännischen Könnens sind auch bei anderen Stämmen anwendbar.
Ferner ist denkbar, daß die Herstellung von Vitamin B12 mittels Bacillus megaterium oder Escherichia coli beispielsweise dadurch gesteigert werden kann, daß dem Kulturmedium wenigstens Cobalt zugesetzt wird. Auch der Zusatz von beispielsweise Betain, Methionin, Glutamat, Dimethylbenzimidazol oder Cholin oder deren Kombinationen wirkt sich vorteilhaft auf die Vitamin B12 Produktion aus. Vorteilhaft können auch die zuvor genannten Verbindungen einzeln oder deren Kombinationen in Kombination mit Cobalt sein. Es ist denkbar, daß durch Zugabe von Stoffen wie Cobalt erreicht wird, daß Cobalt verstärkt, z.B. gegenüber Eisen- oder Magnesium-Ionen, in gemeinsame Vorstufen des Biosyntheseweges eingebaut wird und so verstärkt beispielsweise die Synthese von Sirohaem, Hämoglobin oder Chlorophyll zu Gunsten von Cobalamin (Vitamin B12) erfolgt.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung ist es denkbar, eine Fermentierung unter aeroben Bedingungen in einem Medium enthaltend wenigstens Cobalt und/oder wenigstens Cobalt und 5-Aminolävulinsäure durchzuführen.
Erfindungsgemäß kann auch eine Fermentierung in Medium enthaltend Glukose als C-Quelle erfolgen. Denkbar ist auch eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem die Fermentierung in einem Medium enthaltend Glycerin als C-Quelle erfolgt.
Bei der Fermentierung von Bacillus megaterium mit Glycerin als Kohlenstoffquelle wird generell eine höhere Zelldichte erreicht als mit Glucose. Interessanterweise führt dabei unter aeroben Fermentationsbedingungen die gemeinsame Zugabe von Cobalt und 5- Aminoiävulinsäure zu einer höheren Vitamin B12 Produktion als in entsprechendem Medium ohne Zusätze.
Diese verbesserte Vitamin B12 Produktion kann noch weiter gesteigert werden, indem die fermentierten Bacillus megaterium Zellen von aeroben Wachstumsbedingungen zu anaeroben überführt werden. Die Verwendung eines Kulturmediums enthaltend Glycerin, Cobalt und 5- Aminolävulinsäure ist vorteilhaft. Durch das Transferieren der Kulturen von aeroben zu anaeroben Wachstumsbedingungen ist eine Kombination von hohen Vitamin B 12-Gehalten mit hohen Zelldichten möglich. Vorteilhaft erfolgt die Kultivierung in einem batch-Ansatz. Varianten, bei der die Fermentation in einem fed-batch-Ansatz oder in kontinuierlicher Kultur erfolgen sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleotidsequenzen kodierend für die Enzyme Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase, Sirohydrochlorin- Cobalt-Chelatase und Precorrin-2-dehydrogenase einzeln oder in Kombination zur Herstellung von Vitamin B12.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile davon kodierend für die Enzyme der Sirohaemsynthese zur Herstellung von Vitamin B12. Gleichermaßen ist die Verwendung der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile davon kodierend für Enzyme der Sirohaemsynthese einzeln oder in Kombination mit der Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym der Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase zur Herstellung von Vitamin B12 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dabei ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Genstruktur oder eines erfindungsgemäßen Vektors zur Herstellung von Vitamin B12 umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder Teile davon einzeln oder in Kombination mit der Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym der Sirohydrochlorin-Cobalt- Chelatase oder Teile davon oder einer Genstruktur der erfindungsgemäßen Art oder eines Vektors der erfindungsgemäßen Art zur Herstellung eines transgenen Mikroorganismus wie zuvor erläutert. Dies schließt auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, einer Genstruktur oder eines Vektors zur Herstellung eines Vitamin B12-Produktionsstammes, bevorzugt der Gattung Bacillus oder Escherichia, besonders bevorzugt der Spezies Bacillus megaterium oder Escherichia, ein. Gleichermaßen umfaßt ist die Verwendung eines transgenen Mikroorganismus, bevorzugt der Gattung Bacillus und besonders bevorzugt der Spezies Bacillus megaterium, zur Herstellung von Vitamin B12.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Sie wirken sich jedoch nicht limitierend auf die Erfindung aus.
1. Chemikalien und molekularbiologische Agenzien Chemikalien, Reagenzien, Antibiotika und DEAE sephacels wurden von Amersham-Pharmacia, Wachstumsmedien bei Oxoid bezogen. Enzyme wurden bei Promega, Bioline oder Invitrogen Life Technologies bezogen.
2. Bakterienstämme, Plasmide und Primer Alle in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme, Plasmide und Primer sind in den Tabellen 1, 2 und 3 aufgeführt.
3. Puffer und Lösungen 3.1. Minimalmedium E. coli-Minimalmedium κ2HP04 60.3 mM mM
(NH4)2S04 7.6 mM
Natriumeitrat 1.7 mM
MgS04 1.0 mM
D-Glucose 10.1 mM
Thiamin 3.0 μM
Casaminoacids 0.025
% (w/v)
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt.
Mopso-Minimalmedium
Mopso (pH 7.0) 50.0 mM
Tricin (pH 7.0) 5.0 mM MgCI2 520.0 μM
K2S04 276.0 μM FeS04 50.0 μM
CaCI2 1 -0 mM
MnCI2 100.0 μM
NaCI 50.0 mM
KCI 10.0 mM K2HP04 1.3 mM
nM
C0CI2 300.0 pM
CuS04 100.0 pM ZnS04 100.0 pM
D-Glucose 20.2 mM
NH4CI 37.4 mM
Titrationsreagenz war KOH-Lösung.
S. typhimurium-Minimalmedium
NaCI 8.6 mM
Na2HP04 33.7 mM mM
NH4CI 18.7 mM
D-Glucose 20.2 mM
MgS04 2.0 mM CaC 0.1 mM
Für feste Medien wurden 15 g/l Agar-Agar zugesetzt.
3.2. Lösungen zur Protoplastentransformation von B. megaterium SMMP-Puffer
Antibiotic Medium No. 3 (Difco) 17.5 g/l
Saccharose 500.0 mM
Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0 mM
MgCI2 20.0 mM Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
PEG-P-Lösung
PEG 6000 40.0
% (w/v) Saccharose 500.0 mM
Na-Maleinat (pH 6.5) 20.0
- mM
MgCI2 20.0 mM
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
cR5 Top-Agar
Saccharose 300.0 mM
Mops (pH 7.3) 31.1 mM
NaOH 15.0 mM L-Prolin 52.1 mM
D-Glucose 50.5 mM
K2S04 1.3 mM MgCI2 x 6 H20 45.3 mM
KH2P04 313.0 μM CaCI2 13.8 mM Agar-Agar 4.0 g/ι
Casaminoacids 0.2 g/l
Hefe-Extrakt 10.0 g/ι
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung.
4. Medien und Medienzusätze 4.1 Medien
Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, gearbeitet.
4.2. Zusätze
Zusätze wie Kohlenstoffquellen, Aminosäuren oder Antibiotika wurden entweder den Medien zugefügt und zusammen autoklaviert oder als konzentrierte Stammlösungen in Wasser angesetzt und sterilisiert oder sterilfiltriert. Die Substanzen wurden den autoklavierten und auf unter 50°C abgekühlten Medien zugesetzt. Bei lichtempfindlichen Substanzen, wie Tetracyclin wurde auf Inkubation im Dunkeln geachtet. Die üblicherweise verwendeten Endkonzentrationen waren folgende:
Ampicillin 296 μM
Tetracyclin 21 μM ALA 298 μM
Häm 153 μM X-Gal 98 μM
Methionin 335 μM
Cystein 285 μM
Natriumnitrat 10 mM
Natriumnitrit 10 mM Dinatriumfumarat 10 mM
Glucose 10 mM
Ammoniumchlorid 37 mM
Xylose 33 mM
Lysozym 10 μg/ml Casaminoacids 0.025
% (w/v)
5. Mikrobiologische Techniken 5.1. Sterilisation Soweit nicht anders angegeben wurden sämtliche Medien und Puffer für
20 min bei 120°C und 1 bar Überdruck dampfsterilisiert.
Temperaturempfindliche Substanzen wurden sterilfiltriert, Glaswaren mindestens 3 h bei 180°C hitzesterilisiert.
5.2.Allgemeine Wachstumsbedingungen
Aerobe Bakterienkulturen wurden in Schikanekolben bei 37 °C und einer minimalen Drehzahl von 180 rpm inkubiert. Die Inkubationszeiten wurden entsprechend den erwünschten optischen Dichten der Bakterienkulturen variiert. 5.3.Bedingunqen für Bacillus megaterium Wachstum Aerobe Kulturen wurden für eine bestmögliche Durchlüftung in Schikanekolben bei 250 rpm und, falls nicht anders angegeben, bei 30 °C inkubiert. Anaerobe Kulturen wurden in einem Volumen von 100 ml in kleinen Anaerobenflaschen bei 30 °C und 100 rpm fermentiert. In beiden Fällen wurde auf die Verwendung qualitativ konstanter Medien, Animpfung im Verhältnis 1 :100 aus Übernachtkulturen, sowie Verwendung gleichbleibender Bedingungen für die Übernachtkulturen geachtet.
5.4. Bestimmung der Zelldichte
Die Zelldichte einer Bakterienkultur wurde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm bestimmt, wobei davon ausgegangen wurde, daß einer OD578 von eins eine Zellzahl von 1x109 Zellen entspricht.
5.5. Vergleichende Wachstumsuntersuchungen
Es wurden vergleichende Untersuchungen zum aeroben und anaroben Wachstumsverhalten verschiedener Bacillus megaterium-Stämme durchgeführt, die in den Figuren 1 , 2 und 3 dargestellt sind. Bei den eingesetzten Stämmen handelt es sich um die Stämme B. megaterium DSMZ 32 (Wildtyp) oder die unter aeroben Bedingungen zur Vitamin B12- Produktion geeigneten „Produktionsstämme" DSMZ 509 und DSMZ 2894. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf den Einsatz dieser Stämme limitiert. Denkbar sind auch andere zur Herstellung von Vitamin B12 geeignete Stämme, eingeschlossen genetisch veränderte Bakterienstämme, die durch klassische Mutagenesen oder gezielte molekularbiologische Techniken und entsprechende Selektionsverfahren hergestellt werden können. 5.6. Vergleichende Untersuchungen zur Vitamin B12 Produktion Ferner wurden Analysen zur Vitamin B12 Produktion unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen von Bacillus megaterium durchgeführt. Erfindungsgemäß wurden beispielhaft die Stämme Bacillus megaterium DSMZ 32, DSMZ 509 und DSMZ 2894 unter anaeroben Bedingungen in Glukose-haltigem (LB-Voll)-Medium herangezogen und am Ende der exponentiellen Wachstumsphase der Vitamin B12 Gehalt in pmol/OD578 ermittelt. Parallel dazu wurde die Vitamin B12 Produktion bei aerober Lebensweise in der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase untersucht. Die Ergebnisse sind in Figur 4 wiedergegeben.
Man erkennt, daß die unter anaeroben Bedingungen herangezogenen B. megaterium (2, 4, 6) vermehrt Vitamin B12 produzieren. 2 bis 3-fach höhere Werte werden erzielt. Das Vitamin B12 lässt sich in dem Fachman bekannter Weise isolieren.
5.7.Quantitative Vitamin Bι?-Analvse
Aerobe ß. megafer/ϊ/m-Kulturen wurden in der Mitte der exponentiellen
Wachstumsphase, anaerobe Kulturen am Ende der exponentiellen Wachstumsphase nach Bestimmung der OD578 durch 15-minütiges Abzentrifugieren bei 5000 rpm geerntet (Centrifuge 5403, Eppendorf). Nach Waschen mit 40 ml Salzlösung wurde erneut 15 min bei 5000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Die erhaltenen Zellsedimente wurden abschließend lyophilisiert. S. typhimurium metE cysG Doppelmutanten (Raux, E. et al., 1996, J. Bacteriol., 178: 753-767) wurden über Nacht auf Methionin und Cystein enthaltendem Minimalmedium bei 37 °C inkubiert, von der Platte gekratzt und mit 40 ml isotonischer Salzlösung gewaschen. Nach Abzentrifugieren wurde das Zellsediment wieder in isotonischer Salzlösung resuspendiert. Die gewaschene Bakterienkultur wurde sorgfältig mit 400 ml 47-48 °C warmem, Cystein enthaltendem Minimalmedium-Agar gemischt. 10 μl der in deionisiertem, sterilem Wasser resuspendierten und 15 min im Wasserbad gekochten ß. megaterium-Proben wurden auf die abgekühlten Platten gegeben und für 18 h bei 37 °C inkubiert. Die Durchmesser der gewachsenen Salmonellenkolonien sind dann proportional dem Gehalt an Vitamin B12 der aufgetragenen ß. megaterium-Proben. Durch Vergleich mit einer Eichkurve, angefertigt aus der Zugabe von 0.01, 0.1 , 1, 10 und 40 pmol Vitamin B12, wurde auf den Gehalt . an Vitamin B 2 in den untersuchten Proben zurückgeschlossen. Diese Standardmethode erlaubt schnell und sehr reproduzierbar den Nachweis geringer Vitamin B12- Mengen in biologischen Materialien.
5.8 Bestimmung der Enzvmaktivitäten Die Bestimmung der Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase-Aktivität wurde anhand der Umsetzung von Uroporphyrinogen-III zu Precorrin-2 bestimmt. Die Produktion von Precorrin-2 wurde durch Überwachung der Fluoreszenz und Precorrin-2 nach Anregung bei 380 nm und Emmission bei 610 nm mittels eines handelsüblichen Fluorometers verfolgt. Quantifiziert wurde durch Kalibrierung mittels bekannter Mengen von Precorrin-2, d. h. Erzeugung einer Eichkurve. Eine Einheit (unit) Enzymaktivität wird definiert als 1 nM produziertes Precorrin-2 pro Stunde.
1 ml einer 2 μM Uroporphyrinogen-Ill-Lösung mit 0,1 mM S-Adenosyl-L- Methionin in 50 mM Tris/HCI-Puffer bei pH 8 wurden mit ca. 50 bis 200 μg Rohzellextrakt versetzt und die Reaktion unter anaeroben Bedingungen über einen Zeitraum von 30 Minuten verfolgt.
In den Wildtypstämmen ergibt sich für die Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase eine Aktivität von 0,2 units pro mg Rohzellextrakt. Dies liegt nur knapp oberhalb der erfaßbaren Werte. Für die transformierten Escherichia coli und Salmonella typhimurium ergibt sich eine Uroporphyrinogen-Ill-Metyltransferaseaktivität von 50 units pro mg Rohzellextrakt. Für transformierte Bacillus megaterium ergibt sich ein Niveau von 20 units pro mg Rohzellextrakt.
Für die Chelatasen sirB und cbiX wurde die Aktivität der Chelatasereaktion für die Cobaltinsertion in Sirohydrochlorin durch Messung der Abnahmerate der Syrohydrochlorin-Fluoreszenz bei λmax von 376 nm mittels eines Extinktionskoeffizienten von 2,4 x 105 M"1 cm"1 bestimmt. Eine Einheit (unit) der Enzymaktivität wurde festgelegt als Abnahme von 1 nM Sirohydrochlorin pro Minute.
Zur Bestimmung der Aktivität wurden Rohzellextrakte beinhaltend zwischen ca. 50 und 200 μg Protein mit Sirohydrochlorin (50 μM) und Cobalt (10 μM) mit 50 mM Tris/HCI-Puffer bei pH 8 umgesetzt.
Für die Wildtypstämme wurden Aktivitäten von ca. 0,01 units pro mg Rohzellextrakt bestimmt. In transformierten Escherichia coli und Salmonella typhimurium waren die Aktivitäten von SirB und cbiX etwa gleich, in beiden Fällen wurden eine Aktivität von 3 units pro mg Rohzellextrakt bestimmt.
Zur Bestimmung der Precorrin-2-Dehydrogenaseaktivität (Syro C) wurde die Dehydrogenasereaktion durch Bildung von Syrohydrochlorin bei λmax von 376 nmm mittels eines Extinktionskoeffizienten von 2,4 x 105 M"1 cm"1 bestimmt. Dabei wird eine unit der Enzymaktivität als Erzeugung von 1 nM Sirohydrochlorin pro Minute festgelegt.
Zur Bestimmung der Enzymaktivitäten wurden Rohzellextrakte beinhaltend zwischen 50 und 200 μg Protein mit Precorrin-Il (5 μM) und NAD (100 μM) in einem Reaktionsvolumen von 1 ml mit 50 mM Tris/HCI- Puffer bei pH 8 umgesetzt.
In den Wildtypstämmen wurde eine Aktivität von 0,002 units pro mg Rohzellextrakt bestimmt. In den transformierten Escherichia coli und Salmonella typhimurium betrug die Precorrin-2-Dehydrognaseaktivität 0,3 units pro mg Rohzellextrakt.
Daraus ist ersichtlich, daß die transformierten Organismen eine teilweise mehr als 100-fach höhere Enzymaktivität gegenüber den vermessenen Wildtypstämmen aufweisen.
6. Molekularbiologische Techniken
Allgemeine Techniken, wie DNA-Präparation, Restriktion von DNA, Ligation, PCR, Sequenzierung, funktionelle Komplementation, Proteinexpression etc gehören zur gängigen Laborpraxis und sind bei Sambrook, J. et al. (1989, In Molecular cloning; a laboratory manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.
6.1. Protoplastentransformation von Bacillus megaterium
Protoplastenpreparation:
50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen bei 15,000 rpm und 4 °C 15 min abzentrifugiert (RC 5B Plus, Sorvall) und in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37 °C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 rpm und Rt (Centrifuge 5403, Eppendorf) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80 °C eingefroren werden.
Transformation:
500 μl der Protoplastensuspension wurden mit 0.5 bis 1 μg DNA in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension bei 3000 rpm und Rt für 10 min zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorf). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 μl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50 - 200 μl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar- Platten gegeben, die die für die Selektion geeigneten Antibiotika enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach zweitägiger Inkubation bei 37 °C sichtbar.
6.2. Identifizierung und Seguenzierung des sirABC-Operons aus B. megaterium
Die Klonierung des sirABC-Operons erfolgte mittels PCR. Genomische DNA aus B. megaterium wurde nach Sambrook et al., 1989 präpariert und die Gene sirA, sirB und sirC anhand der genomischen DNA wie folgt mit den Primern gemäß Tabelle 3 isoliert: Anhand der bekannten Sequenz des cobA-Gens kodierend für eine Methyltransferase, die Uroporphyrinogen-III in Precorrin-2 umwandelt (Robin et al., 1991 , J. Bacteriol., 172 (15): 4893-6), wurden Primer komplementär zum 3'-Ende der Gensequenz hergestellt. Diese Primer wurden in ein Vectoretten-System der Firma Sigma-Genosys nach der Methode von Lilleberg et al. (1998, Genosys Origins 1(2)) zur Amplifikation der unbekannten sirA Sequenz aus B. megaterium eingesetzt. Entsprechend konnten die Gene sirB und sirC amplifiziert werden. Ferner wurde das komplette sirABC-Operon sequenziert. Es konnte ein 2150 bp großes DNA-Fragment identifiziert werden, das für das sirABC-Operon kodiert. Die entsprechende Nukleotid-Sequenz ist in SEQ ID No. 1 und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen in SEQ ID No.'s 2, 4 und 6 aufgeführt. Die Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1, 3 und 5 sind dabei identisch und ausschließlich zur Erstellung des Patentln- Sequenzprotokolls generiert worden, da Patentin keine überlappenden Kodierregionen akzeptiert und für jedes Protein eine eigene Nukleotidsequenz fordert.
Anschließend wurden Primer synthetisiert, mit deren Hilfe die drei Gene einzeln und in Kombination in zwei verschiedenen Expressionsvektoren kloniert werden konnten.
Für Komplementationsstudien wurden PCR-Produkte von sirA, sirAB, sirABC und sirAC hergestellt und in die EcoRI-BamHI-Schnittstelle von pKK8668 (Modifikation des Plasmids pKK223.3) unter Kontrolle des tac- Promotors kloniert. SirC wurde als BamHI-Pstl-Fragment in pKK8668 kloniert. SirA, sirB und sirC wurden einzeln als Ndel-BamHI-Fragmente in pET14b (einem T7-Expressionsvektor) kloniert. Dies erlaubt eine Überexpression der entsprechenden Proteine mit einem N-terminalen His- tag.
6.3. Transformations- und Expressionssysteme Geeignete Plasmide zur Transformation und Überexpression von Genen in B. megaterium sind pWH1510 und pWH1520 sowie der plasmidfreie Überexpressionsstamm B. megaterium WH320 (Rygus, T. et al., 1991 , Inducible high level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium, Appl. Microbiol. And Biotechnol., 35, 5: 594-599). Das Kontrollplasmid pWH1510 enthält im unterbrochenen xylA-Leseraster eine spoVG-lacZ Fusion. SpoVG-lacZ bezeichnet dabei die Fusion aus einer sehr starken Ribosomen-Bindesequenz eines Sporulationsproteins aus B. subtilis (spoVG) mit dem für die ß-Galaktosidase codierenden Gen (lacZ) aus E. coli. Dieses Plasmid ist damit hervorragend geeignet zur Untersuchung von Transformationseffizienzen und
Überexpressionsbedingungen bei B. megaterium.
Das Plasmid pWH1520 fungiert als eigentlicher Klonierungs- und Expressionsvektor. Beide Vektoren weisen ein Tetracyclin- und eine Ampicillinresistenz sowie die für die Replikation in E. coli und Bacillus spp wichtigen Elemente auf. Damit sind sie zugänglich für alle in E. coli etablierten Techniken für Abkömmlinge des Plasmids pBR322. Beiden Vektoren enthalten die B. megaterium xylA- und xylR- Gene des xyl Operons mit ihren regulatorischen Sequenzen (Rygus, T. et al., 1991 , Molecular Cloning, Structure; Promoters and Regulator/ Elements for Transcription of the Bacillus megaterium Encoded Regulon for Xylose Utilization, Arch. Microbiol. 155, 535-542). XylA codiert für die Xyloseisomerase, während xylR für ein Regulatorprotein codiert, das eine starke transkriptionelle Kontrolle auf xylA ausübt. XylA wird reprimiert in Abwesenheit von Xylose. Bei Zugabe von Xylose kommt es zu einer ca. 200-fachen Induktion durch Derepression von xylA. Mit Hilfe eines Polylinkers im xylA-Leseraster wird eine Fusion von Genen mit xylA möglich, die dann ebenfalls unter der starken transkriptioneilen Kontrolle von XylR stehen. Dabei kann man zwischen den Alternativen zur Bildung einer Transkriptions- oder Translationsfusion wählen, da das xylA- Leseraster stromaufwärts des Polylinkers noch vollkommen intakt ist.
6.4. Komplementationsstudien Zur Komplementation von E. coli Sirohaem-Mutanten wurden die Derivate von pKK8668 mit den oben erwähnten Kombinationen der sir-Gene in den Stamm E. coli cysG"302Δa (ER171) (Raux et al., 1997, J. Bacteriol., 179 (10): 3202-12) transformiert, der in allen Enzymaktivitäten zur Umsetzung von Uroporphyrinogen-III zu Sirohaem defizient ist. Dieser Stamm ist nicht in der Lage Sirohaem und folglich Cystein zu synthetisieren. Die Selektion der transformierten E. coli Stämme erfolgte auf Minimalmedium ohne und mit Cystein. Ferner wurde der Effekt von Cobalt auf die Sirohaemsynthese auf Minimalmedium ohne und mit Cobalt (1 mg/l CoCI2) untersucht. Die Minimalmediumplatten wurden bei 37 °C für 24 Stunden inkubiert. Die Plasmide pKK8668sirAB und pKK8668sirABC sind beide in der Lage E. coli ER171 zu komplementieren. Dies bedeutet, daß SirA (Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase) und SirB (Sirohydrochlorin- Eisen-chelatase) für die Produktion von Sirohaem absolut erforderlich sind. Die transformierten Escherichia coli sind nun in der Lage, Vitamin B12 zu synthetisieren. Sie produzieren 4,25 bzw. 72,5 pM/OD Vitamin B12. Man erkennt den Vorteil des Einsatzes aller drei durch die Sir Gene ABC codierten Enzyme.
Zur Untersuchung, ob SirB für eine Eisen- oder Cobalt-Chelatase kodiert, wurde in ein Medium mit und ohne Cobalt eingesetzt. Die Komplementation von E. coli ER171 mit pKK8668sirAB bzw. pKK8668sirABC wurde durch die Zugabe von externem Cobalt nicht gehemmt (Tabelle 4). Dies zeigt, daß SirB eine spezifische Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase ist. In einem parallelen Ansatz wurden die pKK8668-Derivate enthaltend die sir-Gene einzeln oder in Kombination in den E. coli Stamm ER185 übertragen, der alle Gene zur B12-Synthese aus S. typhimurium außer cibK (Cobaltchelatase; Raux et al., 1997, J. Bacteriol., 179 (10): 3202-12) enthält. Die transformierten Stämme wurden durch Überschichtung mit Mineralöl anaerob gezüchtet (6 Stunden bei 37 °C). IPTG und ALA wurden zugegeben und die Kulturen für weitere 18 Stunden gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen und der Rohextrakt zur quantitativen Bestimmung von Vitamin B12 nach Standardmethoden, mittels S. typhimurium cysGmetE (AR3621) Bioassayplatten (Raux et al., 1996, J. Bacteriol., 178 (3): 753-67), bestimmt.
Wie aus Tabelle 4 zu entnehmen ist, kann SirB als Sirohydrochlorin Cobalt-chelatase agieren, da es die Vitamin B12-Biosynthese in Abwesenheit von cbiK wiederherstellen kann. Der Gehalt an gebildetem Vitamin B12 ist gesteigert , wenn SirC ebenfalls anwesend ist.
Somit eignen sich erfindungsgemäß transformierte Escherichia Coli zur Produktion von Vitamin B12.
Eine Komplementation von E. coli 302Δa (cysG-defizienter Stamm ohne funktionale Sirohaemsynthase, der nur bei Zugabe von exogenem Cystein auf Minimalmedium wächst) war nur mit dem Plasmid pAR8766 (pKK223.3-Derivat enthaltend cbiX aus Bacillus megaterium plus cysG aus E. coli; Pharmacia; Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 1998, 335: 167- 173) oder dem Plasmid pER179 (pKK223.3-Derivat, enthaltend cobA-Gen aus Pseudomonas denitrificans und cbiX-Gen aus Bacillus megaterium; Pharmacia; Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 1998, 335: 167-173) möglich, nicht jedoch mit cysG bzw. cobA alleine. Dies zeigt, daß cbiX als Sirohydrochlorin-Chelatase agiert. Hinsichtlich der lonen-Spezifität konnte gezeigt werden, daß bei Zugabe von exogenem Cobalt (5 μM) zum Minimalmedium keine Komplementation der Cystein-auxotrophen Mutante E. coli 302Δa erfolgte. D.h. Eisen wurde durch Cobalt verdrängt was zur Biosynthese von Cobalamin führt. CbiX verfügt dabei über die gleiche Sirohydrochlorin-Chelatase-Aktivität wie sirB und kann aufgrund dessen sowohl zur Sirohaem- als auch Cobalamin-Biosynthese eingesetzt werden. Allerdings besitzt CbiX eine höhere Afffinität zu Coblat als zu Eisen. 6.5. Überproduktion und Aufreinigung der Proteine SirA, SirB, SirC und CbiX
Zur schnellen Aufreinigung der durch sirA, sirB und sirC kodierten Enzyme
, wurden die Gene separat in den Vektor pET14b unter Kontrolle des mit IPTG induzierbaren Promotors T7 kloniert. Nach Transformation dieser
Vektoren in den E. coli Stamm BL21 DE3 pLysS erfolgte bei der
Überexpression der entsprechenden Gene eine Anfügung eines His-tags an das jeweilige Protein. Ultraschall-Zellextrakte wurden zentrifugiert. Eine
Aufreinigung der Proteine aus dem Überstand erfolgte nach Standardmethoden und Herstellerangaben über Chromatographie (Metall-
Chelatbildung). Die Proben wurden anschließend über eine SDS-
Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Ergebnis ist in Figur 5 dargestellt.
Das cbiX-Gen aus Bacillus megaterium wurde aus dem Plasmid pAR8766, welches das gesamte cop-Operon enthält (Raux, E. et al., 1998, Biochem. J., 1998, 335: 167-173), als Sspl/SnaBI-Fragement isoliert und in das Plasmid pKK223.3 (Pharmacia) kloniert, resultierend in dem Plasmid pAR8882. Nach Transformation in E. coli 302Δa und Zugabe von IPTG erfolgte die Expression und Aufreinigung analog zu der Aufreinigung für SirA, SirB bzw. SirC.
6.6. Spektrophotometrische Analyse von akkumulierten Produkten in transformierten Stämmen in vivo
Derivate von pKK8668 mit verschiedenen Kombinationen der sir-Gene wurden in den Stamm E. coli cysG"302ΔaER171 (Raux et al., 1997, J. Bacteriol., 179 (10): 3202-12) transformiert, der in allen Enzymaktivitäten zur Umsetzung von Uroporphyrinogen-III zu Sirohaem defizient ist. Dieser Stamm ist nicht in der Lage Sirohaem und folglich Cystein zu synthetisieren. Entsprechend transformierte Stämme wurden in 200 ml Minimalmedium inocculiert und ohne und mit Cobalt kultiviert. Die Kulturen wurden bis zu einer OD von 0,1 kultiviert und nach Zugabe von IPTG und ALA für weitere 4 Stunden gezüchtet. Nach Ultraschallaufschluß der geernteten Zellen wurde der Rohextrakt auf eine DEAE-Sephacol-Säule gegeben. Das Eluat wurde spektrophotometrisch zwischen 300 und 600 nm analysiert. Das Ergebnis ist in Figur 6 dargestellt. In Extrakten von E. coli pKK8668sirAC wurde ein Absorptionsmaximum bei 378 nm gemessen, was Sirohydrochlorin entspricht. Das Spektrum von E. coli pKK8668sirA zeigt ein Maximum bei 354 nm und entspricht der nicht-physiologischen Verbindung Trimethylpyrrocorphin resultierend aus einer Übermethylierung von Uroporphyrinogen-III. Ein Spektum von Sirohaem mit E. coli pKK8668sirABC konnte nicht deutlich nachgewiesen werden. Es bestehen viele Ähnlichkeiten im UV-Vis-Spektrum von Sirohydrochlorin und Sirohaem, das ein Maximum bei 378 nm aufweist, so daß eine eindeutige Unterscheidung schwierig ist. Allerdings ist das Cobalt- Sirohydrochlorin-Spektum deutlich verschieden von dem von Sirohydrochlorin mit Maxima bei 410 und 590 nm.
6.7 Bestimmung der Notwendigkeit einer Precorrin-2-Dehvdrogenase für eine verbesserte Cobalaminproduktion
Wie bereits erwähnt, ist Escherichia coli nicht in der Lage, Vitamin B12 de novo zu synthetisieren, da es einige Enzyme vermißt, die benötigt werden, um Precorrin-2 zu Cobinamid umzusetzen. Jedoch kann diese Fähigkeit in E. coli durch Einbringen der fehlenden cobalamin-biosynthetischen Gene mittels eines geeigneten Plasmides wieder hergestellt werden. Wird dabei ferner ein cysG-Stamm eingesetzt, dann sind alle Enzyme für die Umsetzung von Uroporphyrinogene-Ill zu Cobinamid in dem entsprechenden E. coli-Stamm wieder vorhanden. Mittels dieses Wissens wurde die Notwendigkeit von Enzymen zur Synthese von Precorrin-2 und seinem oxidierten Produkt, Sirohydrochlorin in der Cobalaminbiosynthese untersucht. Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, daß die Vitamin B12 Produktion bei Vorhandensein einer Precorrin-2 Dehydrogenase erfindungsgemäß verbessert ist.
Zunächst wurde die Notwendigkeit einer Precorrin-2 Dehydrogenase in dem Bacillus megatirium-Pfad zur Cobalaminbiosynthese mittels eines Escherichia coli Stamms untersucht, der die notwendigen Gene für die Transformation von Uroporphyrinogen-III zu Cobyrsäure enthält. Dies wurde erreicht durch Transformation eines E. coli cysG-Stammes (E. Coli 302 Δ a) mit dem Plasmid pER 270, welches die Bacillus megaterium Gene cbiW, -H, -X, -J, -C, -D, -ET, -L, -F, -G, -A, cysGA, -Y, -btuR und cbiP beinhaltet. Zusätzlich wurde ein zweites geeignetes Plasmit beinhaltet entweder cysG, metδP oder sirC zur Transformation des E. coli Stamms verwendet. CysG, metδP und sirC codieren alle für ein Enzym mit Precorrin-2 Dehydrogenaseaktivität. Nach einer Cotransformation mittels der jeweiligen beiden Plasmide war die Cobalaminproduktion mindestens um den Faktor 30 erhöht, wie die folgenden Ergebnisse zeigen:
Der mit cysGG21D transformierte Stamm wies keine Dehydrogenaseaktivität, da er nicht in der Lage ist, NAD zu binden, da die NAD Bindungsstelle gestört ist. CbiK ist die Cobaltchelatase aus Salmonella enterica.
Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, daß das Vorhandensein einer Precorrin-Il Dehydrogenase essentiell für eine verbesserte Produktion von Vitamin B12 ist.
Zur Untermauerung dieser Ergebnisse wurde die Notwendigkeit einer Dehydrogenase innerhalb des Salmonella enterica (Salmonella typhimurium) Pfades untersucht. Dazu wurde der E. coli cysG Stamm mit einem Plasmid pER 185KD transformiert, welches ein Plasmid ist, das alle Salmonelle enterica cbi Gene beinhaltet, jedoch eine Deletion in dem cbiK Gen aufweist. Die E. coli wurden weiterhin mit einem weiteren Plasmid cotransformiert, welches die Untersuchung der Notwendigkeit der Precorrin-Il Dehydrogenase codierenden Gene erlaubt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Diese Ergebnisse bestätigen die Notwendigkeit für eine bzw. den Vorteil einer Precorrin-Il Dehydrogenase in der Biosynthese des Corrinringes von Vitamin B12 in dem Biiosynthese-Pfad innerhalb von Salmonella enterica. Es werden reproduzierbar bessere Ergebnisse der Cobalaminproduktion erhalten, wenn die Dehydrogenase (hier SirC) vorhanden ist, wobei die erhältliche Cobalaminproduktion etwa um den Faktor 10 erhöht ist, wie sich aus der detektierten Cobyr-Säure ergibt.
6.8. Bestimmung der Rolle von SirB und SirC Zellen, die SirA überexprimieren zeigen eine charakteristische leichte Fluoreszenz unter UV-Licht (Warren et al., 1994, Biochem. J., 302 (Pt3): 837-44) und wurden nicht weiter enzymatisch analysiert. Zur Bestimmung der Rolle von SirB als Chelatase und SirC als Dehydrogenase wurden die Proteine aufgereinigt und in einem in-vitro- Reaktionsansatz zur Überprüfung der Bildung von Sirohydrochlorin und Cobalt-Sirohydrochlorin eingesetzt. Dazu wurde 0,5 mg CobA, 0,1 mg HemC, 0,15 mg HemD, 0,75 SAM und 0,05 mg PBG eingesetzt. CobA (stellvertretend für SirA), HemC und HemD wurden nach Raux et al. (1999, Bioorganic.Chem., 27: 100-118) aufgereinigt. Der Ansatz wurde in 1 ml von 50mM Tris/HCI pH8 gemischt. Anschließend wurden 0,1 mg SirB, 0,1 mg SirC, 0,5 mg NAD+ und 21 μM CoCI2x6H20 zugegeben. Dieser Ansatz wurde dann bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert und anschließen photospektrometrisch analysiert. Zur Kontrolle wurden Spektren ohne SirB und SirC gefahren.
Figur 7a zeigt, daß die Synthese von Precorrin-2 in dem gekoppelten Ansatz enthaltend PBG, HemC, HemD, CobA und SAM, nach 20 Minuten Inkubation sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von NAD+ ein Spektrum zeigt, daß mit dem spezifischen Spektrum für Precorrin-2 vergleichbar ist. Durch Zugabe von SirC wurde ein Spektrum erhalten, das dem von Sirohydrochlorin entspricht mit einem Maximum bei 378 nm, vergleichbar dem Spektrum des Rohextraktes von E. coli pKK8668sirAC in Figur 6.
Durch Zugabe von SirB und SirC wurde ebenfalls ein Spektrum mit einem Absorptionsmaximum bei 378 nm erhalten (Figur 7b). Wurde jedoch Cobalt zugegeben, wurde ein Spektrum erhalten, das Absorptionsmaxima bei 410 und 590 nm aufweist, die äquivalent zu einem Spektrum von Cobalt-Sirohydrochlorin sind. Dies bedeutet, daß SirB als Cobalt- Chelatase agiert.
Ferner wurden anstelle von Cobalt Nickel-(ll)-sulfat-6-hydrate, Kupfer-(ll)- sulfat, Magnesiumchlorid-6-hydrat, Zinkchlorid und Eisensulfat-7-hydrat in den gekoppelten Reaktionsansatz eingesetzt. Die entsprechenden Spektren wurden zwischen 300-700 nm aufgenommen. Figur 8 zeigt, daß die Absorptionsmaxima der resultierenden Sirohydrochlorin-Metall- Komplexe deutlich unterschiedlich sind. Dies zeigt, daß SirB als Eisen- Chelatase und in-vitro als Cobalt-Chelatase agieren kann und darüber hinaus eine Reihe weiteren Metallo-isobacteriochlorine synthetisieren kann.
6.9. Überexpression von sirA:
Nach Transformation von E. coli ER 171 mit dem Plasmid pKK8668 enthaltend sirA (pKK8668sirA) wurde der so transformierte Mikroorganismus gemäß Beispiel 5.3 kultiviert. Als Kontrolle wurde der entsprechend nicht-transformierte E. coli Stamm unter gleichen Bedingungen kultiviert. Die Genexpression wurde mit IPTG und ALA in einer Konzentration von 10 mg/l induziert. Anschließend wurde die spezifische Aktivität der Urophorphyrinogen-lll-methyltransferase (sirA) durch Bestimmung des gebildeten Precorrin-2 bestimmt. Precorrin-2 fluoresziert und es kann nach Anregung des Ansatzes bei 340 nm eine deutliche Emission des fluoreszierenden Precorrin-2 bei 600 nm gemessen werden (Extinktionskoeffizient: 8x105 M"1L"1). Das Substrat Uroporphyrinogen-III fluorsziert nicht. Hierbei war in dem nicht-transformierten E. coli Stamm die Urophorphyrinogen-lll-methyltransferase-Aktivität kaum meßbar. In dem transformierten E. coli Stamm hingegen ist ein Überschuß des durch sirA kodierten Enzyms Urophorphyrinogen-lll-methyltransferase von wenigstens 10 mg Protein pro Liter Kulturmedium, mit einer Enzymaktivität von etwa 15.000 Units pro Liter Kulturmedium, meßbar. 1 Unit entspricht der Produktion von 1 nmole Precorrin-2 pro Stunde. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem Protein Detection Kit (BioRad, Germany) basierend auf der Methode von Bradford (Anal. Biochem., 1989, 178, 263.268).
In Analogie wurde auch der Bacillus megaterium Stamm DSMZ 509 mit dem Plasmid pKK8668 enthaltend sirA (pKK8668sirA) transformiert und wie unter Beispiel 5.3 beschrieben, kultiviert. Als Kontrolle dient auch hier ein entsprechend nicht-transformierter B. megaterium Stamm, der entsprechend kultiviert wird.
Das durch sirA kodierte Protein wird in dem transformierten B. megaterium Stamm verstärkt produziert, was sich qualitativ durch eine rote Fluoreszenz der Zellen zeigt, sobald das Gen exprimiert wird. Die Genexpression wurde mit IPTG und ALA in einer Konzentration von 10 mg/l induziert.
Ferner wurde die spezifische Aktivität der Urophorphyrinogen-Ill- methyltransferase bestimmt. Auch hier war die spezifische Enzymaktivität in dem nicht-transformierten Stamm kaum meßbar. In dem transformierten
B. megaterium Stamm wurde eine spezifische Aktivität von etwa 15.000
Units/I Kulturmedium gemessen.
Nach Aufreinigung des durch sirA kodierten Proteins, wie unter Beispiel 6.5 beschrieben, wurde der spezifischen Proteingehalt für die gebildete
Urophorphyrinogen-lll-methyltransferase gemessen (Bradford; Anal. Biochem., 1989, 178, 263.268). Dies ergab einen Überschuß von SirA von 10 mg Protein pro Liter Kulturmedium.
6. 0 Überexpression von SirA und SirC: Nach Transformation von E. coli ER 171 mit dem Plasmid PKK8668sirAC (enthaltend sirA und sirC) wurde der so transformierte Mikroorganismus gemäß Beispiel 5.3 kultiviert. Als Kontrolle wurde der entsprechend nicht- transformierte E. coli Stamm unter gleichen Bedingungen kultiviert. Die Genexpression wurde mit IPTG und ALA in einer Konzentration von 10 mg/l induziert. Anschließend wurde die spezifische Aktivität der Urophorphyrinogen-lll-methyltransferase (sirA) durch Bestimmung des gebildeten Precorrin-2 bestimmt. Nach Anregung des Ansatzes bei 340 nm ist eine deutliche Emission des fluoreszierenden Precorrin-2 bei 600 nm meßbar (Extinktionskoeffizient: 8x105 M"V1). Das Substrat Uroporphyrinogen-III fluorsziert nicht. Hierbei ergab sich für den nicht- transformierten E. coli Stamm eine kaum meßbare Enzymaktivität. In dem transformierten E. coli Stamm konnte eine spezifische Enzymaktivität der Uroporphyrinogen-III-methyltransferase (SirA) von 2.500 Units Precorrin-2 pro Liter Kulturmedium und eine spezifische Enzymaktivität der Precorrin- 2-dehydrogenase (SirC) von 4.000 Units Sirohydrochlorin pro Liter Kulturmedium bestimmt werden.
Ferner wurde das Produkt Sirohydrochlorin im Kulturmedium, wie unter Beispiel 6.6 beschrieben, nachgewiesen.
6.11 Untersuchung der Rolle von Sirohydrochlorin Die Produktion von Sirohydrochlorin erfolgt beispielsweise in transformierten Zellen wie unter 6.9 beschrieben. In in-vitro Enzymtests mit Sirohydrochlorin oder Precorrin-2 als Substrat (je 2,5 μM Substrat in 1 ml 0,05 M Tris-HCI-Puffer, pH 8) und aufgereinigten Enyzmen (je 25 μg) kodiert durch sirB bzw. cbiX stellte sich heraus, daß Sirohydrochlorin als intermediäre Substanz sowohl für das Sirohaem synthetisierende Enzym kodiert durch sirB (Sirohydrochlorin Eisen-chelatase) als auch für die Cobalamin-Chelatase kodiert durch cbiX als Substrat dient. Hierbei erfolgt der Einbau von Metall-Ionen (20 μM) durch die beiden genannten Enzyme Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase (sirB) bzw. Cobalamin-Chelatase (cbiX) mit einer um einen Faktor von mehr als 100 verbesserten Effizienz in Sirohydrochlorin als in das reduzierte Precorrin-2-lntermediat. D.h., ein Einbau von Metallionen in Precorrin-2 findet lediglich mit geringer Effizienz (< 1 %) katalysiert durch die Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase (sirB) statt. Die Cobalamin-Chelatase (cbiX) unterstützt den Einbau von Eisen in Precorrin-2 hingegen überhaupt nicht.
Es wurden folgende Bakterienstämme, Plasmide und Primer gemäß den Tabellen 1. 2 und 3 eingesetzt.
Tab. 1 : Verwendete Bakterienstämme
Braunschweig Tab. 2: Verwendete Plasmide
Tab. 3: Verwendete Primer
Tab. 4: zeigt die Ergebnisse von Komplementationsstudien der E. coli Stämme ER171 und ER185 mit pKK8668-Derivaten enthaltend unterschiedliche Kombinationen an sir-Genen. Es ist das Wachstum (+ = Komplementation; - = keine Komplementation) und der Gehalt an B12 bezogen auf die optische Zelldichte (OD) dargestellt.
Legende zu den Figuren
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Figuren noch erläutert.
Figur 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums von ß. megaterium DSMZ32 (Wildtyp) bei 30 °C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Figur 2 zeigt einen Vergleich des Wachstums von ß. megaterium DSM509 bei 30 °C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt.
Figur 3 zeigt einen Vergleich des Wachstums von ß. megaterium DSM2894 bei 30 °C unter aeroben sowie anaeroben Bedingungen. Anaerobes Wachstum wurde unter Zugabe von 10 mM Nitrat (leere Rauten), 10 mM Nitrit (leere Dreiecke) und 10 mM Fumarat (Kreuze) gemessen. Fermentatives (leere Kreise) und aerobes Wachstum (gefüllte Rauten) fanden in LB-Medium ohne Zusätze statt. Zu angegebenen Zeitpunkten wurden Proben genommen und die optische Dichte bei 578 nm bestimmt. Figur 4 zeigt die Vitamin Bι2-Produktion von ß. megaterium unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen. Es wurde der Gehalt an Vitamin B12 pro Zellmasse angegeben in pmol/OD578 für den Wildtypstamm ß. megaterium DSM32 aerob gewachsen (1) und anaerob gewachsen (2), für ß. megaterium DSM509 aerob gewachsen (3) und anaerob gewachsen (4), sowie für ß. megaterium DSM2894 aerob gewachsen (5) und anaerob gewachsen (6), bestimmt.
Figur 5 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel von His-tagged, gereinigtem Sir A, SirB und SirC. In Spur 1 ist ein Molekulargewichtsstandard und in den Spuren 2, 3 und 4 gereinigtes His-tagged Protein SirA, SirB bzw. SirC aufgetragen.
Figur 6 zeigt ein UV-Vis-Spektrum von akkumulierten Pigmenten isoliert von pKK8668SirA, pKK8668SirAB, pKK8668SirABC und pKK8668SirAC überexprimierenden Bakterienstämmen von E. coli ER171 , die in Anwesenheit von ALA kultiviert wurden.
Figur 7 zeigt UV-Vis-Spektren von in-vitro akkumulierten Pigmenten eines gekopplenten Precorrin-2 Enzymansatzes mit SirB und SirC.
(7a) Spektrum des gekoppelten Precorrin-2-Ansatzes enthaltend Precorrin-2 (PC-2) und Precorrin-2 nach Zugabe von SirC (in An- und Abwesenheit von Cobalt). Das Absorptionsmaximum ist äquivalent zu dem von Sirohydrochlorin. (7b) Spektrum von PC-2 mit SirB und SirC. Die Absorptionsmaxima (410 nm und 590 nm) sind äquivalent zu dem von Cobalt-Sirohydrochlorin.
Figur 8 zeigt UV-Vis-Spektren von in-vitro akkumulierten Pigmenten eines gekopplenten Precorrin-2 Enzymansatzes mit SirB und SirC unter Zugabe anderer Metalle als Cobalt, nämlich Ni2+, Zn2+, Cu2+ und Fe2+. Die Absorptionsmaxima von Ni2+, Zn2+, Cu2+ und Fe2+ sind 395 nm, 405 und 402 nm.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur verbesserten Herstellung von Vitamin B12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase und Precorrin-2-dehydrogenase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Precorrin-2-dehydrogenase und das an der Cobalamin-Synthese beteiligte Enzym Sirohydrochlorin-Cobalt-Chelatase kodiert durch cbiX in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur fermentiert wird, enthaltend einen Mikroorganismus, bei dem wenigstens die an der Sirohaem-Synthese beteiligten Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen-
Chelatase und Precorrin-2-dehydrogenase in ihrer Aktivität gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2 und eine Precorrin-2- dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechenden endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2, eine Precorrin-2- dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 und die Sirohydrochlorin-Cobalt-
Chelatase (GbiX) oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechend endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2 und eine Sirohydrochlorin- Eisen-Chelatase gemäß SEQ ID No. 4 und eine Precorrin-2- dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6 oder deren Isoenzyme gegenüber den entsprechend endogenen Enzymaktivitäten erhöht sind.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1 und sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 verstärkt exprimiert und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1, sirB von Nukleotid 761-1561 gemäß SEQ ID No. 1 oder 3 und sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 verstärkt exprimiert und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 , 2, 5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Enzyme der Sirohaem-Synthese kodierenden Gene sirA von Nukleotid 1-780 gemäß SEQ ID No. 1 , sirC von Nukleotid 1542-2150 gemäß SEQ ID No. 1, 3 oder 5 und das für das Enzym der Cobalamin-Synthese kodierende Gen cbiX verstärkt exprimiert und/oder in erhöhter Kopienzahl vorliegen.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur enthaltend einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Salmonella, Pseudomonas oder
Propionibakterium oder eine Mischung der Mikroorganismen fermentiert wird.
11. Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase gemäß SEQ ID No. 2.
12.Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase gemäß SEQ ID No. 4.
13.Precorrin-2-dehydrogenase gemäß SEQ ID No. 6.
14. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 enthaltend das sirABC-Operon aus Bacillus megaterium kodierend für Enzyme der Sirohaem-Synthese.
15. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder deren Allele kodierend von Nukleotid 1-780 für eine Uroporphyrinogen-Ill- methyltransferase (sirA) gemäß SEQ ID No. 2.
16. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder 3 oder deren Allele, kodierend von Nukleotid 761-1561 für eine Sirohydrochlorin- Eisen-chelatase (sirB) gemäß SEQ ID No. 4.
17. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 , 3 oder 5 oder deren Allele, kodierend von Nukleotid 1542-2150 für eine Precorrin-2- dehydrogenase (sirC) gemäß SEQ ID No.6.
18. Genstruktur enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Teile davon sowie operativ damit verknüpfte Nukleotidsequenzen mit regulatorischer Funktion.
19. Genstruktur gemäß Anspruch 18 enthaltend zusätzlich eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Sirohydrochlorin-Cobalt- chelatase.
20. Vektor enthaltend eine isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Teile davon oder eine Genstruktur gemäß Anspruch einem der Ansprüche 18 oder 19 sowie zusätzliche
Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.
21. Transgener Mikroorganismus zum Einsatz in ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer Nukleotidsequenz kodierend für eine Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase und Precorrin-2- dehydrogenase aufweist.
22. Transgener Mikroorganismus gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer Nukleotidsequenz kodierend für eine Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Cobalt- chelatase oder Sirohydrochlorin-Eisen-chelatase und Precorrin-2- dehydrogenase aufweist.
23. Transgener Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 oder22, dadurch gekennzeichnet, daß er eine verstärkte Expression und/oder erhöhte Kopienzahl einer isolierten Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Teile davon aufweist.
24. Transgener Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß er in replizierender Form eine Genstruktur gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 oder einen Vektor gemäß Anspruch 20 enthält.
25. Transgener Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Salmonella, Pseudomonas oder Propionibakterium ist.
26. Transgener Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Spezies Bacillus megaterium gehört.
27. Verwendung von Nukleotidsequenzen kodierend für die Enzyme Uroporphyrinogen-lll-methyltransferase, Sirohydrochlorin-Eisen- chelatase, Sirohydrochlorin-Cobalt-chelatase und Precorrin-2- dehydrogenase einzeln oder in Kombination zur Herstellung von Vitamin B12.
28. Verwendung der Nukleotidsequenzen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Teile davon einzeln oder in Kombination mit der Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym der Sirohydrochlorin- Coblat-chelatase oder der Genstruktur gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 oder eines Vektors gemäß Anspruch 20 zur Herstellung von Vitamin B12.
29. Verwendung der Nukleotidsequenzen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder Teile davon einzeln oder in Kombination mit der Nukleotidsequenz kodierend für das Enzym der Sirohydrochlorin- Coblat-chelatase oder der Genstruktur gemäß einem der Ansprüche
18 oder 19 oder eines Vektors gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines transgenen Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26.
30. Verwendung eines transgenen Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26 zur Herstellung von Vitamin B12.
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