DE10335447B4 - Aminooxidase - Google Patents

Abstract

Verbindung der Formel I:

Description

• Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäure und die durch diese Nukleinsäure kodierte Aminooxidase.
• Polyketidantibiotika und der Polyketidstoffwechsel sind seit vielen Jahren bekannt (D. O'Hagan, The Polyketide Metabolites, Ellis Horwood, Chichester, 1991).
• Auch ist bekannt, dass Streptomyces thioluteus das Polyketidantibiotikum Aureothin synthetisiert (Y. Hirata, H. Nakata, K. Yamada, K. Okuhara, T. Naito, Tetrahedron, 1961, 14, 252) und dass verschiedene andere Streptomyces-Stämme in der Lage sind, Derivate dieser Verbindung zu synthetisieren.
• Weiterhin ist bekannt, dass aromatische Nitroverbindungen, wie bspw. Chloramphenicol (J. He, N. Magarvwy, M. Piraee, L. C. Vining; Microbiology, 2001, 147, 2817), in der Natur sehr selten vorkommen.
• Über die enzymatische Nitrogruppenbildung, bspw. die Reaktion von para-Aminobenzoat zu para-Nitrobenzoat, ist noch sehr wenig bekannt. Ein Beispiel eines Amino-oxidierenden Enzyms (Klasse der 1A Oxygenase) ist von der Pyrrolnitrinbiosynthese bekannt (S. Kirner, P. E. Hammer, D. S. Hill, A. Altmann, I. Fischer, L. J. Weislo, M. Lanahan, K.-H. van Pee, J. M. Ligon, J. Bacteriol. 1998, 180, 1939).
• Die Oxidation von p-Aminobenzoat zu p-Nitrobenzoat durch Streptomyces thioluteus ist durch die Publikation von Kawai u.a. (Kawai, S.; Kobayashi, K.; Oshima, T. and Egami, F.; The oxidation of p-aminobenzoate to p-nitrobenzoate by Streptomyces thioluteus; Arch. Biochem. Biophy. 1965; Vol. 112, 537–543) bekannt.
• Der Stamm Streptomyces thioluteus DSM 40027 ist seit 1952 bekannt.
• Aufgabe der Erfindung ist es, eine Nukleinsäuresequenz anzugeben, die eine Aminooxidase kodiert und eine durch dieses Gen kodierte Aminooxidase bereitzustellen.
• Diese Aufgabe wird durch eine Nukleinsäure folgender Sequenz (Formel I) gelöst:

  
• Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodiert eine Aminooxidase und weist folgende Nukleotidgehalte auf:
• • % A = 16.53 [239]
• • % G = 34.23 [495]
• • % T = 12.59 [182]
• • % C = 36.65 [530]
• Ausgangspunkt für die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz ist die Fermentation einer Streptomyces-Species. Vorteilhaft für die Fermentation ist die Verwendung von Streptomyces thioluteus.
• Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Streptomyces thioluteus DSM 40027.
• Die im folgenden beschriebene Fermentationsbedingungen gelten für Streptomyces sp., Streptomyces thioluteus und den hinterlegten Stamm Streptomyces thioluteus DSM 40027 sowie für heterologe Wirtsorganismen, wie bspw. Streptomyces lividans, E. coli, Pseudomonas sp..
• Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich Na-Pyruvat und Na-Propionat, assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glucose und D-Mannitol, sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt.
• Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Ammoniumsalze, Nitrate, Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone und Peptone, Hefe- und Fleischextrakte sowie Rückstände der Alkoholherstellung.
• An organischen Salzen kann die Nährlösung zum Beispiel Phosphate, Sulfate, Chloride oder Carbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, Mangan, Eisen und Kobalt enthalten.
• Die Kultivierung erfolgt aerob, zum Beispiel submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Zuführung von Luft oder Sauerstoff. Sie kann bei einer Temperatur von 15 bis 37°C, vorzugsweise bei 20 bis 35°C, insbesondere bei 26 bis 31°C durchgeführt werden. Der pH-Bereich sollte zwischen 6,0 und 8,0 liegen, vorteilhaft zwischen 6,5 und 7,5.
• Man kultiviert die Streptomyces-Stämme unter diesen Bedingungen im allgemeinen über einen Zeitraum von 2 bis 20 Tagen, bevorzugt 4 bis 7 Tage.
• Vorteilhaft kultiviert man in aufeinanderfolgenden Stufen, in dem man eine oder mehrere aufeinanderfolgende Vorkulturen mit flüssigem Nährmedium kultiviert und dann in das eigentliche Produktionsmedium (Hauptkultur) überimpft.
• Das Volumenverhältnis von Vor- und Hauptkultur beträgt beispielsweise 1:10. Das Mycel für die Vorkultur kann zum Beispiel erhalten werden, in dem man aus der Stammhaltung Biomasse steril separiert.
• Der Fermentationsverlauf kann anhand der Biomassezunahme, der Kohlenstoffquellenabnahme und der Kontrolle der Produktbildung, bspw. Enzyme, durch chromatographische Methoden, wie zum Beispiel durch Dünnschicht- oder Hochdruckflüssigchromatographie, bzw. Teste der enzymatischen oder biologischen Aktivitäten überwacht werden.
• Besonders vorteilhaft wird für die Fermentation eine M10 Nährlösung folgender Zusammensetzung verwendet:
  4g Hefeextrakt
  10g Malzextrakt
  4g Glucose
  gelöst in 1 Liter H₂O mit eingestelltem pH-Wert von 7,3.
• Die beimpften Bakterienkulturen, je 100 ml Nährlösung in 500 ml-Erlenmeyerkolben, werden bei 28°C mit 200 rpm für 5 Tage auf einem Schüttler bewegt. Nach 5 Tagen wird das Streptomyces-Mycel geerntet, und aus diesem wird mit bekannten Methoden die genomische DNA isoliert.
• Ausgehend von hochkonservativen Aminosäuresequenzen bekannter pro- und eukaryontischer para-Aminobenzoat-Synthasen werden übliche Primer synthetisiert, die für Aminooxidasen unspezifisch sind.
• Diese Primer werden für die PCR der isolierten Streptomyces thioluteus-DNA gemäß bekannter Methoden verwendet.
• Die so gewonnene Genprobe wird mit bekannten Methoden kloniert, transformiert und sequenziert, so dass damit die Bestimmung des gesamten Aureothin-Biosynthese-Genclusters erfolgen kann.
• Ein Fragment dieser sequenzierten DNA-Probe (Aureothin-Biosynthese-Gencluster) weist eine Homologie zu para-Aminobenzoat-Synthasen des des Sekundärstoffwechsels auf. Ein weiteres Fragment der sequenzierten DNA-Probe weist keine Homologie zu bekannten, enzymkodierenden Sequenzen auf.
• Dieses natürlicherweise hergestellte Aureothin-Biosynthese-Gen ist das bevorzugte Gen zur Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, welche u.a. durch den Produzentenstamm DSM 40027 synthetisiert wird.
• Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodiert u.a. eine Aminooxidase mit folgender Aminosäuresequenz (Formel II):

  

  und folgenden Eigenschaften:
• • Molekulargewicht: 51265.17 Dalton
• • 481 Aminosäuren
• • 107 stark basische(+)Aminosäuren (K,R)
• • 33 stark saure(–)Aminosäuren (D,E)
• • 138 hydrophobe Aminosäuren (A,I,L,F,W,V)
• • 50 polare Aminosäuren (N,C,Q,S,T,Y)
• • Isoelektrischer Punkt: 12.334
• • Ladung bei PH 7.0: 77.843
• • keine Homologie zu bereits bekannten Proteinen mit ähnlichen, katalytischen Funktionen
• Die Aminooxidase entfaltet bspw. in der Synthese des Polyketidantibiotikums Aureothin eine katalytische Wirkung, indem sie die Reaktion von para-Aminobenzoat zu para-Nitrobenzoat katalysiert.
• Diese katalytische Eigenschaft der enzymatischen Nitrogruppenbildung ist für die Detektion der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz von großer Bedeutung. Durch das gezielte Ausschalten definierter Genabschnitte, die bspw. vermittels Cosmid-Genbanken eine systematische Suche nach Funktions-tragenden Sequenzabschnitten ermöglicht, kann eine DNA-Aminosäuresequenz-Funktionsanalyse erfolgen und das Aminooxidase-Gen lokalisiert werden.

Claims (2)

1. Verbindung der Formel I:

   

   wobei A-Adenin, G-Guanin, C-Cytosin und T-Thymidin bedeuten.
2. Verbindung der Formel II:

   

   

   wobei A- Ala, C- Lys, D-Asp, E- Glu, F- Phe, G- Gly, H- His, I- Jle, K- Lys, L- Leu, M- Met, N- Asn, P- Pro, Q- Gln, R- Arg, S- Ser, T- Trp, V- Val, Y- Tyr bedeuten.