CN1291022C

CN1291022C - 编码对农业杀真菌剂表现抗性的scytalone脱水酶的基因

Info

Publication number: CN1291022C
Application number: CNB038108496A
Authority: CN
Inventors: 角康一郎; 渡边哲; 河合清; 清水力; 永山孝三
Original assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kumiai Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2003-02-24
Publication date: 2006-12-20
Anticipated expiration: 2023-02-24
Also published as: US20080213788A1; KR100975354B1; TW200402472A; US7504203B2; TWI308593B; KR20040095282A; JP4212479B2; CN1653178A; US20060223136A1; US7399625B2; JPWO2003076628A1; WO2003076628A1

Abstract

本发明提供了一种可广泛用于抗性稻瘟病真菌相关研究中的基因。该基因编码下列蛋白质(a)或(b)中的任意一个：(a)包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质；或(b)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列通过缺失取代或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，其在scytalone脱水酶抑制剂存在时具有scytalone脱水酶活性。

Description

编码对农业杀真菌剂表现抗性的SCYTALONE脱水酶的基因

发明领域

本发明涉及一种来自稻瘟病真菌编码scytalone脱水酶的基因，其中稻瘟病真菌被认为是稻瘟病的致病真菌。

背景技术

在大多数种植水稻的国家公认稻瘟病是由稻瘟病真菌(pyricularia oryzae，Magnaporthe grisea)所引起的。尤其地，在具有高温和高湿度气候的地区(例如，日本)，稻瘟病是农业产业中最严重的病害之一。对于高产率水稻的培育而言，稻瘟病的预防和灭虫是必要的。最近，作为对具有治疗作用的试剂的替换，具有预防作用的箱-治疗试剂被用于减少农民在预防和消灭稻瘟病真菌方面的劳动。此种试剂的实例包括scytalone脱水酶(在下文中，简称为“SCDH”)抑制剂，典型地为加普胺((1RS，3SR)-2，2-二氯-N-((R)-1-4-氯苯基)乙基)-1-乙基-3-甲基环丙烷羧酰胺))(Kurahashi等，J.Pestle.Sci，23，22-28，1998；Motoyama等，J.Pestic.Sci，23，58-61，1998)。SCDH为一种催化黑素生物合成途径中由scytalone到1，3，8-三羟基萘(在下文中，简称为“1，3，8-THN”)的脱水反应的酶。

当稻瘟病真菌破裂和侵入水稻叶面表皮的膜时，附着胞中甘油的浓度增加高达80atm，其中附着胞是一种感染-特异性的器官。为了将甘油包围在附着胞内，细胞壁的黑色素层是必要的(Karnakura等，KASEAA，39，340-347，2001)。抑制黑色素的生物合成阻止了附着胞的形成。因此，SCDH抑制剂不具有直接的杀真菌作用，而是一种通过抑制致病性而具有预防和灭虫活性的非杀真菌剂。

首先用稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)来说明丝状真菌的SCDH基因。公众不能得到这些基因的核苷酸序列且仅仅SCDH蛋白的三维结构已被报道(Landquist等，Structure，2，937-944，1994)。此后，来自葫芦科毛盘霉(Colletorichum lagenarium)的SCDH基因(Kubo等，Appi.Environment.Microbiol，62，4340～4344，1996；注册号D86079)，然后是来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Tsai等，Mol.Microbiol，26，175-183，1997；注册号1195042)，稻瘟梨孢霉(Pyricularia oryzae)(Motoyarna等，Biosci.Biotech.Biochem，62，564-566，1998；注册号.AB004741)以及Ophiostomafloecorurn(Wang等，注册号AF316575)的SCDH基因被相继报道。结合于加普胺的SCDH蛋白的三维结构也已被报道(Nakasako等，Biochemistry，37，9931-9939，1998；Wawrzak等，Proteins.Struct.Fune.Genet，35，425-439，1999)。

发明内容

最近，人们已经发现了对SCDH抑制剂诸如加普胺具有降低的敏感性的稻瘟病真菌(在下文中，称为“抗性稻瘟病真菌”)。如上所述，由于SCDH抑制剂诸如加普胺是水稻裁培中非常重要的试剂，研究抗性稻瘟病真菌中的敏感性决定因子以及发现预防和消灭抗性稻瘟病真菌的有效方法来保持稳定的水稻裁培是至关重要的。

然而，目前几乎还没有开展与抗性稻瘟病真菌有关的研究，诸如对抗性稻瘟病真菌中敏感性决定因子的解释或抗性稻瘟病真菌繁殖场所的定位。

为了实现上述的目的，本发明人已经进行了充分的研究并成功阐明了抗性稻瘟病真菌中的敏感性决定因子，由此完成了本发明。

因此，本发明包含如下所述的。

(1).编码下列任一蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列通过缺失取代或添加一个或多个氨基酸组成的蛋白质，其在scytalone脱水酶抑制剂存在时表现scytalone脱水酶活性。

(2).根据权利要求1的基因，其中所述的scytalone脱水酶抑制剂抑制黑素生物合成途径中由scytalone到1，3，8-三羟基萘的脱水反应。

(3).根据权利要求1的基因，其中所述的scytalone脱水酶抑制剂为加普胺。

(4).由权利要求1的基因编码的scytalone脱水酶。

(5).重组载体，其包括权利要求1的基因。

(6).通过权利要求5的重组载体转化获得的转化体。

(7).用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性的方法，其包括步骤：

(a)鉴定受试稻瘟病真菌中scytalone脱水酶氨基酸序列中的氨基酸，其对应于SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中位点75处的缬氨酸；和

(b)基于步骤(a)的结果评估受试稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性。

(8).根据权利要求7的评估敏感性的方法，其中当步骤(a)中鉴定的氨基酸为甲硫氨酸时，受试稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性被评估为低于步骤(b)中的野生型稻瘟病真菌。

(9).用于筛选抑制剂的试剂盒，其包括权利要求4的scytalone脱水酶。

(10).用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂抗性的试剂盒，包括一对引物，所述的引物设计为侧接于编码相应于SEQ IDNO：4所示氨基酸序列中位点75处缬氨酸的氨基酸的核苷酸序列。

(11).用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂抗性的试剂盒，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中位点75处的缬氨酸所对应的氨基酸的核苷酸序列。

下面，本发明将具体的进行描述。

本发明的基因编码在存在scytalone脱水酶抑制剂(在下文中，称为“SCDH抑制剂”)时具有scytalone脱水酶活性的scytalone脱水酶(在下文中，称为“突变SCDH酶”)。下面的描述中，在SCDH抑制剂存在的条件下具有降低的scytalone脱水酶活性的scytalone脱水酶简称为“SCDH酶”或“野生型SCDH酶”。

SCDH抑制剂的实例包括加普胺(2，2-二氯-N-(1-(4-氯苯基)乙基)-1-乙基-3-甲基环丙烷羧酰胺)，fenoxanil(1-(2，4-二氯苯基)羟基-N-(1-氰基-)-1，2-二甲基)丙基乙烷羧酰胺)，diclocymet(N-[1-(2，4-二氯苯基)乙基]-1-氰基-2，2-二甲基丙烷羧酰胺)等。SODH抑制剂通常用作具有稻瘟病真菌的水稻的传染抑制剂来抑制SCDH酶的活性。特定地，在显示于图1的黑素生物合成途径中，SCDH酶催化由scytalone到1，3，8-三羟基萘(在下文中，简称为“1，3，8-THN”)的脱水反应以及由vermelone到1，8-二羟基萘的脱水反应。

SCDH抑制剂抑制这些SCDH酶的活性来阻止稻瘟病真菌中附着胞的形成由此抑制了对水稻的致病性。换句话说，SCDH抑制剂降低了稻瘟病真菌的传染性，以及因此阻止稻瘟病的爆发。然而，突变SCDH酶甚至在SCDH抑制剂存在的条件下也具有上述的酶活性，且因此赋予稻瘟病真菌对SCDH抑制剂的抗性。相应地，表达突变SCDH酶(在下文中，称为“抗性稻瘟病真菌”或“抗性菌株”)的稻瘟病真菌甚至在存在SCDH抑制剂时也不抑制黑素生物合成，且可形成附着胞来破裂并侵入叶面的表皮膜。

因此，抗性稻瘟病真菌甚至在SCDH抑制剂存在的情况下也显示出高度的传染性。

突变SCDH酶的实例包括具有显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酶。突变SCDH酶可具有类似于SEQ ID NO：2的具有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列，其在scytalone脱水酶抑制剂存在的条件下具有scytalone脱水酶活性。此处所用的术语“一个或多个”是指，例如，1-30个，优选地1-20个，且更优选地为1-10个。

野生型SCDH酶或突变SCDH酶的酶活性可通过测定由scytalone到1，3，8-THN的脱水反应或由vermelone到1，8-二羟基萘的脱水反应来进行评估。具体地，含有野生型SCDH酶或突变SCDH酶以及一种底物(scytalone或vermelone)的反应溶液被用于进行酶反应。然后，测定底物的减少和/或反应产物(1，3，8-THN或1，8-二羟基萘)的增加，由此评估野生型SCDH酶或突变SCDH酶的酶活性。

特定地，由scytalone到1，3，8-THN的酶反应可利用光谱来测定。例如，可根据由Motoyama等，在J.Pestic.Sci，23，58-61，1998中所描述的来测定scytalone的减少。

在另一方面，可通过scytalone底物和1，3，8-THN产物在340-360nm处的UV吸收光谱来测定1，3，8-THN的增加(如图2所示)。虽然scytalone的吸收与1，3，8-THN在200-300nm处的吸收有重叠，但scytalone在340-360nm处的吸收是可以忽略不计的。在利用340-360nm处UV吸收光谱的测定方法中，其中酶反应测定100秒的比率试验被用于测定野生型SCDH酶或突变SCDH酶对SCDH抑制剂的敏感性。

根据此方法，酶反应在一种反应溶液中进行，其中已加入预定浓度的SCDH抑制剂(例如，加普胺)，测定340-360nm处的UV吸收光谱，由此测定反应产物1，3，8-THN的合成的量。测定的1，3，8-THN的合成量除以在缺乏SCDH抑制剂情况下1，3，8-THN的合成量便获得了SCDH抑制剂在该浓度的抑制率。改变SCDH抑制剂的浓度来测定野生型和突变SCDH酶的抑制率并计算每一酶的I₅₀值。由野生型SCDH酶的I₅₀值和突变SCDH酶的I₅₀值，计算R/S比率来评估突变SCDH酶对SCDH抑制剂的敏感性。例如，当计算的R/S比率为2或更高时，突变SCDH酶可被定义为与野生型SCDH酶相比对SCDH抑制剂具有较低的敏感性。

突变SCDH酶的酶活性测定并不局限于上述的方法，且可使用任意的方法。测定突变SCDH酶酶活性的方法可使用，例如，通过HPLC分析对酶反应产物，1，3，8-三羟基萘进行的定量分析。

编码突变SCDH酶的基因(在下文中，称为“突变SCDH基因”)可获自具有内含子的基因组DNA或者没有内含子的cDNA，只要其含有编码上述突变SCDH酶的核苷酸序列。

可通过利用基于来自稻瘟病真菌SCDH酶的cDNA序列以及来自抗SCDH抑制剂的稻瘟病真菌(在下文中，称为“抗性稻瘟病真菌”)的基因组DNA设计的引物进行PCR来获得突变SCDH基因。突变SCDH基因也可通过利用上述引物和从抗性稻瘟病真菌中提取的mRNA进行RT-PCR来获得。来自稻瘟病真菌的SCDH酶的cDNA序列是已知的且描述在Motoyama等，Biosei.Biotech.Biochem，62，564-566，1988(DNA数据库，注册号no_AB004741)上。

根据这些方法获得的突变SCDH基因的实例包括显示于SEQ IDNO：1的核苷酸序列。突变SCDH基因和编码野生型SCDH酶(在下文中，称为“SCDH基因”)的核苷酸序列(cDNA)之间的比较结果显示于图3中。基因组DNA中的突变SCDH基因以及SCDH基因的核苷酸序列之间的比较结果显示于图4中。如图3和4所示，在突变SCDH基因中，在SCDH基因223位点处的G(鸟嘌呤)被同型改变为A(腺嘌呤)。此变化意味着在野生型SCDH酶75位点处的缬氨酸(Val)被突变为甲硫氨酸(Met)。

比较突变SCDH基因与SCDH基因的核苷酸序列的结果，发现位点450处的T(胸腺嘧啶)被突变为突变SCDH中的C(胞嘧啶)。然而，这些变化没有导致氨基酸的突变。

从图3和4的比较，发现突变SCDH基因在突变SCDH酶氨基酸序列的42和43以及141和142位点之间分别具有一个81个碱基的内含子以及一个大约89个碱基的内含子。因为后一内含子(位于突变SCDH酶氨基酸序列的位点141和142之间的)的后面为poly(A)链，且当进行PCR时，生成的产物具有不同的长度，其精确的长度不能被测定。因此，其被表示为“大约89个碱基”。突变SCDH基因并不局限于显示于SEQ IDNO：1的核苷酸序列，可采用任意编码由显示于SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：2通过缺失取代或添加一个或多个氨基酸但在scytalone脱水酶抑制剂存在时具有scytalone脱水酶活性的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。这些核苷酸序列的实例包括显示于SEQ ID NO：1，其包括不导致氨基酸突变的核苷酸取代的核苷酸序列。

突变SCDH基因可以是编码在scytalone脱水酶抑制剂存在时具有scytalone脱水酶活性的蛋白质的核苷酸序列，且能够在严谨条件下与互补于核苷酸序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列杂交。严谨条件是指，例如，10-300mM的钠离子浓度，优选为20-100mM，以及25-70℃的温度，优选地42-55℃。

突变SCDH基因可通过利用来自稻瘟病真菌的基因组DNA作为模板以及一对具有预定序列的引物进行PCR来获得，其中的稻瘟病真菌甚至在SCDH抑制剂存在的条件下侵染水稻。可根据利用CTBA(溴化十六烷基三甲基铵)作为提取溶液的方法、通过SDS/苯酚或苯酚/氯仿提取的方法、或用市售的试剂盒(例如，来自Qiagen的DNeasy PlantSystem，购自Amersbam Biosciences的Nucleon PhytoPure试剂盒，等等)制备基因组DNA，不过其制备不局限于这些方法。

此外，可通过从甚至在SCDH抑制剂存在时也能侵染水稻的稻瘟病真菌中提取总的mRNA以及利用所述的总mRNA以及一对具有预先确定序列的引物进行RT-PCR来获得突变SCDH基因。可从稻瘟病真菌中提取总mRNA，例如，通过胍盐法，SDS-苯酚法，通过用购自Qiagen的RNAeasyTotal RNA System进行的苯酚/氯仿提取，用购自AmershamBiosciences的Quick Prep Micro mRNA纯化试剂盒或Quick PrepTotal RNA提取试剂盒，不过其制备方法不局限于这些方法。

用于上述PCR和RT-PCR的一对引物可基于基因组DNA的核苷酸序列来设计侧接于SCDH基因，其中的基因组DNA来自，例如，储存在基因文库中的稻瘟病真菌。所述的引物对也可被设计来进一步加入基于来自稻瘟病真菌的基因组DNA的核苷酸序列的功能性序列。功能性序列的实例包括由限制性酶识别用于连接载体的序列，以及用于阅读框校正的插入序列。

引物对的实例包括，但不局限于，下列序列：

引物1(SEQ ID NO：5)：5′-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3′

引物2(SEQ ID NO：6)：5′-TTATTTGTCG GCAAAGGTCTCC-3′，

引物3(SEQ ID NO：7)：

5′-AGTTCGAACTG GAATTCAACCGGCACGCATGATGCATGCATTTA-3′，

引物4(SEQ ID NO：8)：5′-ATGGGTTCGCAAGTTCAAAAG-3′

引物5(SEQ ID NO：9)；5′-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3′

引物6(SEQ ID NO：10)：5′-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3′，

引物7(SEQ ID NO：11)：

5′-ATC GTCGACGT GAATTCGTCTTGTAAAAGCCGCCAAC-3′，

引物1、4、6和7为正义引物而引物2、3和5为反义引物。因此，引物对中的一个引物选自正义引物且另一个选自反义引物。

基于公开在出版物中(Motoyama等，Biosei.Biotech.Bioehem，62，564-566，1988)的核苷酸序列来合成引物2，且加下划线的碱基为“G”。然而，在来自DNA数据库的注册号为no.AB004741中的相应碱基为“C”。尽管正确的碱基是“C”，但即使碱基为“G”对PCR和RT-PCR的结果也没有影响。在引物3和7中加下划线的字母表示EcoRI识别的序列。这些EcoRI识别的序列可被用于结合到蛋白质表达载体或其类似物中。引物3和7中5’端到EcoRI识别序列的核苷酸序列被加入来产生足够的空间用于EcoRI识别EcoRI识别序列。在引物7中，EcoRI识别序列的3’侧的两个核苷酸序列(即，引物7中位点18和19处的“GT”)为当结合到蛋白质表达载体(pGEX-2T)中用于阅读框校正的核苷酸。

例如，利用引物7和3并用总的RNA为模板进行RT-PCR。获得的PCR产物用EcoRI处理，然后插入到已用EcoRI消化以及预先用碱性磷酸酶BAP处理的pGEX-2T(Amersham Biosciences)中，由此制备了质粒。质粒被依据布达佩斯条约于2002年3月8日进行国际专利生物保藏，保藏在National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，作为稻瘟病突变SCDH cDNA(FERM BP-7948)。

此质粒(稻瘟病突变SCDH cDNA)能够在宿主诸如大肠杆菌中表达作为融合蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(在下文中，称为“GST”)的SCDH酶。具有突变SCDH基因的质粒可被构建来用于无细胞蛋白质表达系统。

此外，可利用预先确定的探针和来自甚至在SCDH抑制剂存在时仍侵染水稻的稻瘟病真菌的cDNA文库来获得突变SCDH基因。

突变SCDH基因也可获自野生型SCDH基因的突变形成。例如，可通过利用引物进行所谓的定点诱变获得突变SCDH，其中定点诱变是通过将野生型SCDH基因中位点75处编码缬氨酸(Val)的一个密码子改变为编码甲硫氨酸(Met)的密码子。可使用市售的试剂盒进行定点诱变来获得突变SCDH基因。市售试剂盒的实例包括TaKaRa LA PCR体外诱变试剂盒(Takara)。

上述的突变SCDH基因对于筛选降低抗性稻瘟病真菌传染性的新SCDH抑制剂是有用的，如下面的实例所描述的。特定地，可操作地插入了上述突变SCDH基因的表达载体被用于表达突变SCDH酶，在存在候选物试剂的条件下依次测定所述酶的酶活性来筛选新的SCDH抑制剂。通过在侯选试剂存在的条件下，测定突变SCDH酶的酶活性是否下降，可筛选新的SCDH抑制剂。

特定地，根据常规的测定方法，通过所谓的pot试验或基于观察与附着在琼脂培养皿上的玻璃纸破裂相关的附着胞的试验来评估在候选物试剂存在的情况下抑制稻瘟病真菌附着胞的形成，且因此这些方法几乎不能用于SCDH抑制剂的快速筛选。在另一方面，根据上述的方法，SCDH酶的酶活性可根据一种简单的方法进行测定，来允许新的SCDH抑制剂的快速筛选。

从上述突变SCDH的核苷酸序列分析，人们发现在位点75处的缬氨酸(Val)已经改变为甲硫氨酸(Met)突变的SCDH酶在SCDH抑制剂存在的情况下仍具有酶活性。因此可分析编码SCDH酶75位点处氨基酸的核苷酸序列来测定是否受试的SCDH基因赋予了对SCDH抑制剂的抗性。

特定地，当研究是否稻瘟病真菌，例如，来自预先确定的对SCDH抑制剂具有敏感性的区域(一种受试的稻瘟病真菌时)，可鉴定由受试稻瘟病真菌的SCDH基因编码的SCDH酶的位点75处的氨基酸来评估受试稻瘟病真菌对SCDH抑制剂的敏感性。

编码受试SCDH酶位点75处氨基酸的核苷酸序列可根据任意的且不受限于特定方法的方法进行鉴定。为了对编码SCDH酶位点75处氨基酸的核苷酸序列进行测序，至少一对侧接于含有编码SCDH酶位点75处氨基酸的核苷酸序列和模板DNA(cDNA或基因组DNA)的引物被用于测序模板DNA的预先确定的区域。基于测定的核苷酸序列，可鉴定受试SCDH酶中位点75处的氨基酸。

对于编码受试SCDH酶中位点75处氨基酸的核苷酸序列的测序而言，作为模板的基因组DNA优选地通过受试稻瘟病真菌的固态培养，继之以收集丝状的菌丝体并微波照射该菌丝体来获得。照射可通过微波例如利用微波炉等来进行。与液体培养后收集受试稻瘟病真菌并提取基因组DNA的标准方法相比，作为模板的基因组DNA可通过此方法在很短的时间内获得。

为了测定编码受试SCDH酶位点75处氨基酸的核苷酸序列，引物中的一个优选被设计杂交于邻近的，例如，编码位点75处氨基酸的核苷酸序列上游的40个碱基。因此，可在较短的时间内测定编码受试SCDH酶中位点75处氨基酸的核苷酸序列。

此外，为了测定编码受试SCDH酶中位点75处氨基酸的核苷酸序列，可使用一种含有编码对应于氨基酸序列SEQ ID NO：4中位点75处缬氨酸的氨基酸的核苷酸序列的寡核苷酸。例如，寡核苷酸被设计在当受试SCDH酶位点75处的氨基酸是甲硫氨酸时杂交于编码受试SCDH酶的基因。然后，通过利用这些寡核苷酸作为探针进行菌落杂交或Southern杂交，可鉴定受试稻瘟病真菌中位点75处的氨基酸。也可通过此方法进行评估受试稻瘟病真菌对SCDH抑制剂的敏感性。

此外，为了分析受试SCDH酶位点75处的氨基酸，可利用单链DNA构象多态性(在下文称为“SSCP”)。特定地，取决于单链构象差异的野生型SCDH基因和抗性SCDH基因之间迁移率模式的差异被预先检测，并与基于该受试SCDH基因单链构象的迁移率模式相比较。相应地，可鉴定编码受试SCDH酶中位点75处氨基酸的受试SCDH基因的核苷酸序列。通过利用SSCP分析受试SCDH酶位点75处的氨基酸，可非常快速地测定受试稻瘟病真菌对SCDH抑制剂的敏感性。

为了进行分析受试SCDH酶中位点75处的氨基酸，也可应用修饰的PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析(在下文中，称为“修饰的PCR-RFLP法”)。特定地，通过修饰的PCR-RFLP分析，可以以一种简单的方式测定受试稻瘟病真菌的SCDH酶中位点75处的缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)(在下文中，称为“Val75Met突变”)。

在修饰的PCR-RFLP分析中，用于PCR的一个引物不包含位点223处的碱基(该碱基包含在编码SCDH酶位点75处氨基酸的密码子中)且被设计具有依赖于位点223处碱基类型的3-末端的限制性-酶-识别序列。当含有上述限制性-酶-识别序列时，此引物可含有一个或多个与作为模板的基因组DNA或cDNA的核苷酸序列部分错配的碱基。限制性-酶-识别的序列不受特别限制且可以为XbaI识别的序列。

根据修饰的PCR-RFLP分析，首先，利用如上所述设计的一对引物和作为模板的基因组DNA或cDNA进行PCR。进行PCR时，可适当地测定不同的条件诸如温度或时间使得模板的期望的区域可被扩增即使使用包括一个或多个与模板错配的碱基的引物。PCR产生的产物含有一种限制性-酶-识别序列以及上述的取决于位点223处碱基的引物。限制性-酶-识别序列可取决于位点223处的碱基而不被包含。

紧接着，用一种限制性内切酶识别含于上述引物中的限制性-酶-识别序列处理PCR产生的产物。通过此限制性酶处理获得的片段具有取决于位点223处碱基差异的不同长度。然后，通过限制性酶处理获得的片段的长度可被检测，例如，通过方法诸如电泳来鉴定223位点处的碱基，从而来分析受试SCDH酶中位点75处的氨基酸。

此外，为了分析受试SCDH酶的位点75处的氨基酸，可利用通常已知的单核苷酸多态性分型法。单核苷酸多态性分型法的实例包括来自Applied Biosystems的SNaPshot Multiplex试剂盒(单引物延伸反应)，来自Qiagen的Masscode系统(质谱法)，来自Sequenom的MassARRAY系统，来自Takara的UCAN法，利用裂解酶的Invader试验以及利用微阵列的方法。

附图的简要说明

图1是说明稻瘟病真菌中黑素生物合成途径的图解。

图2是显示scytalone和1，3，8-THN的UV吸收光谱的典型图。

图3显示了来自已在基因文库中登记的稻瘟病真菌SCDH基因的核苷酸序列，来自标准菌株的SCDH基因的核苷酸序列(cDNA)以及来自抗性菌株SCDH基因(cDNA)之间的比较。

图4显示了已在基因文库中登记的稻瘟病真菌SCDH基因的核苷酸序列、标准菌株的SCDH基因的核苷酸序列(基因组DNA)以及来自抗性菌株的SCDH基因(基因组DNA)之间的比较。

图5为显示加普胺(Carpropamid)浓度以及提取自标准菌株和抗性菌株(A和B)的粗酶溶液中SCDH酶活性的抑制率之间关系的典型图。在此曲线图中，圆环表示标准菌株的粗酶溶液的结果，空心三角形表示抗性菌株A的粗酶溶液的结果且空心正方形表示抗性菌株B的粗酶溶液的结果。

图6是显示实施例4进行的单链DNA构象多态性(SSCP)分析的结果的电泳照片，其中A(左边)表示没有利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行纯化的电泳的结果，而B(右边)表示利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒纯化后的电泳的结果。

图7是表示质粒稻瘟病野生的SCDH cDNA以及突变SCDH cDNA的制备方法的示意图。

图8为表示加普胺浓度以及在大肠杆菌中表达标准菌株的cDNA获得的GST-融合SCDH酶、在大肠杆菌中表达抗性菌株的cDNA获得的获得的GST-融合SCDH酶、来自标准菌株的粗酶溶液以及来自抗性菌株的粗酶溶液的SCDH酶活性的抑制率之间关系的典型图。在此曲线图中，空心圆环表示标准菌株的粗酶溶液的结果，空心三角形表示由标准菌株cDNA表达的GST-融合SCDH酶的结果，实心圆环表示由抗性菌株的粗酶溶液的结果且实心三角形表示由抗性菌株cDNA表达GST-融合SCDH的结果。

图9为表示fenoxanil或diclocymet浓度和在大肠杆菌中表达标准菌株的cDNA获得的GST-融合SCDH酶以及在大肠杆菌中表达抗性菌株cDNA获得的GST-融合SCDH酶的抑制率之间关系的典型图。在此曲线图中，空心圆环表示通过fenoxanil对标准菌株cDNA表达的GST-融合SCDH酶的抑制，空心三角形表示通过fenoxanil对抗性菌株cDNA表达的GST-融合SCDH酶的抑制，实心圆环表示通过diclocymet对标准菌株cDNA表达的GST-融合SCDH酶的抑制，以及实心三角形表示通过diclocymet对抗性菌株cDNA表达的GST-融合SCDH酶的抑制。

图10是显示通过实施例6中应用的PCR-RFLP方法分析SCDH酶中的Val75Met突变获得的结果的电泳(3％琼脂糖凝胶)照片。

发明的最佳实施方式

实施例

在下面，本发明将通过实施例的方式更具体的进行描述。然而，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1

根据此实施例，首先，制备用于提取SCDH酶的丝状菌丝体。含有作为标准(野生型)菌株的稻瘟病真菌(Pyricularia oryzae)以及加普胺-抗性稻瘟病真菌(抗性菌株A和B)的孢子溶液(10⁵/ml)被分别加入到200ml含有酵母抽提物(5g)、葡萄糖(20g)、KH₂PO₄(0.5g)、Na₂HPO₄(0.5g)和CaCl₂(0.5mg)的YGPCa液体培养溶液(pH 6.5)中，并在27℃培养4到5天。

培养结束后，通过离心培养液收集丝状的菌丝体并用蒸馏水洗涤。加入具有5倍菌丝体重量的冷丙酮，且产物用韦林搅拌器搅匀。离心该匀浆(15,000xg，20分钟)。在4℃干燥沉淀物来获得丙酮粉末，于-85℃储存。

获得的丙酮粉末用于制备含有SCDH酶的粗酶溶液，以测定它们的酶活性。为了制备这些粗酶溶液，每一丙酮粉末被悬浮在20毫升的1/15M的磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中，冰冻过程中搅拌30分钟然后15,000xg离心15分钟。通过离心获得的上清液被用作粗酶溶液。

然后，利用粗酶溶液测定SCDH酶的酶活性，首先混合1,300μl含有1mM EDTA的100mM磷酸盐(pH 6.8)缓冲液、30μl的20mMscytalone(乙醇溶液)、30μl合适浓度的加普胺的乙醇溶液以及1,440μl超纯水并27℃预温育2分钟。然后，加入200μl的粗酶溶液来激发酶反应。监控100秒的通过酶反应由scytalone产生的1，3，8-THN的量，通过UV 350nm处的吸光率的增加而体现，由此测定包含在粗酶溶液中的SCDH酶引起的酶活性。根据常规技术(Kurahashi等，J.Pestic.Sci，23，22-28，1998)，由在加普胺存在下液体培养标准(野生型)菌株获得的菌丝体来制备scytalone底物。

结果显示于图5中。这些结果被通过概率分析用于计算50％的抑制浓度(I₅₀值)。结果，从标准(野生型)菌株提取的粗酶溶液相对于加普胺的I₅₀值为7.45nM，而抗性菌株A和B的分别为163nM和157nM。根据这些值，R/S比率为约21.5。这些暗示抗性菌株A和B对加普胺产生抗性的因素是对scytalone脱水酶的敏感性的下降，其为加普胺的靶位。

实施例2

在此实施例中，首先，如下所述制备丝状的菌丝体来用于从稻瘟病真菌提取基因组DNA和mRNA。首先，标准(野生型)菌株，和加普胺-抗性稻瘟病真菌(抗性菌株A和B)分别培养在麦片培养基上。培养结束后，菌丝体部分被加到20毫升的土豆-葡萄糖(PD)液体培养基中并28℃预培养3天。由于预培养的丝状菌丝体自身形成成块状，用灭菌的韦林搅拌器将其搅匀且1毫升的每一样品在20毫升的PD液体培养基中培养3-5天。通过减压过滤分离菌丝体并用蒸馏水进行洗涤。利用研钵在液氮中将这些菌丝体磨碎。磨碎的粉末-85℃储存。因此，获得了标准(野生型)菌株、抗性菌株A和抗性菌株B的粉末。

为了从抗性菌株A粉末提取总的RNA，使用Rneasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)根据所述的操作说明来进行。为了利用获得的粉末提取基因组DNA，使用Dneasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)根据所附的操作说明来进行。通过用分光光度计测定OD₂₆₀处的吸收来测定RNA的浓度。通过观察1％琼脂糖凝胶上的亮度或通过利用Hoe 33258(Hoechst)测定荧光光谱来测定DNA的浓度。

然后，获得的总的RNA被用于制备含有抗性菌株的突变SCDH基因的cDNA。为了制备含有突变SCDH基因的cDNA，首先，获得的RNA(2μg)与2μl寡聚(dT)₂₀(10pmol/μl)、2μl的引物1(5’-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3’，25pmol/μl)和引物2(5’-TTATTTGTCGGCAAAGGTCTCC-3’，25pmol/μl)以及RT-PCR磁珠(Amersham Biosciences)混合至50μl的终体积来制备反应溶液。反应在下列条件下进行。对于cDNA合成而言，反应在42℃进行30分钟，然后95℃反应30分钟。随后，对于利用合成的cDNA作为模板的PCR反应而言，35个循环的重复95℃30秒、55℃1分钟以及72℃1分钟。最终循环结束后，72℃反应进行7分钟并终止。利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences)进行反应后纯化所获得的反应溶液，来获得RT-PCR产物，含有标准菌株的SCDH基因的cDNA以及含有来自抗性菌株B的突变SCDH基因的cDNA也通过类似于上述方法的方式获得。

此外，利用所获得的基因组DNA制备含有抗性菌株A的突变SCDH基因的DNA。为了制备这些DNA，首先，4μl所获得的基因组DNA被与各1μl的引物1(5’-GCAGTGATACCCACACCAAAG-3’，25pmol/μl)和引物3(5’-AGTTCGAACTGGAATTCAACCGGCACGCATGATGCATGCATTTA-3’，25pmol/μl)和PCR、磁珠(Amersham Biosciences)相混合至25μl的终体积来制备反应溶液。反应在下列条件下进行。对于利用基因组DNA作为模板的PCR反应，进行40个循环的重复95℃30秒、55℃1分钟和72℃2分钟。在72℃7分钟的最后循环之后，反应被终止。利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosc iences)反应之后，纯化获得的反应溶液来获得PCR产物。以类似于上述方法的方式同样获得了含有标准菌株SCDH基因的DNA以及含有抗性菌株B的突变SCDH基因的DNA。

然后，获得的RT-PCR产物和PCR产物被用于测序含有突变SCDH基因的cDNA的核苷酸序列以及含有突变SCDH基因的DNA的核苷酸序列。通过利用来自Applied Biosystems的BigDye终止剂循环测序法FS简便反应试剂盒(BigDye Terminator Cycle Sequencing FS ReadyReaction Kit)进行测序。

利用此试剂盒的测序反应是在用RT-PCR或PCR产物作为模板、3.2pmol引物(引物1，3，5和6)以及8μl的终止剂预混合物的混合物的反应溶液(总计：20μl)中进行的。作为反应条件，40个循环的96℃10秒钟、50℃5秒和60℃4分钟被重复。最后的循环之后，60℃7分钟中止反应。反应之后，通过利用Auto Seq G-50(Amersham Bioscienee)凝胶过滤除去残留在反应溶液中的组分诸如熄灭的终止剂。然后，利用来自Applied Biosystems的ABI 310遗传分析仪分析反应产物来进行核苷酸测序。利用RT-PCR产物作为模板测得的突变SCDH基因的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1且通过该突变SCDH基因编码的突变SCDH酶的氨基酸序列被显示为SEQ ID NO：2。

利用RT-PCR产物作为模板分析突变SCDH基因的cDNA的结果显示于图3中。图3显示了核苷酸序列之间的比较，其中的核苷酸序列分别为已在基因文库中注册的稻瘟病真菌SCDH基因的核苷酸序列(登录号no.AB004741，上行)、利用获自标准菌株的RT-PCR产物进行SCDH基因分析的核苷酸序列(中行)以及利用获自抗性菌株A的RT-PCR产物进行SCDH基因分析的核苷酸序列(下行)。

利用PCR产物作为模板分析基因组DNA中突变SCDH基因的结果显示于图4中。图4显示了核苷酸序列之间的比较，其中的核苷酸序列分别为已在基因文库中注册的稻瘟病真菌SCDH基因的核苷酸序列(登录号no.AB004741，上行)、利用获自标准菌株的PCR产物进行SCDH基因分析的核苷酸序列(中行)以及利用获自抗性菌株A的PCR产物进行SCDH基因分析的核苷酸序列(下行)。关于图3和4，发现在抗性菌株A中SCDH基因的cDNA核苷酸序列223位点处的G(鸟嘌呤)被同型改变为A(腺嘌呤)。此意味着在标准菌株SCDH酶的氨基酸序列75位点处的缬氨酸(Val)被突变为甲硫氨酸(Met)。已注册的核苷酸序列(注册号no.AB004741，图3中的上行)的cDNA核苷酸序列中位点450处的碱基为T(胸腺嘧啶)，而在标准菌株和抗性菌株中其为C(胞嘧啶)。然而，由于这些cDNA核苷酸序列的位点450处碱基的变化与氨基酸突变没有关系，其与对SCDH抑制剂的敏感性毫无关系。

从图4可见，在显示于SEQ ID NO：3的核苷酸序列中具有81个碱基和大约89个碱基长度的内含子被证实分别位于位点42和43之间以及位点141和142之间。因为后一内含子后面邻接poly(A)链且PCR产生的产物具有不同的长度，因此不能测定其精确的长度。相应地，其被表示为“大约89个碱基”。

实施例3

测定稻瘟病真菌SCDH酶的位点75处的缬氨酸(Val)突变成甲硫氨酸(Met)(在下文中，称为“Val75Met突变”)的简单试验已经被考虑。

用牙签挑取在麦片培养基(5％麦片，2％蔗糖和1.5％琼脂)上28℃培养的稻瘟病真菌并转移到1.5μl的微管中。微管用帽盖上并在微波炉(600W)中用微波照射5-7分钟。通过此处理，真菌的细胞壁被破裂。紧接着，向微管中添加50μl的TE缓冲液(pH 8.0)，且彻底搅拌生成物以及14,000rpm离心10分钟。将含有游离基因组DNA的上清液转入另一个微管并在-20℃储存。其中5μl的上清液与各1μl的引物4(5′-ATGGGTTCGCAAGTTCAAAAG-3′，25pmol/μl)、引物5(5′-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3′，25pmol/μl)以及PCR磁珠(Amersham Biosciences)相混合至25μl的终体积来制备反应溶液。对于PCR反应而言，重复进行35个循环的95℃30秒、55℃1分钟以及72℃2分钟。最终循环结束后，72℃反应进行7分钟来终止反应。利用Invisorb Spin PCRapid试剂盒(Invitek)纯化反应溶液来获得PCR产物。反应溶液中的PCR产物被用于利用来自Applied Biosystems的BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready反应试剂盒进行的测序反应。

为了进行测序反应，将作为模板的PCR产物、3.2pmol的引物6(5’-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3′)以及8μl的终止剂预混合物进行混合来制备总量为20μl的反应溶液。为了进行测序反应，重复进行40个循环的96℃10秒钟、50℃5秒和60℃4分钟。最终循环结束后，60℃反应7分钟终止该反应。反应之后，通过利用Auto Seq G-50(AmershamBioscienee)凝胶过滤除去残留在反应溶液中的组分诸如熄灭的终止剂。然后，将反应产物用于利用购自Amersham Biosciences的AB1 310遗传分析器进行的序列分析。通过利用购自Amersham Biosciences的47cm×50μm的短毛细管，以每种样品大约35分钟的较短时间证实了位点75处的缬氨酸到甲硫氨酸的突变。

实施例4

通过应用单链DNA构象多态性(SSCP)分析来进行测定稻瘟病真菌SCDH酶的位点75处的缬氨酸(Val)突变成甲硫氨酸(Met)(在下文中，称为“Val75Met突变”)的简单试验。

如同实施例3，通过用微波照射稻瘟病真菌丝状菌丝体简单地制备基因组DNA溶液。5μl的此基因组DNA溶液被与1μl的引物6(5′-ACAAGCTCTGGGAGGCAATG-3′，25pmol/μl)、引物5(5′-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3′，25pmol/μl)和PCR磁珠(Amersham Biosciences)混合至25μl的终体积来制备反应溶液。对于PCR反应而言，重复进行40个循环的95℃30秒、55℃1分钟以及72℃2分钟。最后的循环之后，72℃7分钟中止该反应。此反应的结果，获得了215bp的PCR产物。利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences)除去残留在反应溶液中的组分诸如taq DNA聚合酶和引物。

此后，制备0.4ml的0.5M EDTA(pH8.0)、10mg的溴酚蓝以及10毫升的甲酰胺的混合物作为用于SSCP的加样缓冲液。以1∶1的比例混合反应溶液和加样缓冲液，85℃加热15分钟并且立即冷却。结果，包含在反应溶液中的PCR产物变成单链DNA。

然后，将反应溶液和加样缓冲液的混合物用于通过购自AmershamBiosciences的PhastSystem全自动电泳系统进行电泳。购自Amersham Biosciences的PhastGeJ Homogeneous 12.5和PhastGelNative Buffer Strips被分别用作凝胶载体和缓冲液试剂，用于400V，10mA，2.5W，4℃和100Vh的预电泳以及400V，10mA，2.5W，4℃和200Vh的实际电泳。结果显示于图6A和6B中。图6A显示了没有利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行上述纯化的电泳的结果。图6B显示了利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒进行上述纯化的电泳的结果。

图6A和6B中的单链DNA的电泳图谱是不同的，推定可能是取决于PCR溶液中的缓冲液组分。在任何情况下，均观察到了标准菌株和加普胺-抗性菌株之间电泳图谱的差异和图6A和6B的区别。

实施例5

构建插入了突变SCDH基因的表达载体来研究其对SCDH抑制剂的抗性。

为了插入稻瘟病真菌的scytalone脱水酶基因到蛋白质表达载体pGEX-2T(Amersham Biosciences)中，利用在它们的末端具有EcoRI切割位点的引物7(5′-ATCGTCGACGTGAATTCGTCTTGTAAAAGCCGCCAAC-3′)和引物3(5′-AGTTCGAACTGGAATTCAACCGGCACGCATGATGCATGCATTTA-3′)进行RT-PCR。根据实施例1中描述的方法进行RT-PCR。引物7和3分别位于SCDH基因的开放阅读框架(ORF)的上游和下游，使其侧接于SCDH酶的整个编码区。

为了进行RT-PCR，首先，提取自标准(野生型)真菌或加普胺-抗性稻瘟病真菌的总的RNA(各自2pg)被与2μl的寡聚(dT)20(10pmol/μl)、各2μl的引物4(25pmol/μl)和引物3(25pmol/μl)以及RT-PCR磁珠(Amersham Biosciences)进行混合来制备终体积为50μl的反应溶液。反应在下列条件下进行。对于cDNA链合成而言，反应溶液在42℃反应30分钟，然后95℃反应30分钟。随后，通过重复进行25个循环的95℃30秒、55℃1分钟以及72℃1分钟进行PCR反应。反应之后，利用GFX PCP DNA和凝胶条带纯化试剂盒(AmershamBiosciences)从反应溶液中纯化RT-PCR产物然后用终体积为50μl的无菌水进行洗脱。

然后，混合30μl含有一种RT-PCR产物的溶液与4μl的10x H缓冲液(Takara)，1μl的EcoRI(12u/μl，Takara)至终体积为40μl并用于37℃的限制性酶反应进行2小时。限制性酶反应之后，用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences)纯化反应溶液并用30μl的无菌水进行洗脱。

此外，1μg的GST-融合蛋白质表达载体pGEX-2T(AmershamBiosciences)被与1μl的10x H缓冲液(Takara)和1μl的EcoRI(12u/μl，Takara)混合至终体积为10μl，并用于限制性酶反应，在37℃反应1小时。在此反应溶液中，加入10μl的BAP缓冲液(TOYOBO)，2.5μl的碱性磷酸酶(0.4u/μl，BAP-101，TOYOBO)和77.5μl的无菌水。生成物被用于在37℃的脱磷酸反应，反应2小时。

然后，混合2μl的EcoRI-消化的RT-PCR产物，1μl的EcoRI/BAP-处理的pGEX-2T，2μl的无菌水以及5μl的连接缓冲液1(Ver.2，Takara)来制备反应溶液并用于连接反应，于16℃反应12小时。反应后，通过按照大肠杆菌感受态细胞(菌株JM109)(Takara)所附的说明，将反应溶液用于转化大肠杆菌JM109。然后，转化的大肠杆菌JM109被涂布在各含有50ppm氨苄青霉素的LB固体培养基上并37℃静止培养12小时。培养后，刮取一些单菌落进行直接菌落PCR。作为直接菌落PCR的结果，筛选到按目的方向插入SCDH基因的pGEX-2T。对核苷酸序列进行进一步的测序以证实插入SCDH基因的核苷酸序列是正确的。这些方法被图示在附图7中。根据此方法获得的质粒被依据布达佩斯条约于2002年3月8日进行了国际生物保藏，保藏在National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，作为稻瘟病突变SCDH cDNA(FERM BP 7948)。

然后，用含有正确插入了SCDH基因的pGEX-2T载体转化的大肠杆菌被27℃培养在200ml含有50ppm氨苄青霉素的LB液体培养基中直至OD₂₆₀变为0.6-1.0。此后，加入异丙基-1-硫代-D-半乳糖苷(IPTG)直至最终浓度为1mM以及进一步彻底地搅拌在27℃培养5小时。培养结束后，通过离心(10,000xg，10分钟，4℃)收集大肠杆菌。大肠杆菌被悬浮在10ml冷的1/15M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中进行洗涤，然后通过再次离心(10,000xg，10分钟，4℃)进行收集。随后，大肠杆菌被再次悬浮在5ml冷的1/15M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中，当冷冻时用微芯片进行超声处理，并在4℃，15,000xg离心20分钟。上清液被用作粗酶溶液。

粗酶溶液被用于测定对加普胺的敏感性。通过与实施例1中描述的相同的方法测定对加普胺的敏感性。结果显示于图8中。在图8中，空心圆环和实心圆环表示实施例1测定的对加普胺敏感性的测定结果。

参见图8可见，对于标准真菌和加普胺-抗性真菌而言，在大肠杆菌中表达的GST-融合SCDH酶与从稻瘟病真菌中提取粗酶溶液含有的SCDH酶具有相同的药物敏感性。

类似地，同样研究了对SCDH抑制剂，fenoxanil和diclocymet，的敏感性。结果显示于图9中。

参见图9，同样发现GST-融合SCDH酶对fenoxanil和diclocymet显示出了抗性。换句话说，图8和9的结果揭示了GST-融合SCDH酶在不同SCDH抑制剂存在的情况下显示出高度的酶活性。相应地，为了发现和/或开发阻止和杀死那些甚至在存在SCDH抑制剂时也对水稻具有高度传染性的稻瘟病真菌的药物，候选试剂可通过利用GST-融合SCDH酶来筛选。特定地，在候选物试剂存在的条件下测定GST-融合SCDH酶的酶活性来选择显著降低了酶活性的候选试剂。筛选的候选试剂降低了突变SCDH酶的酶活性且因此降低了抗性稻瘟病真菌的传染性。相应地，可阻止由抗性稻瘟病真菌所引起的稻瘟病的发展。

实施例6

通过应用PCR-RFLP法得到对于来自稻瘟病真菌的SCDH酶中Val75Met突变的简单的试验。类似于实施例3，用微波照射稻瘟病真菌的丝状菌丝体来简单地制备基因组DNA溶液。将5μl的此基因组DNA溶液与各1μl的引物8(SEQ ID NO：12，5′-TTCGTCGGCATGGTCTCGAGCATCTAG-3′，25pmol/μl)、引物5(5′-GTGGCCCTTCATGGTGACCTCCT-3′，25pmol/μl)以及PCR磁珠(Amersham Bioscience)混合至终体积为25μl来制备反应溶液。

引物8中加下划线的碱基“TCT”与作为模板的基因组DNA的核苷酸序列错配且被用于与3’-末端的碱基“AG”和通过后面所述PCR扩增的第一个碱基形成限制性酶XbaI的切割识别位点(“TCTAGA”)。当通过PCR扩增的第一个碱基是“A”时，通过引物8扩增的片段将包括限制性酶XbaI的切割识别位点。另一方面，当通过PCR扩增的第一个碱基不是“A”时，在扩增的片段中不存在限制性酶XbaI的切割识别位点。

为了进行PCR反应，重复进行40个循环的95℃30秒、55℃1分钟以及72℃2分钟。72℃反应7分钟的最终循环结束后，反应被进行和终止。此反应的结果，获得了183bp的PCR产物。利用GFX PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Biosciences)纯化PCR产物然后用终体积为20μl的无菌水进行洗脱。在生成物中，取7.5μl与1μl 10xM缓冲液(Takara)，1μl的0.1％BSA溶液和0.5μl XbaI(12u/μl，Takara)混合直至终体积为10μl并用于限制性酶反应，在37℃反应1小时。反应溶液的总体积在3％琼脂糖中进行电泳的结果显示于图10中。在图10中，泳道2表示利用从标准菌株提取的基因组DNA的反应溶液。泳道3表示利用提取自抗性菌株的基因组DNA的反应溶液。泳道4表示利用提取自标准菌株的基因组DNA的反应溶液，其没有进行限制性酶反应。泳道5表示利用提取自抗性菌株的基因组DNA的反应溶液，其没有进行限制性酶反应。

从图10可理解，XbaI-处理的来自抗性菌株的PCR产物的样品短大约25个碱基。由此结果可见，很显然可通过应用PCR-RFLP技术来鉴别标准菌株(野生型菌株)和抗性菌株。

工业实用性

如上所述，本发明提供了一种能广泛地应用于，例如，对SCDH抑制剂具有抗性的稻瘟病真菌进行的研究中的基因。此基因可被用于，例如，筛选一种新的SCDH抑制剂以及评估受试的稻瘟病真菌对SCDH抑制剂的敏感性。

序列表的单独文件

SEQ ID NOS：5-12为合成的引物。

序列表

<110>组合化学工业株式会社

<120>编码对农业杀真菌剂表现出抗性的scytalone脱水酶的基因

<130>PH-1735-PCT

<150>JP 2002-66955

<151>2002-03-12

<160>12

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>516

<212>DNA

<213>稻瘟病菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(516)

<400>1

atg ggt tcg caa gtt caa aag agc gat gag ata acc ttc tca gac tac 48

Met Gly Ser Gln Val Gln Lys Ser Asp Glu Ile Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5 10 15

ctg ggc ctc atg act tgc gtc tat gag tgg gca gac agc tac gac tcc 96

Leu Gly Leu Met Thr Cys Val Tyr Glu Trp Ala Asp Ser Tyr Asp Ser

20 25 30

aag gac tgg gat agg ctg cga aag gtc att gcg cct act ctg cgc att 144

Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ile Ala Pro Thr Leu Arg Ile

35 40 45

gac tac cgc tcc ttc ctc gac aag ctc tgg gag gca atg ccg gcc gag 192

Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Trp Glu Ala Met Pro Ala Glu

50 55 60

gag ttc gtc ggc atg gtc tcg agc aag cag atg ctg ggc gac ccc acc 240

Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gln Met Leu Gly Asp Pro Thr

65 70 75 80

ctc cgc acg cag cac ttc atc ggc ggc acg cgc tgg gag aag gtg tcc 288

Leu Arg Thr Gln His Phe Ile Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser

85 90 95

gag gac gag gtc atc ggc tac cac cag ctg cgc gtc ccg cac cag agg 336

Glu Asp Glu Val Ile Gly Tyr His Gln Leu Arg Val Pro His Gln Arg

100 105 110

tac aag gac acc acc atg aag gag gtc acc atg aag ggc cac gcc cac 384

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His

115 120 125

tcg gca aac ctt cac tgg tac aag aag atc gac ggc gtc tgg aag ttc 432

Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Val Trp Lys Phe

130 135 140

gcc ggc ctc aag ccc gat atc cgc tgg ggc gag ttc gac ttt gac agg 480

Ala Gly Leu Lys Pro Asp Ile Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg

145 150 155 160

atc ttt gag gac gga cgg gag acc ttt ggc gac aaa 516

Ile Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys

165 170

<210>2

<211>172

<212>蛋白质

<213>稻瘟病菌

<400>2

Met Gly Ser Cln Val Gln Lys Ser Asp Glu Ile Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5 10 15

Leu Gly Leu Met Thr Cys Val Tyr Glu Trp Ala Asp Ser Tyr Asp Ser

20 25 30

Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ile Ala Pro Thr Leu Arg Ile

35 40 45

Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Trp Glu Ala Met Pro Ala Glu

50 55 60

Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gln Met Leu Gly Asp Pro Thr

65 70 75 80

Leu Arg Thr Gln His Phe Ile Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser

85 90 95

Glu Asp Glu Val Ile Gly Tyr His Gln Leu Arg Val Pro His Gln Arg

100 105 110

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His

115 120 125

Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Val Trp Lys Phe

130 135 140

Ala Gly Leu Lys Pro Asp Ile Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg

145 150 155 160

Ile Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys

165 170

<210>3

<211>516

<212>DNA

<213>稻瘟病菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(516)

<400>3

atg ggt tcg caa gtt caa aag agc gat gag ata acc ttc tca gac tac 48

Met Gly Ser Gln Val Gln Lys Ser Asp Glu Ile Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5 10 15

ctg ggc ctc atg act tgc gtc tat gag tgg gca gac agc tac gac tcc 96

Leu Gly Leu Met Thr Cys Val Tyr Glu Trp Ala Asp Ser Tyr Asp Ser

20 25 30

aag gac tgg gat agg ctg cga aag gtc att gcg cct act ctg cgc att 144

Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ile Ala Pro Thr Leu Arg Ile

35 40 45

gac tac cgc tcc ttc ctc gac aag ctc tgg gag gca atg ccg gcc gag 192

Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Trp Glu Ala Met Pro Ala Glu

50 55 60

gag ttc gtc ggc atg gtc tcg agc aag cag gtg ctg ggc gac ccc acc 240

Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gln Val Leu Gly Asp Pro Thr

65 70 75 80

ctc cgc acg cag cac ttc atc ggc ggc acg cgc tgg gag aag gtg tcc 288

Leu Arg Thr Gln His Phe Ile Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser

85 90 95

gag gac gag gtc atc ggc tac cac cag ctg cgc gtc ccg cac cag agg 336

Glu Asp Glu Val Ile Gly Tyr His Gln Leu Arg Val Pro His Gln Arg

100 105 110

tac aag gac acc acc atg aag gag gtc acc atg aag ggc cac gcc cac 384

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His

115 120 125

tcg gca aac ctt cac tgg tac aag aag atc gac ggc gtc tgg aag ttc 432

Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Val Trp Lys Phe

130 135 140

gcc ggc ctc aag ccc gat atc cgc tgg ggc gag ttc gac ttt gac agg 480

Ala Gly Leu Lys Pro Asp Ile Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg

145 150 155 160

atc ttt gag gac gga cgg gag acc ttt ggc gac aaa 516

Ile Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys

165 170

<210>4

<211>172

<212>蛋白质

<213>稻瘟病菌

<400>4

Met Gly Ser Gln Val Gln Lys Ser Asp Glu Ile Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5 10 15

Leu Gly Leu Met Thr Cys Val Tyr Glu Trp Ala Asp Ser Tyr Asp Ser

20 25 30

Lys Asp Trp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ile Ala Pro Thr Leu Arg Ile

35 40 45

Asp Tyr Arg Ser Phe Leu Asp Lys Leu Trp Glu Ala Met Pro Ala Glu

50 55 60

Glu Phe Val Gly Met Val Ser Ser Lys Gln Val Leu Gly Asp Pro Thr

65 70 75 80

Leu Arg Thr Gln His Phe Ile Gly Gly Thr Arg Trp Glu Lys Val Ser

85 90 95

Glu Asp Glu Val Ile Gly Tyr His Gln Leu Arg Val Pro His Gln Arg

100 105 110

Tyr Lys Asp Thr Thr Met Lys Glu Val Thr Met Lys Gly His Ala His

115 120 125

Ser Ala Asn Leu His Trp Tyr Lys Lys Ile Asp Gly Val Trp Lys Phe

130 135 140

Ala Gly Leu Lys Pro Asp Ile Arg Trp Gly Glu Phe Asp Phe Asp Arg

145 150 155 160

Ile Phe Glu Asp Gly Arg Glu Thr Phe Gly Asp Lys

165 170

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>5

gcagtgatac ccacaccaaa g 21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

ttatttgtcg gcaaaggtct cc 22

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>7

agttcgaact ggaattcaac cggcacgcat gatgcatgca ttta 44

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>8

atgggttcgc aagttcaaaa g 21

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>9

gtggcccttc atggtgacct cct 23

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>10

acaagctctg ggaggcaa tg 20

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>11

atcgtcgacg tgaattcgtc ttgtaaaagc cgccaac 37

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>12

ttcgtcggca tggtctcgag catctag 27

Claims

1.编码下列蛋白质的基因：

由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的蛋白质，其在scytalone脱水酶抑制剂存在时表现scytalone脱水酶活性。

2.根据权利要求1的基因，其中所述的scytalone脱水酶抑制剂抑制黑素生物合成途径中由scytalone到1，3，8-三羟基萘的脱水反应。

3.根据权利要求1的基因，其中所述的scytalone脱水酶抑制剂为加普胺。

4.由权利要求1的基因编码的scytalone脱水酶。

5.重组载体，其包括权利要求1的基因。

6.通过权利要求5的重组载体转化获得的转化体。

7.用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性的方法，其包括步骤：

(b)基于步骤(a)的结果评估受试稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性，其中当步骤(a)中鉴定的氨基酸为甲硫氨酸时，受试稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂的敏感性被评估为低于步骤(b)中的野生型稻瘟病真菌。

8.用于筛选抑制剂的试剂盒，其包括权利要求4的scytalone脱水酶。

9.用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂抗性的试剂盒，其包括一对引物，所述的引物设计为侧接于编码相应于SEQ IDNO：4所示氨基酸序列中位点75处缬氨酸的氨基酸的核苷酸序列。

10.用于评估稻瘟病真菌对scytalone脱水酶抑制剂抗性的试剂盒，其包括寡核苷酸，所述寡核苷酸包含编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中位点75处的缬氨酸所对应的氨基酸的核苷酸序列。