KR970702369A - 루시퍼라제(Luciferases) - Google Patents

Abstract

포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제의 354번 위치 또는 루시올라(Luciola) 루시퍼라제의 356번 위치에 상응하는 글루타메이트가 다른 아미노산, 특히 라이신으로 대체됨으로써 야생형 루시퍼라제보다 열 안정성이 훨씬 큰 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질이 제공된다. 또한 이러한 단백질을 암호화하고 발현하는 DNA, 벡터 및 세포가 본 발명의 단백질을 사용하는 발광 검정을 수행하기 위한 시험 키트와 시약으로씨 제공된다. 바람직한 단백질은 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 215번 위치 또는 루시올라 루시퍼라제의 217번 위치에 상응하는 위치에서 제2의 대체된 아미노산을 갖는다.

Description

루시퍼라제(Luciferases)

본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

제1도는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 1uc 유전자의 삽입에 의해 pKK223-3으로부터 기원한 플라스미드 pPW204의 제한 지도를 도시한 것이다,

제2도는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 1uc 유전자의 삽입에 의해 pDR540으로부터 기원한 플라스미드 pPW116의 제한 지도를 도시한 것이다,

제3도는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 1uc 유전자의 삽입에 의해 pT7-7로부터 기원한 플라스미드 pPW304의 제한 지도를 도시한 것이다,

제5도는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 주어진 온도에서 20분간 항온 처리한 재조합체 및 야생형 포티누스 루시퍼라제(Sigma 제조원)의 열 불활성화에 대한 그래프를 도시한 것이다,

제7도는 pPW304 및 pPW304M-1(라이신이 글루타메이트 354로 교체되는 방식으로 암호화된 본 발명의 플라스미드)로부터 기원한 루시퍼라제의 활성에 대한 열 불활성화의 그래프를 도시한 것이다.

Claims (25)

1. 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제의 354번 잔기 또는 루시올라 민그렐리카(Luciola mingrelica), 루시올라 크루시아타(Luciola cruciata) 및 루시올라 라테랄리스(Luciola lateralis) 루시퍼라제의 356 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타메이트 이외의 아미노산임을 특징으로 하는, 포티누스 피랄리스, 루시올라 민그렐리카, 루시올라 크루시아타 또는 루시올라 라데랄리스로부터의 루시퍼라제에 대한 아미노산 서열과 60% 이상이 상동성이고 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 XGDDKPGA(여기서, X는 글루타메이트이외의 아미노산 잔기이다)을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
3. 제2항에 있어서, 아미노산 서열 TPXGDDKPGA(여기서, X는 글루타메이트이외의 아미노산 잔기이다)을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 X가 글라이신, 프롤린 또는 아스파르트산이 아닌 것임을 특징으로 하는 단백질.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 X가 트립토판, 발린, 루이신, 이소루이신 및 아스파라긴 또는 이들 중 어느 하나의 동족체 또는 변형체임을 특징으로 하는 단백질.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 X가 라이신 및 아르기닌 또는 이들의 동족체 또는 변형체임을 특징으로 하는 단백질.
7. 서열확인번호 2(여기서, Xaa는 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에서 기술된 바와 같은 아미노산 또는 이의 동족체 또는 변형체이다)에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.
9. 제8항에 있어서, 서열확인번호 1(여기서, 1063 내지 1065에서의 3개의 염기 N은 글루타메이트이외의 아미노산을 암호화하는 코돈을 형성한다)에 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA.
10. 제9항에 있어서, 코돈이 제5항 또는 제6항에 기술된 바와 같은 아미노산, 동족체 또는 변형체를 암호화하는 DNA.
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 1uc 유전자를 포함하는 벡터.
12. 제11항에 있어서, 야생형 또는 재조합 1uc 유전자를 포함하는 벡터를 부위 지시된 돌연변이 유발에 의해 처리하여 포탈리스 피랄리스 루시퍼라제의 354번 위치에서의 글루타메이트 또는 루시올라 민그리렐리카, 루시올라 크루시아타 또는 루시올라 라테랄리스 루시퍼라제의 356번 위치에서의 글루타메이트를 암호화하는데 관여하는 코돈을 다른 아미노산, 이의 동족체 또는 이의 변형체로 교환시킴으로써 수득 가능한 벡터.
13. 제12항에 있어서, 다른 아미노산이 제5항 또는 제6항 중 어느 한 항에서 기술한 바와 같은 아미노산, 동족체 또는 변형체인 벡터.
14. 1uc 유전자가 연결된 pKK223-3, pDR540 및 pT7-7로부터 선택된 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 벡터.
15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에서 청구된 바와 같은 DNA 또는 벡터를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서 청구한 바와 같은 단백질을 발현할 수 있는 세포.
16. 제15항에 있어서, 이.콜라이(E.Coli). 에스. 세레비지아에(S.Cerevisiae) 또는 곤충 세포인 세포.
17. 발광성 시약내에 포함된 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 포함함을 특징으로 하는, ATP의 측정을 통한 검정을 수행하기 위한 시험 키트.
18. 루시퍼라제가 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질임을 특징으로 하는, 루시페린 및 루시퍼라제를 사용하여 ATP의 양과 관련된 양의 광을 생성시킴으로써 ATP를 측정하는 검정 방법.
19. 제18항에 있어서, 검정을 30 내지 70℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
20. 제18항에 있어서, 검정을 37 내지 60℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
21. 제18항에 있어서, 검정을 40 내지 50℃의 온도에서 수행하는 검정 방법.
22. 열안정화제의 부재하에 실온에서 10일간 저장한 경우 루시퍼라제 자체의 활성을 85% 이상 보유하는 루시퍼라제 제제.
23. 특이적 결합 시약용 표지로써 제1항 내지 제7항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 루시퍼라제의 용도.
24. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 루시퍼라제로 표지된 특이적 결합 시약을 포함함을 특징으로 하는 시험 키트.
25. 세포 또는 DNA의 확인을 기록하기 위한 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 DNA 또는 벡터를 암호화하는 루시퍼라제의 용도.

    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.