FI120096B - Lusiferaaseja - Google Patents
Lusiferaaseja Download PDFInfo
- Publication number
- FI120096B FI120096B FI963741A FI963741A FI120096B FI 120096 B FI120096 B FI 120096B FI 963741 A FI963741 A FI 963741A FI 963741 A FI963741 A FI 963741A FI 120096 B FI120096 B FI 120096B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- amino acid
- luciferase
- protein
- leu
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
- C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Lusiferaaseja - Luciferaser
Keksintö liittyy uusiin lusiferaasiaktiivisuutta sisältäviin proteiineihin sekä vek-5 toreihin ja DNAihan, jotka koodaavat näiden ilmentymistä. Tarkemmin sanottuna tästä keksinnöstä saadaan käyttöön lusiferaaseja, jotka ovat lämpöstabiileja yli 30 °C:n lämpötiloissa.
Tulikärpäsen lusiferaasi katalysoi lusiferiinin hapettumista ATP:n, Mg2+:n ja ίο molekulaarisen hapen läsnäollessa, minkä tuloksena syntyy valoa. Tämän reaktion kvanttituotto on noin 0,88 [tätä on käsitelty julkaisuissa DeLuca & McElroy (1978) ja Seliger & McElroy (1960)] ja reaktiota käytetään tämän valoa säteilevän ominaisuutensa johdosta luminometrisissä määrityksissä ATP-määriä määritettäessä.
15
Lusiferaasia on hankittavissa käyttöön hyönteisten, kuten tulikärpästen tai kiiltomatojen, ruumiista suoraan tai saattamalla tämä ilmentymään tätä entsyymiä koodaavia yhdistelmä-DNA-konstruktioita sisältävistä mikro-organismeista. Neljä sellaista merkittävää tulikärpäslajia, joista entsyymiä voidaan 20 saada tai sitä koodaavaa DNA:ta voidaan hankkia, ovat japanilaiset GENJI- ja HEIKE-tulikärpäset Luciola cruciata ja Luciola lateralis, itäeurooppalainen tuli-kärpänen Luciola mingreliga ja pohjoisamerikkalainen tulikärpänen (Photinus pyralis). Vielä yksi lähtömateriaali on Lampyris noctiluca -kiiltomato, jonka • lusiferaasin aminohapposekvenssi on 84- %: isesti homologinen Photinus pyra- 25 liksen aminohapposekvenssin suhteen.
• · · • · * : ·* Villityyppisen ja yhdistelmätyyppisen lusiferaasin lämpöstabiilisuus on sitä luokkaa, että nämä menettävät aktiivisuuttaan melko nopeasti, kun ne joutuvat • · · : olemaan yli noin 30 °C:n lämpötiloissa, varsinkin yli 35 °C:n lämpötiloissa.
30 Tällainen epästabiilisuus vähentää entsyymin käyttökelpoisuutta käytettäessä tai varastoitaessa tätä korkeissa ympäristön lämpötiloissa tai jos on tarpeellista kohottaa reaktionopeutta lämmön avulla. Japanilaisen tulikärpäsen lusiferaasia . tiedetään voitavan stabiloida lämpöinaktivoitumista vastaan mutatoimalla sitä .···. siten, että sen 217-asemassa sijaitseva treoniiniryhmä korvautuu isoleusiini- 35 ryhmällä [Kajiyama & Nakano, Biochemistry 32 (1993) 13795 - 13799]. Tällä ’ * : tavoin menetellen entsyymin lämpöstabiilisuus ja pH-stabiilisuus sekä sen *:; ominaisaktiivisuus paranevat. Tutkimusraportteja Photinus pyraliksen ja Luciola . · · ·. mingrelican lusiferaasien lämpöstabiloinnista ei ole saatavilla.
»I· • · · • · · • · 2 Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön uusia lusiferaaseja, joiden lämpöstabiilisuus on villityyppisten lusiferaasien stabiilisuutta suurempi, menetellen siten, että kussakin lajeista Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola lateralis ja Lu-5 ciola cruciata säilyneessä sekvenssissä esiintyvä glutamaattiryhmä korvataan vaihtoehtoisilla aminohapoilla, erityisesti lysiinillä tai arginiinilla. Tämä glutamaatti esiintyy Photinus pyraliksen lusiferaasissa asemassa 354, tämän ja näiden muiden lajien lusiferaaseissa esiintyvän säilyneen aminohapposekvenssin TPE-GDDKPGA kolmannessa aminohapossa.
10 Tämän keksinnön ensimmäisessä kohteessa saadaan siten käyttöön proteiini, jossa esiintyy lusiferaasiaktiivisuutta ja jonka aminohapposekvenssi on yli 60- %: isesti homologinen Photinus pyraliksen, Luciola mingrelican, Luciola craciatan tai Luciola lateraliksen aminohapposekvenssien suhteen, ja jolle on 15 tunnusomaista, että Photinus pyraliksen lusiferaasin ryhmää 354 ja Luciola mingrelican, Luciola craciatan ja Luciola lateraliksen lusiferaasin ryhmää 356 vastaava aminohapporyhmä on jokin muu aminohappo kuin glutamaatti.
Aminohappo voi olla luonnossa esiintyvä aminohappo tai se voi olla niin kutsut-20 tu harvinainen aminohappo, kuten luonnossa esiintyvä modifioitu aminohappo tai tällaisen analogi. Muiden aminohappojen kuin glutamaatin analogien katsotaan olevan yhdisteitä, jotka vaikuttavat proteiiniin vastaavalla tavalla kuin mitä ..... se aminohappo, jonka analogeja ne ovat. Tyypillisiä harvinaisia aminohappoja . ovat aminohapot, joita on esitetty yhdysvaltalaisten ja eurooppalaisten paten- 25 tointikäsikirjojen sisältämissä patenttiasioiden käytännön ohjeissa: käyttöä kos- • · j kevät kuvaukset, jotka sisältävät nukleotidi- ja/tai aminohapposekvenssejä: : 1.; modifioidut ja harvinaiset aminohapot.
• · · • · « ··· :T: Proteiinille on edullisesti tunnusomaista se, että se sisältää aminohappo- 30 sekvenssin XGDDKPGA, jossa X on jokin muu aminohappo kuin glutamaatti. Proteiini sisältää edullisemmin aminohapposekvenssin TPXGDDKPGA ja lämpöstabiilisuuden aikaansaamiseksi X on edullisesti mikä tahansa muu aminohappo kuin asparagiinihappo, proliini tai glysiini; se on vielä edullisemmin • · ♦ .···. tryptofaani, väliini, leusiini, isoleusiini tai asparagiini, mutta se on . 35 edullisimmin lysiini tai arginiini tai minkä tahansa näiden analogi.
··· I
*:·1: On selvää, että joissakin lajeissa voi olla lusiferaaseja, joissa tällä säilyneellä .···’ TPXGDDKPA-alueella on yksi tai kaksi erilaista aminohappoa, mutta tästä • · • · · · • · · • · · • · 3 keksinnöstä saadaan käyttöön kaikki ne aktiiviset proteiinit, jotka vastaavat tällaisia lusiferaaseja, joita on muutettu siinä määrin, että tämän sekvenssin asemassa kolme esiintyvä aminohappo ei ole glutamaatti.
5 Tämän keksinnön edullisissa sovellutusmuodoissa tämän keksinnön mukainen proteiini sisältää myös Luciola-tulikärpäsen lusiferaasien aminohappoa 217 tai Photinus pyraliksen aminohappoa 215 vastaavassa asemassa olevan aminohapon, joka julkaisussa EP-0 524 448A kuvatulla tavalla on muutettu hydrofobiseksi aminohapoksi, edullisesti isoleusiiniksi, leusiiniksi tai valimiksi. Täl-10 laisen muutoksen on havaittu lisäävän pelkällä 354:n muuttamisella aikaansaatavaa lämpöstabiilisuutta; nämä kaksi muutosta vaikuttavat siten huomattavassa määrin toisistaan riippumattomalla tavalla ja niitä voidaan käyttää yhtä aikaa.
15 Tämän keksinnön toisessa kohteessa siitä saadaan käyttöön tämän keksinnön mukaista proteiinia koodaavaa DNA:ta ja kolmannessa kohteessa saadaan käyttöön vektori, erityisesti plasmidi, joka sisältää sellaisessa muodossa olevan luc-geenin (lusiferaasia koodaavan geenin), että tämä kykenee ilmentämään tämän keksinnön mukaista proteiinia. Tällaiset muodot ovat muotoja, joissa vek-20 tori sisältää DNA-sekvenssejä, jotka kykenevät ohjaamaan tämän keksinnön mukaisen proteiinin ilmentymistä siten, että silloin kuin tämä liitetään mikro-organismi-isäntäsoluun, niin proteiini ilmentyy vaikeuksitta vaadittavalla tavalla ....· tarvittaessa sopivia indusoreita lisäämällä.
• « • · I.1 25 Photinus pyraliksen, Luciola mingrelican, Luciola cruciatan ja Luciola latera- I liksen luc-geenit ovat kaikki tunnettuja ja ne ovat eristettävissä tavallisin mole- • | : · kyylibiologisin menetelmin. Photinus pyraliksen luc-geeni on saatavilla kaupal- lisesti Promega-yhtiöstä pGEM-plasmidina. Siten sopivia menetelmiä ja mate- • · * · riaalilähteitä tämän keksinnön mukaisen DNA:n tuotannon lähtömateriaalin 30 valmistamiseksi ovat (i) luonnossa esiintyvän tulikärpäsen genomisen DNA:n käyttö ja tästä tehtävä luc-geenin monistaminen esimerkiksi PCR:ää käyttäen, (ii) pGEM ja (iii) Kajiyaman & Nakanon pGLf37-plasmidi. Materiaalilähteitä, . j* jotka soveltuvat tämän keksinnön mukaisen DNA:n ja lopulta geenien ilmen- ,··* tymisen välityksellä proteiinin valmistamiseen soveltuvaksi lähtömateriaaliksi, t * 35 ovat muut lusiferaasiaktiivisuutta, toisin sanoen valon säteilyyn liittyvää lusi-feriinin hapetusaktiivisuutta, sisältäviä proteiineja koodaavat geenit.
• ··· • · • · · • · * · • ·« 4
Sopivia vektoreita käytettäväksi villityyppisen luc-geenin DNA:n tai jonkin muun luc-geenin DNA:n muokkaukseen tämän keksinnön mukaisen DNA:n aikaansaamiseksi ovat mikä tahansa vektoreista, joissa tämä DNA voi olla silloin, kun luonnossa esiintyvää glutamaattia muutetaan vaihtoehtoiseksi amino-5 hapoksi. Tämä ei ole erityisen ratkaisevaa käytettäessä kemiallisesti aiheutettua mutageneesia, esimerkiksi sellaisten aineiden, kuten hydroksyyliamiinin, käytön kyseessä ollessa, ja tämän alan ammattikokemuksen perusteella on tunnistettavissa monia sopivia vektoreita, joiden avulla tätä geeniä on mahdollista vaikeuksitta muokata ennen mutageneesin suorittamista tai tämän jälkeen.
10
Voi olla edullista mutatoida luc-geeniä spesifisesti glutamaatin kohdalta, joten on tarpeellista käyttää kohdemutageneesia. Näitä menetelmiä käytetään kaikkein helpoimmin alan ammattikokemuksen perusteella tunnettuja vektoreita käyttäen.
15 Villityyppisten ja tunnettuja tyyppejä sekä tämän keksinnön mukaisia tyyppejä olevien luc-geenien ilmentämiseen sopivia vektoreita ovat pKK223-3, pDR540 (tämä on saatavilla yhtiöstä Boehringer Mannheim) ja pT7-7; näistä kaksi ensimmäistä sisältävät laktoosirepressorin ohjaaman tac-promoottorin, joka mahdollistaa sen, että ilmentyminen on indusoitavissa käyttämällä isopropyylitio-20 galaktosidia (IPTG). Käytettäessä pT7-7:ää on ilmentymistä mahdollista ohjata T7-RNA-polymeraasin promoottorin avulla, mikä siten muodostaa perustan erittäin voimakkaalle geenien ilmentymiselle T7-RNA-polymeraasia sisältävissä E. coli -soluissa. Näistä vektoreista havaitaan ilmentymisen olevan voimak-kainta luc-geenien ollessa liitettynä pT7-7-vektoriin.
25
Kun lusiferaasia ilmennetään pKK223-3:een ja pDR540:aan liitetystä luc-gee-: ;·; nistä, niin tämä johtaa villityyppisen N-terminaalisen sekvenssin sisältävän lusi-
• M
feraasin ilmentymiseen, kun taas pT7-7:een liitetyn luc-geenin ilmentyminen johtaa ylimääräiset N-terminaaliset aminohapot M-A-R-I-Q sisältävän fuusio-30 proteiinin syntetoitumiseen. Kussakin luc-geenin sisältävässä vektorissa olevan luc-geenin ribosomin sitomiskohta ja aloituskodoni (nimetyt konstruktiot pPW204, pPW 116 ja pPW304) on esitetty esimerkkien taulukossa 1.
: Tämän keksinnön kolmannesta kohteesta saadaan käyttöön soluja, jotka kyke- ··. : 35 nevät ilmentämään tämän keksinnön mukaisia proteiineja; menetelmiä näiden proteiinien tuottamiseksi näiden solujen avulla sekä tämän keksinnön mukaisia proteiineja sisältäviä testipakkauksia ja reagensseja. Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön määritysmenetelmiä, joissa määritetään ATP:ta lusiferiini/lusi- • · • · · * · · 5 feraasireagenssien avulla tällä alalla tunnetulla tavalla ja joille on tunnusomaista, että lusiferaasi on tämän keksinnön mukainen proteiini. Tämän keksinnön mukaiset lusiferaasipreparaatit ovat suhteellisen lämpöstabiileja 30 - 70 0 C:ssa, erityisesti 37 - 60 °C:ssa ja erityisesti 40 - 50 °C:ssa villityyppisiin ja 5 villityyppisiin yhdistelmä-lusiferaaseihin verrattuna.
Tämän keksinnön mukaisten proteiinien ilmentämiseen voidaan käyttää mitä tahansa solua, joka kykenee ilmentämään heterologista proteiinia sellaisten DNA-sekvenssien avulla, joita on sen DNA:ssa tai vektoreissa, kuten tämän ίο solun sisältämissä plasmideissa. Tällaiset solut ovat tyypillisesti hiivasoluja ja bakteerisoluja, kuten Saccharomyces cerevisiae ja Escherichia coli -solut, mutta alan ammattikokemuksen perusteella tiedetään monia muita proteiinin ilmen-tämistarkoituksiin soveltuvia isäntäorganismeja. Hyönteissolut voivat olla edullisia siitä syystä, että tämä proteiini on hyönteisten proteiini. Proteiinia voi-15 daan ilmentää natiivin proteiinin ja tunnettujen yhdistelmä-lusiferaasien rakenteen suhteen samanlaisena proteiinina tai sitä voidaan ilmentää fuusioproteiinina tai tällaisten proteiinien konjugaattina muiden aminohappojen, peptidien, proteiinien tai muiden kemiallisten kokonaisuuksien, esimerkiksi edellä olevan M-A-R-I-Q-sekvenssin, kanssa.
20
Alan ammattikokemuksen perusteella on selvää, että tietyissä isännissä voi vallita tietty nimenomainen kodonien edullinen käyttötapa, esimerkiksi bakteerit käyttävä joissakin tapauksissa eri kodoneja kuin hiivat, joten tällaiseen isäntään liitettävää DNA:ta voidaan edullisesti muuttaa sellaisen tiettyä aminohappoa 25 vastaavan degeneratiivisen kodonin aikaansaamiseksi, joka ilmentyy suotuisammin tuloksin tässä isännässä. Tällaiset degeneratiiviset DNA-mole- • : kyylit kuuluvat luonnollisesti tämän keksinnön mukaisen DNA:n suojapiirin.
• · · • · · • · ·
Yksi sopiva isäntä on E. coli BL21(DE3) ja sen kromosomiin on integroitu 30 stabiilisti T7-RNA-polymeraasi indusoituvan lacUV5-promoottorin ohjaamana ja se on siten yhteensopiva pT7-7:sta peräisin olevien konstruktioiden suhteen. E. coli B -kannoista, kuten BL2lista, puuttuu lon-proteaasi ja ulkomembraanin ompT-proteaasi. Nämä vaillinaisuudet voivat edistää ilmentymisen stabiloitu- • · · * mistä ja vieraiden proteiinien kerääntymistä E. coliin. Määritykset kutakin näitä ... : 35 kolmea edellä kuvattua ilmentymiskonstruktiota sisältävien E. coli BL21(DE3) -solujen raakauutteista osoittivat, että lusiferaasia saatiin ilmentymään voimak- — kaimmin pPW304-konstruktion sisältävistä soluista (ks. taulukko 2).
• · • « · 1 · ♦ · ♦ • · · » · 6 Tämän keksinnön mukaisista mutatoiduista proteiineista saadaan lämpöstabiili-suuden lisäksi muitakin etuja. Photinus 354/Luciola 356 -aminohappoasemassa olevan mutaation on havaittu muuttavan lusiferaasin hapettuessa säteilevän valon aallonpituutta sen mukaan, mitä aminohappoa tai analogia glutamaatin tilal-5 la käytetään. Tästä keksinnöstä saadaan siten myös käyttöön lusiferaaseja, jotka soveltuvat käytettäväksi spesifisinä sitoutumisreagenssileimoina tai reportteri-geeneinä, jotka ilmaisevat identtisyytensä spesifisenä valon aallonpituutena lusiferiinin hapettuessa niiden proteiinituotteita käytettäessä; tämä ominaisuus tekee sellaiset mutaatiot, kuten glysiini, proliini ja aspartaatti, käyttökelpoisiksi, ίο Tämän keksinnön mukaisen proteiinien lisäetu, joka on peräisin niiden lisääntyneestä lämpöstabiilisuudesta, on se, että niitä kyetään valmistamaan normaalia korkeammissa lämpötiloissa, esimerkiksi 37 °C:ssa tai tätä korkeammissa lämpötiloissa, saannon ollessa vastaavassa määrin suurempi, kuten tuonnempana olevista esimerkeistä käy ilmi.
15 Tämän keksinnön mukaisia proteiineja, DNA:ta, vektoreita ja soluja kuvataan seuraavaksi pelkästään valaisevin esimerkein käyttäen apuna seuraavia keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä, kuvioita, taulukoita ja sekvenssilistausta. Muunlaiset proteiinit, proteiinikonjugaatit, DNA-molekyylit, vektorit ja solut ja 20 näitä sisältävät määritykset ja testipakkaukset ovat näiden valossa alan ammattikokemuksen perusteella ilmeisiä.
Kuviot m'\ Kuvio 1 on restriktiokartta plasmidista pPW204, joka on johdettu pKK223-3:sta i \. 25 liittämällä siihen luc-geeni alla olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla.
• · · • · · • · • · . Kuvio 2 on restriktiokartta plasmidista pPW116, joka on johdettu pDR540:stä , v. liittämällä siihen luc-geeni alla olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla.
• · · 30 Kuvio 3 on restriktiokartta plasmidista pPW304, joka on johdettu pT7-7:stä liittämällä siihen luc-geeni alla olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla.
Kuvio 4 on restriktiokartta plasmidista pPW601a, joka on johdettu pDR540:stä • · · ja BamHI/Sstl-fragmentista, joka oli peräisin pGEM-luc:sta, josta Xho-kohta • · ... : 35 oli poistettu.
• 1 . . Kuvio 5 on kuvaaja yhdistelmä-tyyppisen lusiferaasin ja villityyppisen • · · :...: Photinuksen lusiferaasin (Sigma) lämpöinaktivoinnista, jossa inkubointi on • 1 • 1 1 • · · • · 7 suoritettu esitetyssä lämpötilassa 20 minuutin ajan alla olevissa esimerkeissä kuvatulla tavalla.
Kuvio 6 on kuvaaja lusiferaasiaktiivisuudesta E. coli BL21(DE3)pPW304:n 5 raakauutteissa eri lämpötiloissa suoritetun kasvatuksen aikana.
Kuvio 7 on kuvaaja sellaisten lusiferaasien aktiivisuuden lämpöinaktivoinnista, jotka ovat peräisin pPW304:sta ja pPW304M-l :sta (tämän keksinnön mukainen plasmidi, joka koodaa siten, että glutamaatin 354 tilalla on lysiini).
10
Kuvio 8 on kuvaaja Sigman villityyppisen lusiferaasin ja pPW304- ja pPW304 M-l-yhdistelmälusiferaasien ajasta riippuvaista inaktivoitumista 37 °C:ssa.
Kuvio 9 on pT7-7:n restriktiokartta Tabor’in mukaan.
15
Kuvio 10 on kuvaaja, joka kuvaa tämän keksinnön mukaista lusiferaasia ilmentävän E. colin raakasolu-uutteiden aktiivisuuden lämpöinaktivointia Promega-hajotuspuskurissa 40 °C:ssa, jotka solut ilmentävät lusiferaaseja, joissa kussakin erikseen on asemassa 354 olevan villityyppisen glutamaatin tilalla alaniini, 20 väliini, leusiini, isoleusiini, tyrosiini, fenyylialaniini, tryptofaani, glutamiini, histidiini, asparagiini, metioniini, arginiini, lysiini, seriini, treoniini tai kysteiini.
• » «
Kuvio 11 on kuvaaja, joka kuvaa sellaisen puhdistetun kaksinkertaisen mutaa- • · • *·· 25 tion sisältävän lusiferaasin aktiivisuuden lämpöinaktivointia, joka sisältää E354K-lysiini- ja A215L-leusiinimuutokset, 47 °C:ssa fosfaattipuskurissa : yksinkertaisen mutaation sisältäviin mutatoituihin A215L- ja E354K-muotoihin ··· verrattuna.
• · ♦ 30 Kuvio 12 on kuvaaja, joka kuvaa E354K-lysiinimutaation sisältävän lusiferaasin, villityyppisen yhdistelmä-lusiferaasin ja natiivin tulikärpäsen lusiferaasin . jäännösaktiivisuutta ilmoitettuna prosentteina lähtöaktiivisuudesta ajan suhteen **j· 37 °C:ssa HEPES-puskurissa, jonka pH oli 7,75 ja joka sisälsi 0,02 % atsidia.
• · • · • « ··· 35 Kuvio 13 on kuvaaja, joka kuvaa villityyppisen yhdistelmälusiferaasin, yksin- kertaisen E354K-mutaation sisältävän lusiferaasin ja kaksinkertaisen E354K+A215L-mutaation sisältävän lusiferaasin ilmentymistä 37 °C:ssa, jossa • · « • · • · · • * · • · g viljelmän solutiheyttä kuvaava absorbanssin lisääntyminen on esitetty lusiferaa-siaktiivisuuden funktiona.
Kuvio 14 on kuvaajaa, joka kuvaa yksinkertaisen A215L-mutaation sisältävän 5 lusiferaasin ja yksinkertaisen E354K-mutaation sisältävän lusiferaasin, kaksinkertaisen A215L+E354K-mutaation sisältävän lusiferaasin, yhdistelmä-tyyppisen lusiferaasin ja Sigman villityyppisen lusiferaasin jäännösaktiivisuutta ilmoitettuna prosentteina lähtöaktiivisuudesta ajan suhteen, joiden kunkin lusiferaasin konsentraatio on 10 ng/ml ja joita kutakin tutkittiin 5 tunnin ajan 37 °C:ssa ίο HEPES-puskurissa, jonka pH oli 7,75 ja joka sisälsi 1 % BSA:ta ja 0,02 % at-sidia.
Kuvio 15 on kuvaaja, joka kuvaa yksinkertaisen A215L-mutaation sisältävän lusiferaasin ja yksinkertaisen E354K-mutaation sisältävän lusiferaasin, kaksin-15 kertaisen A215L+E354K-mutaation sisältävän lusiferaasin, yhdistelmä-tyyppisen lusiferaasin ja Sigman villityyppisen lusiferaasin jäännösaktiivisuutta ilmoitettuna prosentteina lähtöaktiivisuudesta ajan suhteen, joiden lusiferaasien konsentraatio on 10 ng/ml ja joita on tutkittu 5 tunnin ajan 37 °C:ssa HEPES-puskurissa, jonka pH oli 7,75 ja joka sisälsi 1 % BSA:ta ja 0,02 % atsidia, 2 mM 20 EDTA:aa ja 2 mM DTT:tä.
Sekvenssilistaus: Tämän patenttiselityksen jälkeen esitetyssä sekvenssilistauksessa kuvataan seu- ..;: raavat DNA- ja aminohapposekvenssit: • · : ·. 25 Γ·· SEKVENSSI ID NO:l on sellaista tämän keksinnön mukaista lusiferaasia koo- • · ; .1 daavan DNA:n DNA-sekvenssi, jossa Photinus pyraliksen asemassa 1063 - • · · .·.· 1065 oleva villityyppinen kodoni on mutatoitu; lysiinin kyseessä ollessa kohdal la 1063 oleva emäs on mutatoitu A:ksi.
30 SEKVENSSI ID NO:2 on sellaisen tämän keksinnön mukaisen proteiinin aminohapposekvenssi, jossa Photinus pyraliksen villityyppinen aminohappo, ’·:· glutamaatti 354, on muutettu joksikin muuksi aminohapoksi.
• · • » « · ... 35 SEKVENSSI ID NO:3 on sellaisen oligonukleotidin sekvenssi, jota on käytetty ....· pPW601:n kohdemutatointiin lysiinin saamiseksi asemassa 354 olevan gluta- • · maatin tilalle esimerkissä 2.
• · · « · • 1 • t • · · • · 9 SEKVENSSI ID N0:4 on sellaisen oligonukleotidin sekvenssi, jota on käytetty pPW601:n kohdemutatointiin leusiinin saamiseksi asemaan 215 esimerkissä 5.
SEKVENSSI ID NO:5 on sellaisen tämän keksinnön mukaisen proteiinin 5 aminohapposekvenssi, jossa Photinus pyraliksen villityyppinen aminohappo, glutamaatti 354, on muutettu joksikin muuksi aminohapoksi ja aminohappo 215 muutettu leusiiniksi.
Esimerkit 10 Esimerkki 1: Tämän keksinnön mukaista DNA:ta sisältävien plasmidien valmistus
Plasmidit pKK223-3 ja pDR540 hankittiin Boehringer-Mannheim -yhtiöstä; pDR540 on myös saatavilla Pharmacia-yhtiöstä.
15 Plasmidi pT7-7 (tätä on käsitelty teoksessa Current protocols in Molecular Biology Voi II Section 16.2.1) saatiin Stan Tabor’ilta, Dept of Biol Chem, Harvard Medical School, Boston, Mass 02115 ja (kuten kuviossa 8 on esitetty) tämä sisältää T7-RNA-polymeraasin promoottorin <pl0 ja T7:n geenin 10 proteiinin translaation aloituskohdan (T7 ep 22857 - 22972), joka on liitetty pT7-20 5:n PvuII- ja Clal-kohtien väliin. Fuusioproteiinien muodostamiseen tarkoitetut ainutkertaiset restriktiokohdat (5'-päiden täyttämisen jälkeen) ovat kehys 0: EcoRI; kehys 1: Ndcl, Smal, Clal; kehys 2: BamHI, Sali, Hindlll. Alkuperäi-sen polylinker-sekvenssin Sacl-kohta poistetaan deletoimalla ja aloituskodonin .. ‘: suhteen vastasuuntaan käytetään uutta Xbal-kohtaa.
• · : *. 25 t Γ·*. Tulikärpäsen lusiferaasi (tämä on valmistettu kiteisestä suspensiosta, tuote- : luettelon nro L9009), koentsyymi-A ja ATP hankittiin yhtiöstä Sigma « · « :y Chemicals Co. Kovakuoriaisen lusiferiinin kaliumsuola hankittiin Promega- yhtiöstä. Solu-uutteet valmistettiin Promegan teknisessä tiedotteessa nro 101 30 kuvatulla tavalla. E. coli -viljelmien näytteet hajotettiin 10 minuutin ajan huoneenlämmössä soluviljelmän hajotusreagenssissa (seoksen koostumus oli , 25 mM Tris-fosfaatti, pH 7,8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10-%:inen glyseroli, • * *·|· l-%:inen Triton X-100, 2,5 mg/ml BSA, 1,25 mg/ml lysotsyymi) ja ne varas- toitiin sitten jäissä ennen määritystä.
35 .... Solulinjojen lusiferaasiaktiivisuus määritettiin seuraamalla pesäkkeiden säteile- mää bioluminesenssia siirtämällä pesäkkeet nailonsuodattimille (Hybond N, • *··· Amersham) ja kastamalla suodattimet sitten seokseen, jonka koostumus oli « · 10 0,5 mM lusiferiinia 100 mM natriumsitraattipuskurissa, jonka pH oli 5,0 [Wood & DeLuca, Anal Biochem 161 (1987) 501 - 507]. Lusiferaasimääritys suoritettiin in vitro -olosuhteissa 25 °C:ssa käyttäen 125 μΐ määrityspuskuria (20 mM Tricine, 1 mM MgSC>4, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 0,27 mM 5 koentsyymi-A, 0,47 mM lusiferiini, 0,53 mM ATP ja 1 - 2 μΐ näytettä). Määritysseoksen lopullinen pH oli 7,8 ja valonmääritykset suoritettiin BioOrbit 1250 -luminometrillä.
DNA:n epäspesifisten kemiallisten mutaatioiden aikaansaamiseksi käsiteltiin ίο luc-geenejä sisältäviä plasmideja Kironde, et al.’:n, Biochem. J. 259 (1989) 421 - 426, menetelmän mukaan käyttäen 0,8 M hydroksyyliamiinia ja 1 mM EDTA:a 0,1 mM natriumfosfaatissa, jonka pH oli 6,0, 2 tunnin ajan 65 °C:ssa. Mutagenisoidusta plasmidista poistettiin suolat DNA-puhtausastetta olevassa G60-Nick-kolonnissa (Pharmacia), minkä jälkeen se transformoitiin E. coli 15 BL21 (DE3) -soluihin.
Lämpöinaktivointitutkimukset suoritettiin inkuboimalla lusiferaasiaktiivisuutta sisältäviä puhdistamattomia solu-uutteita useissa eri lämpötiloissa 20 minuutin ajan ja määrittämällä jäljellä olevat aktiivisuudet. Sigma-yhtiöstä hankittua 20 puhdistettua lusiferaasia käyttäen suoritetuissa tutkimuksissa entsyymi laimennettiin ennen inaktivointia Promega-hajotuspuskuriin. Aikariippuvuutta koskevien tutkimusten kyseessä ollessa inkuboitiin Eppendorf-koeputkia, jotka sisäl-sivät 50 μΐ puhdistamatonta solu-uutetta tai Sigman lusiferaasia, hajotus-. puskurissa 37 °C:ssa. Koeputki poistettiin eri aikoina ja tämä jäähdytettiin jäissä 25 ennen määritystä. Jäljellä oleva aktiivisuus ilmoitettiin prosenttimääränä alku- ' peräisestä aktiivisuudesta.
• · · • · E. coli BL21 (DE3):sta tapahtuvan lusiferaasin ilmentymisen suhteelliset tasot : kustakin konstruktioista pPW204, pPW116 ja pPW304 ovat 0,1 : 0,5 : 1,0.
30 Solut kasvatettiin LB:ssa absorbanssiarvoon 0,3 600 nm:n kohdalta määritettynä, minkä jälkeen ne indusoitiin IPTG:lla ja niiden annettiin kasvaa vielä 4 tuntia, jonka jälkeen valmistettiin raakauute ja lusiferaasiaktiivisuus määri- . tettiin.
• · « ♦ · · ♦ * · 35 Taulukko 1: Ribosomin sitoutumiskohdat (alleviivattuna) ja aloituskodonit esi-" : merkissä 1 käytetyissä ilmentämiskonstruktioissa.
. ·:·! pPW304 A AGG AGAT AT AC AT ATG* CGT AGA ATT CAA ATG
11 ppwll6 AGGAACAGGATCCA ATG1 pPW204 AGGAAACAGCAA ATG1
Kohdemutageneesi, jota tarvittiin glutamaatin muuttamiseksi vaihtoehtoiseksi 5 aminohapoksi, suoritettiin käyttäen seuraavaa menetelmää. Koska glutamaatin lysiiniksi muuttava mutaatio sijaitsee ainutkertaisessa Aval-restriktiokohdassa ja siten tuhoaa sen, on mutageenisenä ja selektio-oligonukleotidina mahdollista käyttää yhtä oligonukleotidia.
10 Kohdemutageneesimenetelmä:
Valittu plasmidi denaturoidaan ja sen annetaan liittyä lysiinin selektio-oligo-nukleotidiin/mutageeniseen nukleotidiin: 5'-CATCCCCCTTGGGTGTAAT- CAG-3', jossa alleviivattu T on epäyhteensopiva kohta. Syntetoidaan mutatoitu DNA-juoste ja se ligatoidaan ja seokselle kokonaisuudessaan suoritetaan 15 primaarinen pilkkominen Aval-restriktioentsyymillä.
Transformaatio soluihin, tässä tapauksessa E. coli BMH 71-18 mut S -soluihin, suoritettiin käyttäen BioRad-Gene Pulser versio 2-89 -laitetta. Hankittiin käyttöön talteen otettuja soluja ja eri plasmideista koottu puhdistettu yhdistelmä, 20 joka sisälsi mutatoituja ja lähtömuotoisia plasmideja, ja suoritettiin sekundaarinen pilkkominen restriktioentsyymillä käyttäen Aval:ta, minkä jälkeen seos transformoitiin E. coli JM 109 -soluihin. Nämä solut maljattiin selektio-mediumeille (LB-agar + 50 pg/ml ampisilliiniä) ja kloonit seulottiin puhdista-. maila niiden plasmidi-DNA ja analysoimalla Aval-restriktiokohdan häviäminen.
J·’’ 25 Plasmidi-DNA puhdistettiin kussakin tapauksessa käyttäen Bimboim’in ja • · · J. . Dolyn, Nucleic Acids Research 7 (1979) 1513, alkalista hajotusmenetelmää.
: ; ‘ Menetelmien täsmälliset yksityiskohdat olivat sen mukaiset, kuin mitä on kuvat- • · · tu Clontech Laboratories Inc (US) -yhtiön kaupan pitämässä reagenssipakkauk-: sessa Transformer^TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Version 2), tuote- 30 luettelon nro K1600-1.
Kuviona 4 on esitetty restriktiokartta pPW601A:sta, joka on sellainen : pPW116:n variantti, joka on saatu Pharmacian pDR540:sta ja pGEM-luc:sta peräisin olevasta BamHl/Sstl-fragmentista, josta Xho-kohta on tuhottu. Kohde-35 mutageneesi suoritettiin edellä ja Clontech’in ohjeissa kuvatulla tavalla siten, • · · · että tähän plasmidiin liitetty villityyppinen Photinuksen luc-geeni saatiin muun-nettua SEKVENSSISSÄ ID NO:l esitetyksi sekvenssiksi, jossa 1063 - 1065 on • · · • · • · · · • · · • · · • · 12 AAG, ja ilmennetty proteiini modifioitua aminohapposekvenssiltään asemasta 354 SEKVENSSISSÄ ID NO:2 esitetyllä tavalla lysiiniksi.
Esimerkki 2: Lusiferaasien lämpöstabiilisuus: 5 Lämpöstabiilisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla valmistetuista useista erilaisista sellaisista lusiferaaseista, jotka olivat E. colin sisältämissä vektoreissa esiintyvien modifioimattomien ja modifioitujen (toisin sanoen tämän keksinnön mukaisten) luc-geenien ilmentämiä, ja tulokset on esitetty kuvioissa 5-8.
ίο Kun sellaisen lusiferaasiaktiivisuuden t^ita (puoliintumisaikaa) verrattiin olosuhteissa, joissa lusiferaasin konsentraatio oli 50 pg/ml, ja lämpötila 43,5 °C seoksessa, jonka koostumus oli 50 mM kaliumfosfaattipuskuri, pH 7,8, 1 mM EDTA, 0,2 % (w/v) BSA, 1 mM DTT ja 10 % ammoniumsulfaatti, niin tilanne, jossa aktiivisuudesta on jäljellä 50 %, havaitaan saavutettavan aikoina, jotka 15 ovat:
Sigman villityyppinen lusiferaasi: t^2 saavutetaan noin 1,5 minuutissa pPW601 (354 = glutamaatti): t1/2 saavutetaan noin 5 minuutissa pPW601aK (354 = lysiini): t1/2 saavutetaan noin 30 minuutissa 20
Edellä olevista luvuista on siten selvästi havaittavissa, että lysiinin käyttö glutamaatti 354:n tilalla lisää lusiferaasin lämpöstabiilisuutta vähintään 43,5 °C:een.
··· Esimerkki 3: Lusiferaasin lämpöstabiilisuus: :·. 25 Määritettiin useiden sellaisten lusiferaasien lämpöstabiilisuus, joita kohde- mutageneesimenetelmällä modifioidut muita tämän keksinnön mukaisia aseman • · .' 354 mutaatioita vastaavat luc-geenit ilmensivät E. colin sisältämissä vektori reissä, jotka oli valmistettu esimerkissä 1 kuvattujen menetelmien suhteen ana logisin menetelmin, ja tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 10.
30 t1/2-arvoja verrattiin 40 °C:ssa Promega-hajotuspuskurissa ja harvoina esitetyt tulokset minuuteissa ilmoitettuna olivat: • « · • · · :T pPW601aK (354 = lysiini), t1/2 saavutetaan noin 13 minuutissa 35 pPW601aR (354 = arginiini), t1^ saavutetaan noin 13 minuutissa pPW601aL (354 = leusiini), tl/2 saavutetaan noin 10 minuutissa PPW601aI (354 = isoleusiini), t1/2 saavutetaan noin 10 minuutissa pPW601aN (354 = asparagiini), t1/2 saavutetaan noin 10 minuutissa • · • · · • · ♦ ♦ « 13 pPW601aV (354 = väliini), t1/>2 saavutetaan noin 9 minuutissa pPW601aW (354 = tryptofaani), t1/2 saavutetaan noin 8 minuutissa pPW601aA (354 = alaniini), t1/2 saavutetaan noin 6,5 minuutissa pPW601aY (354 = tyrosiini), t1/2 saavutetaan noin 6,5 minuutissa 5 pPW601aM (354 = metioniini), t1^ saavutetaan noin 5,5 minuutissa pPW601aF (354 = fenyylialaniini), t1^ saavutetaan noin 5 minuutissa pPW601aH (354 = histidiini), t1/2 saavutetaan noin 5 minuutissa pPW601aT (354 = freoniini), t1/2 saavutetaan noin 4,5 minuutissa pPW601aQ (354 = glutamiini), t1//z saavutetaan noin 4,5 minuutissa ίο pPW601aC (354 = kysteiini), t^2 saavutetaan noin 4 minuutissa pPW601aS (354 = setiini), t1/2 saavutetaan noin 3,5 minuutissa pPW601aE (354 = glutamiinihappo), t,j/2 saavutetaan noin 1 minuutissa pPW601aD (354 = asparagiinihappo), t^2 saavutetaan noin 1 minuutissa pPW601aP (354 = proliini), t1/2 saavutetaan noin 1 minuutissa 15 pPW601aG (354 = glysiini), tl/2 saavutetaan noin < 1 minuutissa
Esimerkki 4: Lusiferaasien stabiilisuus 37 °C:ssa ja huoneenlämmössä pPW601K-lysiinimutaation lusiferaasia (86 ng/ml), villityyppistä yhdistelmä-lusiferaasia (550 ng/ml) ja natiivin tyypin (Sigma) lusiferaasia (62,5 ng/ml) in-20 kuboitiin 4 tunnin ajan 37 °C:ssa l-% :isessa BSA:ssa, joka oli valmistettu HE-PES-puskuriin, jonka pH oli 7,75 ja joka sisälsi säilyteaineena 0,02 % atsidia. Jäljellä olevan aktiivisuuden määrittämiseksi lisättiin 1 ng lusiferaasia D-lusi-.:: feriinisubstraattiin ja luminesenssi-iskut minuuttia kohti määritettiin.
• · · j.“* 25 Tulokset on esitetty alla sinä jäljellä olevana aktiivisuutena, joka saatiin kahden i. ! tunnin inkuboinnista 37 °C:ssa ja 10 päivän inkuboinnista huoneen lämmössä.
• · · '.: ·: Kahden tunnin kuluttua 37 °C: ssa: • * :: ·’ mutatoitu E354K-lusiferaasi, jäännösaktiivisuus 70 % 30 villityyppinen yhdistelmälusiferaasi, jäännösaktiivisuus 12 % natiivi Sigma-lusiferaasi, jäännösaktiivisuus 18 % . 10 päivän kuluttua huoneenlämmössä: ,··.· mutatoitu E354K-lusiferaasi, jäännösaktiivisuus 85 % • · 35 villityyppinen yhdistelmälusiferaasi, jäännösaktiivisuus 59 % natiivi Sigma-lusiferaasi, jäännösaktiivisuus 71 % • · • · · • · • · • · · • · • · · • · 14
Esimerkki 5 354K:215L-kaksoismutantin valmistus ia sen pysyvyys
Valmistettiin pPW601a:n Photinus pyralis -lusiferaasin 354-lysiini:215-leusiini -kaksoismutantti ottamalla käyttöön pPW601aE354K esimerkissä 1 kuvatulla 5 tavalla ja mutatoimalla se käyttämällä SEKVENSSIN ID NO:4 5’-GAATCT-GACGCAGAGAGTTCTATGCGG-3' mukaista oligonukleotidia, jossa alleviivatut emäksen esittävät mutaation aikaansaavia epäyhteensopivuuksia. Tämä mutaatio varmistettiin DNA:n sekvensoinnilla ja E. colissa ilmennetyssä muodossa olevan lusiferaasin lämpöstabiilisuuden määritys suoritettiin esimerkissä 1 ίο kuvatun määrityksen suhteen analogisella menetelmällä esimerkeissä 2-4 kuvatulla tavalla käyttäen lämpöinaktivointimediumina fosfaattipuskuria, jonka pH oli 7,8 ja joka sisälsi 1 mM EDTA:ta, 0,2 % (w/v) BSA:ta, 1 mM DTT:ta ja 10 % ammoniumsulfaattia.
15 43,5 °C:ssa fosfaattipuskurissa aktiivisuutta katosi 32 minuutin aikana alle 5 %, kun taas 47 °C:ssa tl/2 oli noin 38 minuuttia. 50 °C:ssa kaksoismutantilla oli jäljellä 15% aktiivisuudesta 16 minuutin inkuboinnin jälkeen. Tämän inakti-vaatiotutkimuksen tulokset on esitetty graafisesti kuviossa 12.
20 Esimerkki 6: Lusiferaasien puhdistus
Yhdistelmä-villityyppistä tai mutatoitua lusiferaasia ilmentäviä E. coli JM 109 -soluja kasvatettiin 30 °C:ssa Luria-lihaliemessä (LB), joka sisälsi ampisilliinia 50 g/ml, ja solut indusoitiin aikaisessa logaritmivaiheessa IPTG:lla (1 mM). Solut *:**: koottiin talteen stationaarivaiheen keskipaikkeilla ja ne suspendoitiin uudelleen
··· 25 50 mM Tris-HCl:ään jonka pH oli pH 8,0 ja joka sisälsi 50 mM KC1, 1 mM
• · · ·
ditiotreitolia, 1,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja 1 mM
EDTA:a (puskuri A). Solut hajotettiin hajottamalla ne MSE-soniprep 150 [ .·. -ultraäänilaitteessa (amplitudi 14 pm) ja solulysaatti sentrifugoitiin 30 000 x g:n • · · voimalla 30 minuutin ajan. Raakauutteen supematantti fraktioitiin tämän jälkeen * * 30 ammoniumsulfaatilla ja 35-%:isen ja 55-%:isen kylläisyysasteen välillä saostuvan fraktion havaittiin sisältävän lusiferaasiaktiivisuutta ja tämä liuotettiin puskuriin • ♦ · A.
··« • · • · • · ·
Uutteesta poistettiin suolat käyttäen Pharmacian PD10-kolonnia, joka oli tasa- .·*·. 35 painotettu 50 mM Tris-HCl:llä, jonka pH oli 8,0 ja joka sisälsi 0,5 mM DTT:tä • ·
(puskuri B), ja uute, josta suolat oli poistettu, käsiteltiin Pharmacia Mono Q
: *·* -anioninvaihtokolonnissa ja eluoitiin 2 ml:n fraktioihin lineaarisella NaCl-gra- • · · dientilla, jossa NaCl-konsentraatio muuttui 0 - 500-mM:ksi puskurissa B, käyt- 15 täen virtausnopeutena 4 ml minuutissa. Lusiferaasin aktiivisuushuippu koottiin talteen ja se dialysoitiin pitkäaikaiseen varastointiin tarkoitettua 25 mM natriumfosfaattipuskuria vastaan, jonka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 0,5 mM DTT:tä ja 12 % (v/v) glyserolia.
5
Esimerkki 7: Puhdistettujen lusiferaasien lämpöinaktivointi Soluttomia lusiferaasiuutteita sisältäviä Eppendorf-koeputkia valmistettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Puhdistettuja lusiferaasipreparaatteja (50 pg/ml) inkuboitiin lämpöstabiilisuuspuskurissa, joka käsitti 50 mM kaliumfosfaatti-lo puskurin, jonka pH oli 7,8 ja joka sisälsi 10-% risesti kylläistä ammonium-sulfaattia, 1 mM ditiotreitolia ja 0,2 % naudan seerumialbumiinia (BSA). Putki poistettiin määrättyinä ajankohtina ja se jäähdytettiin jäävesihauteessa ennen määritystä, jossa jäljellä oleva aktiivisuus määritettiin ja tulokset ilmoitettiin prosentteina lähtöaktiivisuudesta.
15
Puhdistetuista yhdistelmä-villityyppisestä ja lämpöstabiilista lusiferaasista laadittiin Arrhenius-kuvaajat määrittämällä inaktivoitumisen puoliintumisaika lämpöstabiilisuuspuskurissa alueelta 42 - 50 °C olevissa lämpötiloissa. Laadittiin kuvaaja, joka esitti minuuteissa ilmoitetun t^in luonnollista logaritmia 20 1/K:n funktiona. Toisiaan vastaavien inaktivaatioasteiden kyseessä ollessa lisää E354K-mutaatio lämpöstabiilisuutta tällä alueella olevissa lämpötiloissa 2 °C:lla verrattuna 5 °C:n lisäykseen A251L-mutaation kyseessä ollessa ja 6 °C:n li-säykseen kaksoismutaation E354K+A215L:n kyseessä ollessa; viimeksi mainit-.· tu osoittaa kaksoismutaation additiivisen luonteen.
25 • · *. . Esimerkki 8: Mutatoitujen lusiferaasien ilmentymisen voimistuminen villi- : ; tyyppiseen vhdistelmälusiferaasiin verrattuna E. colissa.
'···' Lusiferaasin ilmentymistä E. coli JM 109 -soluissa seurattiin kasvatettaessa solu- • · · ja nestemäisessä viljelmässä 37 °C:ssa. Lämpöstabiileja mutatoituneita muotoja 30 ilmentäviin soluihin havaittiin kasvun aikana kerääntyvän enemmän aktiivista lusiferaasia kuin villityyppistä yhdistelmä-entsyymiä ilmentäviin soluihin. Tämä ilmiö on esitetty graafisesti kuviossa 13, jossa villityyppisten yhdistelmä- : f. solujen, E354K+A215L-kaksoismutaation sisältävien solujen ja E354K-mu- • · · .·;· taation sisältävien solujen lusiferaasiaktiivisuus on esitetty kuvaajassa 600 nm:n 35 kohdalta määritetyn absorbanssin kohoamisen funktiona. Voidaan havaita, että • · · lusiferaasia on mahdollista tuottaa aikaisempaa suurempia määriä yksinkertai-sesti ja kaksinkertaisesti mutatoidun muodon lisääntyneen lämpöstabiilisuuden • · : * ·1*. vuoksi 37 °C:n viljelylämpötilassa.
• ·· • · • · • · · • · 16
Esimerkki 9: Puskurin vaikutus mutatoitujen lusiferaasien stabiilisuuteen 37 0 C:ssa A215L-lusiferaasin, E354K-lusiferaasin, E354+A215L-lusiferaasin, villi-5 tyyppisen yhdistelmä-lusiferaasin ja Sigma-lusiferaasin liuoksia, joiden konsent-raatio oli 10 ng/ml, valmistettiin HEPES-puskuriin, jonka pH oli 7,75 ja joka sisälsi 1 % BSA:ta ja 0,02 % atsidia, ja lämpöstabiilisuutta 37 °C:ssa verrattiin sellaisten samanlaisten koostumusten lämpöstabiilisuuteen, joihin oli lisätty 2 mM EDTA:ta ja 2 mM DTT:tä. Tulokset on esitetty graafisesti kuvioissa 14 ίο ja 15 ja ne viittaavat siihen, että A215L:n ja E354K:n suhteellinen stabiilisuus vaihtelee puskurin mukaan 37 °C:ssa.
Esimerkki 10: Aminohapposubstituution vaikutus D-lusiferiinin hapettuessa säteilevän valon aallonpituuteen 15 Määritettiin D-lusiferiinin hapettuessa säteilevän valon aallonpituus käyttäen useita erilaisia esimerkissä 3 esitettyjä tämän keksinnön mukaisia lusiferaaseja ja tässä havaittiin esiintyvän aminohappomutaation mukaista vaihtelua. Solujen lähettämän valon aallonpituus poikkesi villityyppisen yhdistelmämuodon (E354) ja E354K:n välillä 5 nm ja E354K:n ja E354I:n välillä noin 15 nm.
20
Villityyppiset E. coli -organismit tuottavat kellanvihreää luminesenssia D-lusiferiinin läsnäollessa. D-lusiferiinia käyttäen olivat kunkin E. coli -mutantin sä- •: · ·: teilemän valon värit seuraavat: * • · :·. 25 E354G kellanvihreä • · ··.· E354N kellanvihreä E354A vihreä • · · E354V oranssinpunainen • · E354M oranssinpunainen 30 E354F kellanvihreä E354L keltainen E354Y kellanvihreä : E354S kellanvihreä «·· :T E354C kellanvihreä * ! 35 E354K keltainen • · · E354Q kellanvihreä E354W kellanvihreä • · E354T kellanvihreä ··· ♦ « · · • » • · 17 E354P oranssi E354R keltaoranssi E354H kellanvihreä E354N keltainen 5 E354I punainen ·*«« # » • · • · · t • · • * • · • · · • · • * • · • · • · · * · * • · • · * · - • · • · # · · »·* • · • · • · «#· • · · · • · • · · ··· 9 • · « • »« » ·
SEKVENSSILISTAUS
18 (1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA:
(A) NIMI: THE SECRETARY OF STATE FOR DEFENCE IN HER
BRITANNIC MAJESTY
(B) KATU: WHITEHALL
(C) KAUPUNKI: LONTOO
(E) MAA: YHDISTYNEET KUNINGASKUNNAT (GB)
(F) POSTINUMERO SW1A 2HB
(A) NIMI: CHRISTOPHER ROBIN LOWE
(B) KATU: UNIVERSITY OF CAMBRIDGE; TENNIS COURT ROAD
(C) KAUPUNKI: CAMBRIDGE
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: CAMBRIDGESHIRE
(E) MAA: YHDISTYNEET KUNINGASKUNNAT (GB)
(F) POSTINUMERO: CB2 1QT
(A) NIMI: PETER JOHN WHITE
(B) KATU: UNIVERSITY OF CAMBRIDGE; TENNIS COURT ROAD
(C) KAUPUNKI: CAMBRIDGE
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: CAMBRIDGESHIRE
(E) MAA: UNITED KINGDOM (GB)
(F) POSTINUMERO: CB2 1QT
(A) NIMI: JAMES AUGUSTUS HENRY MURRAY
(B) KATU: UNIVERSITY OF CAMBRIDGE; TENNIS COURT ROAD
(C) KAUPUNKI: CAMBRIDGE
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: CAMBRIDGESHIRE
(E) MAA: YHDISTYNEET KUNINGASKUNNAT (GB)
(F) POSTINUMERO: CB2 1QT
(A) NIMI: DAVID JAMES SQUIRRELL
(B) KATU: CBDE, PORTON DOWN
(C) KAUPUNKI: SALISBURY
(D) OSAVALTIO TAI LÄÄNI: WILTSHIRE
(E) MAA: YHDISTYNEET KUNINGASKUNNAT (GB)
(F) POSTINUMERO: SP4 OJQ
(ii) KEKSINNÖN NIMITYS: LUSIFERAASEJA
(iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 5 • « • · • * (iv) KONEKOODIMUOTO: :\\ (A) VÄLINETYYPPI: Levyke • ·' (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
. (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
*·Ϊ·' (D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.25 (EPO) • · • · (vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: GB 9405750.2 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 23-3-1994 (vi) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: GB 9501170.6 (B) JÄTTÖPÄIVÄMÄÄRÄ: 20-1-1995 « « · · * · ··♦ :*:* (2) SEKVENSSIN ID NO:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 1722 emäsparia ###,- (B) TYYPPI: nukleiinihappo * (C) JUOSTEISUUS: kaksisäikeinen #·#· (D) TOPOLOGIA: tuntematon *·*. (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) • · · • · 19
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
(iii) ANTI-SENSE: EI (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Photinus pyralis (ix) OMINAISPIIRTEET:
(A) NIMI/SELITYS : CDS
(B) ASEMA: 4..1653 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: CAAATGGAAG ACGCCAAAAA CATAAAGAAA GGCCCGGCGC CATTCTATCC TCTAGAGGAT 60 GGAACCGCTG GAGAGCAACT GCATAAGGCT ATGAAGAGAT ACGCCCTGGT TCCTGGAACA 120 ATTGCTTTTA CAGATGCACA TATCGAGGTG AACATCACGT ACGCGGAATA CTTCGAAATG 180 TCCGTTCGGT TGGCAGAAGC TATGAAACGA TATGGGCTGA ATACAAATCA CAGAATCGTC 240 GTATGCAGTG AAAACTCTCT TCAATTCTTT ATGCCGGTGT TGGGCGCGTT ATTTATCGGA 300 GTTGCAGTTG CGCCCGCGAA CGACATTTAT AATGAACGTG AATTGCTCAA CAGTATGAAC 360 ATTTCGCAGC CTACCGTAGT GTTTGTTTCC AAAAAGGGGT TGCAAAAAAT TTTGAACGTG 420 CAAAAAAAAT TACCAATAAT CCAGAAAATT ATTATCATGG ATTCTAAAAC GGATTACCAG 480 GGATTTCAGT CGATGTACAC GTTCGTCACA TCTCATCTAC CTCCCGGTTT TAATGAATAC 540 GATTTTGTAC CAGAGTCCTT TGATCGTGAC AAAACAATTG CACTGATAAT GAATTCCTCT 600 GGATCTACTG GGTTACCTAA GGGTGTGGCC CTTCCGCATA GAACTGCCTG CGTCAGATTC 660 TCGCATGCCA GAGATCCTAT TTTTGGCAAT CAAATCATTC CGGATACTGC GATTTTAAGT 720 GTTGTTCCAT TCCATCACGG TTTTGGAATG TTTACTACAC TCGGATATTT GATATGTGGA 780 • · « · , TTTCGAGTCG TCTTAATGTA TAGATTTGAA GAAGAGCTGT TTTTACGATC CCTTCAGGAT 840 I· TACAAAATTC AAAGTGCGTT GCTAGTACCA ACCCTATTTT CATTCTTCGC CAAAAGCACT 900 • · • · I. , CTGATTGACA AATACGATTT ATCTAATTTA CACGAAATTG CTTCTGGGGG CGCACCTCTT 96 0 • t .1 TCGAAAGAAG TCGGGGAAGC GGTTGCAAAA CGCTTCCATC TTCCAGGGAT ACGACAAGGA 1020 • · • · ΪΙ TATGGGCTCA CTGAGACTAC ATCAGCTATT CTGATTACAC CCNNNGGGGA TGATAAACCG 1080 • 1 * · GGCGCGGTCG GTAAAGTTGT TCCATTTTTT GAAGCGAAGG TTGTGGATCT GGATACCGGG 1140 AAAACGCTGG GCGTTAATCA GAGAGGCGAA TTATGTGTCA GAGGACCTAT GATTATGTCC 1200 GGTTATGTAA ACAATCCGGA AGCGACCAAC GCCTTGATTG ACAAGGATGG ATGGCTACAT 1260 . TCTGGAGACA TAGCTTACTG GGACGAAGAC GAACACTTCT TCATAGTTGA CCGCTTGAAG 1320 » i • · t’|1 TCTTTAATTA AATACAAAGG ATATCAGGTG GCCCCCGCTG AATTGGAATC GATATTGTTA 1380 • » · CAACACCCCA ACATCTTCGA CGCGGGCGTG GCAGGTCTTC CCGACGATGA CGCCGGTGAA 1440 • · · CTTCCCGCCG CCGTTGTTGT TTTGGAGCAC GGAAAGACGA TGACGGAAAA AGAGATCGTG 1500 0 · · ; , GATTACGTCG CCAGTCAAGT AACAACCGCG AAAAAGTTGC GCGGAGGAGT TGTGTTTGTG 1560 • · · GACGAAGTAC CGAAAGGTCT TACCGGAAAA CTCGACGCAA GAAAAATCAG AGAGATCCTC 1620 « • » • m · • · 20 ATAAAGGCCA AGAAGGGCGG AAAGTCCAAA TTGTAAAATG TAACTGTATT CAGCGATGAC 1680 GAAATTCTTA GCTATTGTAA TCCTCCGAGG CCTCGAGGTC GA 1722 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 550 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Photinus pyralis (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Modifioidun kohdan sisältävä (B) ASEMA: 354 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 15 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gin Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30
Tyr Ala Leu Vai Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu 35 40 45
Vai Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Vai Arg Leu Ala 50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Vai Vai 65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe Met Pro Vai Leu Gly Ala Leu ·:»·· 85 90 95 ··· Phe Ile Gly Vai Ala Vai Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg ;;·· loo 105 no *. . Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gin Pro Thr Vai Vai Phe Vai ns 120 125 : : : Ser Lys Lys Gly Leu Gin Lys Ile Leu Asn Vai Gin Lys Lys Leu Pro ;;; 130 135 140
Ile Ile Gin Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gin Gly 145 150 155 160
Phe Gin Ser Met Tyr Thr Phe Vai Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Vai Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile iso ies 190 · Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Vai ’· . 195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Vai Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 1 • · · • · · · • · • · 21
Pro Ile Phe Gly Asn Gin Ile He Pro Asp Thr Ala He Leu Ser Val 225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255
He Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gin Asp Tyr Lys He Gin Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu He Asp Lys Tyr 290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu He Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly He 325 330 335
Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala He Leu He Thr 340 345 350
Pro Xaa Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380
Asn Gin Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met He Met Ser Gly 385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu He Asp Lys Asp Gly 405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp He Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430
Phe He Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu He Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin 435 440 445 • « . Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser He Leu Leu Gin His Pro Asn He 450 455 460 • ♦ * *·· Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480 . Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys M.· 485 490 495 * Glu He Val Asp Tyr Val Ala Ser Gin Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu He Leu He Lys Ala Lys Lys . 530 535 540 • · » • · ·
Gly Gly Lys Ser Lys Leu 545 550 • » a · · • · • » · • · · • · (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: 22 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 22 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Photinus pyralis (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: sekal. eroavuus (B) ASEMA: korvataan (10, "") (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: CATCCCCCTT GGGTGTAATC AG 22 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI (vi) ALKUPERÄ: (A) ORGANISMI: Photinus pyralis (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: sekal. eroavuus (B) ASEMA: korvataan (16..17, "") • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4: ··«» GAATCTGACG CAGAGAGTTC TATGCGG 27 (2) SEKVENSSIN ID NO: 5 TIEDOT: * · ; (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ···1 (A) PITUUS: 550 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo * (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: tuntematon (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini
(iii) HYPOTEETTINEN (kyllä/ei): EI
: :1: (vi) alkuperä: ’1’ (A) ORGANISMI: Photinus pyralis . (ix) OMINAISPIIRTEET: ... : (A) NIMI/SELITYS: Modifioidun kohdan sisältävä (B) ASEMA: 354 * - (ix) OMINAISPIIRTEET: (A) NIMI/SELITYS: Modifioidun kohdan sisältävä » (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: 23 (B) ASEMA: 215
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 15 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gin Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30
Tyr Ala Leu Vai Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu 35 40 45
Vai Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Vai Arg Leu Ala 50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Vai Vai 65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe Met Pro Vai Leu Gly Ala Leu 85 90 95
Phe Ile Gly Vai Ala Vai Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg 100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gin Pro Thr Vai Vai Phe Vai 115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gin Lys Ile Leu Asn Vai Gin Lys Lys Leu Pro 130 135 140
Ile Ile Gin Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gin Gly 145 150 155 160
Phe Gin Ser Met Tyr Thr Phe Vai Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Vai Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile 180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Vai 195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Leu Cys Vai Arg Phe Ser His Ala Arg Asp ··· 210 215 220 • ♦ ·· •*\ Pro Ile Phe Gly Asn Gin Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Vai * * 225 230 235 240 ·· ♦ • · · * ·* Vai Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu : 245 250 255 • · · : : ; He Cys Gly Phe Arg Vai Vai Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu * 260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gin Asp Tyr Lys Ile Gin Ser Ala Leu Leu Vai 275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr . 290 295 300 • · · 11^ Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser ϊ.ϊ 305 310 315 320 ... ‘ Lys Glu Vai Gly Glu Ala Vai Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile 325 330 335 « • · · ·
Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr 340 345 350 • · · • · • · « • · » • · 24
Pro Xaa Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Vai Gly Lys Vai Val Pro Phe 355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380
Asn Gin Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met He Met Ser Gly 385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu He Asp Lys Asp Gly 405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp He Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430
Phe He Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu He Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin 435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser He Leu Leu Gin His Pro Asn He 450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495
Glu He Val Asp Tyr Val Ala Ser Gin Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys He Arg Glu He Leu He Lys Ala Lys Lys 530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu 545 550 • < ·1·« • · • · · • · • · • · • · « • · · • · · • · • · • · · • · • · ··« ··· * · « « • · ··· · • · ··· • · • · • · ·
· I
• It • ·
Claims (26)
- 25
- 1. Proteiini, joka sisältää lusiferaasiaktiivisuutta ja jonka aminohapposekvenssi on yli 60-%:sti homologinen Photinus pyraliksesta, Luciola mingrelicasta, Luciola cruciatasta tai Luciola lateraliksesta peräisin olevien lusiferaasien 5 suhteen, tunnettu siitä, että aminohapporyhmä, joka vastaa Photinus pyraliksen lusiferaasin ryhmää 354, joka on kuvattu sekvenssissä ID NO: 2, on jokin muu aminohappo kuin glutamaatti, glysiini, proliini tai asparagiinihappo.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että se sisältää aminohapposekvenssin XGDDKPGA, jossa X on jokin muu aminohapporyhmä 10 kuin glutamaatti, glysiini, proliini tai asparagiinihappo.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että se sisältää aminohapposekvenssin TPXGDDKPGA, jossa X on jokin muu aminohappo-ryhmä kuin glutamaatti, glysiini, proliini tai asparagiinihappo.
- 4. Patenttivaatimusten 1, 2 tai 3 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että 15 aminohappo tai aminohappo X on jokin aminohapoista tryptofaani, väliini, leusiini, isoleusiini tai asparagiini.
- 5. Patenttivaatimusten 1, 2 tai 3 mukainen proteiini, tunnettu siitä, että aminohappo tai aminohappo X on jokin aminohapoista lysiini tai arginiini. • · . 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteiini, joka sisältää aminohappo- • · · *;·· 20 sekvenssin, joka on kuvattu sekvenssissä NO: 2, tunnettu siitä, että Xaa on • · : '* jommassakummassa patenttivaatimuksista 4 tai 5 lueteltu aminohappo. • · · • · φ «
- 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen proteiini, edelleen • · · tunnettu siitä, että aminohapporyhmä, joka vastaa Photinus pyraliksen • · · lusiferaasin ryhmää 215 tai Luciola mingrelican, Luciola cruciatan tai Luciola .. 25 lateraliksen lusiferaasin ryhmää 217, on hydrofobinen aminohappo. • * · · • · ·
- 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen proteiini, jossa hydrofobinen aminohappo on yksi seuraavista: isoleusiini, leusiini tai väliini. • · · • · · • · ·
- 9. Proteiini, joka sisältää sekvenssin ID NO: 5 mukaisen aminohappo-sekvenssin, jossa Xaa on jommankumman patenttivaatimuksista 4 tai 5 • · · · .···. 30 mukainen aminohappo. • · • · · 26
- 10. DNA, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukaista proteiinia.
- 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen DNA, joka sisältää sekvenssissä ID NO:l kuvatussa muodossa olevan nukleotidisekvenssin, tunnettu siitä, että kohdissa 5 1063-1065 esiintyvät kolme emästä N muodostavat jotakin muuta aminohappoa kuin glutamaattia, glysiiniä, proliinia tai asparagiinihappoa koodaavan kodonin. ^.Patenttivaatimuksen 10 mukainen DNA, tunnettu siitä, että kodoni koodaa jommankumman patenttivaatimuksista 4 tai 5 lueteltua aminohappoa.
- 13. Patenttivaatimuksen 10 mukainen DNA, joka sisältää sekvenssissä ID NO:l 10 esitetyn nukleotidisekvenssin, jossa kohdissa 1063-1065 esiintyvät kolme emästä N muodostavat jotakin muuta aminohappoa kuin glutamaattia koodaavan kodonin, ja jolloin kohdissa 646-648 esiintyvät kolme emästä muodostavat kodonin joka koodaa hydrofobista aminohappoa.
- 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA, tunnettu siitä, että kohdissa 646 ja 15 647 esiintyvät emäkset ovat C ja vastaavasti T.
- 15. Vektori, joka sisältää luc-geenin, tunnettu siitä, että geeni koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukaista proteiinia.
- 16. Patenttivaatimuken 15 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on saatavissa .* aikaan käsittelemällä villityyppistä tai yhdistelmä-luc-geeniä sisältävää vektoria ··· 20 kohdemutageneesillä sellaisen kodonin, joka koodaa Photinus pyraliksen lusi- • · • ** feraasin asemassa 354 olevaa glutamaattia tai Luciola mingrelican, Luciola ·· · : cruciatan tai Luciola lateraliksen lusiferaasin asemassa 356 olevaa glutamaattia, muuttamiseksi vaihtoehtoiseksi aminohapoksi. »«· • · · • · ·
- 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vaihtoehtoinen .. 25 aminohappo on jommassakummassa patenttivaatimuksista 4 tai 5 lueteltu *..** aminohappo. • · • · • ♦ · , ’·, 18. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 15-17 mukainen vektori, tunnettu siitä, Ϊ.Ι' että se on pKK223-3, pDR540 tai pT7-7, joihin luc-geeni on ligatoitu. • · ·«·
- 19. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksista .···. 30 10-14 mukaisen DNA:n ♦ · ··· 27
- 20. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukaista proteiinia ilmentämään kykenevä solu, tunnettu siitä, että se sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksista 10-18 mukaisen DNA:n tai vektorin.
- 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on E.coli, 5 S.cerevisiae tai hyönteissolu.
- 22. Testipakkaus määrityksen suorittamiseksi APT-määrityksen avulla, tunnettu siitä, että testipakkaus sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukaista proteiinia, joka sisältyy luminesenssireagenssiin.
- 23. Määritysmenetelmä, jossa ATP määritetään käyttäen lusiferiiniä ja 10 lusiferaasia valon muodostamiseksi, jonka määrä on verrannollinen ATP:n määrään, tunnettu siitä, että lusiferaasi on minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen proteiini.
- 24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että määritys suoritetaan 30 - 70 °C:n lämpötiloissa.
- 25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että määritys suoritetaan 37 - 60 °C:n lämpötiloissa.
- 26. Patenttivaatimuksen 23 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että _ . määritys suoritetaan 40 - 50 °C:n lämpötiloissa. • · • · · • ·· · ·· • · • · ♦ • · · • · · • · • · • · · • · · • · · • · · • « · • · · • · • · • ♦ · • · · • · • · • · · • · · • 1 · • · · • · · • · • · • · · · · • M» • · · • · « · • « · 28
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9405750 | 1994-03-23 | ||
| GB9405750A GB9405750D0 (en) | 1994-03-23 | 1994-03-23 | Luciferases |
| GBGB9501170.6A GB9501170D0 (en) | 1994-03-23 | 1995-01-20 | Luciferases |
| GB9501170 | 1995-01-20 | ||
| PCT/GB1995/000629 WO1995025798A1 (en) | 1994-03-23 | 1995-03-22 | Luciferases |
| GB9500629 | 1995-03-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI963741A0 FI963741A0 (fi) | 1996-09-20 |
| FI963741A FI963741A (fi) | 1996-11-20 |
| FI120096B true FI120096B (fi) | 2009-06-30 |
Family
ID=26304561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI963741A FI120096B (fi) | 1994-03-23 | 1996-09-20 | Lusiferaaseja |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6132983A (fi) |
| EP (2) | EP0751996B1 (fi) |
| JP (3) | JP4490508B2 (fi) |
| KR (1) | KR100392020B1 (fi) |
| CN (1) | CN100387720C (fi) |
| AT (1) | ATE230800T1 (fi) |
| AU (1) | AU697883B2 (fi) |
| BR (1) | BR9507140A (fi) |
| CA (1) | CA2186144C (fi) |
| DE (1) | DE69529337T2 (fi) |
| DK (1) | DK0751996T3 (fi) |
| ES (1) | ES2185697T3 (fi) |
| FI (1) | FI120096B (fi) |
| GB (1) | GB9501170D0 (fi) |
| NO (1) | NO319706B1 (fi) |
| RU (1) | RU2192467C2 (fi) |
| WO (1) | WO1995025798A1 (fi) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9501170D0 (en) * | 1994-03-23 | 1995-03-08 | Secr Defence | Luciferases |
| GB2311525B (en) * | 1995-01-20 | 1998-11-11 | Secr Defence | Mutant Luciferases |
| WO1996022376A1 (en) * | 1995-01-20 | 1996-07-25 | The Secretary Of State For Defence | Mutant luciferases |
| GB9707486D0 (en) | 1997-04-11 | 1997-05-28 | Secr Defence | Enzyme assays |
| EP1015601B1 (en) * | 1997-09-19 | 2015-01-07 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| US6602677B1 (en) * | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
| GB9722481D0 (en) * | 1997-10-25 | 1997-12-24 | Secr Defence | Expression system |
| US6117643A (en) * | 1997-11-25 | 2000-09-12 | Ut Battelle, Llc | Bioluminescent bioreporter integrated circuit |
| EP1925320A3 (en) | 1998-03-27 | 2008-09-03 | Prolume, Ltd. | Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics |
| EP1064360B1 (en) * | 1998-03-27 | 2008-03-05 | Prolume, Ltd. | Luciferases, gfp fluorescent proteins, their nucleic acids and the use thereof in diagnostics |
| GB9823468D0 (en) * | 1998-10-28 | 1998-12-23 | Secr Defence | Novel enzyme |
| GB9925161D0 (en) | 1999-10-26 | 1999-12-22 | Secr Defence | Novel enzyme |
| ATE374820T1 (de) * | 1999-10-26 | 2007-10-15 | Secr Defence | Mutantenluciferase |
| US7879540B1 (en) | 2000-08-24 | 2011-02-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| US20020073441A1 (en) | 2000-12-13 | 2002-06-13 | Ross Brian D. | Compositions and methods for detecting proteolytic activity |
| GB0111275D0 (en) | 2001-05-09 | 2001-06-27 | Secr Defence | Analytical method and kit |
| JP4553588B2 (ja) | 2002-02-21 | 2010-09-29 | メディミューン，エルエルシー | メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）株と、ワクチン製剤でのおよび抗原配列発現用ベクターとしてのその使用 |
| WO2004042010A2 (en) * | 2002-10-30 | 2004-05-21 | University Of Tennessee Research Foundation | Modified luciferase nucleic acids and methods of use |
| US7413874B2 (en) | 2002-12-09 | 2008-08-19 | University Of Miami | Nucleic acid encoding fluorescent proteins from aquatic species |
| JP2006521116A (ja) | 2003-03-27 | 2006-09-21 | ピーティーシー セラピューティクス，インコーポレーテッド | 抗真菌性および／または抗増殖性分子を同定するためのｔＲＮＡスプライシング経路の酵素の標的化 |
| EP1613158A4 (en) | 2003-03-27 | 2007-08-22 | Ptc Therapeutics Inc | METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS WITH A TRNA-SPLICEN ENDONUCLEASE AT THE PLACE OF ATTACK, AND USES THEREOF FOR PROVIDING THESE COMPOUNDS AS PROLIFERATION-INHIBITABLE AGENTS |
| JP4385135B2 (ja) * | 2003-05-06 | 2009-12-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | マルチ遺伝子転写活性測定システム |
| US7728118B2 (en) | 2004-09-17 | 2010-06-01 | Promega Corporation | Synthetic nucleic acid molecule compositions and methods of preparation |
| GB0517005D0 (en) | 2005-08-19 | 2005-09-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Analytical method and kit |
| US7807429B2 (en) * | 2006-02-13 | 2010-10-05 | Connecticut College | Isolated luciferase gene of L. italica |
| JP5188771B2 (ja) * | 2007-09-26 | 2013-04-24 | 株式会社日立製作所 | 変異型ホタルルシフェラーゼ |
| WO2010011607A1 (en) | 2008-07-22 | 2010-01-28 | Promega Corporation | Adp detection based luminescent phosphotransferase or atp hydrolase assay |
| JP2010081908A (ja) * | 2008-10-02 | 2010-04-15 | Hitachi Ltd | 変異型のホタルルシフェラーゼ |
| JP2011120559A (ja) | 2008-12-26 | 2011-06-23 | Kikkoman Corp | ホタルルシフェラーゼ、その遺伝子、およびホタルルシフェラーゼの製造法 |
| US20110076706A1 (en) * | 2009-06-26 | 2011-03-31 | Genprime, Inc. | Methods and kits for the rapid detection of microorganisms |
| AU2011323418B2 (en) | 2010-11-02 | 2017-07-27 | Promega Corporation | Novel coelenterazine substrates and methods of use |
| KR101968475B1 (ko) | 2010-11-02 | 2019-04-15 | 프로메가 코포레이션 | 코엘렌테라진 유도체 및 이를 이용하는 방법 |
| CN105121653B (zh) | 2013-02-22 | 2020-01-24 | 普洛麦格公司 | 用于荧光素酶和核苷磷酸的发光检测的稳定制剂 |
| EP3099691B1 (en) | 2014-01-29 | 2019-11-20 | Promega Corporation | Pro-substrates for live cell applications |
| EP3099683B1 (en) | 2014-01-29 | 2020-08-05 | Promega Corporation | Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements |
| WO2016040788A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Promega Corporation | Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence |
| EP3204509B1 (en) | 2014-10-08 | 2019-07-10 | Promega Corporation | Bioluminescent succinate detection assay |
| CN105200022B (zh) * | 2015-11-03 | 2018-11-16 | 南京工业大学 | 萤火虫荧光素酶热稳定性改造的方法 |
| JP6349003B1 (ja) * | 2017-03-17 | 2018-06-27 | 東洋ビーネット株式会社 | 耐熱性ルシフェラーゼ |
| JPWO2021162123A1 (fi) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | ||
| CN114015664B (zh) * | 2021-12-06 | 2023-07-21 | 郑州伊美诺生物技术有限公司 | 荧光素酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3048466B2 (ja) * | 1991-06-27 | 2000-06-05 | キッコーマン株式会社 | 耐熱性ホタルルシフェラーゼ、耐熱性ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ、及び耐熱性ホタルルシフェラーゼの製造法 |
| US5229285A (en) * | 1991-06-27 | 1993-07-20 | Kikkoman Corporation | Thermostable luciferase of firefly, thermostable luciferase gene of firefly, novel recombinant dna, and process for the preparation of thermostable luciferase of firefly |
| DE4124495A1 (de) * | 1991-07-24 | 1993-01-28 | Happich Gmbh Gebr | Fenstereinfassrahmen, insbesondere fuer fahrzeuge |
| GB9501170D0 (en) * | 1994-03-23 | 1995-03-08 | Secr Defence | Luciferases |
-
1995
- 1995-01-20 GB GBGB9501170.6A patent/GB9501170D0/en active Pending
- 1995-03-22 BR BR9507140A patent/BR9507140A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-03-22 CN CNB951932594A patent/CN100387720C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-22 EP EP95912320A patent/EP0751996B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 RU RU96119246/13A patent/RU2192467C2/ru active
- 1995-03-22 JP JP52448695A patent/JP4490508B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 CA CA002186144A patent/CA2186144C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-22 US US08/718,425 patent/US6132983A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 DK DK95912320T patent/DK0751996T3/da active
- 1995-03-22 DE DE69529337T patent/DE69529337T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 ES ES95912320T patent/ES2185697T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 AU AU19545/95A patent/AU697883B2/en not_active Ceased
- 1995-03-22 WO PCT/GB1995/000629 patent/WO1995025798A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-22 KR KR1019960705464A patent/KR100392020B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-22 EP EP02010994.8A patent/EP1281762B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-22 AT AT95912320T patent/ATE230800T1/de not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-20 FI FI963741A patent/FI120096B/fi active IP Right Grant
- 1996-09-23 NO NO19963983A patent/NO319706B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-06-13 JP JP2006163388A patent/JP2006271393A/ja active Pending
-
2009
- 2009-12-03 JP JP2009275807A patent/JP2010088440A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO963983D0 (no) | 1996-09-23 |
| CA2186144A1 (en) | 1995-09-28 |
| RU2192467C2 (ru) | 2002-11-10 |
| JP2006271393A (ja) | 2006-10-12 |
| DE69529337D1 (de) | 2003-02-13 |
| FI963741A (fi) | 1996-11-20 |
| ATE230800T1 (de) | 2003-01-15 |
| KR970702369A (ko) | 1997-05-13 |
| CN1149318A (zh) | 1997-05-07 |
| JP4490508B2 (ja) | 2010-06-30 |
| EP0751996B1 (en) | 2003-01-08 |
| NO963983L (no) | 1996-09-23 |
| BR9507140A (pt) | 1997-09-30 |
| ES2185697T3 (es) | 2003-05-01 |
| WO1995025798A1 (en) | 1995-09-28 |
| NO319706B1 (no) | 2005-09-05 |
| KR100392020B1 (ko) | 2003-10-22 |
| EP0751996A1 (en) | 1997-01-08 |
| DK0751996T3 (da) | 2003-02-24 |
| US6132983A (en) | 2000-10-17 |
| AU697883B2 (en) | 1998-10-22 |
| DE69529337T2 (de) | 2003-10-16 |
| CA2186144C (en) | 2009-12-22 |
| CN100387720C (zh) | 2008-05-14 |
| JP2010088440A (ja) | 2010-04-22 |
| EP1281762A3 (en) | 2003-11-05 |
| GB9501170D0 (en) | 1995-03-08 |
| JPH09510610A (ja) | 1997-10-28 |
| EP1281762B1 (en) | 2014-12-31 |
| EP1281762A2 (en) | 2003-02-05 |
| FI963741A0 (fi) | 1996-09-20 |
| AU1954595A (en) | 1995-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120096B (fi) | Lusiferaaseja | |
| AU707243B2 (en) | Mutant luciferases | |
| EP0689587B1 (en) | Mutant luciferases | |
| AU731408B2 (en) | Enzyme assays | |
| AU2004200277B2 (en) | Novel enzyme | |
| US6387675B1 (en) | Mutant luciferases | |
| MXPA96004194A (en) | Lucifera | |
| CN101173254A (zh) | 虫荧光素酶 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: 3M INNOVATIVE PROPERTIES COMPANY Free format text: 3M INNOVATIVE PROPERTIES COMPANY |
|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120096 Country of ref document: FI |