NO319706B1

NO319706B1 - Protein med luciferaseaktivitet, DNA, vektor, celle, provekit samt analysemetode.

Info

Publication number: NO319706B1
Application number: NO19963983A
Authority: NO
Inventors: David James Squirrell; Christopher Robin Lowe; Peter John White; James Augustus Henry Murray
Original assignee: Secr Defence Brit
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1996-09-23
Publication date: 2005-09-05
Also published as: NO963983D0; CA2186144A1; RU2192467C2; JP2006271393A; DE69529337D1; FI963741A; ATE230800T1; KR970702369A; CN1149318A; JP4490508B2; FI120096B; EP0751996B1; NO963983L; BR9507140A; ES2185697T3; WO1995025798A1; KR100392020B1; EP0751996A1; DK0751996T3; US6132983A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et protein med luciferaseaktivitet og med over 60 % identitet i aminosyresekvens med luciferase fra Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis.

Oppfinnelsen vedrører også DNA samt en vektor som koder for dets ekspresjon. Videre vedrører oppfinnelsen en celle som er i stand til å uttrykke proteinet samt et prøvekit for å utføre analyse gjennom måling av ATP.

Endelig vedrører oppfinnelsen en analysemetode hvor ATP måles ved anvendelse av luciferin og luciferase for å danne lys hvis kvantitet er relatert til mengden av ATP.

Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen luciferaser med varmebestandighet ved temperaturer over 3 0°C.

Ildflue-luciferase katalyserer oksydasjonen av luciferin i

nærvær av ATP, Mg<2+> og molekylært oksygen med den resulterende av dannelse av lys. Denne reaksjon har et kvantumsutbytte på omtrent 0,8 8 (se DeLuca & McElroy (1978) og Seliger & McElroy

(1960)) og denne lysemitterende egenskap har ført til anvend-elsen derav i luminometriske analyser hvor ATP nivåer måles.

Luciferase kan oppnås direkte fra insektkropper som ildfluer eller sankthansormer eller ved ekspresjon fra mikroorganismer inkluderende rekombinante DNA konstrukter som koder for enzymet. Fire signifikante arter av ildflue hvorfra enzymet kan oppnås, eller DNA som koder for det kan avledes, er de japanske Genji og Heike ildfluer Luciola cruciata og Luciola lateralis, den østeuropeiske ildflue Luciola mingrelica og den nordamerikanske ildflue Photinus pyralis. Sankthansormen. Lampyris noctiluca er en ytterligere kilde hvor aminosyresekvensen til dens luciferase har 84 % homologi med sekvensen til Photinus pyralis.

Varmebestandigheten til villtype-luciferaser og rekombinant-type luciferaser er slik at de taper aktivitet ganske hurtig når de utsettes for temperaturer i overkant av omtrent 3 0°C, særlig over 35°C. Slik ustabilitet fører til mangel på enzym når det anvendes eller lagres ved høye omgivelsestemperaturer eller dersom varmeindusert økning i reaksjonshastighet kreves. Det er kjent at japansk ildflue-luciferase kan sta-biliseres overfor varmeinaktivering ved mutering i posisjon 217 for å erstatte en treoninrest med en isoleucinrest (Kajiyama & Nakano, 1993, Biochemistry 32 side 13795 til 13 7 99) . På denne måte ble den termiske stabilitet og pH-stabiliteten og den spesifikke aktivitet til enzymet økt. Varmestabiliseringen av Photinus pyralis og Luciola mingrelica luciferaser er ennå ikke blitt rapportert.

EP 052444 8 Al beskriver en termostabil luciferase hvor en aminosyre ved posisjon 217 i villtype aminosyresekvensen er konvertert til en hydrofobisk aminosyre og som dermed har bedre varmestabilitet.

EMBL Database, Accession N.: X65316 Identification: CVPGEMLUC, Promega cloning vector pGEM-luc See bp 693-695 omhandler kloningsvektoren pGEM-luc fra luciferase cDNA.

Man har nå i forbindelse med oppfinnelsen tilveiebragt nye

luciferaser med økt varmebestandighet i forhold til villtype-luciferaser ved å erstatte en glutaminsyrerest til stede i en sekvens konservert i hver av Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola lateralis og Luciola cruciata med alternative aminosyrer, særlig lysin eller arginin. Denne glutaminsyre finner man i posisjon 354 i Photinus pyralis luciferase, ved den tredje aminosyren av den konserverte aminosyresekvensen TPEGDDKPGA funnet i luciferasene til denne og andre arter.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et protein med luciferaseaktivitet, et DNA som koder for proteinet, en vektor som omfatter et lue gen som koder for proteinet, en celle i stand til å uttrykke proteinet, et prøvekit samt en analysemetode slik de er definert med de i kravene anførte trekk.

I et første aspekt tilveiebringer således oppfinnelsen et protein med luciferaseaktivitet og med over 60 % identitet 'i aminosyresekvens med luciferase fra Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis, og som er kjennetegnet ved at aminosyreresten svarende til rest 3 54

i sekvensen til Photinus pyralis luciferase som vist ved SEQ ID No 2 er en aminosyre annet enn glutaminsyre, glysin, prolin eller asparaginsyre.

Aminosyren kan være en naturlig forekommende aminosyre eller kan være en såkalt sjelden aminosyre slik som en modifisert naturlig forekommende aminosyre eller en analog derav. Analoger av aminosyrer vil forstås til å være de forbindelser som har en effekt på proteinet som er ekvivalent med den til aminosyren de er analoger av. Typiske sjeldne aminosyrer er dem som er angitt i the US and European Patentin Manuals and the Rules of Practice in Patent Cases: "application disclosures containing nucleotide and/or amino acid sequences: modified and unsual amino acids".

Proteinet er foretrukket kjennetegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens XGDDKPGA hvor X er aminosyren annet enn glu-. taminsyre, glysin, prolin eller asparaginsyre. Mere foretrukket omfatter proteinet aminosyresekvensen TPXGDDKPGA og foretrukket, for varmebestandighet, er X hvilken som helst aminosyre annet enn glutaminsyre, asparaginsyre, prolin eller glysin, <p>g enda mere foretrukket er den tryptofan, valin, leucin, isoleucin eller asparagin, men er mest foretrukket lysin eller arginin, eller en analog av hvilken som helst av disse.

Det vil forstås at noen arter kan ha luciferaser med en eller to ulike aminosyrer i denne konserverte TPXGDDKPA region, men alle aktive proteiner svarende til slike luciferaser som er endret i den utstrekning at aminosyren i stilling tre i sekvensen ikke er glutaminsyre er omfattet av den foreliggende oppfinnelse.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen har proteinet endret aminosyren i posisjonen svarende til aminosyre 217 for Luciola ildflueluciferaser eller 215 for Photinus pyralis til en hydrofob aminosyre, foretrukket til isoleucin, leucin eller valin, som beskrevet i EP 0524448 A. En slik endring er blitt funnet til å resultere i en økning i varmebestandighet utover 3 54 endringen alene, og de to endringer har således effekter som er hovedsakelig uavhengige av hverandre og som kan anvendes sammen.

I et annet aspekt av oppfinnelsen er det tilveiebragt DNA som koder for proteinet ifølge oppfinnelsen og i et tredje aspekt er det tilveiebragt en vektor, særlig et plasmid, omfattende et lue gen (genet som koder for luciferase) i en slik form at det er i stand til å uttrykke proteinet ifølge oppfinnelsen. Slike former er dem hvor vektoren inkluderer DNA sekvenser som er i stand til å styre ekspresjonen av proteinet i henhold til oppfinnelsen slik at ved innlemmelse i en mikroorga-nisme-vertscelle kan proteinet lett uttrykkes på passende måte, om nødvendig ved tilsetning av egnede indusere.

Lue genene for Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata og Luciola lateralis er alle kjente og kan isoleres ved standard molekylærbiologiteknikker. Photinus pyralis lue genet er kommersielt tilgjengelig fra Promega som plasmidet pGEM. Passende metoder og kilder for oppnåelse av utgangsmaterial for fremstilling av DNA i henhold til oppfinnelsen er således (i) anvendelse av et naturlig forekommende ildflue genomisk DNA og amplifikasjon av lue genet fra dette ved anvendelse av f.eks. PCR, (ii) pGEM og (iii) pGLf37 plasmid fra Kajiyama & Nakano. Videre vil gener som koder for proteiner med luciferaseaktivitet, dvs. aktiviteten omfattende oksydasjon av luciferin med emisjon av lys, også være passende kilder for utgangsmaterial for oppnåelse av et DNA, og til sist gjennom genekspresjon, et protein i henhold til oppfinnelsen.

Vektorer som er egnet for anvendelse i manipulering av villtype eller annet lue gen DNA for å danne DNA'et i henhold til oppfinnelsen vil være en hvilken som helst vektor som DNA'et kan være inneholdt i mens forandring av den naturlig forekommende glutaminsyre til en alternativ aminosyre gjennom-føres. For kjemisk indusert mutagenese, f.eks. ved anvendelse av midler som hydroksylamin, er dette ikke spesielt kritisk og en rekke passende vektorer vil finnes for de fagkyndige på området som vil tillate enkel manipulering av genet før og etter den mutageniske prosess.

Det kan være foretrukket å spesifikt mutere lue genet i glutaminsyren og således vil en seterettet mutagenese være nødvendig. Slike operasjoner kan på enklest måte gjennom-føres i vektorer og disse vil være vel kjente for fagkyndige på området.

For ekspresjon av lue gener av villtype og kjent type, og dem i henhold til oppfinnelsen, inkludere passende vektorer pKK223-3, pDR540 (tilgjengelig fra Boehringer Mannheim) og pT7-7, idet de to første har tac promoteren under kontroll av laktoserepressoren som tillater indusering av ekspresjon ved tilstedeværelse av isopropyltiogalaktosid (IPTG). pT7-7 tillater kontroll ved T7-RNA polymerasepromoteren og tilveiebringer således grunnlaget for et svært høyt nivå av genekspresjon i E. coli celler inneholdende T7 RNA polymerase.

I forbindelse med disse faktorer har man funnet at ekspresjonen er høyest når lue genene innskytes i pT7-7 vektoren.

Ekspresjon av luciferase fra et lue gen innskutt i pKK223-3 og pDR54 0 resulterer i ekspresjonen av villtype N-terminal sekvens luciferase mens ekspresjon av et lue gen innskutt i pT7-7 resulterer i syntese av et fusjonsprotein med ekstra N-terminale aminosyrer M-A-R-I-Q. Ribosom-bindingssetet og startkodonet av lue genet i hver av vektorene med lue genet til stede (betegnet konstrukter pPW204, pPW116 og pPW304) er vist i tabell 1 i eksemplene.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt celler i stand til å uttrykke proteinene i henhold til oppfinnelsen samt prøvekit og reagenser omfattende proteinene i henhold til oppfinnelsen. Det er også tilveiebragt analysemetoder hvori ATP måles ved anvendelse av luciferin/luciferasereagenser, som er vel kjent innen tek-nikken, og som er kjennetegnet ved at luciferasen er et protein i henhold til oppfinnelsen. Luciferasepreparater i henhold til oppfinnelsen er relativt, varmebestandige ved 30-70°C, særlig 37-60°C og spesielt 40-50°C sammenlignet med villtype og rekombinant villtype luciferaser.

En hvilken som helst celle i stand til å uttrykke heterologt protein ved anvendelse av DNA sekvenser i dens DNA, eller i vektorer slik som plasmider inneholdt i cellen, kan anvendes til å uttrykke proteinene i henhold til oppfinnelsen. Typiske for slike celler vil være gjær og bakterieceller som Saccharomyces cerevisiae og Escherichia coli celler, men mange andre vertsorganismer som er egnet for formålet med proteinekspresjon vil være kjent for de fagkyndige på området. Insektceller kan være foretrukne når proteinet er et insektprotein. Proteinet kan uttrykkes som et protein med en struktur som er tilsvarende den til native eller kjente rekombinante luciferaser, eller kan være uttrykt som en fusjon eller konjugat av slike proteiner med andre aminosyrer, pep-tider, proteiner eller andre kjemiske entiteter, f.eks. den ovennevnte M-A-R-I-Q sekvensen.

De fagkyndige på området vil forstå at bestemte verter kan ha spesielle kodonpreferanser, og bakterier anvender f.eks. i enkelte tilfeller andre kodoner enn gjær, og det DNA som er innlemmet i en slik vert kan således fordelaktig endres til å gi et degenerert kodon for en gitt aminosyre som vil gi en mere gunstig ekspresjon i denne vert. Slike degenererte DNA1 er er selvfølgelig innenfor rammen av DNA'et i henhold til oppfinnelsen.

E. coli BL2l(DE3) er en egnet vert og har T7 RNA polymerasen integrert stabilt i sitt kromosom under kontroll av den induserbare lacUV5 promotor og er således kompatibel med pT7-7 avledede konstrukter. E. coli B stammer som BL21 mangler lon proteasen og den ompT ytre membran-protease. Disse mangler kan hjelpe til med å stabilisere ekspresjon og akkumulering av fremmede proteiner i E. coli. Analyser av råekstrakter av E. coli BL21(DE3) inneholdende hver av de tre ekspresjons-konstrukter beskrevet i det foregående indikerte at de høyeste ekspresjonsnivåer av luciferase ble oppnådd fra celler som inneholdt konstruktet pPW304 (se tabell 2).

De mutante proteiner i henhold til oppfinnelsen gir fordeler annet enn varmebestandighet. Man har funnet at mutasjon av aminosyren i stilling Photinus 354/Luciola 3 56 ga en endring i bølgelengde av lys som ble emittert ved oksydasjon av luciferin avhengig av den aminosyre eller analog som erstatter glutaminsyren. I forbindelse med oppfinnelsen er det således også tilveiebragt luciferaser for anvendelse som spesifikke bindingsmiddelmarkører eller rapporteringsgener som tilbake-rapporterer identitet som en spesifikk bølgelengde av lys når luciferinoksydasjonen anvender deres proteinprodukter, idet en slik egenskap gir anvendelighet til slike mutasjoner som glysin, prolin og aspartat. En ytterligere fordel med proteinene i henhold til oppfinnelsen, som følger av deres økte varmebestandighet, er at de kan fremstilles ved en høyere temperatur, f.eks. ved 3 7°C eller høyere, med et tilsvarende økt utbytte, som er eksemplifisert i det etterfølgende.

Proteinene, DNA, vektorene og cellene i henhold til oppfinnelsen skal nå illustreres nærmere under henvisning til de etterfølgende eksempler.

FIGURER:

Pig. l viser et restriksjonskart av plasmid pPW2 04 avledet fra pKK223-3 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 2 viser et restriksjonskart av plasmid pPW116 avledet fra pDR540 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 3 viser et restriksjonskart av plasmid pPW3 04 avledet fra pT7-7 ved innskudd av et lue gen som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 4 viser et restriksjonskart av plasmid pPWSOla avledet fra pDR540 og BamHl/Sstl fragment fra pGEM-luc med Xho setet fjernet. Fig. 5 viser en kurve for varmeinaktivering av rekombinant og villtype Photinus luciferase (Sigma) inkubert ved en gitt temperatur i en 2 0 minutters periode som beskrevet i de etterfølgende eksempler. Fig. 6 viser en kurve for luciferaseaktivitet i urene ekstrakter av E. coli BL21(DE3)pPW304 under vekst ved forskjellige temperaturer. Fig. 7 viser en kurve for varmeinaktivering av aktivitet til luciferase avledet fra pPW3 04 og pPW3 04M-l (plasmid i henhold til oppfinnelsen som koder slik at lysin erstatter glutamat 354). Fig. 8 viser en kurve for tidsavhengig inaktivering av Sigma villtype og pPW3 04 og pPW3 04M-l rekombinante luciferaser ved 37°C.

Fig. 9 viser et restriksjonskart av pT7-7 etter Tabor.

Fig. 10 viser en kurve som illustrerer varmeinaktivering, i Promega lysisbuffer ved 40°C, av aktivitet av urene celleekstrakter av luciferase-uttrykkende E. coli i henhold til oppfinnelsen som uttrykker luciferaser med henholdsvis alanin-, valin-, leucin-, isoleucin-, tyrosin-, fenylalanin-, tryptofan-, gluta-min-, histidin-, asparagin-, metionin-, arginin-, lysin-, serin-, treonin- og cysteinsubstitusjoner for villtype glutaminsyren i posisjon 354. Fig. 11 viser en kurve som illustrerer varmeinaktiveringen av aktiviteten til renset dobbelmutant luciferase som har E354K lysin og A 215L leucin endringer, ved 47°C i fosfatbuffer sammenlignet med de enkle mutanter A215L og E354K. Fig. 12 viser en kurve for gjenværende prosent av initial aktivitet av lysin E354K mutanten, rekombinant villtype og native ildflueluciferaser over tid ved 37°C i pH 7,75 HEPES buffer med 0,02 % azid. Fig. 13 viser en kurve for luciferaseekspresjon ved 37°C for rekombinant villtype, E354K enkel og E3 54K+A215L doble mutanter med økning i optisk densitet som et mål på kultur-celledensitet plottet mot luciferaseaktivitet. Fig. 14 viser en kurve for prosent initial aktivitet over tid for 10 ng/ml av hver av A215L og E3 54K enkle, A215L+E3 54K doble, rekombinante og Sigma villtype luciferaser over fem timer i HEPES pH 7,75, inneholdende 1 % BSA og 0,02 % azid, ved 3 7°C. Fig. 15 viser en kurve for prosent initial aktivitet over tid for 10 ng/ml av hver av A215L og E354K enkle, A215L+E3 54K doble, rekombinante og Sigma villtype luciferaser over fem timer i HEPES pH 7,75 inneholdende 1 % BSA, 0,02 % azid, 2 mM EDTA og 2 mM DTT ved 37°C.

SEKVENSLISTE:

Sekvenslisten angitt til sist i beskrivelsen beskriver DNA og aminosyresekvenser som følger: SEQ ID No 1: viser DNA-sekvensen til et DNA som koder for luciferase i henhold til oppfinnelsen hvor Photinus pyralis villtype kodon er mutert ved 1063 til 1065, og for lysin er basen ved 1063 mutert til en A.

SEQ ID No 2: viser aminosyresekvensen til et protein i henhold til oppfinnelsen hvor Photinus pyralis villtype aminosyren 3 54 glutaminsyre er blitt forandret til en annen aminosyre .

SEQ ID No 3: viser sekvensen■for oligonukleotidet anvendt for SDM-mutasjonen av pPW601 til å gi et lysin i stedet for glutaminsyre i posisjon 3 54 i eksempel 2.

SEQ ID No 4: viser sekvensen for oligonukleotidet anvendt for SDM-mutasjonen av pPW601 til å gi leucin i posisjon 215 i eksempel 5.

SEQ ID No 5: viser aminosyresekvensen for et protein i henhold til oppfinnelsen hvor Photinus pyralis villtype aminosyren 3 54 glutaminsyre er blitt forandret til en hvilken som helst annen aminosyre og 215 aminosyren er forandret til leucin.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1: Fremstilling av plasmider inneholdende DNA i

henhold til oppfinnelsen

Plasmider pKK223-3 og pDR540 ble oppnådd fra Boehringer Mannheim, pDR54 0 er også tilgjengelig fra Pharmacia.

Plasmid pT7-7 (se "Current protcols in Molecular Biology Vol II Section 16.2.1") ble oppnådd fra Stan Tabor, Dept of Biol Chem, Harvard Medical School, Boston, Mass 02115, og (som vist i fig. 8) inneholder T7 RNA polymerase promoteren

4>10 og translasjonsstartsetet for T7 gen 10 proteinet (T7 bp 22857 til 22972) innskutt mellom PvuII og Clal setene i pT7-5. Unike restriksjonsseter for dannelse av fusjonsproteiner-(etter ifylling av 5'-ender) er Frame 0: EcoRl; Frame 1: Ndcl, Smal, Clal; Frame 2: BamHI, Sali, Hindlll. SacI setet i den originale polylinker fjernes ved delesjon og et ytterligere Xbal sete tilveiebringes oppstrøms for startkodonet.

Ildflueluciferase (fremstilt fra en krystallinsk suspensjon, Cat No L9009), koenzym A og ATP ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. Billeluciferinkaliumsalt ble oppnådd fra Promega. Celleekstrakter ble fremstilt som beskrevet i The Promega Technical Bulletin No 101. Prøver av E. coli kulturer ble lysert i cellekultur-lysisreagens (25 mM Tris-fosfat, pH 7,8, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 % glyserol, 1 % Triton X-100, 2,5 mg/ml BSA, 1,25 mg/ml lysozym) i ti minutter ved romtemperatur og deretter lagret på is før analyse.

Luciferaseaktivitet for cellelinjer ble bestemt ved å regi-strere bioluminescens emittert ved hjelp av kolonier ved å overføre disse til nylonfiltere (Hybond N, Amersham) og deretter bløte filterne med 0,5 mM luciferin i 100 mM natrium-citratbuffer pH 5,0 (Wood & Deluca 1987, Anal Biochem 161, side 501-507). Luciferaseanalyser in vitro ble gjennomført ved 25 °C ved anvendelse av 125 fil analysebuf f er (20 mM Tri-cine, 1 mM MgS04, 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 0,27 mM koenzym A, 0.47 mM luciferin, 0,53 mM ATP og 1 til 2 /il prøve). Den endelige pH i analyseblandingen var 7,8 og lysmålinger ble utført med et BioOrbit 1250 luminometer.

For fremstilling av ikke-spesifikke kjemiske mutasjoner av DNA, ble plasmider inneholdende luc-gener behandlet med meto-den etter Kironde et al., 1989, Biochem. J. 259, side 421-426, ved anvendelse av 0,8 M hydroksylamin, 1 mM EDTA i 0,1 mM natriumfosfat pH 6,0 i to timer ved 65°C. Det muterte plasmid ble avsaltet på en G60 DNA "grade" Nick-kolonne (Pharmacia) etterfulgt av transformasjon inn i E. coli BL21(DE3).

Varmeinaktiveringsundersøkelser ble gjennomført ved å inku-bere urene celleekstrakter med luciferaseaktivitet ved forskjellige temperaturer i tyve minutter og måling av gjenværende aktiviteter. I undersøkelser med det rensede luciferase oppnådd fra Sigma ble enzymet fortynnet i Promega lysisbuffer før inaktivering. For tidsavhengige undersøkelser ble Eppen-dorf-rør inneholdende 5 0 \ l1 urent celleekstrakt eller Sigma luciferase i lysisbuffer(inkubert ved 37°C. Ved forskjellige tidspunkter ble røret fjernet og avkjølt på is før analyse. Restaktiviteten ble uttrykt som prosent av opprinnelig aktivitet .

De relative nivåer av ekspresjon av luciferase fra hvert av konstruktene pPW2 04, pPW116 og pPW304 er 0,1:0,5:1,0 fra E. coli BL21(DE3). Celler ble dyrket i LB ved 37°C til en OD 60 0 på 0,3, deretter ble IPTG innført og cellene ble dyrket ytterligere fire timer hvoretter den urene ekstrakten ble fremstilt og luciferaseaktivitet ble målt.

Tabell 1: Ribosombindingsseter (understreket) og startkodoner i ekspresjonskonstrukter anvendt i eksempel l.

Den seterettede mutagenese som kreves for å omdanne glutaminsyren til en alternativ aminosyre ble utført ved anvendelse av den følgende protokoll. Fordi glutaminsyre til lysin-mutasjonen ligger innen et unikt Aval restriksjonssete, og således bevirker ødeleggelse derav, er det mulig å anvende et enkelt oligonukleotid som det mutageniske oligonukleotid og seleksjonsoligonukleotidet.

Protokoll for seterettet mutagenese:

Det valgte plasmid denatureres og anneales med et selek-sjons/mutagenisk oligonukleotid for lysin: 5'-CATCCCCCTTGGGTGTAATCAG-3<1> hvor den understrekede T er m mismatchen. Den mutante DNA tråd syntetiseres og ligeres, og hele den primære restriksjon kuttes med Aval.

Transformasjon inn i celler, her E. coli BMH 71-18 mut S celler, ble utført ved anvendelse av en Bio-Rad Gene Pulser versjon 2-89. Høstede celler og renset blandet plasmid-pool inneholdende muterte og parentale plasmider ble tilveiebragt og sekundær restriksjonskutting med Aval ble utført før transformasjon i E. coli JM109 celler. Disse celler ble ut-platet på selektive medier (LB agar + 50 fig/ ml ampicillin) , og klonene ble screenet ved å rense deres plasmid DNA og analysere for tap av Aval restriksjonssetet. Plasmid DNA ble renset i hvert tilfelle ved anvendelse av den alkaliske lysismetoden etter Birnboim og Doly, 1979, Nucleic Acids Research 7, side 1513. Nøyaktige protokoller var som beskrevet i The Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (versjon 2) solgt av Clontech Laboratories Inc (US), katalog nr. K1600-1.

Restriksjonskartet for pPW60la, en variant av pPWll6 avledet fra Pharmacia pDR540 og BamHl/Sstl fragment fra pGEN-luc med Xho setet ødelagt er vist på fig. 4. Seterettet mutagenese ble gjennomført som beskrevet i det foregående og i Clontech-instruksjonene for å omdanne villtype Photinus Jue genet innskutt deri til en sekvens som vist i SEQ ID No 1 hvor 1063-1065 er AAG, med uttrykt protein med aminosyresekvens modifisert i stilling 354 til lysin som vist i SEQ ID No 2. EKSEMPEL 2: Varmebestandighet for luciferaser Varmebestandigheten til forskjellige luciferaser uttrykt ved umodifiserte og modifiserte (dvs i henhold til oppfinnelsen) Jue gener i vektorer i E. coli fremstilt som beskrevet over ble bestemt og resultatene er vist i fig. 5 til 8.

En sammenligning av t* (halveringstid) av aktiviteten av ;50 £ig/ml luciferase ved 43,5°C i 50 mM kaliumf osf atbuf f er pH 7,8, 1 mM EDTA, 0,2 % (vekt/volum) BSA, 1 mM DTT og 10 % ammoniumsulfat viser at 50 % gjenværende aktivitet ble nådd ved følgende tidspunkter: Sigma villtype luciferase: oppnådd etter omtrent 1,5 min. pPWSOl (354=glutaminsyre): oppnådd etter omtrent 5 min. ;pPW6 01aK (354=lysin): tM oppnådd etter omtrent 3 0 min. ;Fra de ovennevnte figurer kan det således klart ses at er-statning av 354 glutaminsyren med lysin øker varmebestandigheten for luciferase i det minste opp til 43,5°C. ;EKSEMPEL 3: Varmebestandighet for luciferase Varmebestandigheten for en rekke luciferaser uttrykt ved SDM-modifiserte Jue gener svarende til andre mutasjoner i posisjon 354 i henhold til oppfinnelsen i vektorer i E. coli fremstilt ved metoder som er analoge med dem som er nevnt i eksempel l, ble bestemt og resultatene er vist grafisk i fig. 10. ;En sammenligning av tK ved 40°C i Promega lysis buffer ble gjennomført og resultatene ble oppnådd som tM i minutter: ;EKSEMPEL 4: Stabilitet av luciferaser ved 37 °C og ;romtemperatur ;Luciferaser av pPW601K lysinmutasjon (86 ng/ml), rekombinant villtype (550 ng/ml) og nativ type (Sigma) (62,5 ng/ml) ble inkubert i fire timer ved 37°C i 1 % BSA, pH 7,75 HEPES buffer med 0,02 % azid som konserveringsmiddel. For å måle gjenværende aktivitet ble 1 ng luciferase tilsatt til D-lucifer-insubstratet og luminescenstall pr. minutt ble registrert. ;Resultater er vist i det etterfølgende uttrykt som gjenværende aktivitet etter inkubasjon i to timer ved 3 7°C og etter ti døgn ved romtemperatur. ;EKSEMPEL 5: Fremstilling og stabilitet av 354K:215L dobbel ;mutant ;Den doble mutant 3 54 lysin:215 leucin av pPW60la Photinus pyralis luciferase ble fremstilt ved å ta pPW601aE354K som beskrevet i eksempel l og mutere den ved anvendelse av oligonukleotidet med SEQ ID No 4 5 '-GAATCTGACGCAGAG.AGTTCTATGCGG-3', hvor de understrekede baser representerer mismatcher som bevirker mutasjonen. Denne mutasjon ble bekreftet ved DNA-sekvensering og måling av varmebestandigheten til den opp-nådde luciferase som uttrykt i E. coli ved en metode analog med den som er beskrevet i eksempel 1 gjennomført som i eksempel 2 til 4 ved anvendelse-av pH 7,8 fosfatbuffer inneholdende l mM EDTA, 0,2 % (vekt/volum) BSA, 1 mM DTT og 10 % ammoniumsulfat som varmeinaktiveringsmedium. ;Ved 43,5°C i fosfatbufferen var der mindre enn 5 % tap av aktivitet i løpet av 32 minutter, mens t<*> ved 47°C var omtrent 3 8 minutter. Ved 50°C bibeholder den doble mutant 15 % aktivitet etter 16 minutters inkubasjon. Resultater fra denne inaktiveringstest er vist grafisk i fig. 12.

EKSEMPEL 6: Rensing av luciferaser

E. coli JM10 9 celler som uttrykker den rekombinante villtype eller mutant luciferase ble dyrket ved 30°C i Luria Broth (LB) inneholdende 50 /tg/ml ampicillin og det ble tilført IPTG (1 mM) under den tidlige logfase. Celler ble høstet ved midtre stasjonære fase og resuspendert i 50 mM Tris-HCl pH 8,0 inneholdende 50 mM KC1, l mM ditiotreitol, 1,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og 1 mM EDTA (buffer A). Celler ble nedbrutt i en MSE soniprep 150 sonikator (ampli-tyde 14 \ l) og cellelysatet ble sentrifugert ved

30000 x g i 30 minutter. Supernatanten av den urene ekstrakt ble deretter underkastet fraksjonering med ammoniumsulfat, og hvor fraksjonen som presipiterte mellom 35 % og 55 % metning ble funnet til å inneholde luciferaseaktivitet og til å være oppløst i buffer A.

Ekstrakten ble avsaltet ved anvendelse av en Pharmacia PD10 kolonne ekvilibrert i 50 mM Tris-HCl pH 8,0 inneholdende 0,5 mM DTT (buffer B), og den avsaltede ekstrakt ble påført på en Pharmacia Mono Q anionbytterkolonne og eluert med en lineær gradient av 0 til 500 mM NaCl i buffer B ved en strøm-ningshastighet på 4 ml/min i 2 ml fraksjoner. Toppfraksjonen for luciferaseaktivitet ble samlet og dialysert mot 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,5, inneholdende 0,5 mM DTT og 12 %

(volum/volum) glyserol for langtidslagring.

EKSEMPEL 7: Varmeinaktivering av rensede luciferaser Eppendorf-rør inneholdende cellefrie ekstrakter av luciferase ble fremstilt som beskrevet i eksempel 6. Rensede preparater av luciferase {50 ptg/ml) ble inkubert i en termostabilitetsbuffer omfattende 50 mM kaliumfosfatbuffer pH 7,8 inneholdende 10 % mettet ammoniumsulfat, l mM ditriotreitol og 0,2 % bovint serumalbumin (BSA). Ved fastsatte tidspunkter ble et rør fjernet og avkjølt i et is/vannbad før analyse og hvor gjenværende målte aktivitet ble beregnet som en prosentdel av den initiale aktivitet.

Arrhenius-plottinger for renset rekombinant villtype og varmebestandige luciferaser ble konstruert ved å måle halve-ringstiden for inaktivering i termostabilitetsbuffer over et temperaturområde fra 42°C til 50 °C. Den naturlige logaritmen til tM i minutter ble deretter plottet mot l/K. For en ekvivalent inaktiveringshastighet øker E354K mutasjonen varmebestandigheten med 2°C ved temperaturer i dette område sammenlignet med en økning på 5°C med A215L mutasjonen og 6°C for dobbelmutanten E3 54K+A215L, idet den sistnevnte viser den additive naturen til dobbelmutasjonen.

EKSEMPEL 8: Økt ekspresjon av mutante luciferaser sammenlignet med villtype rekombinant luciferase i

E. coli

Ekspresjon av luciferase i E. coli JM109 celler ble målt under vekst i flytende kultur ved 3 7°C. Celler som uttrykker de varmebestandige mutanter ble funnet til å akkumulere mere aktiv luciferase under vekst enn celler som uttrykker det rekombinante villtypeenzym. Fig. 13 viser denne effekt grafisk ved å plotte luciferaseaktivitet sammen med økende optisk densitet ved 600 nm for kulturer av rekombinant villtype, E3 54K+A215L dobbelmutant og E354K. Det fremgår at den økte varmebestandighet for den enkle og doble mutant tillater

økt fremstilling, av luciferase ved kulturtemperaturen på 37°C.

EKSEMPEL 9: Effekt av buffer på stabilitet til mutant

luciferase ved 37°C

10 ng/ml oppløsninger av hver av A215L, E354K, E3S4+A215L, rekombinant villtype og Sigma luciferaser ble fremstilt i HEPES pH 7,75 buffer med 1 % BSA og 0,02 % azid og varmebestandighet ved 37°C ble sammenlignet med den til de samme blandinger med tilsetning av 2 mM EDTA og 2 mM DTT. Resultater er vist grafisk i fig. 14 og 15 og indikerer at den relative stabilitet til A215L og.E354K varierer med buffer ved 37°C.

EKSEMPEL 10: Effekt av aminosyresubstitusjon på bølge-lengden av lys emittert ved oksydasjon av D-luciferin

Bølgelengden av lys emittert ved oksydasjon av D-luciferin med de forskjellige luciferaser i henhold til oppfinnelsen angitt i eksempel 3 ble målt og funnet til å variere med aminosyremutasjonen. Bølgelengden av lys som emitterte varierte med 5 nm mellom rekombinant villtype (E3 54) og E354K, og med omtrent 15 nm mellom E354K og E354I.

Villtype rekombinant E. coli organismer gir en gulgrønn lumi-nescens i nærvær av D-luciferin. Farger som emitterte ved de respektive E. coli mutanter i nærvær av D-luciferin var som følger:

Claims

1. Protein med luciferaseaktivitet og med over 60 % identitet i aminosyresekvens med luciferase fra Photinus pyralis, Luciola mingrelica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis, karakterisert ved at aminosyreresten svarende til rest 354 i sekvensen til Photinus pyralis luciferase som vist ved SEQ ID No 2 er en aminosyre annet enn glutaminsyre, glysin, prolin eller asparaginsyre.

2. Protein som angitt i krav 1, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens XGDDKPGA hvor X er aminosyreresten annet enn glu- .taminsyre, glysin, prolin eller asparaginsyre.

3. Protein som angitt i krav 2, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens TPXGDDKPGA hvor X er aminosyreresten annet enn glutaminsyre, glysin, prolin eller asparaginsyre.

4. Protein som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at aminosyren X er en av tryptofan, valin, leucin, isoleucin og asparagin.

5. Protein som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at aminosyren X er en av lysin eller arginin.

6. Protein, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID No 2 hvor Xaa er en aminosyre som angitt i hvilket som helst av kravene 4 eller 5.

7. Protein som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, karakterisert ved at aminosyreresten svarende til rest 215 i Photinus pyralis luciferase eller rest 217 i Luciola mingrelica, Luciola cruciata og Luciola lateralis luciferase er en hydrofob aminosyre.

8. Protein som angitt i krav 7, karakterisert ved at den hydrofobe aminosyre er en av isoleucin, leucin eller valin.

9. Protein, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som vist i SEQ ID No 5 hvor Xaa er en aminosyre som angitt i hvilket som helst av kravene 4 eller 5.

10. DNA, karakterisert ved at det koder for et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 9.

11. DNA som angitt i krav 10, karakterisert ved at det omfatter en nukle-otidsekvens som beskrevet i SEQ ID No 1 hvor de tre baser N i 1063 til 1065 danner et kodon som koder for en aminosyre annet enn glutaminsyre, glysin,' prolin eller asparaginsyre.

12. DNA som angitt i krav 11, karakterisert ved at kodonet koder for en aminosyre som angitt i krav 4 eller 5.

13. DNA som angitt i krav 10, karakterisert ved at det omfatter en nukle-otidsekvens som vist i SEQ ID No 1 hvor de tre baser N i 1063 til 10 65 danner et kodon som koder for en aminosyre annet enn glutaminsyre, og at de tre baser i posisjoner 646 til 64 8 danner et kodon som koder for en hydrofob aminosyre.

14. DNA som angitt i krav 13, karakterisert ved at basene i posisjoner 646 og 64 7 er henholdsvis C og T.

15. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et lue gen som koder for et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1 - 9.

16. Vektor som angitt i krav 15, karakterisert ved at den oppnås ved å behandle en vektor som inneholder et villtype eller rekombinant lue gen ved seterettet mutagenese for å endre det kodon som er ansvarlig for å kode for glutaminsyren i stilling 354 i Photinus pyralis luciferase eller det tilsvarende glutamat i Luciola mingrelica, Luciola cruciata eller Luciola lateralis luciferase til en alternativ aminosyre.

17. Vektor som angitt i krav 16, karakterisert ved at den alternative aminosyre er en aminosyre som angitt i hvilket som helst av kravene 4 eller 5.

18. Vektor som angitt i ett eller flere av kravene 15 - 17, karakterisert ved at den er valgt fra pKK223-3, pDR54 0 og pT7-7 og hvor et lue gen er blitt ligert inn i nevnte vektor.

19. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA som angitt i ett eller flere av kravene 10 - 14.

20. Celle i stand til å uttrykke et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1-9, karakterisert ved at den omfatter DNA eller en vektor som angitt i ett eller flere av kravene 10 - 19.

21. Celle som angitt i krav 20, karakterisert ved at den er E. coli, S. cerevisiae eller en insektcelle.

22. Prøvekit for å utføre en analyse gjennom måling av ATP, karakterisert ved at prøvekitet omfatter et protein som angitt i ett eller flere av kravene 1-9 inneholdt i et lumineseerende reagens.

23. Analysemetode hvor ATP måles ved anvendelse av luciferin og luciferase for å danne lys hvis kvantitet er relatert til mengden av ATP, karakterisert ved at luciferasen er et protein som angitt i ett eller flere av kravene l - 9.

24. Analysemetode som angitt i krav 23, karakterisert ved at analysen gjennomføres ved en temperatur fra 30°C til 70°C.

25. Analysemetode som angitt i krav 23, karakterisert ved at analysen gjennomføres ved en temperatur fra 37°C til 60°C.

26. Analysemetode som angitt i krav 23, karakterisert ved at analysen gjennomføres ved en temperatur fra 40°C til 50°C.