RU96119246A - Люциферазы - Google Patents

Claims (25)

1. Белок, обладающий люциферазной активностью и имеющий более чем 60% гомологию аминокислотной последовательности с люциферазой из Photinus pyralis, Zuciola mingrelica, Zuciola cruciata или Zuciola lateralis, характеризующийся тем, что аминокислотный остаток, соответствующий остатку 354 люциферазы Photinus pyralis или остатку 356 люцифераз Zuciola mingrelica, Zuciola cruciata и Zuciola lateralis является аминокислотой, отличной от глутамата.

2. Белок по п.1, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность XGDDKPGA, где X представляет аминокислотный остаток, отличный от глутамата.

3. Белок по п.2. отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность TPXGDDKPGA, где X представляет аминокислотный остаток, отличный от глутамата.

4. Белок по пп.1,2 или 3, отличающийся тем, что аминокислота X не является глицином, пролином или аспарагиновой кислотой.

5. Белок по пп.1,2 или 3, отличающийся тем, что аминокислота X является одной из триптофана, валина, лейцина, изолейцина и аспарагина или аналог или модификация любой из них.

6. Белок по пп.1,2 или 3, отличающийся тем, что аминокислота X является одной из лизина и аргинина или их аналог или модификация.

7. Белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную как последовательность ID N 2, где Xaa представляет аминокислоту, указанную в п.5 или 6, или ее аналоги или модификации.

8. ДНК, кодирующая белок по любому из пп. 1 - 7.

9. ДНК по п.8, отличающаяся тем, что содержит нуклеотидную последовательность, представленную в последовательности ID N 1, где три основания под номерами 1063 - 1065 образуют кодон, кодирующий аминокислоту, отличную от глутамата.

10. ДНК по п.9, отличающаяся тем, что кодон кодирует аминокислоту, ее аналог или модификацию по пп.5 и 6.

11. Вектор, содержащий luc ген, кодирующий белок по любому из пп.1 - 7.

12. Вектор по п.11. отличающийся тем, что получен за счет обработки вектора, содержащего дикого типа или рекомбинантный luc ген, с помощью сайт-направленного мутагенеза для замены кодона, ответственного за кодирование глутамата в положении 354 люциферазы Photalis pyralis или глутамата в положении 356 люциферазы Zuciola mingrelica, Zuciola cruciata или Zuciola lateralis на альтернативную аминокислоту, ее аналог или модификацию.

13. Вектор по п.12. отличающийся тем, что альтернативной аминокислотой является аминокислота, ее аналог или модификация по любому из п. 5 или 6.

14. Вектор по любому из пп. 9 - 13, отличающийся тем, что выбран из pKK223-3, pDR540 и pT7-7, в которые был лигирован luc ген.

15. Клетка, способная к экспрессии белка по любому из пп.1 - 7, содержащая ДНК или вектор по любому из пп.8 - 14.

16. Клетка по п.15, отличающаяся тем, что является клеткой E.coli, S.cerevisiae или клеткой насекомого.

17. Тестовый набор для осуществления анализа путем измерения АТР, характеризующийся тем, что этот набор содержит белок по любому из пп.1 - 7, в люминесцентном реагенте.

18. Способ анализа, в котором АТР измеряют, используя люциферин и люциферазу для эмиссии света, количество которого связано с количеством АТР, отличающийся тем, что люцифераза является белком по любому из пп.1 - 7.

19. Способ анализа по п.18, отличающийся тем, что этот анализ осуществляют при температуре 30 - 70^oC.

20. Способ анализа по п.18, отличающийся тем, что этот анализ осуществляют при температуре 37 - 60^oC.

21. Способ анализа по п.18, отличающийся тем, что этот анализ осуществляют при температуре 40 - 50^oC.

22. Препарат люциферазы, который сохраняет 85% или более своей люциферазной активности при хранении при комнатной температуре в течение 10 дней в отсутствии термостабилизирующего агента.

23. Применение люциферазы по любому из пп.1 - 7 или 22 в качестве метки для специфического связывающего реагента.

24. Тестовый набор, отличающийся тем, что содержит специфический связывающий реагент, меченый люциферазой, по любому из пп.1 - 7.

25. Применение ДНК, кодирующей люциферазу или вектора по любому из пп.8 - 14 для целей идентификации клетки или ДНК.