CN108051418A - 一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于金属有机骨架材料用于疾病标记物的分析检测领域，具体涉及一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法。通过将不同浓度的无机焦磷酸酶溶液与焦磷酸盐反应后，加入Cu‑BDC‑MOF纳米片溶液、过氧化氢溶液与对苯二甲酸溶液，于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度无机焦磷酸酶存在下的荧光信号，构建工作曲线，制得荧光传感器。先利用荧光传感器检测样品中无机焦磷酸酶的荧光信号，然后与工作曲线对应，实现了对样品中无机焦磷酸酶的定量分析。该检测方法选择性高、快速、灵敏、高效。

Description

一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于金属有机骨架材料用于疾病标记物的分析检测领域，具体涉及一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法。
背景技术
焦磷酸酶(EC 3.6.1.1) 或者无机焦磷酸酶（PPase），是一种专门将焦磷酸盐（P2O74-,PPi)转化为无机磷酸盐的水解酶。通过无机焦磷酸酶（PPase）使焦磷酸盐（PPi）降解的反应是一个大量放热的反应，这给生物合成反应提供了热力学动力（J. Biomol.Screening 2013, 18, 490−497.）。早期研究表明无机焦磷酸酶（PPase）与磷的代谢，碳水化合物的代谢以及进化过程有着直接的关联（Biochim. Biophys. Acta 2006, 1764,1299−1306.）。因此，PPase对于发生在活的有机体中的能量代谢过程至关重要，并且PPase的耗尽将导致细胞的死亡。虽然PPase的结构和机理已经被大量研究，但是，在研发一种针对PPase的灵敏便捷的测定方法这方面的关注还是比较少（Natl.Acad. Sci. U. S. A.2001,98, 3121−3126.）。放射性标记技术是检测PPase的一种最常用的方法（Anal.Biochem. 1971, 44, 397−403.）。但因为放射性标记材料都很贵，还需要昂贵的计算设备，更重要的是它对人体有大量潜在的危害，所以这种技术的应用是有限的。为了解决这个缺点，人们开发了测定PPase活性其他方法。例如，基于在焦磷酸盐存在下荧光激发对PPase活性的诱发，Eriksson 等人建立了一种即时生物发光的PPase测定方法（Anal. Biochem.2001,293, 67−70.）。基于在PPi水解反应过程中氢离子浓度会降低并且导致pH变小这一事实，一种快速灵敏的PPase测定方法发展起来（Acta Chem. Scand., Ser. B 1982, 36,689−694.）。最近Deng 等人提出了一种基于金纳米颗粒分散/聚集可逆协调的PPase活性测试比色方法，是通过控制半胱氨酸和带有PPase的PPi之间Cu(Ⅱ)的协调进行的。基于竞争分析方法和带特殊的光学性能的覆盖AuNCs的巯基十一烷酸的荧光，（Anal. Chem. 2013,85, 9409−9415.）。但是这些方法存在仪器昂贵，过程耗时，选择性差、对人体存在潜在危害等缺点。
CN104237193A公开了一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法，在未加入焦磷酸酶，只有焦磷酸存在时，焦磷酸与二价铜形成络合物，抗坏血酸钠不能够还原络合的二价铜为一价铜作为催化剂，叠氮香豆素和丙炔醇也不能发生1,3-偶极环加成反应，从而体系的荧光强度很低；但是在同时加入焦磷酸酶的情况下，焦磷酸酶能够水解焦磷酸抑制二价铜络合物的形成，点击化学反应能够继续发生，体系的荧光强度大幅增强且荧光强度与加入的焦磷酸酶的量存在线性关系。该传感器成功地应用于焦磷酸酶抑制剂氟化钠的检测，但是该方法需要制备叠氮香豆素，制备过程需要加入高能叠氮化物，具有一定的危险性。本发明具有操作简单、安全、成本低、特异性好等优点。
本发明通过结合二维金属有机骨架材料模拟酶活性与酶作用的专一性建立了一种快速、灵敏、高效的PPase活性分析方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法。先合成具有模拟酶活性的二维金属有机骨架材料，并利用合成的材料构建生物传感器用于无机焦磷酸酶的分析检测。
为了实现上述发明目的，本发明提出以下技术方案：
一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1）配制不同浓度单位的无机焦磷酸酶溶液；
2）将具有模拟酶活性的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片分散于超纯水中超声30 min，离心取上清液备用；上清液中Cu-BDC-MOF 纳米片的浓度为200μg/mL；
3）取焦磷酸钠溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中制得焦磷酸钠溶液，贮存在4℃备用；
4）取体积分数为30%的过氧化氢溶液稀释60倍，贮存在4℃备用；
5）取对苯二甲酸溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中制得对苯二甲酸溶液，避光贮存在4℃备用；
6）分别取20μL焦磷酸钠溶液(1.0 mM)、50μL Cu-BDC-MOF纳米片溶液（200μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6 mM）溶液，加入60μL Tris-Hcl (50 mM pH7.4)缓冲液补充体积到200μL于37℃下孵育30分钟，于37℃下放置30分钟，检测荧光信号，得到没有无机焦磷酸酶时体系的荧光强度；
7）将10μL不同浓度的无机焦磷酸酶溶液与20μL焦磷酸钠(1.0 mM)反应后，加入50μLCu-BDC-MOF纳米片溶液（200μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6mM）溶液，加入50μL Tris-Hcl (50 mM pH 7.4)缓冲液补充体积到200μL于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度无机焦磷酸酶溶液存在下的荧光信号，构建荧光信号—浓度工作曲线。
步骤2）中Cu-BDC-MOF 纳米片的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.0-4.0 mg对苯二甲酸溶解在2.0-5.0 mL体积比为2:1的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（2）将2.0-4.0 mg三水合硝酸铜溶解在2.0-5.0 mL体积比为1:2的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（3）配制1.0-3.0 mL体积比为1:1的 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂作为连接液；
（4）先将对苯二甲酸溶液加入到直径为1.0-2.0 cm，容量为10-30 mL的试管中，再加入1.0-3.0 mL的连接液，最后加入硝酸铜溶液；在30-50℃下对底层的对苯二甲酸层进行加热，反应24-48小时；得到蓝色产物，利用离心洗去N，N-二甲基甲酰胺与乙腈，真空烘箱中60-100℃干燥，制得Cu-BDC-MOF 纳米片。
一种如上所述的制备方法制得的检测无机焦磷酸酶的荧光传感器。
如上所述的荧光传感器的使用方法：将样品与焦磷酸钠反应后，加入Cu-BDC-MOF纳米片溶液、过氧化氢溶液与对苯二甲酸溶液，于37℃下孵育30分钟，检测荧光信号；将荧光信号代入荧光信号—浓度工作曲线对应，对样品中无机焦磷酸酶进行定量分析。
本发明荧光传感器的工作原理为：
本发明中，当体系中不存在目标物无机焦磷酸酶（PPase）时，焦磷酸盐能够络合Cu-BDC-MOF 纳米片结构中的金属中心（Cu2+），从而使材料结构破坏，不具备模拟酶活性，无法催化过氧化氢分解，后续反应不能继续。此时体系中无法检测到荧光发射信号。
当体系中存在无机焦磷酸酶时，无机焦磷酸酶与焦磷酸盐发生反应产生正磷酸盐，正磷酸盐无法络合材料中的金属离子（Cu2+），材料结构完整。由于上述合成的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片具有模拟酶活性，能够催化产生的过氧化氢分解生产羟基自由基（·OH），由于羟基自由基具有强氧化性，能够氧化体系中的对苯二甲酸成为2-羟基对苯二酸，得到的2-羟基对苯二酸在315 nm处激发时能得到425 nm的荧光信号。
根据无机焦磷酸酶的存在与否以及在体系中的浓度高低具有相应的荧光信号强度实现对无机焦磷酸酶的分析检测。检测原理如图1所示，检测可行性如图2所示。
上述一种荧光传感器检测无机焦磷酸酶的方法中，所述的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片具有辣根过氧化物酶活性，能够催化过氧化氢分解产生羟基自由基。
本发明所述的基于二维金属有机骨架材料纳米片的荧光传感器检测无机焦磷酸酶的方法并不仅限于上述步骤中制得的Cu-BDC-MOF纳米片，也包括其他二维金属有机骨架材料，同时，对于能够产生使焦磷酸盐分解的物质，诸如：碱性磷酸酶。在本发明技术构思范围内的二维金属有机骨架材料以及能够使焦磷酸盐分解的物质均属于本发明的保护范围。
本发明的有益技术效果在于：
本发明的检测方法克服了现有无机焦磷酸酶检测技术仪器昂贵，过程耗时，选择性差、对人体存在潜在危害等缺点，利用所合成的二维金属有机骨架材料具有模拟酶活性，结合无机焦磷酸酶的特异性识别能力，建立了一种快速、高效的无机焦磷酸酶检测方法。
附图说明
图1基于Cu-BDC-MOF 纳米片构建的荧光传感器检测无机焦磷酸酶的示意图；
图2 基于Cu-BDC-MOF 纳米片构建的荧光传感器检测不同浓度无机焦磷酸酶的可行性研究图；
图3是基于Cu-BDC-MOF Nanosheet构建的荧光传感器检测不同浓度无机焦磷酸酶的荧光光谱图（A），传感器检测无机焦磷酸酶的工作曲线图（B）以及传感器检测无机焦磷酸酶的工作曲线图对无机焦磷酸酶浓度求对数做的拟合曲线（C）。
具体实施方式
为进一步公开而不是限制本发明，以下结合实例对本发明作进一步的详细说明。
一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1）配制不同浓度单位的无机焦磷酸酶溶液；
2）将具有模拟酶活性的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片分散于超纯水中超声30 min，离心取上清液备用；上清液中Cu-BDC-MOF 纳米片的浓度为200 mg/mL；
3）取焦磷酸钠溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中制得焦磷酸钠溶液，贮存在4℃备用；
4）取体积分数为30%的过氧化氢溶液稀释60倍，贮存在4℃备用；
5）取对苯二甲酸溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中制得对苯二甲酸溶液，避光贮存在4℃备用；
6）分别取20μL焦磷酸钠(1.0 mM)反应、50μL Cu-BDC-MOF纳米片溶液（200μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6 mM）溶液，加入60μL Tris-Hcl (50 mM pH7.4)缓冲液补充体积到200μL于37℃下孵育30分钟，于37℃下放置30分钟，检测荧光信号，得到没有无机焦磷酸酶时体系的荧光强度；
7）将10μL不同浓度的无机焦磷酸酶溶液与20μL焦磷酸钠(1.0 mM)反应后，加入50μLCu-BDC-MOF纳米片溶液（200 μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6mM）溶液，加入50μL Tris-Hcl (50 mM pH 7.4)缓冲液补充体积到200 μL于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度无机焦磷酸酶溶液存在下的荧光信号，构建荧光信号—浓度工作曲线。
步骤2）中Cu-BDC-MOF 纳米片的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.0-4.0 mg对苯二甲酸溶解在2.0-5.0 mL体积比为2:1的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（2）将2.0-4.0 mg三水合硝酸铜溶解在2.0-5.0 mL体积比为1:2的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（3）配制1.0-3.0 mL体积比为1:1的 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂作为连接液；
（4）先将对苯二甲酸溶液加入到直径为1.0-2.0 cm，容量为10-30 mL的试管中，再加入1.0-3.0 mL的连接液，最后加入硝酸铜溶液；在30-50℃下对底层的对苯二甲酸层进行加热，反应24-48小时；得到蓝色产物，利用离心洗去N，N-二甲基甲酰胺与乙腈，真空烘箱中60-100℃干燥，制得Cu-BDC-MOF 纳米片。
一种如上所述的制备方法制得的检测无机焦磷酸酶的荧光传感器。
如上所述的荧光传感器的使用方法：先利用荧光传感器检测样品中无机焦磷酸酶的荧光信号，然后与工作曲线对应，对样品中无机焦磷酸酶进行定量分析。
实施例1
一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器的制备方法，具体步骤为：
1、配制不同浓度单位的无机焦磷酸酶溶液；
2、先合成Cu-BDC-MOF纳米片材料，步骤如下：
1）将3.0 mg对苯二甲酸溶解在3.0 mL 体积比为2:1的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
2）将3.0 mg三水合硝酸铜溶解在3.0 mL体积比为1:2的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
3）配制2.0 mL 体积比为1:1的 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂作为连接液；
4）先将对苯二甲酸溶液加入到直径为2.0 cm，容量为30 mL的试管中，再加入2.0 mL的连接液，最后加入硝酸铜溶液；在40℃下对底层的对苯二甲酸层进行加热，反应36小时；得到蓝色产物，利用离心洗去N，N-二甲基甲酰胺与乙腈，真空烘箱中80℃干燥，制得Cu-BDC-MOF 纳米片；将上述具有模拟酶活性的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片分散于超纯水中超声30 min，离心取上清液（200μg/ml）备用；
3、取焦磷酸钠溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中制得焦磷酸钠溶液，贮存在4℃备用；
4、取体积分数为30%的过氧化氢溶液稀释60倍，贮存在4℃备用；
5、取对苯二甲酸溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中制得对苯二甲酸溶液，避光贮存在4℃备用；
6）分别取20μL焦磷酸钠(1.0 mM)反应、50μL Cu-BDC-MOF纳米片溶液（200μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6 mM）溶液，加入60μL Tris-Hcl (50 mM pH7.4)缓冲液补充体积到200μL于37℃下孵育30分钟，于37℃下放置30分钟，检测荧光信号，得到没有无机焦磷酸酶时体系的荧光强度；
7）将10μL不同浓度的无机焦磷酸酶溶液与20μL焦磷酸钠(1.0 mM)反应后，加入50μLCu-BDC-MOF纳米片溶液（200 μg/mL）、50μL过氧化氢溶液(0.2 M)与20μL对苯二甲酸（0.6mM）溶液，加入50μL Tris-Hcl (50 mM pH 7.4)缓冲液补充体积到200 μL于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度无机焦磷酸酶溶液存在下的荧光信号，构建荧光信号—浓度工作曲线。
8、根据检测无机焦磷酸酶的荧光信号和工作曲线对样品中无机焦磷酸酶进行定量分析。
结果显示，当无机焦磷酸酶浓度在1 to 50 mU浓度范围时，体系荧光强度与浓度呈线性关系（F = 121.5+543.0 log10CPPase, R2=0.995），检出限达0.6 mU (S/N = 3)，如图3所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种检测无机焦磷酸酶的荧光传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）配制不同浓度单位的无机焦磷酸酶溶液；
2）将具有模拟酶活性的二维金属有机骨架材料Cu-BDC-MOF 纳米片分散于超纯水中超声30 min，离心取上清液备用；上清液中Cu-BDC-MOF 纳米片的浓度为200 mg/mL；
3）取焦磷酸钠溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中制得焦磷酸钠溶液，贮存在4℃备用；
4）取体积分数为30%的过氧化氢溶液稀释60倍，贮存在4℃备用；
5）取对苯二甲酸溶解在三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸缓冲液中制得对苯二甲酸溶液，避光贮存在4℃备用；
6）分别取20μL、1.0 mM的焦磷酸钠溶液，50 μL、200 μg/mL 的Cu-BDC-MOF纳米片溶液、50 μL、0.2 M的过氧化氢溶液与20 μL、0.6 mM的对苯二甲酸溶液，加入60 μL、50 mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲液补充体积到200 μL于37℃下孵育30分钟，于37℃下放置30分钟，检测荧光信号，得到没有无机焦磷酸酶时体系的荧光强度；
7）将10 μL不同浓度的无机焦磷酸酶溶液与20 μL、1.0 mM的焦磷酸钠溶液反应后，加入50 μL、200 μg/mL 的Cu-BDC-MOF纳米片溶液、50μL、0.2 M的过氧化氢溶液与20 μL、0.6mM的对苯二甲酸溶液，加入50μL 、50 mM、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液补充体积到200 μL于37℃下孵育30分钟，检测不同浓度无机焦磷酸酶溶液存在下的荧光信号，构建荧光信号—浓度工作曲线。
2.根据权利要求1所述的检测无机焦磷酸酶的荧光传感器的制备方法，其特征在于：步骤2）中Cu-BDC-MOF 纳米片的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2.0-4.0 mg对苯二甲酸溶解在2.0-5.0 mL体积比为2:1的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（2）将2.0-4.0 mg三水合硝酸铜溶解在2.0-5.0 mL体积比为1:2的N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂中；
（3）配制1.0-3.0 mL体积比为1:1的 N，N-二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂作为连接液；
（4）先将对苯二甲酸溶液加入到直径为1.0-2.0 cm，容量为10-30 mL的试管中，再加入1.0-3.0 mL的连接液，最后加入硝酸铜溶液；在30-50℃下对底层的对苯二甲酸层进行加热，反应24-48小时；得到蓝色产物，利用离心洗去N，N-二甲基甲酰胺与乙腈，真空烘箱中60-100℃干燥，制得Cu-BDC-MOF 纳米片。
3.一种如权利要求1或2所述的制备方法制得的检测无机焦磷酸酶的荧光传感器。
4.一种如权利要求3所述的荧光传感器的使用方法，其特征在于：将样品与焦磷酸钠反应后，加入Cu-BDC-MOF纳米片溶液、过氧化氢溶液与对苯二甲酸溶液，于37℃下孵育30分钟，检测荧光信号；将荧光信号代入荧光信号—浓度工作曲线对应，对样品中无机焦磷酸酶进行定量分析。
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