WO2016068543A1 - 중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 바이오센서 - Google Patents

중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 바이오센서 Download PDF

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cadc
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김현주
정해영
김중수
이동우
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한국생명공학연구원
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • another aspect of the present invention is a cadC encoding the CadC protein, the expression is regulated by the first promoter, the first promoter A first gene construct comprising a gene; And a reporter gene encoding a reporter protein whose expression is regulated by the second promoter, and interposed between the first promoter and the reporter gene, wherein the CadC protein binds to the second promoter. It provides a transformant for detecting heavy metals, wherein the second gene construct comprising an operator cadO, in which expression of a reporter protein is inhibited; is transformed in a host cell.
  • One aspect of the present invention is a cadC encoding a CadC protein, the expression is controlled by the first promoter, the first promoter A first gene construct comprising a gene; And a second cloning site (Multiple Cloning Site, MCS) in which the gene of the target protein whose expression is regulated by the second promoter is cloned, and an operator cadO interposed between the second promoter and the multiple cloning site. It provides an expression vector comprising; a second gene construct comprising.
  • MCS Multiple Cloning Site
  • the second promoter regulates the expression of a gene encoding a target protein present downstream of the second promoter. Any known all kinds of promoters can be used as long as they can regulate the expression of the gene.
  • an operator cadO is interposed between the second promoter and the multiple cloning site.
  • the cadO is a site to which the CadC protein, which is an electron regulator, is bound.
  • the CadC protein is bound to the cadO interposed between the second promoter and the multiple cloning site, the RNA polymerase bound to the second promoter is the CadC. Blockage of the protein prevents the transcription of the gene of the desired protein downstream of it.
  • the CadC protein is separated from the cadO by binding to the heavy metal in the environment in which the heavy metal is present. At this time, the gene of the downstream target protein blocked by the CadC protein may be transferred.
  • the expression vectors of the invention in order to further improve the efficiency and sensitivity of the transfer and expression of a target protein by separation and a second promoter of CadC protein from cadO as described above, the expression vectors of the invention, the T7 RNA polymerase / T7 promoter system (hereinafter referred to as May be introduced as 'T7 system'.
  • the cadO in the first gene construct is also blocked by the CadC protein, thereby preventing the expression of the T7 RNA polymerase that transcribes the target protein in the second gene construct. It can be suppressed even more completely.
  • the expression of T7 RNA polymerase by the first gene construct becomes possible, and thus the expressed T7 RNA polymerase can express the target protein in the second gene construct.
  • the introduction of the T7 system as described above allows the expression vector of the present invention to regulate the expression of the target protein with even higher efficiency or sensitivity.
  • the second gene construct may further include a gene encoding a tag for separation and purification in order to facilitate purification of the expressed target protein.
  • a tag for separation and purification GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag (His-tag) or c-myc may be used.
  • the expression vector of the present invention can be transformed into a suitable host cell to replicate and function independently of the genome of the host cell, or in some cases can be integrated into the genome itself.
  • a plasmid vector may be used, wherein the plasmid vector is transformed into (a) a replication initiation point so that replication is efficiently carried out to include several hundred plasmid vectors per host cell, and (b) a plasmid vector.
  • It has a structure comprising a selection marker gene that allows a host cell to be selected and (c) a restriction enzyme cleavage site into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA.
  • the first gene construct may further comprise a T7RNAP gene encoding a T7 RNA polymerase, wherein the first gene construct comprises a first promoter and a cadC CadO may be further included between the gene or the T7RNAP gene, and the second promoter of the second gene construct may be a T7 promoter, but is not limited thereto.
  • Beta-galactosidase hydrolyzes X-gal to produce blue derivatives, and hydrolyzes ONPG to produce yellow. Fluorescent substrates can also be used for alkaline phosphatase and ⁇ -galactosidase.
  • the antibiotic resistance gene corresponding to (4) may be selected from tetracycline and kanamycin resistance gene.
  • the host cell may be any one selected from the group consisting of microorganisms, for example, gram-negative bacteria, gram-positive bacteria, actinomycetes, yeasts and fungi.
  • Staphylococcus aureus , Pseudomonas putida ) , Saccharomyces cerevisiae ) and Deinococcus radiodurans may be any one selected from the group consisting of, preferably E. coli , more preferably E. coli BL21 (DE3) or E. coli DH5 ⁇ But it is not limited thereto.
  • the third promoter may be an expression promoter at all times, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a method for detecting or quantifying heavy metals, wherein the recombinant microorganism for heavy metal detection is contacted with a suspected heavy metal-containing sample.
  • Another aspect of the present invention provides a high protein expression method of obtaining a target protein by contacting a protein high expression transformant having the heavy metal as an expression inducing agent with a solution containing the heavy metal.
  • Primer pairs for each of the genes were prepared as shown in Table 3 based on the nucleotide sequences of the gene constructs derived as described above, and using the gene constructs of Table 2 from the whole genome of B. oceanisediminis 2691 P cadC- cadO-cadC gene construct) was amplified and constructed.
  • Primer pairs containing T7 ribosome binding site (primer pairs of SEQ ID NOs: 14 and 31 for cadC538; primer pairs of SEQ ID NOs: 17 and 31 for cadC551; primer pairs of SEQ ID NOs: 20 and 31 for cadC595) primer pairs of SEQ ID NOs: 23 and 31 for cadC640; primer pairs of SEQ ID NOs: 26 and 31 for cadC1945; primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 31 for cadC4657) using the egfp gene, which is a fluorescent gene, by PCR amplification.
  • CadC640 protein which shows specific reactivity to cadmium, has a minimum detectable concentration of about 10-20 ⁇ M for cadmium, and the specific fluorescence change value increases with concentration.
  • CadC1945 protein exhibiting lead-specific reactivity has a minimum detectable concentration of about 10-20 ⁇ M for lead, and it was confirmed that the specific fluorescence change value increases with concentration (FIG. 2).
  • the HCE promoter (Poo, HR et al. 2002. Novel high-level constitutive expression system, pHCE vector, for a convenient and cost-effective soluble production of human tumor necrosis factor- ⁇ . Biotechology Letters 24: 1185-1189)
  • the HCE promoter (P hce ), a constant expression promoter, was amplified by PCR using primer pairs of SEQ ID NOs: 61 and 62, and the cadC4657 gene was subjected to PCR using primer pairs of SEQ ID NOs: 63 and 64 from genomic DNA of B. oceanisediminis 2691.
  • the transformant of HK760 (cadO640-egfp & P hce- cadC640) prepared in Example [3-1] to the heavy metal
  • the transformant of HK760 (cadO640- egfp & P hce -cadC640) Colonies were inoculated into LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin and shaken at 37 ° C. and 180 rpm for 12 hours to be used as a preculture.
  • Colonies of the two transformants were inoculated in LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin and shaken at 37 ° C. and 180 rpm for 12 hours to use as a preculture.
  • the culture solution was inoculated in a 250 ml Erlenmeyer flask with a concentration of 1% (v / v) in an LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin at 37 ° C.

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Abstract

본 발명은 중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 바이오센서에 관한 것으로, 중금속과 반응하는 cadC 유전자를 이용함으로써, 비용이 저렴한 중금속을 이용하여 경제성이 높은 유전자 발현 유도 시스템을 구현할 수 있고, 높은 민감도로 중금속을 검출할 수 있는 바이오센서로 활용할 수 있다.

Description

중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 바이오센서
본 발명은 중금속과 반응하는 cadC 유전자를 이용한, 중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 형질전환체에 관한 것이다.
종래 중금속을 검출하는 바이오센서의 경우, 중금속에 반응하는 프로모터 및 유전자부위를 발굴하고 이를 벡터에 삽입하여 형질전환 한 숙주세포를 바이오센서로 사용하여 형질전환 된 숙주세포를 바이오센서로 개발하는 형태의 연구가 수행되어 왔다.
대표적인 유해중금속인 카드뮴을 검출하는 전세포 바이오센서는 주로 원핵 미생물을 사용하고 있으며, 그 예로는 (1) 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 카드뮴 저항성 유전자 cadA의 프로모터와 반딧불 루시퍼라제(luciferase)를 결합한 재조합 플라스미드 형질전환체(Tauriainen, S., et al., Biosens Bioelectron, 931-938, 1998), (2) 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 카드뮴 저항성을 조절하는 cadR 유전자의 프로모터와 녹색 형광단백질(green fluorescent protein)을 결합한 재조합 플라스미드 형질전환체(Wu, C. H., et al., Biotechnol Prog, 898-903, 2009), (3) 대장균의 cadAC 유전자의 프로모터와 녹색 형광단백질을 결합한 재조합 플라스미드 형질전환체(Shetty, R. S., et al., Anal Bioanal Chem, 11-17, 2003) 등이 보고되고 있다. 또한 카드뮴과 수은에 특이적인 CadR 단백질의 C-terminal의 아미노산을 결실시켜 카드뮴에 특이성이 높도록 개량하여 바이오센서의 감도를 높인 연구도 보고된 바 있다(Tao, H. C., et al., Biotechnol Lett, 1253-1258, 2013).
독성 물질에 대하여 선택적인 반응을 나타내는 유전자를 유전공학적 기술로 조작하여 독성물질을 검출할 수 있는 유전자 재조합 균주와 이를 활용한 세포체 기반 바이오센서(whole cell-based biosensor)를 개발에 관한 특허로는 중금속의 한 종류인 카드뮴(Cd2(II))에 대한 세포체 기반 바이오센서는 DNA 마이크로어레이를 활용하여 카드뮴에 특이성을 갖는 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha)의 카드뮴 유도성 프로모터를 이용하여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 바이오센서의 숙주로 이용한 특허가 있으며(대한민국 특허공개 10-2006-0104939), 또한 방사선 저항성 미생물인 데이노코커스 레디오듀란스 (Deinococcus radiodurans)의 유전자인 DR_0070이 카드뮴 노출에 의해 특이적으로 유전자발현이 증가하는 것을 이용하여 이 유전자와 프로모터부위를 포함하는 유전자 재조합 형질전환체로 카드뮴을 검출하는 바이오센서에 관한 특허가 출원된 바 있다(대한민국 특허공개 10-2012-0047635).
상기 기술들은 중금속에 반응하는 프로모터 및 유전자부위를 발굴하고 이를 벡터에 삽입하여 형질전환 한 숙주세포를 바이오센서로 사용하여 형질전환된 숙주세포를 바이오센서로 개발하는 형태였으나, 이들 바이오센서는 중금속에 대한 반응성이 낮아 중금속에 대한 반응성이 높은 유전자 프로모터의 개발과 바이오센서의 감도를 증진시키기 위한 신호증폭모듈의 적용이 필요하였다.
이에, 본 발명자들은 바실러스 오세아니씨디미니스 2691(Bacillus oceanisediminis 2691)의 유전체정보로부터 중금속 내성에 관여할 것으로 예상되는 6가지 cadC 유전자를 발굴하고, 이들 유전자의 전사조절 시스템을 이용하면 중금속에 의해 목적 단백질의 발현이 유도되는 시스템을 구현할 수 있고, 나아가, 민감도가 획기적으로 향상된 중금속 검출용 바이오센서를 구현할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 목적은 중금속을 발현 유도제로 이용할 수 있는 단백질 발현 유도 시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 중금속을 높은 민감도로 검출할 수 있는 중금속 검출용 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 중금속 감지용 재조합 미생물을 이용한 카드뮴의 검출 및 정량방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 단백질의 유전자가 클로닝되는 다중 클로닝 자리(Multiple Cloning Site, MCS), 및 상기 제2 프로모터 및 상기 다중 클로닝 자리의 사이에 개재되고, 상기 CadC 단백질이 결합하여 상기 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 발현이 저해되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 단백질을 코딩하는 리포터 유전자, 및 상기 제1 프로모터 및 상기 리포터 유전자의 사이에 개재되고, 상기 CadC 단백질이 결합하여 상기 제2 프로모터에 의한 리포터 단백질의 발현이 저해되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;가 숙주세포 내에 형질전환되어 있는 중금속 검출용 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 중금속 검출용 재조합 미생물을 카드뮴 함유 의심 샘플을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 카드뮴의 검출 또는 정량방법을 제공한다.
본 발명에 따른 cadC 유전자를 이용하면, 비용이 저렴한 중금속을 발현 유도제로 이용할 수 있어서 경제성이 높은 유전자 발현 유도 시스템을 구현할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 민감도로 중금속을 검출할 수 있는 바이오센서를 개발할 수 있다.
도 1은 재조합 벡터 pCadC538(cadC538-egfp), pCadC551(cadC551-egfp), pCadC595(cadC595-egfp), pCadC640(cadC640 - egfp), pCadC1945(cadC1945-egfp), 및 pCadC4657(cadC4657-egfp)의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 재조합 벡터 pCadC538(cadC538-egfp), pCadC551 (cadC551-egfp), pCadC595(cadC595-egfp), pCadC640(cadC640-egfp) pCadC1945(cadC1945-egfp), 및 pCadC4657(cadC4657-egfp)을 형질전환시킨 형질전환체의 중금속(비소, 카드뮴, 납, 아연)의 농도에 따른 형광량을 나타낸 결과이다.
도 3은 ΔlacI와 galM-KmR-cadC640 - T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK760 균주, ΔlacI와 galM-KmR-cadC1945 - T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK744 균주, 및 ΔlacI와 galM-KmR-cadC4657 - T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK739 균주의 염색체에 상동재조합된 제1 유전자 컨스트럭트의 구조를 도시한 것이다.
도 4는 제2 유전자 컨스트럭트가 클로닝된 재조합 벡터 pET21a(PT7-cadO1945-egfp), pET21a(cadO640-egfp&Phce-cadC640) 및 2-플라스미드 시스템인 재조합 벡터 pET21a(PT7-cadO4657-egfp)와 pACYC184(Phce-cadC4657)의 2-플라스미드 시스템구조를 도시한 것이다.
도 5는 도 4에 개시된 제2 유전자 컨스트럭트가 클로닝된 재조합 벡터들을 도 3의 제1 유전자 컨스트럭트가 염색체 상에 상동재조합되어 있는 HK744 균주, HK760 균주 및 HK739 균주에 형질전환시켜 구현한 바이오센서 내의 구조를 도시한 것이다.
도 6은 T7 RNA 중합효소/T7 프로모터 시스템을 도입하기 전과, 2-플라스미드 시스템의 재조합 벡터인 pET21a(PT7-cadO4657-egfp)와 pACYC184(Phce-cadC4657)을 HK739에 형질전환하여 유전자 발현 과정에 T7 RNA 중합효소/T7 프로모터 시스템을 도입한 후의 EGFP 단백질의 발현 효율을 비교한 그래프이다.
도 7은 HK744(PT7-cadO1945-egfp) 형질전환체와 HK760(cadO640-egfp&Phce-cadC640)의 형질전환체의 납과 카드뮴의 농도에 따른 형광량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 HK744(PT7-cadO1945-egfp)의 형질전환체의 납 농도에 따른 EGFP의 발현과 pET21a-egfp/BL21(DE3) 형질전환체에서 IPTG 농도에 따른 EGFP의 발현을 서로 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 중금속에 의해 목적 단백질의 발현이 조절되는 발현 벡터
본 발명의 일 측면은 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 단백질의 유전자가 클로닝되는 다중 클로닝 자리(Multiple Cloning Site, MCS), 및 상기 제2 프로모터 및 상기 다중 클로닝 자리의 사이에 개재되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터는 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트를 포함한다.
상기 제1 프로모터는 CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자의 발현을 조절하는 것으로서, 그 다운스트림에 존재하는 cadC 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것이라면 임의의 공지된 모든 종류의 프로모터가 이용될 수 있고, 특히 바실러스 오세아니씨디미니스 2691에서 유래한 cadC 유전자의 프로모터가 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 cadC 유전자는 전사조절인자인 CadC 단백질을 코딩하는 유전자로서, 상기 CadC 단백질은 중금속이 존재하지 않는 환경에서 그에 대한 오퍼레이터인 cadO에 결합되어 cadO의 다운스트림에 위치한 목적 유전자의 전사를 억제하는 역할을 하는 반면, 중금속이 존재하는 환경에서는 상기 CadC 단백질이 중금속과 결합하여 cadO로부터 분리됨으로써 cadO의 다운스트림에 위치한 목적 유전자의 전사를 활성화시키는 역할을 한다.
상기 CadC 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 CadC538, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CadC551, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CadC595, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CadC640, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 CadC1945 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CadC4657의 6가지 종류가 있으나, 상기와 같은 6가지 종류의 CadC 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들이 이용될 수 있다. 상기 CadC 단백질의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명의 CadC 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 전사조절인자 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 발현 벡터는 제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 단백질의 유전자가 클로닝되는 다중 클로닝 자리, 및 상기 제2 프로모터 및 상기 다중 클로닝 자리의 사이에 개재되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트를 포함한다.
상기 제2 프로모터는 그 다운스트림에 존재하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 것으로서, 그 다운스트림에 존재하는 목적 단백질의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것이라면 임의의 공지된 모든 종류의 프로모터가 이용될 수 있다.
상기 다중 클로닝 자리(Multiple Cloning Site, MCS)는 본 발명의 발현 벡터를 통해 과발현시키고자 하는 목적 단백질이 삽입되는 자리로서, 많은 제한 효소 부위를 함유하는 부분이며, 클로닝 또는 서브클로닝을 포함하는 과정 동안 일반적으로 사용될 수 있다. 클로닝 자리 내의 제한 효소 부위는 목적에 따라 다양하게 구성할 수 있고, 이러한 제한 효소 부위의 유연성으로 인해 다양한 응용에 대한 목적 유전자의 클로닝이 가능할 수 있다.
상기 제2 유전자 컨스트럭트에서는 상기 제2 프로모터와 상기 다중 클로닝 자리 사이에 오퍼레이터 cadO가 개재된다. 상기 cadO는 전자조절인자인 CadC 단백질이 결합되는 자리로서, 상기 제2 프로모터와 상기 다중 클로닝 자리 사이에 개재된 상기 cadO에 CadC 단백질이 결합되어 있으면 상기 제2 프로모터에 결합된 RNA 중합효소가 상기 CadC 단백질에 막혀 그 다운스트림에 존재하는 목적 단백질의 유전자를 전사할 수 없게 된다. 반면, 상기 설명한 바와 같이 CadC 단백질은 중금속이 존재하는 환경에서 중금속과 결합하여 상기 cadO로부터 분리되는데, 이때 비로소 CadC 단백질에 의해 막혀 있던 다운스트림의 목적 단백질의 유전자가 전사될 수 있다. 상기 cadO의 경우, 상기 6 종류의 CadC 단백질이 특이적으로 결합될 수 있는 것들이 정해져 있는데, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 CadC538은 서열번호 69의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CadC551은 서열번호 70의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CadC595는 서열번호 71의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CadC640은 서열번호 72의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 CadC1945는 서열번호 73의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CadC4657은 서열번호 74의 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 cadO와 각각 특이적으로 결합한다. 상기 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 CadC 단백질과 결합할 수 있는 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 cadO는 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트 및 제2 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터의 경우, 제1 유전자 컨스트럭트의 제1 프로모터에 의해 CadC 단백질이 발현되고, 이렇게 발현된 CadC 단백질은 제2 유전자 컨스트럭트의 cadO에 결합되어 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 발현을 억제한다. 이런 상황에서 중금속이 처리되면, 상기 cadO에 결합되어 있던 CadC 단백질이 중금속과 결합되면서 상기 cadO로부터 분리되고, 그 결과 비로소 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 전사 및 발현이 개시된다. 그리고 상기와 같이 처리되는 중금속의 농도가 증가할수록, cadO로부터의 CadC 단백질의 분리 및 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 전사 및 발현도 함께 증가된다.
상기와 같은 cadO로부터의 CadC 단백질의 분리 및 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 전사 및 발현에 관한 효율 및 민감도를 더욱 향상시키기 위하여, 본 발명의 발현 벡터에는 T7 RNA 중합효소/T7 프로모터 시스템(이하, 'T7 시스템'으로 기재함)이 도입될 수 있다.
먼저, 상기 제1 유전자 컨스트럭트는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 T7RNAP 유전자를 더 포함할 수 있고, 이 때 상기 제2 유전자 컨스트럭트의 제2 프로모터는 T7 프로모터일 수 있으나, 상기와 같은 T7 시스템 이외에도 목적 단백질의 발현을 증가시키기 위해서 특이성이 우수한 다른 RNA 중합효소/프로모터 시스템이 적용될 수 있다.
상기와 같이 제1 유전자 컨스트럭트에 T7 RNA 중합효소가 포함되는 경우, 상기 제1 유전자 컨스트럭트에는 상기 cadC 유전자와 상기 T7RNAP 유전자 사이에 리보솜 결합 부위(Ribosome binding site, RBS)을 더 포함할 수 있고, 임의의 공지된 모든 종류의 RBS가 이용될 수 있다.
또한, 상기 제1 유전자 컨스트럭트도, 상기 제1 프로모터와 상기 cadC 유전자 또는 T7RNAP 유전자 사이에 cadO를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 프로모터와 상기 cadC 유전자 또는 T7RNAP 유전자 사이에 cadO가 존재하는 경우, 제1 유전자 컨스트럭트에 의한 CadC 단백질 또는 T7 RNA 중합효소의 발현 또한 중금속의 존재에 영향을 받게 된다. 따라서 상기와 같이 제1 유전자 컨스트럭트에도 cadO가 존재하는 경우에는 중금속이 존재하지 않는 환경에서는 1차적으로 제2 유전자 컨스트럭트에서 cadO가 CadC 단백질에 의해 막힘으로 인해 목적 단백질이 발현되지 못함과 더불어, 2차적으로 제1 유전자 컨스트럭트 내의 cadO도 CadC 단백질에 의해 막힘으로 인해 상기 제2 유전자 컨스트럭트에서 목적 단백질을 전사시키는 T7 RNA 중합효소도 발현되지 못하게 되어, 상기 목적 단백질의 발현이 더욱더 완벽하게 억제될 수 있다. 반면, 중금속이 존재하는 환경에서는 제1 유전자 컨스트럭트에 의한 T7 RNA 중합효소의 발현도 가능해지고, 이렇게 발현된 T7 RNA 중합효소가 제2 유전자 컨스트럭트에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있게 되므로, 상기와 같은 T7 시스템의 도입으로 인해 본 발명의 발현 벡터는 목적 단백질의 발현을 더욱 더 높은 효율 또는 민감도로 조절할 수 있게 된다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트에서는 제1 프로모터, cadO, cadC 유전자 및 T7RNAP 유전자가 순차적으로 구비될 수 있고, 이 중 상기 제1 프로모터, cadO 오퍼레이터 및 cadC 유전자는 서열번호 7 내지 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 염기서열 또는 그와 실질적으로 동일한 염기서열일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 중금속은 카드뮴 또는 납일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 특히, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 CadC538, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 CadC551 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 CadC1945는 납에 특이적인 반응성을 나타내고, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 CadC640 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 CadC4657는 카드뮴에 특이적인 반응성을 나타내며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 CadC595는 납과 카드뮴 모두에 특이적인 반응성을 나타낸다.
또한, 상기 제2 유전자 컨스트럭트에는 발현된 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 추가적으로 포함될 수 있다. 상기 분리정제용 태그로는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 또는 c-myc 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 적당한 숙주세포로 형질전환되어, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 특히, 본 발명에서는 플라스미드 벡터가 이용될 수 있는데, 상기 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선택 마커 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
2. 중금속 검출용 형질전환체
본 발명의 다른 측면은 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및 제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 단백질을 코딩하는 리포터 유전자, 및 상기 제1 프로모터 및 상기 리포터 유전자의 사이에 개재되는 오퍼레이트 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;가 숙주세포 내에 형질전환된 중금속 검출용 형질전환체를 제공한다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 T7RNAP 유전자를 더 포함할 수 있고, 상기 제1 유전자 컨스트럭트은 제1 프로모터와 cadC 유전자 또는 T7RNAP 유전자 사이에 cadO를 더 포함할 수 있으며, 상기 제2 유전자 컨스트럭트의 제2 프로모터는 T7 프로모터일 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
상기 '제1 유전자 컨스트럭트' 및 '제2 유전자 컨스트럭트'를 구성하는 모든 구성에 대해서는 상기 '1. 중금속에 의해 목적 단백질의 발현이 조절되는 발현 벡터 '에서 기재한 바와 동일하므로 해당 관련 설명을 원용하고, 본 항목에서는 중금속 검출용 형질전환체에 특이적인 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
상기 리포터 유전자는 형광유전자 또는 항생제 내성 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 아니하며, 본 기술 분야에 공지된 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 유전자는 (1) 형광 단백질(예를 들어, GFP)를 코딩하는 유전자; (2) 유색 단백질을 코딩하는 유전자; (3) 색깔-촉진 또는 유도 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (4) 항생제 내성 유전자;로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 (3)에 해당하는 리포터 유전자는, 예를 들어 루미나제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다. 알칼리성 포스파타제는 BCIP를 가수분해하여 청색을 생성하고, PNPP를 가수분해하여 황색을 생성한다. 베타-갈락토시다제는 X-gal을 가수분해하여 청색 유도체를 생성하고, ONPG를 가수분해하여 황색을 생성한다. 형광 기질도 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제에 대해 사용될 수 있다. 상기 (4)에 해당하는 항생제 내성 유전자는 테트라사이클린 및 카나마이신 내성 유전자로부터 선택될 수 있다.
상기 숙주세포는 미생물, 예를 들면 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다. 아울러, 포도상구균(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida ), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli BL21(DE3) 또는 E.coli DH5α일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 상태로 존재하고, 상기 제2 유전자 컨스트럭트는 재조합 발현 벡터에 포함된 채로 상기 숙주세포 내에 형질전환된 상태로 존재할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 숙주세포에는 제3 프로모터 및 상기 제3 프로모터에 의해 발현이 조절되는 CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트;가 재조합 발현 백터에 포함된 채로 상기 숙주세포 내에 추가적으로 형질전환된 상태로 존재할 수 있고, 이 경우 상기 상기 제3 유전자 컨스트럭트는 상기 제2 유전자 컨스트럭트와 별개의 재조합 발현 벡터에 나뉘어져서 포함되어 있을 수도 있고, 상기 제2 유전자 컨스트럭트와 동일한 재조합 발현 벡터 내에 포함되어 있을 수 있다.
또한, 상기 제3 프로모터는 항시 발현 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중금속 검출용 재조합 미생물을 중금속 함유 의심 샘플과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 중금속의 검출 또는 정량방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 중금속을 발현 유도제로 하는 단백질 고발현 형질전환체를 중금속이 함유된 용액과 접촉시켜 목적 단백질을 얻는 단백질 고발현 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 단백질 고발현 방법을 이용하면, 저렴한 중금속을 이용함에도 불구하고 상업적으로 판매되는 IPTG와 비슷하거나 그보다 더욱 우수한 발현 효율을 달성할 수 있다(도 8).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 및 실험예 ]
[ 실시예 ]
각 종 중금속에 대한 CadC 단백질의 반응성 확인
[1-1] PcadC-cadO-cadC 유전자 컨스트럭트의 제작
NCBI에 개제된 B. oceanisediminis 2691의 게놈 정보(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ALEG00000000)로부터, 아래 표 1에 기재된 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 6개의 CadC 단백질(cadC1945, cadC4657, cadC538, cadC551, cadC595 및 cadC640)을 확인하였고, 상기 B. oceanisediminis 2691의 게놈에서 상기 6개의 CadC 단백질을 코딩하는 유전자(cadC1945, cadC4657, cadC538, cadC551, cadC595 및 cadC640)와 그 업스트림에서 이들 유전자의 발현을 조절하는 프로모터(PcadC) 및 오퍼레이터(cadO)의 염기서열을 포함하는, 표 2와 같은 유전자 컨스트럭트(PcadC-cadO-cadC 유전자 컨스트럭트)들을 도출하였다.
상기와 같이 도출된 유전자 컨스트럭트의 염기서열을 기초로 각각의 유전자들에 대한 프라이머 쌍들을 표 3과 같이 제조하였고, 이를 이용하여 B. oceanisediminis 2691의 전체 게놈으로부터 표 2의 유전자 컨스트럭트(PcadC-cadO-cadC 유전자 컨스트럭트)를 증폭 및 제작하였다.
단백질 명(서열번호) 아미노산 서열 길이(aa) pI258 CadC 대비서열 상동성(%)
CadC538(서열번호 1) MQNDACEVTCIDEEKVNRGKNELLQQNPLEVAKVFKALSDDTRIKIAYALSLEDELCVCDVANIVGATTATTSHHLRLLKNLGLAKYRKEGKLVYYSLDDDHVKQLIQVAFAHQKEVVKIV 121 49.38
CadC551(서열번호 2) MSLVDKNMKDTLKDECEIYCYDPVKVSKLQDLLSSKSTLHLSKKFKLLADETRLKIILSLAIEGELCVCDVANIIHSSIATASYHLRFLKKSGVANYRKEGKLAFYYIDDEIFKSMVLLSFHHKEP 126 43.54
CadC595(서열번호 3) MSDKVLNKSSQDTCETFCYDEEKVSRVSGRIDEIMGVEQLFKALSDSTRIKIAYALTLEEELCVCDVANIIGSSTATASHHLRLLRKMGLAKYRKEGKMVFYSLSDEHVHQLVSIALIHSKEGEGDGESTGK 132 51.96
CadC640(서열번호 4) MKQDDVCEVTCVDEEKVRRVKESVKQQNTLAVSQIFKALSDDTRVKITFSLYEEEGLCVCDVANIVGCTTATASHHLRLLRNMGLAKYRKEGKLVFYSLDDDHVRQLIQIAFAHQKEVENYE 122 52.45
CadC1945(서열번호 5) MSKKDTCDIYCYDEAKVKRIQGEMQKEDISSVSQLFKALADENRAKISYALCQDDELCVCDVANIIGATVATTSHHLRTLHKQGIVKYRKEGKLAFYSLDDEHIRQLMVIALTHKKEMKVNV 122 74.28
CadC4657(서열번호 6) MKHEDVCEVTCVDEEKVRRVKESASHHNTSAVAQIFKALSDETRVKIAFSLCEEEELCVCDVANIVGCTTATASHHLRLLRNMGLAKYRKEGKLVFYSLDDDHVKQLIQIAFTHQKEVAHYE 122 52.45
서열 상동성(%)의 계산 = (Matches x 100)/Length of aligned region (with gaps)
유전자 명(서열번호) 염기서열(볼드체: 개시 코돈 및 종결 코돈)
길이(bp)
cadC538(서열번호 7) aaaactggcacccttacactattcctagtgtatccaacatagaaaggaaattaaatttagttataagaataattaattactgcaaactaaagaaaacctgctttttatgggaattatattcaaacgtatatttgactatttgtttttgttcacatataataatattcaaatgaatatttgattgatctgaggtgaaaaatttgcaaaatgatgcatgtgaagttacgtgtatagatgaagaaaaagtcaatagaggtaaaaatgaactactccaacaaaatcctttggaagtagccaaagtttttaaagctttatcggatgatactaggattaagattgcgtatgctctttctttggaagatgaattgtgtgtatgtgatgtagcaaatattgttggtgctacaactgccacaacatctcatcatttgaggttacttaaaaatcttggattagctaaatatcgaaaagaaggtaagttagtttactattcattagatgatgatcatgtaaagcaactaatacaggttgcatttgcacatcaaaaggaggttgtaaaaattgtctga
566
cadC551(서열번호 8) taagttatgattttttggttattctcacgcgtttttgttaagagccgatataaagtaacacgtgaatcagatatacttacgtcttcagacataagagaatatgaaacacttcgcttctttattcaagtaaatatttgaatgttgacatgaaagcttactcattataagctaatcacatattttttaatgaggtgggagaattgtctttagttgataaaaatatgaaagatactctaaaagatgaatgtgaaatctattgttatgaccctgtaaaagtatcaaagttacaagatttgttaagttctaaaagtacacttcatctatcaaaaaaatttaaacttcttgctgatgagacaagattaaaaattattctttcattagctatagaaggggaactttgcgtttgtgatgtcgctaatattattcattcctcaatagctacagcttcttatcatttacggtttttaaaaaaatcaggtgtagctaattatagaaaggaaggtaaattagcattttactatatcgatgatgaaattttcaagtcgatggtattactctcttttcatcataaggagccttga
581
cadC595(서열번호 9) acgataaaaagtataaaggtaattaagaatagctttttaatcataagaaacctcctaatagtattaacgaactttattttaacagagtaaatataattattcaaaagtacatttgaataaatttttgacaaatttgttaaatcagcatagactaacgatataacatattcaaacaaatatttgaataaagggtgacaaatatgagtgataaagtattgaacaaatcttcccaagatacatgtgagacgttttgctacgatgaagaaaaggttagccgagtaagcgggcggatagatgagataatgggagtagagcaactgtttaaggcgctatccgattcaacaagaataaagattgcatacgcacttacacttgaagaagaattgtgtgtatgtgatgtggctaatattatcggatccagtactgccaccgcttcccaccatttgcgtttactgcgtaaaatgggcttggctaaatatcggaaagagggaaagatggtattttactctttatcagatgagcacgtccatcaactagtttctattgctttaatacactcaaaggaaggtgaaggagatggggaaagcactggcaagtag
599
cadC640(서열번호 10) cttattttctgacattgttttacctcctcttaaaaagtttccttaatccaaaaatattagtacttgccaataatttatgacaaggacaacctttttgtcaacaaacattttacgaaaacattcaaataattatttgaccaaataaaaggaattacatatactaataatcaaatgattgtttgagtatggaggggtttaatttgaaacaagatgatgtttgtgaagttacctgtgtggatgaagagaaagtaaggcgtgttaaggaatcggtaaaacagcagaataccttggctgtttctcaaatatttaaagcattatctgatgacactagagtaaagattactttttccctatatgaagaagaggggttatgtgtctgtgatgttgcgaatatcgtcggatgtacgacagcaaccgcatcacaccatttgcgtttgttacgcaatatgggactagcgaaatatcgaaaggaaggaaaactagttttttattcgctggatgatgatcatgtcagacagcttatccaaatcgcatttgcacatcaaaaggaggtggagaactatga
565
cadC1945(서열번호 11) acttctttgataaatctattcaaataatgtaacagttttgatcgttatgatcatttgctaatataagtaggtttggatatggaatttattgagttatttaattttttatccattattcaaataatcatttgaataatgttagggtaataatatataatatattcaaacatacacttgaataaaaggagggataatgagtaatgagtaagaaagatacttgtgatatttattgttatgacgaagcaaaagtcaaacgaatacaaggtgagatgcaaaaagaagatatatctagtgtttcccaattatttaaagcacttgcagatgaaaatagggcaaaaatttcctatgcattatgtcaagatgatgaactttgtgtgtgtgatgtagctaatatcattggggctactgttgcaacgacatctcaccatttaaggacccttcataaacaagggattgtaaaataccgaaaagaaggcaaactagccttttattcgcttgatgatgaacatattagacagttaatggttattgcattaactcataaaaaggagatgaaagtcaatgtctga
569
cadC4657(서열번호 12) aatttaagatagaataaagcaaataataattttcagttaatggttcatccttcaatttggatgaaccatttgtgctgttggatactcattttcttatgacataaaaatatcttcctaataatcaaatgaatgtttgactgtttggtaatagatgcatatactaataatcaaataatcgtttgattaaggaggtggcttccttgaagcatgaagatgtttgtgaagtaacctgcgtagatgaagaaaaagtaagacgtgttaaagaatctgcctcacaccacaatacctctgctgttgcccaaatatttaaagcattatctgatgaaactagggttaagattgccttttccctatgtgaggaagaagaactgtgcgtctgtgatgtagccaatattgtggggtgcacaacggctacggcttctcaccatttacggcttcttcggaatatgggattggcgaagtatcgtaaggagggcaaattggtcttttattcactggatgatgatcatgtcaaacagctgattcaaattgcctttacacatcaaaaggaggtggcgcactatgagtga
569
서열번호 프라이머 이름 프라이머 염기서열 (5'→3')
13 Cad538F gaaaactggcacccttacactattcctagt
14 538_OF ttgtaaaaattgtctgaggagatatacatatggtg
15 538_OR tatgtatatctcctcagacaatttttacaacctcc
16 Cad551F gtaagttatgattttttggttattctcacg
17 551_OF catcataaggagccttgaggagatatacatatggt
18 551_OR atgtatatctcctcaaggctccttatgatgaaaag
19 Cad595F gacgataaaaagtataaaggtaattaagaa
20 595_OF gaaagcactggcaagtagaggagatatacatatgg
21 595_OR tgtatatctcctctacttgccagtgctttccccat
22 Cad640F gcttattttctgacattgttttacctcctc
23 640_OF tggagaactatgaatgaggagatatacatatggtg
24 640_OR tatgtatatctcctcattcatagttctccacctcc
25 Cad1945F gacttctttgataaatctattcaaataatg
26 1945_OF tgaaagtcaatgtctgaggagatatacatatggtg
27 1945_OR tatgtatatctcctcagacattgactttcatctcc
28 Cad4657F gaatttaagatagaataaagcaaataataa
29 4657_OF tggcgcactatgagtgaggagatatacatatggtg
30 4657_OR tatgtatatctcctcactcatagtgcgccacctcc
31 rbs_eGFPR gttacttgtacagcttgtccatgccg
32 galM_F gagccagcccttgccagtcggcgtaagg
33 galMKmR_OF gcaccgtcgcgccgaggaattctgtaggctgg
34 galMKmR_OR gcagctccagcctacagaattcctcggcgcgacg
35 Km640OR ggaggtaaaacaattccggggatccgtcgac
36 Km640OF gatccccggaattgttttacctcctcttaaaaag
37 T7_640OR tagtaaatccggatcattcatagttctccacctc
38 T7_640OF ctatgaatgatccggatttactaactggaag
39 Km1945OR tatcaaagaagtattccggggatccgtcgac
40 Km1945OF gatccccggaatacttctttgataaatctattc
41 T7_1945OR gttagtaaatccggatcagacattgactttc
42 T7_1945OF caatgtctgatccggatttactaactggaag
43 K4657OF gatccccggaatataaaaatatcttcctaataatc
44 K4657OR ggaagatatttttatattccggggatccgtcgac
45 T74657tga_OR atccggatcactcatagtgcgccacctccttttg
46 T74657tga_OF tggcgcactatgagtgatccggatttactaactg
47 T7R2 agaccacgcctcgccaccgagtagaccc
48 gpmA_F cgccatgacgaaccagaaccagcttag
49 egfp_XhoI_R tggtgctcgagttacttgtacagcttgtccatgc
50 egfp_NdeI_F agaaggagatatacatatggtgagcaagggcgag
51 T7-For-BamHI gatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggatcccgggt
52 T7-Rev-BamHI ctagacccgggatcctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcga
53 del_lacI_F cccttacacggaggcatcagtgacc (5'-phosphorylated)
54 del_lacI_R ccctgcattaggaagcagcccagtag (5'-phosphorylated)
55 CadO640-F gatccaataatcaaatgattgtttgagtatgt
56 CadO640-R ctagacatactcaaacaatcatttgattattg
57 CadO1945-F gatcctatattcaaacatacacttgaataaat
58 CadO1945-R ctagatttattcaagtgtatgtttgaatatag
59 CadO4657-F gatccaataatcaaataatcgtttgattaagt
60 CadO4657-R ctagacttaatcaaacgattatttgattattg
61 hceF_HindIII ggaagcttcatgaccccatctggaatcgcc
62 hceOR atcttcatgcttcaatgatatctcctttttccag
63 4657OF aaaaggagatatcattgaagcatgaagatgtttg
64 4657R_BamHI ccggatccacttgcatcagaaacaccatcc
65 hce_F gggcccgatctctccttcacagattcccaatc
66 hce640_OR cccctccattgatatctcctttttccagaag
67 hce640_OF ggagatatcaatggaggggtttaatttg
68 640R gggcccttcatagttctccacctccttttg
[1-2] PcadC-cadO-cadC-egfp 유전자 컨스트럭트의 형질전환체 제작
T7 리보솜 결합 부위(T7 ribosome binding site)를 포함한 프라이머 쌍(cadC538에 대해서는 서열번호 14 및 31의 프라이머 쌍; cadC551에 대해서는 서열번호 17 및 31의 프라이머 쌍; cadC595에 대해서는 서열번호 20 및 31의 프라이머 쌍; cadC640에 대해서는 서열번호 23 및 31의 프라이머 쌍; cadC1945에 대해서는 서열번호 26 및 31의 프라이머 쌍; cadC4657에 대해서는 서열번호 29 및 31의 프라이머 쌍)을 이용하여 형광유전자인 egfp 유전자를 PCR로 증폭하여 두 개의 DNA 단편을 얻고, 이를 주형으로 하여 overlap PCR을 수행하여 상기 실시예 1-1에서 제작한 PcadC-cadO-cadC 유전자 컨스트럭트와 egfp 유전자가 융합된, 6개의 PcadC-cadO-cadC-egfp 유전자 컨스트럭트를 각각 제작하였다.
상기와 같이 제작된 6개의 PcadC-cadO-cadC-egfp 유전자 컨스트럭트들 중, PcadC-cadO-cadC538-egfp 유전자 컨스트럭트, PcadC-cadO-cadC511-egfp 유전자 컨스트럭트, PcadC-cadO-cadC595-egfp 유전자 컨스트럭트, PcadC-cadO-cadC1945-egfp 유전자 컨스트럭트 및 PcadC-cadO-cadC4657-egfp 유전자 컨스트럭트는 Tblunt™ vector(Solgent, Korea)에 접합(ligation)으로 삽입하여 재조합 벡터 pCadC538(cadC538-egfp), pCadC551(cadC551-egfp), pCadC595(cadC595-egfp), pCadC1945(cadC1945-egfp), pCadC4657(cadC4657-egfp)를 제작하였고, PcadC-cadO-cadC640-egfp 유전자 컨스트럭트는 JET1.2 vector(Thermo Fischer Scientific, USA)에 접합(ligation)으로 삽입하여 재조합 벡터 pCadC640(cadC640-egfp)를 제작하였다(도 1).
상기와 같이 제작된 6개의 재조합 벡터를 E. coli DH5α 균주에 형질전환시켜 PcadC-cadO-cadC-egfp 유전자 컨스트럭트의 형질전환체를 제작하였다.
[1-3] 각 종 중금속에 대한 CadC 단백질의 반응성 확인
상기 실시예 1-2에서 제작된 6개의 형질전환체의 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 180rpm으로 12시간동안 진탕배양하여 전배양액으로 이용하였다. 상기 배양액을 250㎖ 삼각 플라스크에 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 50㎖의 LB 액체 배지에 1%(v/v)의 농도로 접종하여 37℃, 180rpm으로 배양하면서 대수증가기(OD600㎚=0.4~0.6)가 될 때 14㎖ round bottom tube에 4㎖ 씩 분주하고, 염화비소(Sodium meta- arsenate(III), NaAsO2), 염화카드뮴(Cadmium chloride, CaCl2), 염화코발트(Cobalt(II) chloride, CoCl2), 크로뮴산칼륨(Potassium chromate, K2CrO4), 염화납(Lead(II) chloride, PbCl2), 염화아연(Zinc(II) chloride, ZnCl2)을 최종농도가 각각 0, 1μM, 5μM, 10μM, 25μM, 50μM 농도가 되도록 첨가한 후, 37℃, 180 rpm에서 진탕배양였다.
상기 배양액 중 200㎕를 취하여 96 well black, clear bottom plate(Greiner, Austria) 에 옮긴 후, 형광 플레이트더기(Infinite 2000, Tecan, Austria)에서, 흡광필터를 이용하여 595㎚에서의 흡광도를 1차로 측정하고, 4시간 후 다시 200㎕의 배양액을 취하여 동일 필터로 흡광도를 측정함으로써, 흡광도 변화량을 분석하였다. 마찬가지로, 상기 배양액 중 200㎕를 취하여 96 well black, clear bottom plate(Greiner, Austria) 에 옮긴 후, 형광 플레이트더기(Infinite 2000, Tecan, Austria)에서, 형광필터를 이용하여 Ex485㎚, Em535nm에서의 형광량을 측정하고, 4시간 후 다시 200㎕의 배양액을 취하여 동일 필터로 형광량을 측정함으로써, 형광 변화량을 분석하였다. 그리고 상기와 같이 측정된 형광 변화량(형광 증가량)을 흡광도 변화량(흡광도 증가량)으로 나누어 specific fluorescence change (ΔF/ΔA) 값을 구하여 각 중금속에 대한 농도별 반응성을 산출함으로써, 중금속 비소(As3 +), 카드뮴(Cd2 +), 코발트(Co2 +), 크롬(Cr6 +), 납(Pb2 +), 아연(Zn2 +)에 대한 CadC 단백질의 반응성을 분석하였다.
각 형질전환체의 각 중금속 농도에 따른 specific fluorescence change 값을 도 2에 나타내었고, 각 CadC 단백질은 각 중금속에 대하여 서로 다른 반응성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 2). 특히, CadC538, CadC551, CadC1945는 납에 특이적인 반응성을 보이는 것으로 나타났고, CadC640, pCadC4657은 카드뮴에 특이적인 반응성을 나타내는 것으로 나타났으며, CadC595는 납 및 카드뮴에 비슷한 반응성을 나타내는 것으로 나타났다.
이들 중 카드뮴에 특이적인 반응성을 나타내는 CadC640 단백질은 카드뮴에 대한 최소 감지 농도가 약 10-20μM 수준이며, 농도에 따라 specific fluorescence change 값이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 납에 특이적인 반응성을 나타내는 CadC1945 단백질은 납에 대한 최소 감지 농도가 역시 약 10-20μM 수준이며, 농도에 따라 specific fluorescence change 값이 증가하는 것으로 확인되었다(도 2).
[ 실시예 2]
민감성이 향상된 중금속 검출용 형질전환체의 구현
[2-1] T7 RNA 중합효소를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트의 제작
B. oceanesediminis 2691의 유전체로부터, 서열번호 36 및 37의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 10의 PcadC-cadO-cadC640 유전자 컨스트럭트를, 서열번호 40 및 41의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 11의 PcadC-cadO-cadC1945 유전자 컨스트럭트를, 그리고 서열번호 44 및 45의 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 12의 PcadC-cadO-cadC4657 유전자 컨스트럭트를 각각 PCR로 증폭하였다. 그리고 PcadC-cadO-cadC640 유전자 컨스트럭트에 대해서는 서열번호 33 및 35의 프라이머 쌍을, PcadC-cadO-cadC1945 유전자 컨스트럭트에 대해서는 서열번호 33 및 39의 프라이머 쌍을, 그리고 PcadC-cadO-cadC4657 유전자 컨스트럭트에 대해서는 서열번호 33 및 43의 프라이머 쌍을 각각 이용하여 PCR로 항생제 마커인 카나마이신 유전자를 증폭하였다. 그런 다음, 각각의 PcadC-cadO-cadC 유전자 컨스트럭트들에 대하여, 상기와 같이 수득된 두 개의 DNA 단편을 주형으로 overlap PCR을 수행하여 KmR-cadC640, KmR-cadC1945 및 KmR-cadC4657의 유전자 카셋트를 제작하였다.
[2-2] 제1 유전자 컨스트럭트가 염색체 상에 도입된 형질전환체의 제작
E. coli BL21(DE3)의 T7 RNA 중합효소의 업스트림에 있는 galM 유전자 부분 중 약 1000bp를 서열번호 32 및 34의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하고, 상기 PCR 산물을 상기 실시예 2-1에서 제작된 각각의 유전자 카셋트들(KmR-cadC640, KmR-cadC1945 및 KmR-cadC4657)과 overlap PCR하여 galM-KmR-cadC640, galM-KmR-cadC1945 및 galM-KmR-cadC4657 유전자 카셋트를 제작하였다.
그런 다음, E. coli BL21(DE3)의 T7 RNA 중합효소의 유전자 부분 중 약 800bp를 표 3에 기재된 프라이머 쌍(cadC640에 대해서는 서열번호 38 및 47의 프라이머 쌍; cadC1945에 대해서는 서열번호 42 및 47의 프라이머 쌍; cadC4657에 대해서는 서열번호 46 및 47의 프라이머 쌍)으로 PCR 증폭하여 얻은 PCR 산물(T7RNAPfragment)과 상기 galM-KmR-cadC640, galM-KmR-cadC1945 및 galM-KmR-cadC4657 유전자 카셋트를 서열번호 32 및 47의 프라이머 쌍으로 overlap PCR하여 BL21(DE3)의 유전체에 상동재조합(homologous recombination) 가능한 형태의 선형 galM-KmR-cadC640-T7RNAPfragment, galM-KmR-cadC1945-T7RNAPfragment 및 galM-KmR-cadC4657fragment 유전자 카셋트를 제작하였다.
한편, KEIO collection의 ΔlacI::KmR 균주를 배양하여 P1 파지에 접종하고, BL21(DE3) 균주를 수용 세포(recipient cell)로 하여 P1 파지의 세포용해물(lysate)을 P1 형질도입(P1-transduction)하여 ΔlacI 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 치환한 대장균 BL21(DE3) ΔlacI::KmR 균주를 제작하였고, 상기 대장균 BL21(DE3) ΔlacI::KmR 균주는 25㎍/㎖ 농도의 카나마이신이 첨가되어 있는 배지에서 우선적으로 선별하고, PCR을 통해 ΔlacI 유전자 부위가 카나마이신 저항성 유전자로 치환되었음을 확인하였다. 상기 대장균 BL21(DE3) ΔlacI::KmR 균주에 FRT플립파아제(FRT flippase)를 암호화하고 있는 플라스미드인 pCP20 플라스미드를 형질전환하여 카나마이신 저항성 유전자의 양 말단에 위치한 FRT 서열 사이의 상동재조합을 통해 카나마이신 저항성 유전자가 결실되어 카나마아신 민감성을 가진 BL21(DE3) ΔlacI 균주를 얻었다. 상기와 같이 제조된 BL21(DE3) ΔlacI 균주를 50㎍/㎖ 농도의 앰피실린이 첨가되어 있는 100㎖ LB 액체 배지에 접종하고 30℃, 180 rpm으로 배양하여, 대수성장기(OD600㎚=0.4~0.6)가 될 때 L-Arabinose를 최종농도 0.1M이 되도록 첨가한 다음 3시간 더 배양하였다. 상기 배양물을 50㎖ 코니칼 튜브에 옮긴 다음, 4℃, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 차가운 증류수로 2회 재현탁한 다음 최종적으로 차가운 50㎕의 증류수에 재현탁하여 전기천공용 컴피턴트 세포(competent cell)를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 컴피턴트 세포에, 10ng의 상기 제작된 선형 galM-KmR-cadC640-T7RNAPfragment, galM-KmR-cadC1945-T7RNAPfragment 및 galM-KmR-cadC4657fragment 유전자 카셋트를 첨가하여 형질전환시켜 상동재조합을 유도하고, 상기 형질전환체를 25㎍/㎖ 농도의 카나마이신이 첨가되어 있는 LB 고체 배지에 도말한 다음 생성된 콜로니를 선별하고, 상기 생성된 콜로니로부터 BL21(DE3) ΔlacI 균주의 chromosome에 특이적인 서열번호 48의 프라이머와 galM-KmR-cadC640-T7RNAPfragment, galM-KmR-cadC1945-T7RNAPfragment 및 galM-KmR-cadC4657-T7RNAPfragment 유전자 카셋트에 특이적인 프라이머(cadC640에 대해서는 서열번호 37의 프라이머; cadC1945에 대해서는 서열번호 41의 프라이머; cadC4657에 대해서는 서열번호 45의 프라이머)를 이용하여 PCR로 확인하여, ΔlacI와 galM-KmR-cadC4657-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK739 균주, ΔlacI와 galM-KmR-cadC640-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK760 균주, 및 ΔlacI와 galM-KmR-cadC1945-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK744 균주를 각각 제조하였다(도 3).
[2-3] 오퍼레이터 cadO 를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트의 제작
[2-3-1] CadC1945 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO 를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트의 제조
플라스미드 pGESS(E135K) (Choi SL et al., ACS synthetic biology 3:163-171, 2014)으로부터 NdeI과, XhoI 제한효소 인식서열을 포함하는 서열번호 49 및 50의 프라이머 쌍을 사용하여 egfp 유전자를 PCR로 증폭하고, 이를 NdeI, XhoI 제한효소로 반응시켜 정제한 다음, 이를 동일한 제한 효소로 반응시켜 절단한 pET21a(+) 벡터에 삽입하여 pET21a(egfp)를 제작하였다.
상기와 같이 제조된 pET21a(egfp)에서 lacO를 제거하고, 그 자리에 오퍼레이터 cadO가 삽입될 수 있는 제한효소 자리(T7 BamHI 올리고머 염기서열)를 삽입하였는데, 상기 lacO는 pET21a(egfp)를 BglII, XbaI 제한효소로 절단함으로써 제거하였고, 상기 T7 BamHI 올리고머 염기서열은 정방향 및 역방향이 상보적이도록 설계하여 합성된 47bp 길이의 서열번호 52 및 53의 T7 BamHI 올리고머 염기서열을 95℃에서 약 5분간 반응시킨 다음 상온에서 20분간 방치하여 이중 가닥으로 만든 다음, 상기 pET21a(egfp)의 lacO가 제거된 자리에 삽입하여 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)를 제조하였으며, 상기와 같은 T7 BamHI 올리고머 염기서열의 삽입 여부는 상기 pET21a(T7BamHIoligo-egfp)를 형질전환시킨 형질전환체로부터 수득한 재조합 벡터를 주형으로 PCR 반응을 수행함으로써 확인하였다.
상기와 같이 제조된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)에서 lacI 유전자를 제거하기 위하여, lacI 유전자 부위를 포함하지 않도록 상기 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)를 주형으로 하여 5' 말단이 인산화된 서열번호 53 및 54의 프라이머 쌍으로 PCR을 수행하고, 상기 PCR 산물의 말단을 서로 접합(ligation)함으로써, 최종적으로 pET21a(+) 벡터에서 lacI 유전자가 제거된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp - ΔlacI) 재조합 벡터를 제작하고 lacI 유전자의 제거 여부는 PCR 반응을 수행함으로써 확인하였다.
그런 다음, 상기 pET21a(T7BamHIoligo-egfp)의 T7 BamHI 올리고머 자리에 CadC1945 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO(cadO1945)를 삽입하였는데, 상기와 같이 제조된 pET21a(T7BamHIoligo-egfp-ΔlacI)를 BamHI, XbaI 제한효소로 절단하였고, 상기 cadO1945의 염기서열을 포함하면서 정방향 및 역방향이 상보적이도록 설계하여 합성된 32bp 길이의 서열번호 57 및 58의 올리고머 염기서열을 상기 T7 BamHI 올리고머와 동일한 방식으로 제조하여 이중 가닥으로 만든 다음, 상기 pET21a(T7BamHIoligo-egfp)의 절단된 자리에 삽입하여 pET21a(cadO1945-egfp)를 제조하였으며, 상기와 같은 cadO1945 올리고머 염기서열의 삽입 여부는 상기 pET21a(cadO1945-egfp)를 형질전환시킨 형질전환체로부터 수득한 재조합 벡터를 주형으로 PCR 반응을 수행함으로써 확인하여 최종적으로 pET21a(+) 벡터에서 lacI 유전자가 제거되고 lacO 대신 CadC1945 단백질에 대한 오퍼레이터인 cadO1945가 포함되며 egfp 유전자가 도입된 재조합 벡터 pET21a(PT7_cadO1945_egfp)를 제작하였다(도 5).
[2-3-2] CadC4657 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO를 포함하는, 2-플라스미드 시스템의 제2 유전자 컨스트럭트의 제조
상기 실시예 [2-3-1]에서 제조된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)의 T7 BamHI 올리고머 자리에 CadC4657 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO(cadO4657)를 삽입하였는데, 상기와 같이 제조된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)를 BamHI, XbaI 제한효소로 절단하였고, 상기 cadO4657의 염기서열을 포함하면서 정방향 및 역방향이 상보적이도록 설계하여 합성된 32bp 길이의 서열번호 59 및 60의 올리고머 염기서열을 상기 T7 BamHI 올리고머와 동일한 방식으로 제조하여 이중 가닥으로 만든 다음, 상기 pET21a(T7BamHIoligo-egfp)의 절단된 자리에 삽입하여 pET21a(cadO4657-egfp)를 제조하였으며, 상기와 같은 cadO4657 올리고머 염기서열의 삽입 여부는 상기 pET21a(cadO4657-egfp)를 형질전환시킨 형질전환체로부터 수득한 재조합 벡터를 주형으로 PCR 반응을 수행함으로써 확인하였다.
상기와 같이 제조된 pET21a(cad4657-egfp)에서 상기 실시예 [2-3-1]에서와 같은 방법으로 lacI 유전자를 제거하였고, 최종적으로 pET21a(+) 벡터에서 lacI 유전자가 제거되고 lacO 대신 CadC4657 단백질에 대한 오퍼레이터인 cadO4657이 포함되며 egfp 유전자가 도입된 재조합 벡터 pET21a(PT7_cadO4657_egfp)를 제작하였다(도 5).
나아가, pHCE 벡터(Poo, H.R. et al. 2002. Novel high-level constitutive expression system, pHCE vector, for a convenient and cost-effective soluble production of human tumor necrosis factor-α. Biotechology Letters 24:1185-1189)로부터 서열번호 61 및 62의 프라이머 쌍을 이용하여 항시 발현 프로모터인 HCE 프로모터(Phce)을 PCR로 증폭하였고, B. oceanisediminis 2691의 게놈 DNA로부터 서열번호 63 및 64의 프라이머 쌍을 이용하여 cadC4657 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 이 두 DNA 단편(Phce와 cadC4657 유전자)을 주형으로 하여 서열번호 61 및 64 프라이머 쌍으로 overlap PCR을 수행하여 Phce-cadC4657 유전자 컨스트럭트를 제작하였다. 상기 Phce-cadC4657 유전자 컨스트럭트를 BamH1, HindIII 제한효소로 반응시키고 정제한 다음, 동일 제한효소로 반응시켜 절단한 pACYC184 벡터(Catalog Number E4152S, New England Biolabs, Inc.)에 삽입하여 재조합 벡터 pACYC184(Phce-cadC4657)를 제작하였다(도 4).
[2-3-3] CadC640 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO 를 포함하는, 1-플라스미드 시스템의 제2 유전자 컨스트럭트의 제조
상기 실시예 [2-3-1]에서 제조된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp - ΔlacI)의 T7 BamHI 올리고머 자리에 CadC640 단백질에 대한 오퍼레이터 cadO(cadO640)를 삽입하였는데, 상기와 같이 제조된 pET21a(T7BamHIoligo - egfp)를 BamHI, XbaI 제한효소로 절단하였고, 상기 cadO640의 염기서열을 포함하면서 정방향 및 역방향이 상보적이도록 설계하여 합성된 32bp 길이의 서열번호 55 및 56의 올리고머 염기서열을 상기 T7 BamHI 올리고머와 동일한 방식으로 제조하여 이중 가닥으로 만든 다음, 상기 pET21a(T7BamHIoligo-egfp)의 절단된 자리에 삽입하여 pET21a(cadO640-egfp)를 제조하였으며, 상기와 같은 cadO640 올리고머 염기서열의 삽입 여부는 상기 pET21a(cadO640-egfp)를 형질전환시킨 형질전환체로부터 수득한 재조합 벡터를 주형으로 PCR 반응을 수행함으로써 확인하였다.
그런 다음, 상기 실시예 [2-3-2]에서 이용한 pHCE 벡터로부터 서열번호 65 및 66의 프라이머 쌍을 이용하여 항시 발현 프로모터인 HCE 프로모터(Phce)을 PCR로 증폭하였고, B. oceanisediminis 2691의 게놈 DNA로부터 서열번호 67 및 68의 프라이머 쌍을 이용하여 cadC640 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 이 두 DNA 단편(Phce와 cadC640 유전자)을 주형으로 하여 서열번호 65 및 68 프라이머 쌍으로 overlap PCR을 수행하여 Phce-cadC640 유전자 컨스트럭트를 제작하였다. 상기 Phce-cadC640 유전자 컨스트럭트를 PspOMI 제한효소로 반응시키고 정제한 다음, 동일 제한효소로 반응시켜 절단한 pET21a(PT7_cadO640_egfp-ΔlacI) 재조합 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pET21a(cadO640-egfp&Phce-cadC640)를 제작하였다.
[ 실시예 3]
바이오 센서의 구현 및 중금속에 대한 반응성 확인
[3-1] 바이오 센서의 구현
본 발명의 중금속 검출용 바이오 센서를 구현하기 위하여, 상기 실시예 [2-2]에서 제작한 ΔlacI와 galM-KmR-cadC1945-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK744 균주에 상기 실시예 [2-3-1]에서 제작한 pET21a(PT7_cadO1945_egfp)를 형질전환하여 형질전환체 HK744(PT7_cadO1945_egfp)를 제작하였다. 그리고 상기 실시예 [2-2]에서 제작한 ΔlacI와 galM-KmR-cadC4657-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK739 균주에 상기 실시예 [2-3-2]에서 제작한 2개의 재조합 벡터 pET21a(PT7_cadO4657_egfp) 및 pACYC184(Phce-cadC4657)를 각각 형질전환하여 형질전환체 HK739(PT7_cadO4657_egfp/Phce-cadC4657)을 제작하였다. 마지막으로, 상기 실시예 [2-2]에서 제작한 ΔlacI와 galM-KmR-cadC640-T7RNAP의 유전자 컨스트럭트를 갖는 HK760 균주에 상기 실시예 [2-3-3]에서 제작한 pET21a(cadO640-egfp&Phce-cadC640)를 형질전환하여 형질전환체 HK760(cadO640-egfp&Phce-cadC640)을 제작하였다.
구체적으로, 상기 형질전환은 상기 실시예 2-2에서 제작된 세 형질전환체 HK744, HK739 및 HK760 균주의 콜로니를 LB 액체배지 5㎖에 각각 접종하여 37℃, 180rpm으로 12시간 배양하여 전배양액으로 사용하고, 이를 500㎖ Flask의 100㎖ LB에 1%(v/v) 접종하여 37℃에서 대수증가기(OD600㎚=0.4~0.6)가 될 때까지 배양한 다음, 상기 배양물을 50㎖ 코니칼 튜브에 옮겨 4℃, 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 80mM MgCl2, 20mM CaCl2 용액 50㎖에 재현탁하여 4℃, 3000rpm에서 10분간 원심분리하는 과정을 2번 거쳐, 최종적으로 100mM CaCl2 용액 5㎖에 재현탁하여 형질전환을 위한 컴피턴트 세포를 제조하였다. 상기와 같이 제조된 HK744 및 HK760의 컴피턴트 세포 100㎕에 상기 실시예 [2-3]에서 제작된 pET21a(PT7_cadO1945_egfp)와 pET21a(cadO640-egfp&Phce-cadC640)를 각각 50ng 씩 더하여 42℃에서 1분 30초간 열충격(heatshock)을 주고 SOB 900㎕를 더하여 37℃, 180rpm에서 1시간 동안 배양한 후, 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에 도말하여 상기 pET21a(PT7_cadO1945_egfp)와 pET21a(cadO640-egfp&Phce-cadC640)이 도입된 형질전환체를 선별하였다. 그리고 상기와 같이 제조된 HK739의 컴피턴트 세포 100㎕에 상기 실시예 [2-3]에서 제작된 pET21a(PT7_cadO1945_egfp), pET21a(PT7_cadO4657_egfp)와 pACYC184(Phce-cadC4657)를 각각 50ng 씩 더하여 42℃에서 1분 30초간 열충격(heatshock)을 주고 SOB 900㎕를 더하여 37℃, 180rpm에서 1시간 동안 배양한 후, 50㎍/㎖의 앰피실린과 25㎍/m의 클로람페니콜이 포함된 LB 고체 배지에 도말하여 상기 두 재조합 벡터 pET21a(PT7_cadO4657_egfp)와 pACYC184(Phce-cadC4657)가 동시에 도입된 형질전환체를 선별하였다(도 5).
[3-2] 중금속에 대한 반응성 확인
먼저, 상기 실시예 [3-1]에서 제조된 두 형질전환체 HK744(PT7_cadO1945_egfp)와 HK739(PT7_cadO4657_egfp/Phce-cadC4657)의 중금속에 대한 반응성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1과 같은 방법으로 형질전환체를 배양하고, 납 또는 카드뮴을 0μM, 0.01μM, 0.03μM, 0.1μM, 0.3μM, 1μM, 3μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM, 100μM의 농도로 첨가하고, 형광 플레이트 리더기를 이용하여 상기 형질전환체의 흡광도와 형광량을 측정하였다. T7 RNA 중합효소/T7 프로모터 시스템(이하 'T7 시스템'이라고 합니다)의 도입을 통한 민감성 향상 정도를 확인하기 위하여, 실시예 [1-3]의 pCadC1945(cadC1945-egfp) 및 pCadC4657(cadC4657-egfp)가 도입된 형질전환체와 비교하였다.
그 결과, 기존의 실시예 [1-3]의 pCadC1945(cadC1945-egfp) 및 pCadC4657(cadC4657-egfp)가 도입된 형질전환체에서는 10μM 수준에서 카드뮴을 감지하기 시작하였으나(도 2, 도 6), T7 시스템이 도입된 실시예 [3-1]의 HK744(PT7_cadO1945_egfp)의 형질전환체에서는 10-100 nM 수준의 미량의 납 농도에서(도 7), 실시예 [3-1]의 HK739(PT7_cadO4657_egfp/Phce-cadC4657)의 형질전환체에서는 10-100 nM 수준의 미량의 카드뮴 농도에서도 GFP 형광신호가 증폭되는 것을 확인하였으며(도 6), 상기 T7 시스템의 도입으로 인해 약 100-1000배 정도 민감성 또는 감지능이 증가함을 알 수 있었다.
다음으로, 상기 실시예 [3-1]에서 제조된 형질전환체 HK760(cadO640-egfp&Phce-cadC640)의 중금속에 대한 반응성을 확인하기 위하여, 상기 형질전환체 HK760(cadO640-egfp&Phce-cadC640)의 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 180rpm으로 12시간 동안 진탕배양하여 전배양액으로 사용하였다. 상기 배양액을 250㎖ 삼각 플라스크에 50㎍/㎖의 앰피실린과 0.3%의 포도당이 포함된 M9 액체배지 50㎖에 1%(v/v)의 농도로 접종하여, 37℃, 180rpm으로 배양하면서, 대수증가기(OD600㎚=0.4~0.6)가 될 때 14㎖ round bottom tube에 4㎖ 씩 분주하고, 염화카드뮴(Cadmium chloride, CaCl2), 염화납(Lead(II) chloride, PbCl2)을 최종 농도가 0μM, 0.01μM, 0.03μM, 0.1μM, 0.3μM, 1μM, 3μM, 10μM, 20μM, 30μM, 50μM, 100μM이 되도록 첨가하여 형광플레이트리더기를 이용하여 상기 형질전환체의 흡광도와 형광량을 측정하였다. T7 시스템의 도입을 통한 민감성 향상 정도를 확인하기 위하여, 실시예 [1-3]의 pCadC640(cadC640-egfp)가 도입된 형질전환체와 비교하였다.
그 결과, 기존의 실시예 [1-3]의 pCadC640(cadC640-egfp)가 도입된 형질전환체에서는 10μM 수준에서 카드뮴을 감지하기 시작하였으나(도 2), T7 시스템이 도입된 실시예 [3-1]의 HK760(cadO640-egfp&Phce-cadC640)의 형질전환체에서는 10-100 nM 수준의 카드뮴 농도에서도 GFP 형광신호가 증폭되는 것을 확인하였으며(도 7), 상기 T7 시스템의 도입으로 인해 약 100-1000배 정도 민감성 또는 감지능이 증가함을 알 수 있었다.
[ 실시예 4]
중금속을 발현 유도제로 이용한 단백질 고발현 시스템의 개발
상기 실시예 [3-1]의 HK744(PT7_cadO1945_egfp)의 형질전환체에서 납을 발현 유도제로 이용하여 T7 프로모터의 다운스트림에 있는 egfp 유전자의 발현을 유도하였고, 이에 대한 대조군으로서 IPTG를 발현 유도제로 이용하여 pET21a-egfp/BL21(DE3) 형질전환체에서 egfp 유전자의 발현을 유도하여, 두 형질전환체에서 EGFP의 비발현량(Specific fluorescence, Fluoresence/OD595nm)을 비교하였다.
두 형질전환체의 콜로니를 50㎍/㎖의 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 접종하여 37℃, 180rpm으로 12시간동안 진탕배양하여 전배양액으로 사용하였다. 상기 배양액을 250㎖ 삼각 플라스크에 50㎍/㎖ 농도의 앰피실린이 포함된 LB 액체 배지에 1%(v/v)의 농도로 접종하여 37℃, 180rpm으로 배양하면서 대수증가기(OD600㎚=0.4~0.6)가 될 때 14㎖ round bottom tube에 4㎖ 씩 분주하고, pET21a-egfp/BL21(DE3) 형질전환체에는 IPTG를 최종농도가 0μM, 10μM, 50μM, 100μM이 되도록 첨가하고, HK744(PT7_cadO1945_egfp) 형질전환체에는 염화납(Lead(II) chloride, PbCl2)을 최종농도가 0μM, 10μM, 50μM, 100μM 이 되도록 첨가하여 24시간 배양한 다음, 형광 플레이트 리더기를 이용하여 형질전환체의 광학밀도(성장량)과 형광량을 측정하고, 이를 이용하여 비형광량(Specific fluorescence, Fluoresence/OD595nm)을 분석하였다.
그 결과, IPTG와 납의 농도가 10μM 일 때, EGFP의 비형광량이 거의 동일한 것으로 확인되었으며, 두 형질전환체에서의 단백질 발현량이 비슷한 것으로 확인되었다. 그러나 pET21a-egfp/BL21(DE3) 형질전환체에서 IPTG의 농도가 증가함에 따라 EGFP의 비형광량은 감소하는 반면, HK744(PT7_cadO1945_egfp) 형질전환체에서는 납의 농도가 증가하면 EGFP의 비형광량이 증가하는 것으로 확인되었다(도 8). 상기와 같은 결과로부터, HK744(PT7_cadO1945_egfp) 형질전환체에서 납을 발현 유도제로 이용하면, pET21a-egfp/BL21(DE3) 형질전환체에서 IPTG를 발현 유도제로 이용하는 것보다, 동일하거나 많은 단백질을 생산할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 중금속에 의해 유도되는 단백질 발현 시스템 및 중금속 검출용 바이오센서에 관한 것으로, 중금속과 반응하는 cadC 유전자를 이용함으로써, 비용이 저렴한 중금속을 이용하여 경제성이 높은 유전자 발현 유도 시스템을 구현할 수 있고 중금속을 검출할 수 있는 바이오센서로 활용할 수 있다. 따라서, 유전자 발현 유도시스템은 목적 단백질의 고발현을 요하는 식품 또는 의학 분야에서 이용할 수 있고, 바이오센서는 환경 분야에서 이용될 수 있다.

Claims (19)

  1. 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및
    제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 목적 단백질의 유전자가 클로닝되는 다중 클로닝 자리(Multiple Cloning Site, MCS), 및 상기 제2 프로모터 및 상기 다중 클로닝 자리의 사이에 개재되고, 상기 CadC 단백질이 결합하여 상기 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 발현이 저해되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;를 포함하고,
    중금속의 존재 하에서, 상기 CadC 단백질이 상기 cadO로부터 분리됨으로써, 상기 제2 프로모터에 의한 목적 단백질의 발현이 활성화되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 T7RNAP 유전자를 더 포함하고,
    상기 제2 유전자 컨스트럭트의 제2 프로모터는 상기 T7 RNA 중합효소가 결합하는 T7 프로모터인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는, 상기 cadC 유전자와 상기 T7RNAP 유전자 사이에 리보솜 결합 부위(RBS)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는, 상기 제1 프로모터와 상기 cadC 유전자 또는 T7RNAP 유전자 사이에 cadO를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는 제1 프로모터, cadO, cadC 유전자 및 T7RNAP 유전자의 순서로 구비되고,
    이 중 상기 제1 프로모터, cadO 및 cadC 유전자는 서열번호 7 내지 서열번호 12를 포함하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 청구항 1 내지 5에 있어서,
    상기 CadC 단백질과 상기 CadC 단백질이 결합하는 cadO는 각각 서열번호 1 및 서열번호 69, 서열번호 2 및 서열번호 70, 서열번호 3 및 서열번호 71, 서열번호 4 및 서열번호 72, 서열번호 5 및 서열번호 73, 또는 서열번호 6 및 서열번호 74의 아미노산 서열 및 염기 서열인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 중금속은 카드뮴 또는 납인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 제1 프로모터와, 상기 제1 프로모터에 의해 발현이 조절되고, CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제1 유전자 컨스트럭트; 및
    제2 프로모터, 상기 제2 프로모터에 의해 발현이 조절되는 리포터 단백질을 코딩하는 리포터 유전자, 및 상기 제1 프로모터 및 상기 리포터 유전자의 사이에 개재되고, 상기 CadC 단백질이 결합하여 상기 제2 프로모터에 의한 리포터 단백질의 발현이 저해되는 오퍼레이터 cadO;를 포함하는 제2 유전자 컨스트럭트;가
    숙주세포 내에 형질전환되어 있고,
    중금속의 존재 하에서, 상기 CadC 단백질이 상기 cadO로부터 분리됨으로써, 상기 제2 프로모터에 의해 리포터 단백질이 발현되는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 T7RNAP 유전자를 더 포함하고,
    상기 제2 유전자 컨스트럭트의 제2 프로모터는 상기 T7 RNA 중합효소가 결합하는 T7 프로모터인 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는, 상기 cadC 유전자와 상기 T7RNAP 유전자 사이에 리보솜 결합 부위(RBS)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는, 상기 제1 프로모터와 상기 cadC 유전자 또는 T7RNAP 유전자 사이에 오퍼레이터 cadO를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는 제1 프로모터, cadO, cadC 유전자 및 T7RNAP 유전자의 순서로 구비되고,
    이 중 상기 제1 프로모터, cadO 및 cadC 유전자는 서열번호 7 내지 서열번호 12를 포함하는 염기 서열인 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  13. 청구항 8 내지 12에 있어서,
    상기 CadC 단백질과 상기 CadC 단백질이 결합하는 cadO는 각각 서열번호 1 및 서열번호 69, 서열번호 2 및 서열번호 70, 서열번호 3 및 서열번호 71, 서열번호 4 및 서열번호 72, 서열번호 5 및 서열번호 73, 또는 서열번호 6 및 서열번호 74의 아미노산 서열 및 염기 서열인 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  14. 청구항 8 내지 12에 있어서,
    상기 리포터 유전자는 형광유전자 또는 항생제 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 재조합 미생물.
  15. 청구항 8 내지 12에 있어서,
    상기 중금속은 카드뮴 또는 납인 것을 특징으로 하는 검출용 형질전환체.
  16. 청구항 8 내지 12에 있어서,
    상기 제1 유전자 컨스트럭트는 상기 숙주세포의 염색체 내에 삽입된 상태로 존재하고, 상기 제2 유전자 컨스트럭트는 재조합 발현 백터에 포함된 채로 상기 숙주세포 내에 형질전환된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 숙주세포에는 제3 프로모터 및 상기 제3 프로모터에 의해 발현이 조절되는 CadC 단백질을 코딩하는 cadC 유전자를 포함하는 제3 유전자 컨스트럭트;가 재조합 발현 백터에 포함된 채로 상기 숙주세포 내에 추가적으로 형질전환된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 제3 프로모터는 항시 발현 프로모터인 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 제2 유전자 컨스트럭트 및 상기 제3 유전자 컨스트럭트는 동일한 재조합 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 중금속 검출용 형질전환체.
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