CN105420378B - 基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法，涉及生物化学、分子生物学、糖类成分确认的检测方法，该方法中，半乳糖结合于半乳糖阻遏蛋白，导致半乳糖阻遏蛋白发生构象变化，并从结合的DNA双链的特异识别序列上脱落，从而解除对滚环扩增反应的抑制。通过检测滚环扩增的速率，进而计算出半乳糖的浓度。该方法为检测半乳糖提供了快速、简便、定量的测量技术，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。

Description

基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、糖类成分确认的检测方法，具体涉及一种基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法。
背景技术
半乳糖是自然界生物体内存在的一种重要的单糖，是生物体重要的营养物质之一，在体内是糖蛋白糖链的组成之一，也存在于日常生活的很多的奶制品中，包括食品、饮料、保健品、微生物发酵产品等。
检测半乳糖的常用方法有高压液相(HPLC)、液相串联质谱(LC-MS/MS)、傅里叶变换远红外光谱(FTIR)等分析化学方法。虽然这些方法有较高的检测准确性和检测灵敏度，但是需要分离纯化等样品处理设备，而且所需的专业大型仪器不易普及。生物学方法有细菌抑制试验，包括Guthrie法利用转移酶活性缺陷株大肠杆菌，以及Paigen法结合噬菌体裂解大肠杆菌，用来检测半乳糖的含量，然而变异菌株易产生不稳定结果，而且细菌培养耗时费力。
因此，开发一种新的便捷、快速、准确的检测半乳糖的方法，对于食品安全监测、食品化工生产等领域都有重要意义。
发明内容
本发明针对上述现存的技术问题而提出一种基于滚环扩增技术的全新的检测半乳糖的方法，该方法原理是结合半乳糖操纵子的阻遏蛋白和滚环扩增，通过该方法可以实现半乳糖的简便、快捷、可定量的检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于滚环扩增技术的检测半乳糖的方法，其特征在于：首先制备出由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA所形成的双链结构，该双链含有半乳糖阻遏蛋白GalR的识别结合序列，该GalR的识别序列是5’-CTGTAACCGTTTCCAT-3’，待检测的半乳糖与半乳糖阻遏蛋白结合，结合了半乳糖的半乳糖阻遏蛋白GalR失去了识别并结合由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列的能力，不能与该特异性识别序列结合，使DNA聚合酶能够对线性单链引物DNA进行延伸和滚环扩增，滚环扩增反应的效率与半乳糖的浓度成正比，通过比对半乳糖浓度与滚环扩增效率的标准曲线，从而确定出待测样品中的半乳糖含量。
所述的待检测的半乳糖是半乳糖溶液，浓度为1～50μM。
所述的半乳糖阻遏蛋白是细菌产生的具有调控半乳糖操纵子表达活性的半乳糖阻遏蛋白，该半乳糖阻遏蛋白能够特异性地结合半乳糖，并发生构象变化，降低了与半乳糖操纵子识别序列结合的亲和力。
所述的环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的单链DNA，并含有半乳糖阻遏蛋白的识别序列。
所述的线性单链引物DNA，含有半乳糖阻遏蛋白的识别序列，该线性单链引物DNA序列与环形单链模板DNA的序列碱基具有序列互补性，两者形成的DNA双链能够被半乳糖阻遏蛋白特异性地识别并结合。
所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶。
与传统的HPLC、质谱、生物学等方法相比，本发明具有如下优点：
1、操作简单、步骤简便；
2、不需专业的大型仪器设备。
附图说明
图1是本发明的流程图；
图2是本发明检测半乳糖的原理示意图；
图3为本发明定量测定不同浓度半乳糖的实验结果；
图4是本发明特异性鉴别半乳糖和其他14种单糖或二糖的实验结果。
图2中，1、含有半乳糖阻遏蛋白识别序列的单链模板DNA；2、含有半乳糖阻遏蛋白识别序列的线性单链引物DNA；3、DNA聚合酶；4、结合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白；5、半乳糖；6、未结合半乳糖的半乳糖阻遏蛋白。
图3是本发明定量测定不同浓度半乳糖的实验结果。左图：不同浓度的半乳糖的滚环扩增反应的荧光时间曲线，其中x轴表示时间，y轴表示荧光强度；右图：半乳糖浓度和滚环扩增速率的线性关系，其中x轴表示半乳糖浓度，y轴表示滚环扩增速率。半乳糖浓度单位μM表示微摩尔/升。
图4是本发明特异性鉴别半乳糖和其他14种单糖或二糖的实验结果。该柱状图y轴表示相对滚环扩增速率。x轴表示14种待测糖类的名称：半乳糖、木糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、岩藻糖、异丙基硫代半乳糖苷、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、密二糖。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明。
本发明基于滚环扩增的半乳糖的检测方法包括下述步骤：待检测的半乳糖与半乳糖阻遏蛋白结合，降低半乳糖阻遏蛋白对环形模板中识别序列的亲和力，从环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的DNA双链上脱落，进而解除DNA聚合酶对环形单链模板DNA和线性单链引物DNA的扩增的抑制。滚环扩增的速率与半乳糖的浓度成正比，通过制备一系列不同半乳糖浓度与相应滚环扩增速率的标准曲线，以及测定待测样品对滚环扩增的速率，可以分析出待测样品中的半乳糖的浓度。该方法包括待检测的半乳糖、半乳糖阻遏蛋白、环形单链模板DNA、线性单链引物DNA、DNA聚合酶以及滚环扩增所需的酶反应体系。其中，待检测的半乳糖是半乳糖溶液。半乳糖阻遏蛋白是细菌产生的具有调控半乳糖操纵子表达活性的半乳糖阻遏蛋白(GalR)。该蛋白可以特异的结合半乳糖，进而发生变构，降低对半乳糖操纵子中识别序列的亲和力。环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的环形单链DNA，并含有半乳糖阻遏蛋白的特异识别序列。线性单链引物DNA，含有半乳糖阻遏蛋白的特异识别序列，并且与环形单链模板DNA的序列碱基互补配对，两者形成的DNA双链被半乳糖阻遏蛋白识别并结合。DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶，包括phi29DNA聚合酶。
实施例1
本发明定量测定半乳糖浓度与滚环扩增速率的关系(图3)。具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl的连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA、10pmol线性单链引物DNA和175U T4 DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为0、50、100、150、200、250、300μM的半乳糖水溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和半乳糖阻遏蛋白0.12μM)，分别加入不同量的半乳糖，使其终浓度为0、5、10、15、20、25、30μM，并进行滚环扩增反应。
利用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
滚环扩增的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增速率。滚环扩增速率与半乳糖浓度呈线性相关(图3)。
实施例2
本发明特异性鉴别半乳糖和其他14种糖类(图4)的具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl的连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA、10pmol线性单链引物DNA和175U T4 DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为10mM的半乳糖的水溶液，分别配制摩尔浓度为100mM的木糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、岩藻糖、异丙基硫代半乳糖苷、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、密二糖的水溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和半乳糖阻遏蛋白0.12μM)，分别加入一种糖类进行滚环扩增反应。糖类的终浓度分别是100μM(半乳糖)和10mM(其他糖类：木糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、岩藻糖、异丙基硫代半乳糖苷、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、密二糖)。
用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
滚环扩增的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增速率，相对滚环扩增速率＝滚环扩增速率sac/滚环扩增速率ctl。滚环扩增速率ctl：空白对照(即不含半乳糖阻遏蛋白和半乳糖)的滚环扩增速率；滚环扩增速率sac：含有不同糖类的滚环扩增速率。(图4)
表1.实施例中所用DNA序列

Claims (6)

1.一种基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：首先制备出由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA所形成的双链结构，该双链含有半乳糖阻遏蛋白GalR的识别结合序列，该GalR的识别序列是5’-CTGTAACCGTTTCCAT-3’，待检测的半乳糖与半乳糖阻遏蛋白GalR结合，结合了半乳糖的半乳糖阻遏蛋白GalR失去了识别并结合由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列的能力，不能与该特异性识别序列结合，使DNA聚合酶能够对线性单链引物DNA进行延伸和滚环扩增，滚环扩增反应的效率与半乳糖的浓度成正比，通过比对半乳糖浓度与滚环扩增效率的标准曲线，从而确定出待测样品中的半乳糖含量。
2.按照权利要求1 所述的基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的待检测的半乳糖是半乳糖溶液，浓度为 1～50μM。
3.按照权利要求1 所述的基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的半乳糖阻遏蛋白是细菌产生的具有调控半乳糖操纵子表达活性的半乳糖阻遏蛋白GalR。
4.按照权利要求1 所述的基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的环形单链DNA是滚环扩增的模板，其序列含有半乳糖阻遏蛋白GalR的识别序列。
5.按照权利要求1 所述的基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的线性单链引物DNA的序列与环形单链DNA的序列具有互补性，并形成DNA双链结构被半乳糖阻遏蛋白特异性地识别结合。
6.按照权利要求1 所述的基于滚环扩增技术的非诊断目的的检测半乳糖的方法，其特征在于：所述的DNA 聚合酶是用于滚环扩增的 DNA 聚合酶。
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