JP2006184015A - バイオチップ用基板およびバイオチップ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層が形成され、前記層の膜厚が1nm以上20nm未満であることを特徴とするバイオチップ用基板で、好ましくはホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である。
Description
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率(ハイスループット)化が求められている。この目的の分子アレイとしてDNAチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高い蛋白質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ(微小な基板)表面に固定化したものを総称する。
もう一つは化学的共有結合により蛋白質を固定化する方法である。基板表面に設けた、活性エステルなどの官能基を介して蛋白質を固定化する方法である。この方法では、蛋白質を固定化した後に、固定化部以外の場所に残存する官能基を処理することが必要であるが、官能基を十分に残存官能基を処理できずに、2次抗体と残存官能基が反応して、固定化され、結果として信号対雑音費を低下させる原因となり、検出制度を低下させる原因となっていた。
(1) 固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層が形成され、前記層の膜厚が1nm以上20未満であることを特徴とするバイオチップ用基板、
(2)ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である(1)記載のバイオチップ用基板、
(3)活性エステル基がp−ニトロフェニル基、N−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基及び5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基から選ばれる少なくとも1つの基を有するものである(1)又は(2)いずれか記載のバイオチップ用基板、
(4)前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体である(1)〜(3)いずれか記載のバイオチップ用基板、
(5) 固相基板がプラスチック製である(1)〜(4)いずれか記載のバイオチップ用基板、
(6)プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、である(5)記載のバイオチップ用基板、
(7)固相基板がガラス製である(1)〜(4)いずれか記載のバイオチップ用基板、
(8)(1)〜(7)いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ、
である。
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、ポリメチルメタクリレート、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
本発明に使用するホスホリルコリン基としては、例えば2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン 、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン 、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン 、ヘキセニルホスホリルコリン 、オクテニルホスホリルコリン 、デセニルホスホリルコリン 等を挙げられるが、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
このような活性エステル基としては、たとえばp−ニトロフェニル基、N−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等で活性化された活性エステル基が挙げられるが、p−ニトロフェニル基で活性化されたp−ニトロフェニルカルボニルオキシ基が好ましく用いられる。
本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基及び活性エステル基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。この固相基板を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.05重量%エタノール溶液に浸漬、風乾することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは15nmであった。
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。この固相基板を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.3重量%エタノール溶液に浸漬したあと、エタノール/水の混合溶媒にて洗浄、風乾することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは5nmであった。
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。固相基板を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.5重量%エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは60nmであった。
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状(寸法:76mm×26mm×1mm)に加工して固相基板を作成した。固相基板を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.001重量%エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を導入した。エリプソメータによる層の厚みは0.1nmであった。
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより表1に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウスIgG2aをスポット後、室温4℃の環境下に24時間静置した。その後、0.1規定の水酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。その後1.0%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液に1時間浸漬した。
その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後にCy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表1に示す。
実施例は、高いスポットシグナル値、低いバックグランド値が観測されたが、比較例1は高いバックグランド値をしめした。比較例2はバックグランド値は低いがスポットシグナル強度が低かった。
Claims (8)
- 固相基板の表面に生理活性物質を固定化するバイオチップ用基板であって、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を含む層が形成され、前記層の膜厚が1nm以上20nm未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
- ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項1記載のバイオチップ用基板。
- 活性エステル基がp−ニトロフェニル基、N−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基及び5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基から選ばれる少なくとも1つの基を有するものである請求項1又は2記載のバイオチップ用基板。
- 前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体である請求項1〜3いずれか記載のバイオチップ用基板。
- 固相基板がプラスチック製である請求項1〜4いずれか記載のバイオチップ用基板。
- プラスチックが飽和環状ポリオレフィン、である請求項5記載のバイオチップ用基板。
- 固相基板がガラス製である請求項1〜4いずれか記載のバイオチップ用基板。
- 請求項1〜7いずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固定化したバイオチップ。
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