JP5716738B2 - 細胞の検出方法及び細胞検出システム - Google Patents
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Description
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第1工程と、
前記第1工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第2工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第3工程と、
前記第3工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第4工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
前記第2工程は、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記1に記載の細胞の検出方法。
前記第2工程は、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする前記1に記載の細胞の検出方法。
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第1工程と、
第1工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、該細胞の最大径の2倍未満の厚みの薄層に伸ばすことにより観察領域に展開する第2工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第3工程と、
前記第3工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第4工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定ピッチで配置されたウェルにより形成されており、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。
図2は、本実施形態にかかる稀少細胞の検出方法を説明するフロー図である。
更に以下に説明する細胞の固定と染色を行うことにより、より正確に細胞を観察することができる。細胞の固定方法としては、例えばホルマリン法、メタノール法などが行われる。細胞の染色方法としては、例えば核内のDNAを染色するDAPI染色やヘキスト染色、細胞種に特異的な抗体を用いる免疫染色が行われる。免疫染色としては、例えば白血球共通抗原CD45、腫瘍マーカーCK(サイトケラチン)が行われる。
細胞懸濁液の観察部30への展開方法としては大別すると2つある。(1)極少量の細胞懸濁液を所定のピッチで展開する方法と、(2)所定量の細胞懸濁液を平面方向に広げて薄層に伸ばす方法である。
(第1の例)
図3は、展開方法の一つとしてMWC方式を用いた観察部30の第1の例である。図3(a)は観察部30の上面図であり、図3(b)は、図3(a)の3a枠の拡大図、図3(c)は図3(b)の3b枠の拡大図であり、図3(d)は、図3(c)の断面図である。これらの図に示すように、MWC方式の観察部30においては多数のウェルweが均等のピッチで平面状に配置されている。
図4は、展開方法の一つとしてMWC方式を用いた観察部30の第2の例である。図4(a)は観察部30の上面図であり、図4(b)は、図4(a)の4a枠の拡大図、図4(c)は図4(b)の4b枠の拡大図であり、図4(d)は、図4(c)の断面図である。それぞれ図3(a)〜図3(d)に対応している。
図5は、展開方法の一つとして貫通穴フィルタ方式を用いた観察部30の例である。図5(a)は観察部30の一部拡大図であり、図5(b)は、図5(a)のA−A断面図。図5(c)は、白血球細胞wbcがフィルタの穴hにせき止められている状態を示す図である。
ステップS2で展開した細胞に対して前述したステップS2の2で観察部30(Nuncライブセルアレイまたはニュークリポアメンブレン)において細胞の固定と染色を行う。なおこの手順に替えてステップS1の沈殿物に対してステップS1の2で固定と染色(以下の(1)〜(6))を行った後、観察部に展開しても良い。また、観察を容易に行う工夫として、2時間静置による自然乾燥接着を行うようにしてもよい。
(1)細胞の固定
上記により調整したJurkat細胞とMCF−7細胞の混合液を観察部30に滴下し、毛細管現象または吸引を利用して排液した後に、3%PFA(パラホルムアルデヒド、例えば和光純薬)を添加して20分静置して懸濁。
(2)PFAの洗浄除去
PBSを添加し、(1)と同様に排液。
(3)ブロッキング
3%BSA(例えばpierce)−PBS滴下、45分静置によりブロッキングを行い、PBSで洗浄除去。
(4)一次抗体反応
抗CK(マウスConeA45−B/B3)、抗CD45(ラビットsc−25590)(抗CK、抗CD45共に例えばAS diagnostik)を原液100倍希釈にて45分静置により反応。
(5)二次抗体反応
Alexa488標識抗マウスIgG、Alexa555標識抗ラビットIgG(共に例えばインビトロジェン)を原液1000倍希釈にて45分静置により反応。
(6)核染色
DAPI液(原液40万倍希釈、例えばインビトロジェン)を添加、45分静置により染色。
(7)封入
退色防止剤ProLong Gold(例えばインビトロジェン)と共に細胞をカバーガラスにて封入。
(8)CTCカウント
蛍光顕微鏡下38HEフィルタ(Alexa488(CK)に対応)にて緑色の蛍光像を示す細胞をカウント。
12 回転多面鏡
13 モータ
14 走査光学系
21 光ガイド
22 受光部
23 光学フィルタ
24 撮影部
25 解析部
30 観察部
we ウェル
h 穴
40 エンドレスベルト
Claims (8)
- 血液中の稀少細胞を検出する細胞の検出方法であって、
血液から赤血球を除く前処理を行い、白血球及び稀少細胞が含まれる細胞懸濁液を得る第1工程と、
前記第1工程で得られた前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を、複数の穴が設けられた観察領域に展開する第2工程と、
前記観察領域に展開された細胞を光学的に撮影する第3工程と、
前記第3工程の撮影で得られた画像から稀少細胞を検出する第4工程と、
を備えることを特徴とする細胞の検出方法。 - 前記観察領域に設けられた前記複数の穴は所定のピッチで配置されたウェルにより形成されており、
前記第2工程は、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする請求項1に記載の細胞の検出方法。 - 前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の2倍未満であることを特徴とする請求項2に記載の細胞の検出方法。
- 前記ウェルの上部穴径は、前記観察領域に展開された細胞の最大径の2倍以上の大きさであることを特徴とする請求項2に記載の細胞の検出方法。
- 前記観察領域に設けられた前記複数の穴は、所定の孔密度で配置され前記細胞懸濁液に含まれる細胞よりも小径の貫通した穴を有するフィルタにより形成されており、
前記第2工程は、前記細胞懸濁液を前記フィルタに通すことにより、前記フィルタ上に、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開することを特徴とする請求項1に記載の細胞の検出方法。 - 複数の穴が設けられ、血液から赤血球を除く前処理をすることにより得られた細胞懸濁液に含まれる全部の細胞を展開する観察部と、
前記観察部に展開された全部の細胞を光学的に撮影して画像を得る撮影部と、
前記撮影部で得られた画像から、稀少細胞を検出する解析部と、
を備え、
前記観察部に設けられた前記複数の穴は、所定ピッチで配置されたウェルにより形成されており、前記ウェルに細胞を沈殿させることにより、前記細胞懸濁液に含まれる全部の細胞が展開されることを特徴とする細胞検出システム。 - 前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の2倍未満であることを特徴とする請求項6に記載の細胞検出システム。
- 前記ウェルの上部穴径は、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の最大径の2倍以上の大きさであることを特徴とする請求項6に記載の細胞検出システム。
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