NL8300089A - Werkwijze en inrichting voor het laten reageren van vaste en vloeistoffasen. - Google Patents

Description

* - -1- - VO 4059

Werkwijze en inrichting voor het laten reageren van vaste en vloei-stoffasen.

De uitvinding betreft een werkwijze en een inrichting voor het laten reageren van vaste en vloeistoffasen. Meer in het bijzonder betreft hij een werkwijze voor het effectief omzetten van een reac-tieve stof die gebonden is aan een vaste fase met een reactieve stof 5 in een vloeistoffase, alsmede een inrichting voor het uitvoeren van deze werkwijze.

Er zijn diverse immunologische methoden bekend, waarbij een antigeen-antilichaamreactie wordt gebruikt voor het bepalen van een zeer kleine hoeveelheid stof in lichaamsvloeistoffen, of voor het 10 bepalen van de concentratie van een toegediend geneesmiddel in het bloed of de urine van een organisme. Diverse methoden, die zijn gebaseerd op verschillende bepalingsprincipes zijn bekend en in praktijk gebracht.

Deze omvatten radio-immunoproeven (RIA), enzym-immunoproeven (EIA) en fluorescerende immunoproeven (FIA), die algemeen gebruikt worden vanwege 15 hun hoge gevoeligheid en hun effectiviteit voor kwantitatieve bepalingen-Wanneer deze analyses worden uitgevoerd, wordt ofwel een sandwich-me-thode dan wel een competitieve methode toegepast als proefbeginsel. In het bijzonder wordt de sandwich-methode algemeen toegepast, omdat hij analytisch bijzonder gevoelig is en gemakkelijk is uit te voeren.

20 Volgens deze sandwich-methode wordt een te meten antigeen omge zet met een onoplosbaar gemaakt, overeenkomend antilichaam (eerste reactie), waarbij een antigeen-antilichaam-complex wordt gevormd. Dit complex wordt vervolgens omgezet met een antilichaam, dat gemerkt is met een merk en met het te meten antigeen kan combineren (gemerkt 25 antilichaam) (tweede reactie). Vervolgens wordt het gemerkte antilichaam verdeeld in twee porties; het ene heeft zich gehecht aan het antigeen-antilicnaam complex, en het andere niet, waarna de activiteit van het merk in één of beide porties wordt gemeten. Anderzijds worden overeenkomstige handelingen herhaald met een antigeen in bekende concen-30 treaties om een ijkkromme vast te leggen. De hoeveelheid te bepalen antigeen kan tenslotte worden afgelezen uit deze ijkkromme. Het merk-middel kan bijvoorbeeld een enzym, een radioactief merk of een fluorescerende stof zijn.

Bij de competitieve methode, die voor het eerst is gebruikt in < 8300089 -2- , ï de radio-analyse, wordt de meting als volgt uitgevoerd:

Wanneer het te meten antigeen en een gegeven hoeveelheid gemerkt antigeen worden omgezet met onoplosbaar gemaakt antilichaam, overeenkomend aan het te meten antigeen; hechten beide antigenen zich com-5 petitief met het onoplosbaar gemaakte antilichaam. Vervolgens wordt het gemerkte antigeen in twee porties verdeeld; één gehecht aan het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het andere niet, waarna de activiteit van het merkmiddel in één van beide of beide porties wordt gemeten. Anderzijds worden overeenkomstige handelingen herhaald voor een antigeen 10 in bekende concentraties om een ijkkromme vast te stellen. De te bepalen hoeveelheid antigeen kan nu uit de ijkkromme worden afgelezen.

Bij het uitvoeren van deze reacties is het gunstig het inwendige oppervlak van een houder als drager voor een reactieve stof zoals een onoplosbaar gemaakt antilichaam, toe te passen. Bijvoorbeeld wordt veel-15 al een plastic reageerbuis gebruikt, omdat die zowel als drager voor het onoplosbaar gemaakte materiaal als de reactiehouder kan dienen en gemakkelijk hanteerbaar is. Het inwendig oppervlak van een reactiehouder is evenwel ongunstig,omdat zijn oppervlak, waaraan een antilichaam of een andere reactieve stof is gehecht, kleiner is dan bij 20 andere dragers, zoals plastic korrels, filterpapier of cellulosedeeltjes, en daardoor slechts een geringere hoeveelheid reactieve stof kan dragen. De reactietijd wordt daarom langer bij de gebruikelijke methode, waarbij een reageerbuis of een andere houder met daarop onoplosbaar gemaakte reactieve stoffen stilstaand recht overeind wordt gehouden of de inhoud 25 daarvan nu en dan wordt geroerd.

De uitvinding betreft nu een werkwijze voor het effectief omzet-ten van een reactieve stof gehecht op een vaste fase met een reactieve stof in een vloeistoffase. In het bijzonder betreft de uitvinding een verbeterde methode voor het bepalen van de hoeveelheid van een reactieve 30 stof in een vloeistoffase met behulp van een reactieve stof die gehecht is op een vaste fase. Meer in het bijzonder betreft de uitvinding een snelle reactiemethode voor het meten van een antigeen of antilichaam in een vloeistoffase met behulp van een antilichaam of antigeen danwel een complex daarvan, gehecht op een vaste fase. Tevens betreft de uit-35 vinding inrichtingen waarop reactiehouders hellend worden geroteerd voor het uitvoeren van deze methode.

De uitvinding wordt aan de hand van de tekening en de 8300089 * .- -3- volgende voorbeelden nader toegelicht.

Fig. 1 is een grafiek waarin de ijkkrommen verkregen volgens de uitvinding en volgens bekende methoden worden vergeleken; fig. 2 is een grafiek die aantoont, dat de reactietijd bij de 5 uitvinding kan worden verkort; fig. 3 is een grafiek omtrent een standaardkromme voor de AFP-proef volgens voorbeeld I; fig. 4 is een grafiek die de standaardkromme weergeeft voor de CEA-proef volgens voorbeeld II; 10 fig. 5 is een tekening van een bij de uitvinding toe te passen inrichting; fig. 6 is een weergave van een transmissie-systeem voor de inrichting volgens fig. 5; fig. 7 is een weergave van een verdere inrichting volgens de 15 uitvinding; en de figuren 8 en 9 zijn vergroot weergegeven tekeningen die de wijze waarop de reactiehouders in de apparatuur van fig. 7 zijn bevestigd, aangeven.

Volgens de uitvinding werd gevonden, dat een hoge gevoeligheid 20 en een kortere reactietijd kan worden bereikt, wanneer de reactie-houder hellend met een zekere hoek wordt aangebracht en tijdens de reactie met een zekere snelheid wordt geroteerd,in plaats van rechtop in stilstand te worden gehouden of de inhoud nu en dan te roeren.

De uitvinding betreft dus een werkwijze voor het uitvoeren van 25 een reactie waarbij een reactiehouder hellend wordt geroteerd, alsmede een inrichting voor het uitvoeren van deze methode. Bij de volgende beschrijving is de reactiehouder een reageerbuis, de stof gehecht op de binnenwand van deze reageerbuis een antilichaam en de stof in de vloeistoffase een antigeen. Deze combinatie is evenwel alleen gebruikt 30 voor een gemakkelijkerbeschrijving en dit betekent niet, dat de uitvinding beperkt is tot deze specifieke combinatie.

Stoffen in lichaamsvloeistoffen treden daarin gewoonlijk op in zeer kleine hoeveelheden en deze lichaamsvloeistoffen zijn vaak op zichzelf reeds slechts beschikbaar in kleine volumina. Elke methode 35 die gebruikt wordt voor het meten van dit soort stoffen moet dus analytisch bijzonder gevoelig zijn gezien de uiterst geringe hoeveelheden van het monster. Daarom wordt gewoonlijk een antilichaam op de binnen- 8300033 * * -4- wand van een reageerbuis slechts in de nabijheid van de bodem daarvan' vastgehecht, bijvoorbeeld aaneen oppervlak tot een hoogte van 1 cm van de bodem van deze buis.

Daarentegen maakt de uitvinding het mogelijk een antilichaam 5 over een veel groter oppervlak vast te .hechten, met inbegrip van het bovendeel van een reageerbuis, omdat het monster, zelfs indien het slechts in een zeer klein volume beschikbaar is,in een ruim contact met het antilichaam kan worden gebracht, indien de reactiehouder hellend wordt geroteerd, zoals hierboven is aangegeven. Bovendien draagt 10 het roteren van de reageerbuis bij tot het roeren van zijn inhoud en dit maakt een zeer gevoelige meting in een korte tijd mogelijk.

Tabel A geeft het verband weer tussen de hellingshoek van de reactiehouder en de relatieve hoeveelheid aan monster,nodig voor het bevochtigen van het antilichaam dragende stuk van de reactiehouder, 15 wanneer het oppervlak waarover het antilichaam is opgehecht in de houder constant is. Tabel B geeft het verband weer tussen de hellingshoek van de reactiehouder en het contactoppervlak tussen monster en binnenwand van de houder bij constante hoeveelheid van het monster.

20 TABEL A.

hellingshoek relatief volume benodigd monster 90° (verticaal) 1 45° .circa 1/2 25 30° " 1/3 20° " 1/5 10° * " 1/10 30 tabEL b.

relatieve grootte hellingshoek contact-oppervlak 90° (verticaal) 1 40° circa 1,5 30° " 2 35 20° " 3 10° " 4 8300089 -5- .

Over het algemeen is het zo, dat hoe groter het contactoppervlak van twee reactanten,hoe effectiever de reactie .Zoals blijkt uit tabel A, neemt het benodigde monstervolume voor het bevochtigen van een constant contactoppervlak af met een vermindering van de hellingshoek 5 van de reactiehouder in de richting van de horizontale positie. Het is dus gewenst de reactiehouder zo horizontaal mogelijk op te stellen, met dien verstande dat er natuurlijk voor moet worden gezorgd, dat de vloeistof er niet uitloopt. Zelfs wanneer de hellingshoek van de reactiehouder zeer nabij de horizontaal komt, bijvoorbeeld 5° boven 10 de horizon, behoeft er geen vrees te bestaan, dat het monster de bodem van de houder niet zou bevochtigen, tenzij het monstervolume bijzonder klein is. Hoewel er geen bovengrens is aan de hellingshoek, wordt O o deze bij voorkeur beneden 45 gehouden, liefst in de orde van 10-20 , om monstervolume te sparen en de analytische gevoeligheid te verhogen.

15 Het is tevens gewenst de hellende reactiehouder met een snelheid van 10 - 100, liefst 25 - 55 toeren per minuut te roteren. Indien de rotatiesnelheid de 100 toeren per minuut teboven gaat, zal het monster niet meer naar beneden stromen langs de houderwand, maar met de houder roteren, waardoor een volledig contact van het monster met het anti- 20 lichaam weer verloren gaat. Een rotatiesnelheid beneden 10 toeren per minuut verlaagt anderzijds het roereffect te sterk.

De onderhavige reactiemethode heeft de volgende voordelen: (1) De continue rotatie van de reactiehouder garandeert een voldoende roeren van het reactiemengsel en verbetert het reactie-effeet; 25 een verhoogde gevoeligheid en een verbeterde nauwkeurigheid van de proef zijn het gevolg.

(2) Om een zeer gevoelig analysesysteem te verkrijgen moest vroeger een vergroot monstervolume worden toegepast. Volgens de uitvinding daarentegen is het voldoende een monstervolume te gebruiken dat 30 gelijk is aan niet meer dan de helft tot 1/10 van dat, dat tot dusver nodig was, zoals is weergegeven in tabel A. Dit heeft hetzelfde effect alsof bij een gebruikelijke methode deze werd uitgevoerd met een monstervolume dat 2 tot 10 maal zo groot was als gewoonlijk wordt gebruikt.

35 (3) Wanneer bij een gebruLteljkemethode het monstervolume gering is, wordt de gradiënt van de ijkkromme lager, waardoor de nauwkeurigheid van de verkregen metingen af neemt. Volgens de uitvinding daar- < 8300089 * 5 -6- entegen kan het contactoppervlak tussen monster en Inwendig oppervlak van de reactiehouder 1,5 tot 4 malen worden vergroot,vergeleken met wat gebruikelijk was, zelfs indien een gering volumemonster wordt toegepast, zoals is weergegeven in tabel B. Aangezien het anti-5 lichaam kan worden gebonden aan een vergroot oppervlak, is het mogelijk een proefsysteem te verkrijgen met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid. Tabel C geeft de resultaten weer van een analyse op a-fetoprotelne (AFP),uitgevoerd onder toepassing van hetzelfde reagens en hetzelfde monstervolume. De proeven werden vijf maal 10 herhaald bij elke concentratie overeenkomstig de uitvinding en volgens de gebruikelijke methode. Fig. 1 geeft de ijkkromme weer gebaseerd op de resultaten van tabel C. Daarbij wordt opgemerkt, dat de ijkkromme van de uitvinding een sterke:re gradiënt heeft dan die voor de gebruikelijke methode, en dat de methode volgens de 15 uitvinding duidelijk nauwkeuriger is. Deze proeven op AFP werden o uitgevoerd in een reactiehouder die helde met een hoek van 10 , terwijl geroteerd werd met 30 toeren per minuut.

TABEL C.

20 AFP concentratie (ng/ml) 0 1 10 100 gebruikelijke methode

Optische dichtheid (x+SE) 0,1934O,007 0,240+0,007 0,346+0,009 0,639+0,019 CV% 8,5 6,2 6,0 6,7 25 volgens uitvinding

Optische dichtheid (x+SE) 0,025jj3,001 0,154+0,002 0,412jjD,105 0,970+0,006 CV% 7,4 2,4 2,6 1,3 % (4) De reactieduur kan sterk worden verminderd. Tabel D geef t bij voor-30 beeld in vergelijking analyseduren benodigd voor het verkrijgen van overeenkomstige analytische gevoeligheden en nauwkeurigheden, dat wil zeggen ijkkrommen met overeenkomstige gradiënten weer,onder toepassing van het zelfde reagens bij een proef op AFP. Een reactiehouder helde met een hoek van 20°, terwijl werd geroteerd met een 35 snelheid van 50 toeren per minuut. De aldus verkregen standaard krommen zijn weergegeven in fig. 2. Er wordt op gewezen, dat de '8300089 -7- verlaging van de proeftijd zo sterk was, dat de reacties, die bij een gebruikelijke methode in totaal 12 uur vereisten, bij de uitvinding in slechts één uur konden worden uitgevoerd. Daarentegen resulteerde een verkorte reactietijd bij een gebruikelijke staande 5 methode in een standaardkromme met een zeer geringe gradiënt, zoals bij C in fig. 2 is weergegeven, zodat de desbetreffende proef onbetrouwbaar is.

TABEL D.

10 gebruikelijke methode uitvinding (houder wordt verticaal (houder helt en en stil gehouden). wordt geroteerd) eerste reactie 60 minuten 20 minuten tweede reactie 60 minuten 20 minuten 15 enzyme-reactie 10 uren 20 minuten

De reactiehouder, die bij de uitvinding kan worden gebruikt, omvat bijvoorbeeld een reageerbuis, een optische cel of een monster-cuvet, waarin een reactieve stof op het inwendige oppervlak is gehecht, 20 welke stof kan worden omgezet met een kleine hoeveelheid monster daarin. Bij voorkeur is de reactiehouder een glazen of plastic cilinder met ronde of polygonale bodem en een binnendiameter van 5 tot 20 mm. De werkwijze volgens de uitvinding kan bijvoorbeeld (1) worden toegepast voor het omzetten van een antilichaam gehecht op een binnenoppervlak 25 van een reactiehouder met een antigeen in een vloeistoffase en ook bij EIA volgens de sandwich-methode, bijvoorbeeld (2) voor een omzetting van een gemerkt antilichaam met een antilichaam-antigeen complex, dat gevormd is door een reactie (1) ter vorming van een complex bestaande uit een onoplosbaar gemaakt antilichaam-antigeen-gemerkt-antilichaam, 30 of (3) voor omzetting van een enzymsubstraat met het complex volgens (2) ter uitvoering vein een enzymreactie.

Bij een competitieve reactie-methode kan de onderhavige werkwijze worden uitgevoerd wanneer het te meten antigeen en een gemerkt antigeen worden omgezet met een onoplosbaar gemaakt antilichaam.

35 Vanzelfsprekend bestaan er verdere toepassingen voor de onderhavige werkwijze en inrichting, die aan elke deskundige duidelijk zullen zijn, en de uitvinding is dan ook niet beperkt tot de boven specifiek weergegeven toepassing.

8300089 · -8-

Om de reactiehoudèr te doen hellen en te doen roteren ter uitvoering van de uitvinding, is het mogelijk om elke inrichting of apparatuur toe te passen die de houder in de voorgeschreven hoek houdt en met de voorgeschreven snelheid roteert. Tot dit doel kan het echter 5 gunstig zijn ëén specifiek ontworpen apparatuur volgens de uitvinding toe te passen, die het bijzonder gemakkelijk maakt de werkwijze vlot en zonder moeite uit te voeren.

Deze apparatuur volgens de uitvinding voor het roteren van een hellende reactiehouder omvat één of meer laterale rijen van houders 10 met onderling gelijke afstand die uitsteken uit een buitenoppervlak van een frame, organen voor het roteren van de houders in dezelfde richting en met een tevoren bepaalde snelheid, alsmede organen voor het regelen van de positie van het frame, zodanig, dat de houders opwaarts hellen in een tevoren bepaalde hoek met de horizon.

15 Deze apparatuur wordt nu nader in detail beschreven, waarbij verwezen wordt naar de tekening. Fig. 5 geeft een uitvoeringsvorm van deze inrichting weer. Longitudinale houders 1 op gelijke afstanden steken uit een buitenoppervlak van een frame 2 uit, en dragen reactie-houders A daarop. De houders 1 worden in dezelfde richting met een' 20 motor 3 geroteerd,en wel met een transmissiesysteem, dat hieronder bij fig. 6 nader wordt besproken. De rotatiesnelheid van de houders kan met een controle-inrichting 7 worden geregeld tussen 10 en 100 toeren per minuut. Het frame 2 is vastgezet met een schroef 5 op een stationaire basis 4, zodat de houders 1 die uit bet buitenoppervlak uitsteken kunnen 25 worden geregeld in een hoek tussen 0° en 90° met de horizon. Hulzen met een gewenste diameter kunnen worden gebruikt voor het overdekken van de houders 1 ter regeling van de afstand tussen twee naburige houders 1,zodat de houders 1 in staat kunnen zijn reactiehouders van gewenste diameters voor het roteren daarvan te dragen.

30 Fig. 6 geeft de apparatuur van fig. 5 weer en wel van de rug af gezien tegenover de houders 1, en geeft een elektrisch transmissiesysteem daarvoor weer. De rotatie van de motor 3 wordt geregeld door een snelheidsregelaar 6 en doorgegeven van ronsel 8 op één van de ronsels 9 die coaxiaal zijn aangebracht met de houders 1. De rotatie 35 van de coaxiale ronsels 9 wordt doorgegeven naar de volgende coaxiale ronsels 9 via tussenronsels 10,die de richting van de rotatie regelen, waarbij alle houders 1 in dezelfde richting worden geroteerd. Indien 8300089 '1 -9- een grote verticale tussenruimte wordt gewenst tussen opeenvolgende rijen houders 1, is het mogelijk de afstand tussen rijen tussenronsels 10 aan de achterkant van frame 2 te vergroten, en een ketting aan te brengen tussen één van de tussenronsels in één rij en één van de 5 tussenronsels in een volgende rij.

De uitvinding kan ook worden uitgevoerd onder toepassing van een andere apparatuur die een transportorgaan, zoals een transportketting met een transportoppervlak omvat, waarop vrij roteerbare walsen zijn bevestigd, organen voor het aandrijven van de transportorganen in een 10 richting met een snelheid in het voorgeschreven traject, een transportband ter rotatie van de reactiehouders in een tevoren bepaalde richting en met een tevoren bepaalde snelheid, die in contact staat met de reactiehouders op de walsen, alsmede organen voor het houden van de reactiehouders in een hellende positie met een tevoren bepaalde hoek op de 15 horizon, waarbij hun uitmondingen zich aan de bovenkant bevinden.

Deze apparatuur wordt nader in fig. 7 toegelicht. Deze fig. 7 geeft een verdere uitvoeringsvorm van een inrichting volgens de uitvinding weer, terwijl de figuren 8 en 9 vergrote deelstukken weergeven en aantonen hoe de reactiehouders in de apparatuur volgens fig. 7 zijn 20 bevestigd. Een transportketting 101 met een transportoppervlak waarin vrij roterende walsen 117 zijn bevestigd brengen houders A aan de gang, welke zijn aangebracht op deze walsen 117. De ketting 101 wordt aangedreven met een motor 106 via een snelheidsregelaar 105, ronsels 104, assen 103 en tandwielen 102 om de reactiehouders progressief in één 25 richting te bewegen. De tijd voor het bewegen van de walsen in één positie naar een volgende walspositie kunnen als gewenst worden geselecteerd, bij voorkeur tussen 0,5 en 5 minuten, en wel met behulp van de controle-inrichting 107.

De reactiehouders worden geroteerd met een drijfriem 109 die 30 met drukwalsen 108 tegen de houders wordt gedrukt. De drijfriem 109 wordt aangedreven met een motor 114 via een snelheidsregelaar 113, ronsels 112, assen 111 en aandrijfwielen 110. De snelheid van de aandrijf-riemen wordt geregeld met regelaar 115, waardoor de reactiehouders met een snelheid tussen 10 en 100 toeren per minuut kunnen worden gero-35 teerd.

Deze inrichting is bijvoorbeeld bevestigd op dragerplaten 116 en wel zodanig dat de reactiehouders in een as kunnen worden geplaatst t 8300089 te C ' -10- die 0 tot 90° met de horizontaal maakt, waarbij uiteraard hun uitmondingen aan de bovenkant zijn geplaatst.

De apparatuur kan worden gebruikt voor het automatisch overbrengen van de reactiehouders de één na de ander, terwijl ze continu 5 worden geroteerd en hun inhoud continu wordt geroerd. Aldus is het bijvoorbeeld mogelijk een groot aantal reactiehouders elk met een vloeistofmonster achtereenvolgens op de transportketting bij de startpositie te bevestigen, en de reactie in de houder volledig te doen verlopen, terwijl zij worden geroteerd en automatisch voorwaarts worden 10 bewogen, waarna de resultaten van de reactie in een tevoren bepaalde positie automatisch,bijvoorbeeld met een spectrofotometer kunnen worden bekeken. De onderhavige apparatuur is dus bijzonder geschikt voor een automatisering van dit soort proeven.

Het is duidelijk, dat de beschreven apparatuur lichte verande-15 ringen kan ondergaan vergeleken met wat hier is beschreven.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nog nader toe.

Voorbeeld I. Proef op AFP.

(a) Bereiding van de reageerbuizen.

3 3 2 cm monoclonaal anti-AFP-antilichaam [A] (1 mg/cm ) werd ge- 20 bracht in elk van een aantal polystyreen reageerbuizen (12 mm diameter en 100 mm hoogte) terwijl 20 minuten bij 50°C werd geïncubeerd. Vervolgens werd elke reageerbuis gewassen met 0,05 M fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) met een pH van 6,4 om elke reageerbuis te voorzien van dit antilichaam [A]. Een verder monoclonaal anti-25 lichaam [B] van een kloon die verschilde van die van [A] werd gemerkt met mierikswortel-peroxidase (Boehringer Manheim kwaliteit I, hieronder aangeduid als HRPO) volgens de methode van Nakane beschreven in de J.

Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974). Het antilichaam werd met PBS 49 3 op 1 verdund en 1 cm verdund antilichaam gebracht in elk van de poly-30 styreen reageerbuizen die voorzien waren van antilichaam [A]. Nadat de reageerbuizen waren gelyofiliseerd werden ze goed gesloten waardoor reageerbuizen voor een AFP-proef waren verkregen.

(b) Proef op AFP.

Proefbuizen voor een AFP-proef bereid als beschreven onder (a) 3 3 35 werden gevuld met 0,9 cm PBS. Aan elke reageerbuis werd 0,1 cm van een standaard AFP-oplossing bereid door verdunning van AFP met normaal menselijk serum gebracht, waardoor zij respectievelijk 1, 10, 100 of • _______ 8300089 % -11- 1-000 ng AFP per cm^ bevatten. De reageerbuizen werden bevestigd op de houders in de apparatuur volgens fig. 5, die een hoek van 20° met de horizon maakten. De reactie werd gedurende 30 minuten uitgevoerd, terwijl de reageerbuizen met een snelheid van 50 toeren per minuut 5 werden geroteerd. Na de reactie werden de reageerbuizen met een fysiologische zoutoplossing met daarin 0,005 % Tween 20 (hieronder aangeduid als wasmiddel) gewassen. Elke reageerbuis werd vervolgens gevuld met 2 cm^ van een enzymsubstraatoplossing met daarin 50 mg/dl aan 5-amino-salicylzuur en 0,01 % waterstofperoxyde. De reageerbuizen 10 werden hierna wederom bevestigd op de houders die nog steeds een o hoek van 20 met de horizon maakten, waarna wederom 30 minuten werd omgezet, terwijl de reageerbuizen met een snelheid van 50 toeren per minuut werden geroteerd.

3

Tenslotte werd 50 mm van een 2 %'s natriumazide-oplossing 15 toegevoegd om de reactie te beëindigen. De absorptie van het reactie-mengsel werd vervolgens bij een golflengte van 500 nm in een spectro-fotometer gemeten. De verkregen ijkkromme is weergegeven in fig. 3.

Voorbeeld II. Proef op CEA.

(a) Bereiding van de reageerbuizen.

20 Elk van een reeks polystyreen reageerbuizen (8 mm diameter; 3 100 mm hoogte) werd gevuld met 2 cm monoclonaal anti-carcino-embryo- 3 antigeen (CEA) antilichaam [A*] (1 mg/cm ), waarna 20 minuten bij i o 56 C werd geïncubeerd. Vervolgens werden de reageerbuizen met PBS gewassen waardoor reageerbuizen ontstonden die gesentitiseerd waren met 25 CEA antilichaam [A13.

Een verder monoclonaal antilichaam [B*] van een andere kloon dan die voor [A1] werd gemerkt met HKPO volgens de onder (a) in voorbeeld I beschreven methode. Dit antilichaam werd tot 50 volumina met 3 PBS verdund en 1 cm van het verdunde antilichaam in elke reageerbuis 30 gebracht die gesentitiseerd was met CEA antilichaam [A*]- Nadat de proefbuizen waren gelyofiliseerd werden ze goed gesloten waarna ze geschikt waren voor een CEA-proef.

(b) Proef op CEA.

De reageerbuizen die voorbereid waren als beschreven onder (a) 3 3 35 werden elk voorzien van 0,9 cm PBS en 0,1 cm standaard CEA oplossing bereid door een verdunning van CEA met normaal menselijk serum tot 3 zij respectievelijk 1, 3, 10, 30 respectievelijk 100 ng CEA per cm 8300089 · V * c -12- % bevatten. De reageerbuizen werden bevestigd op een transportketen van de inrichting volgens fig. 7 terwijl ze een hoek maakten van 10° met de horizon. De reactie duurde 20 minuten, terwijl de reageerbuizen met een snelheid van 30 toeren per minuut werden geroteerd. Vervolgens 5 werd elke reageerbuis met wasmiddel gewassen en hieraan 2 cm^ van een enzymsubstraatoplossing toegevoegd met daarin 100 mg/dl o-fenyleen- diamine en een 0,3 %'s waterige oplossing van waterstofperoxyde. De reageerbuizen werden opnieuw bevestigd op de transportketen terwijl ze wederom een hoek van 10° met de horizon maakten. De reactie werd 10 wederom in 20 minuten uitgevoerd, terwijl de reageerbuizen met een snelheid van 30 toeren per minuut werden geroteerd. Vervolgens werd 3 0,5 cm 4N zoutzuur toegevoegd om de reactie te beëindigen. De absorptie van het reactieprodukt werd bekeken bij een golflengte van 492 nm in een spectrofotometer. De hierbij verkregen ijkkromme is 15 weergegeven in fig. 4.

8300039

Claims (29)

1. Werkwijze voor het omzetten van een eerste reactieve stof, gehecht op het hinnenoppervlak van een reactiehouder met een tweede reactieve stof in een vloeistoffase, waarbij een vloeistof met de tweede reactieve stof in de genoemde houder wordt gebracht en deze 5 houder met een snelheid van 10 tot 100 toeren per minuut om zijn as wordt geroteerd, terwijl de houder met een hoek van 5° tot 45° op de horizontaal wordt gehouden.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie- o o houder een hoek maakt van 10 tot 20 met de horizontaal.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de rotatiesnelheid tussen 25 en 55 toeren per minuut bedraagt.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een antigeen of een antilichaam is, terwijl de tweede reactieve stof een corresponderend antilichaam of antigeen is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een antilichaam is, terwijl de tweede reactieve stof een mengsel is van een corresponderend antigeen en een gemerkt antigeen, verkregen door merken van dit antigeen met een merkmiddel gekozen uit radio-actieve isotopen, enzymen of fluorescerende stoffen.

6. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam en een corresponderend antigeen, terwijl de tweede reactieve stof een gemerkt antilichaam is dat correspondeert met de onoplosbaar gemaakte reactieve stof en gemerkt is met een merk in de vorm van een 25 radio-actieve isotoop, enzym of een fluorescerende stof.

7. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam en een corresponderend gemerkt antigeen, terwijl de tweede - reactieve stof een enzymsubstraat is.

8. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam, een corresponderend antigeen en een antilichaam gemerkt met \ 8300089 7 -14- een enzym, terwijl de tweede reactieve stof een enzymsubstraat is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de reactiehouder een cilinder is met een ronde bodem vervaardigd van een glas of een kunststof en een binnendiameter bezit van 5 tot 20 mm.

10. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de reactiehouder een cilinder is met een polygonale bodem en vervaardigd is van glas of plastic en een binnendiameter van 5 tot 20 mm bezit.

11. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een antigeen of een antilichaam is, terwijl de tweede 10 reactieve stof een corresponderend antilichaam of antigeen is.

12. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een antilichaam is, terwijl de tweede reactieve stof een mengsel is van een corresponderend antigeen en een gemerkt antigeen, verkregen door merken van het antigeen met een merk in de vorm van een 15 radio-actieve isotoop, een enzym of een fluorescerende stof.

13. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam en een corresponderend antigeen, terwijl de tweede reactieve stof een gemerkt antilichaam is dat correspondeert met de onoplosbaar gèmaakte 20 reactieve stof en gemerkt is met een merk in de vorm van een radioactieve isotoop, een enzym of een fluorescerende stof.

14. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam en een corresponderend gemerkt antigeen, terwijl de tweede reactieve 25 stof een enzymsubstraat is.

15. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de eerste reactieve stof een complex is van een onoplosbaar gemaakt antilichaam, een corresponderend antigeen en een antilichaam gemerkt met een enzym, terwijl de tweede reactieve stof een enzymsubstraat is.

16. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de reactie houder een cilinder met ronde bodem is, vervaardigd van glas of plastic en een binnendiameter bezit van 5 tot 20 mm.

17. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de reactiehouder een cilinder met polygonale bodem is, vervaardigd van glas of 35 plastic en een binnendiameter bezit van 5 tot 20 mm.

18. Inrichting voor het roteren van een of meer reactiehouder's in hellende positie, omvattende een of meer laterale rijen van houders 8300089 -15- • > met gelijke tussenruimten, die uit een buitenoppervlak van een frame steken, organen voor het roteren van deze houders in dezelfde richting en met een tevoren bepaalde snelheid, alsmede organen voor het plaatsen van dit frame, zodanig dat de houders een tevoren bepaalde hoek met de 5 horizontaal maken.

19. Inrichting volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat de tevoren bepaalde snelheid ligt tussen 10 en 100 toeren per minuut en o o de tevoren bepaalde hoek is gelegen tussen 5 en 45 met de horizontaal.

• 20. Inrichting volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat de 10 tevoren bepaalde snelheid is gelegen tussen 25 en 55 toeren per minuut.

21. Inrichting volgens conclusie 19 of 20, met het kenmerk, dat de o tevoren bepaalde hoek is gelegen tussen 10 en 20 met de horizontaal.

22. inrichting voor het roteren van tenminste een reactiehouder in hellende positie, omvattende een transportorgaan met een transporterend 15 oppervlak, waarop vrij roterende walsen zijn bevestigd, organen voor het aandrijven van dit transportorgaan in een richting en met een snelheid die tevorene gegeven is, een drijfriem die in contact staat met de reactiehouder, bevestigd op deze walsen en die zo beweegt dat hij de reactiehouder in een tevoren bepaalde richting met een tevoren 20 bepaalde snelheid roteert, alsmede organen voor het houden van de reactiehouder in een opwaarts hellende richting met een tevoren bepaalde hoek met de horizontaal.

23. Inrichting volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat de tevoren bepaalde snelheid is gelegen tussen 10 en 100 toeren per minuut en de 25 tevoren bepaalde hoek is gelegen tussen 5 en 45° met de horizontaal.

24. Inrichting volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat de tevoren bepaalde snelheid is gelegen tussen 25 en 55 toeren per minuut.

25. Inrichting volgens conclusie 23 of 24, met het kenmerk, dat de tevoren bepaalde hoek is gelegen tussen 10 en 20° met de horizontaal.

26. Inrichting volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat het transportorgaan een transportketen is.

27. Inrichting volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat het transportorgaan een transportketen is.

28. Inrichting volgens conclusie 24, met het kenmerk, dat het 35 transportorgaan een transportketen is.

29. Inrichting volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat het transportorgaan een transportketen is. 830 00 8 8 -............... ·