"Procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes dans un échantillon liquide".
"Procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes dans un échantillon liquide"
La présente invention est relative à un procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes et plus particulièrement d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, tel qu'un fluide biologique.
Lorsqu'une personne est infectée par une bactérie ou un virus, elle développe des anticorps généralement de diverses classes pour détruire les agents infectueux. Initialement, les anticorps sont principalement de classe IgM mais progressivement les IgG prédominent et peuvent persister pendant plusieurs années. Par conséquent, le fait de déterminer simplement si des anticorps existent est peu pratique dans le diagnostic d'une infection bien que cela puisse être utile pour déterminer si la personne présente une immunité ou une résistance à un type particulier d'infection. Si, toutefois, on détecte l'anticorps qui s'est formé le premier, c'est-à-dire IgM et que l'on estime sa concentration relative comparativement à IgG, on peut savoir si l'infection est récente ou ancienne.
Ces estimations sont extrêmement importantes pendant les premiers temps de la grossesse lorsque, par exemple, diverses infections dues à des bactéries, des protozoaires ou des virus peuvent avoir atteint le foetus.
Une difficulté en ce qui concerne cette estimation est la différence entre la concentration en IgG et IgM. en termes de concentration moléculaire, on peut s'attendre à ce qu'il y ait,par exemple, 10 fois plus d'IgG présents dans le sérum humain que
d'IgM. On peut s'attendre à ce que la proportion d'anticorps IgM <EMI ID=1.1>
soient les mêmes pour les deux immunoglobulines.
Un grand nombre de procédés décrits dans la littérature
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Grande-Bretagne].
Tous les procédés à l'exception du procédé d'agglutination
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sur la liaison d'un antigène ou d'un anticorps aux parois d'un tube ou puits d'une plaque de microtitrage pour absorber sélectivement l'anticorps choisi. Les tubes ou puits sont lavés pour éliminer toute interférence provoquée par les immunoglobulines non désirées ou d'autres substances susceptibles d'interférence éventuelles et l'on
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IgG) pour quantifier l'anticorps à mesurer [voir, par exemple, la description d'Organon Teknika, Oss, Hollande , de leur
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Ces procédés requièrent un grand nombre d'étapes manuelles, une séparation physique des anticorps liés à ceux qui ne sont pas liés, des lavages et de longues durées d'incubation. Une substance d'interférence majeure dans la plupart des essais est l'anticorps appelé "facteur rhumatoïde" ou "RF", qui est une IgM qui se lie à n'importe quelle IgG qui a réagi avec un antigène polyvalent ou qui a été agrégée par des procédés physiques ou chimiques, et qui apparaît dans des proportions importantes dans tous les échantillons. De plus, un grand nombre d'essais ne sont que semi-quantitatifs, c'est-àdire qu'on ne peut pas exprimer les résultats en quantités pondérales.
L'objet de la présente invention consiste, par conséquent, à palier les inconvénients susmentionnés des procédés de dosage <EMI ID=6.1>
gique d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, tel qu'un fluide biologique, extrêmement rapide, ne requérant pas plus de 45 minutes et qui est quantitatif. Le procédé de l'invention ne requiert aucune séparation physique des anticorps IgM des anticorps IgG ou du sérum ou du fluide corporel dans lequel on effectue la mesure. De plus, la même technique permet de mesurer, par exemple, la quantité d'anticorps non-IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM et d'autres classes. A l'inverse des autres techniques, le procédé de la présente invention est également totalement automatisable.
A cet effet, suivant l'invention, on fait réagir l'échantillon liquide contenant les anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, avec des anticorps dirigés contre les anticorps IgG et des anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon contient des anticorps IgA ( les anticorps IgD et IgE sont généralement en quantité négligeable), on ajoute au produit de réaction ainsi obtenu un antigène lié à des particules finement divisées, telles que, par exemple, des particules de latex ou des globules rouges, et un antigène libre du même type que l'antigène lié, et on détermine le degré d'agglutination ou de non agglutination de ces particules finement divisées, la quantité d'anticorps IgM étant inversément proportionnelle à la quantité de ces particules finement divisées non agglutinées.
Suivant une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, après avoir ajouté les anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement les anticorps dirigés contre les anticorps IgA et incubé la solution ainsi obtenue, on ajoute à celle-ci des immunoglobulines IgG agrégées pour neutraliser l'effet provoqué par le facteur rhumatoïde et éviter ainsi un renforcement de l'agglutination par les anticorps IgG qui n'auraient pas été complètement neutralisés par les anticorps anti-IgG et par l'antigène libre.
Suivant une autre forme de réalisation particulière de l'invention, on détermine la quantité de particules finement divisées agglutinées ou non agglutinées dans la suspension résultante en mesurant l'effet néphélémétrique ou turbidimétrique de celle-ci.
L'invention se rapporte également à un procédé de dosage immunologique d'anticorps IgG + IgA dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et IgA, tel qu'un fluide biologique, dans lequel on détermine tout d'abord la quantité d'anticorps IgM dans l'échantillon liquide par le procédé susmentionné, et dans lequel on soustrait ensuite la quantité d'anticorps IgM ainsi obtenue de la quantité d'anticorps totale IgM + IgG + IgA de manière à obtenir la quantité d'anticorps IgG + IgA, la quantité d'activité d'anticorps totale étant basée, par exemple, sur le principe d'agglutination par les anticorps de latex recouvert de l'antigène et de comptage des particules non agglutinées, tel qu'il a été décrit dans un grand nombre de publications [par exemple Masson et col., Particle Counting Immunoassay (PACIA) dans Methods in Enzymology (1981) 74;
106 Academic Press].
La caractéristique du procédé de la présente invention est de limiter l'activité agglutinante aux anticorps IgM et d'utiliser, par conséquent, la technique d'agglutination bien établie pour estimer de façon précise la présence de ces anticorps IgM en présence des autres anticorps, c'est-à-dire IgG et éventuellement IgA. Ainsi que cela est bien connu, lorsque du latex "Lx" est recouvert d'un antigène "Ag" (provenant, par exemple, de la bactérie ou du virus provoquant la maladie donnant lieu à l'anticorps) et que l'on fait passer le LxAg dans un compteur de cellules, il donnera un pic propor-tionnel à la concentration en particules de LxAg isolées.
Lorsque des anticorps de la classe IgM (IgMAc) sont amenés en contact avec LxAg, ces anticorps entraîneront une certaine agglutination de LxAg, en diminuant le nombre de particules libres LxAg et en diminuant, par conséquent, leur concentration. Cette diminution est directement proportionnelle à la quantité d'anticorps totale (IgGAc, IgMAc et éventuellement IgAAc) présente dans l'échantillon mesuré.
Il semblait logique que l'on puisse éliminer la réaction par les IgGAc en ajoutant une substance qui agrégerait les IgGAc et, par conséquent,qui les éliminerait de la réaction avec le latex, en laissant simplement la réaction avec les IgMAc, ainsi que cela a été décrit par Gispen et coll. [Clin.
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Clin. Microbiol. (1975), 1, 132]. Dans le cas où l'échantillon liquide examiné contient également des anticorps IgA (IgAAc), ceux-ci pourraient également être éliminés de la réaction avec le latex en leur ajoutant une substance qui les agrégerait. On choisit, suivant la présente invention, comme réactif spécifique pour séparer les IgG totalement, un antisérum provenant de chèvre, dirigé vers ce que l'on appelle la région Fc de l'IgG humaine (anti-Fc) et connu pour agréger sélectivement les anticorps IgG humains. Lorsque la totalité des anticorps IgM est inactivée par traitement avec du dithiothréitol (DTT), qui n'inactive pas les anticorps IgG, on obtient encore une agglutination de LxAg mais nettement moindre. Si l'on ajoute à cette suspension des anticorps anti-Fc pour agréger. les anticorps IgG, on ne remarque plus aucune agglutination de LxAg.
On suppose,par conséquent, que l'agglutination du latex par anticorps IgG est inhibée par les anticorps dirigés contre les IgG. D'une façon inattendue, le LxAg s'agglutine plus faiblement qu'attendu lorsque l'on ajoute des quantités connues, relativement élevées, d'IgMAc (sans traitement au DTT) aux IgGAc qui ont été agrégés par des anticorps anti-Fc;ce qui montre que l'antigène Ag sur le latex est vraisemblablement masqué par les complexes IgGAc-anti-Fc. Pour bloquer la réaction entre les anticorps IgG et l'antigène de LxAg, on ajoute alors de l'antigène libre "Ag" à la suspension. On aurait pu supposer qu'un
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d'agglutiner le latex. D'une façon surprenante, ce bloquage ne se réalise pas dans le cas où la concentration d'antigène libre n'est pas excessive. En utilisant de l'antigène libre Ag avec des anticorps anti-Fc pour agréger la totalité des anticorps IgG, la concentration en particules libres est apparemment la même que dans le cas où l'agglutination est due à des anticorps IgM seuls. Cette constatation, bien que surprenante dans son effet, est conforme aux caractéristiques connues des deux anticorps. Les IgMAc ont habituellement une affinité plus faible que les IgGAc. Toutefois, du fait de leur valence multiple (10 valences) , les IgMAc réagissent préférentiellement avec l'antigène porteur de déterminants antigéniques répétés. Le couplage de 1'. Ag au latex rend l'Ag répétitif et par conséquent fortement réactif avec les IgMAc.
Une faible concentration en antigène libre peut par conséquent saturer la capacité de liaison totale des anticorps IgG tandis qu'une concentration beaucoup plus élevée en Ag, pour autant qu'il ne contienne pas des déterminants antigéniques répétitifs, est requise pour saturer les anticorps IgM.
Le procédé de la présente invention permet, par conséquent, de mesurer l'activité en anticorps IgM en utilisant, par exemple,des anticorps anti-Fc dirigés contre les anticorps IgG et, bien entendu, des anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon liquide à examiner contient des anticorps IgA, les anticorps IgD et IgE se trouvant généralement, ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, en quantité négligeable,et un antigène libre, les anticorps IgG venant en fait se combiner à l'antigène libre, cette combinaison avec l'antigène venant ainsi compléter l'inactivation des anticorps IgG et éventuellement des anticorps IgA.
Le procédé de l'invention permet également, ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, de doser les anticorps IgG + IgA dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et IgA, en déterminant tout d'abord la quantité d'anticorps IgM dans l'échantillon liquide à examiner par le procédé de l'invention, qui vient d'être décrit, et en soustrayant ensuite la quantité d'anticorps IgM ainsi obtenue de la quantité d'anticorps totale IgM + IgG + IgA de manière à obtenir la quantité d'anticorps IgG + IgA. Pour obtenir la quantité d'anticorps IgG, il suffira bien entendu d'ajouter au mélange de réaction des anticorps anti-IgA et, de la même manière, pour obtenir la quantité d'anticorps IgA, il suffira d'ajouter au mélange de réaction des anticorps anti-IgG.
Un problème qui a amené un grand nombre de procédés de la technique antérieure à faire l'objet de résultats faussement positifs, consiste en l'interférence que provoque le facteur rhumatoïde (FR) qui est un anticorps IgM qui se lie à la plupart des complexes IgGAc-Ag. Suivant l'invention, on a neutralisé l'effet de ce facteur rhumatoïde par addition d'immunoglobulines IgG agrégées. L'efficacité de cette étape a été testée par addition d'un sérum contenant une concentration très élevée en facteur rhumatoïde mais dépourvu d'IgMAc, après l'addition des anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement des anticorps dirigés contre les anticorps IgA et incubation du mélange ainsi obtenu. En aucun cas, on a obtenu un résultat sensiblement différent.
On notera qu'un test d'agglutination de latex pour la détermination spécifique des IgMAc a récemment été décrit [J.S. Remington et coll., Détection of Immunoglobulin M Antibodies with antigen tagged latex particles in an immunosorbent assay, 3. Clin. Microbiololgy (1983), volume
17, n[deg.] 5, page 939]. Comme avec presque tous les essais
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humains sont liés aux parois du puits d'une plaque de microtitrage. Lorsque l'on ajoute du sérum, une certaine proportion de la totalité des IgM adhère aux parois, y compris les anticorps IgM. Une fois cette réaction réalisée, on ajoute des particules de latex recouvertes d'antigène. Après plusieurs heures, on note la quantité de latex lié à la microplaque et l'on compare celle-ci aux résultats obtenus par des concentrations connues en anticorps IgM et on effectue ainsi une estimation de la quantité d'anticorps présents. Les limitations de ce procédé résident dans le fait que l'estimation n'est que semi-quantitative. Le procédé ne tient compte que des anticorps IgM, comporte de longues périodes d'incubation, requiert un lavage pour séparer les substances interférentes et demande beaucoup de travail.
De plus, lorsque le patient a un taux d'immunoglobulines IgM élevé, la proportion d'IgMAc liés diminuera, en réduisant ainsi la sensibilité avec le danger que l'on puisse rater des résultats positifs.
On notera, à cet effet, que les périodes d'incubation utilisées dans le procédé de la présente invention sont de courte durée. C'est ainsi qu'après avoir ajouté les anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement les anticorps dirigés contre les anticorps IgA, on incube la solution ainsi obtenue sous agitation à une température d'environ 37[deg.]C pendant une durée de l'ordre de 1 à 15 minutes. D'autre part, après avoir ajouté l'antigène lié à des particules finement divisées et l'antigène libre, on incube également la suspension ainsi obtenue sous agitation à une température d'environ 37[deg.]C pendant une durée de l'ordre de 5 à 15 ninutes, une incubation similaire s'avérant nécessaire après l'addition éventuelle des immunoglobulines IgG agrégées utilisées pour neutraliser l'effet provoqué par le facteur rhumatoïde.
Bien que le procédé de l'invention puisse être appliqué à n'importe quelle infection, par exemple du type toxoplasmose, cytomégalovirus, herpès, rubéole, etc., on décrira une forme de réalisation se rapportant à la détermination d'anticorps IgG et IgM chez un patient qui a contacté une infection provoquée par Brucella abortus lors de la manipulation de bétail infecté. L'antigène est dans ce cas un lipopolysaccharide provenant de Brucella (LPS). Exemple.
Préparation de LPS.
Du LPS de Brucella est extrait au moyen du procédé à l'eau-phénol de Westphal et coll. [Methods in Carbohydrate Chemistry, volume 5 (1965), page 83, Académie Press, N.Y.]. La phase phénolique est ensuite précipitée par trois volumes de "réactif méthanolique" et traitée par
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par Moreno et coll., [3. Bacteriology (1979), 361, 138, n[deg.]2]. On dialyse ensuite le lipopolysaccharide (LPS) contre de l'eau désionisée et on le lyophilise.
Préparation du latex-antigène (LxLPS).
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dilué 5 fois (dGBS) (GBS : solution saline tamponnée à base
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poids/volume) (K109 - Rhône-Poulenc, Courbevoie, France) et on soumet le mélange aux ultrasons pendant 1 minute à 30 watts (appareil à ultrasons modèle B12, Branson, Danbu- <EMI ID=13.1>
mine de sérum humain (HSA, Behringwerke, Marburg/Lahn, FRG) dans du GBS, et on soumet à nouveau la suspension aux ultrasons. Après 20 minutes d'incubation à la température ambiante et centrifugation pendant 10 minutes à 10.000 tours/minute dans un rotor SS 34 d'une centrifugeuse Sorvall R5 CB, le latex est remis en suspension dans 1 ml de solution aqueuse de dodécyl sulfate de sodium, soumis aux ultrasons et incubé pendant 1 heure à 37[deg.]C. On lave ensuite le latex deux fois avec 1 ml de dGBS et on le remet en suspension dans 1 ml d'EDTA (éthylène diaminetétraacétate)-GBS-BSA
(albumine de sérum bovin). On constate que le latex stocké congelé à -20[deg.]C ou lyophilisé est stable pendant au moins 6 mois. On soumet aux ultrasons pendant 15 secondes à
30 watts du LxLPS qui a été dégelé ou resuspendu après lyophilisation.
Avant utilisation, on dilue le LxLPS 100 fois dans du EDTA-GBS-BSA.
Anticorps anti-Fc.
On prépare le fragment Fc d'IgG humaine par digestion à la papaïne d'après le procédé de Cerottini et coll., [3. Immunology (1968) 101, page 433]. On injecte
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par voie intradermique chez une chèvre à des intervalles de 3 semaines. On recueille le sérum 15 jours après l'injection finale, on extrait les immunoglobulines et on les utilise diluées dans du GBS ( lmg/ml) après avoir vérifié leur spécificité anti-Fc.
Procédé.
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dilué 50 fois dans du GBS. On incube le mélange à 37[deg.]C pendant 2 minutes tout en agitant. On ajoute ensuite 25
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tion de 25 mg/ml et on incube à nouveau le mélange pendant <EMI ID=17.1>
on fait ensuite passer le mélange résultant dans un compteur de cellules optiques où l'on détermine la concentration de LxLPS non agglutiné, en mesurant la diffusion lumineuse de ce mélange. La concentration en anticorps IgM est inversement proportionnelle à la concentration de particules de latex libres. On pourrait évidemment également mesurer directement la quantité de LxLPS agglutiné ou utiliser pour le comptage une autre méthode optique que la diffusion lumineuse, par exemple le comptage de particules par résistance électrique. Pour éviter les erreurs dues à une concentration excessive en anticorps IgM, on répète le processus avec du sérum dilué 100 fois et 200 fois.
Suivant une variante, on peut mesurer l'agglutination du latex par turbidimétrie dans le cas où les concentrations d'anticorps IgM et IgG sont relativement élevées. Les mêmes quantités de sérum humain dans le GBS et d'anti-Fc sont incubées pendant 2 minutes à 37[deg.]C avec agitation. On ajoute
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née et on laisse le mélange incuber pendant 1 heure, a p r è s quoi i
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rapidement le mélange et on mesure la turbidité à 620 nm et à 405 nm, la longueur d'onde de 620 nm constituant la ligne de base. On laisse ensuite le mélange incuber pendant 2 heures, après quoi on mesure l'effet turbidimétrique de celui-ci une seconde fois aux deux longueurs d'onde susmentionnées. La diminution de la différence entre les mesures prises initialement à 620 nm et 405 nm et celles prises après l'incubation de 2 heures est inversément proportionnelle aux particules libres restantes. On pourrait également déterminer la quantité de particules finement divisées agglutinées ou non agglutinées dans la suspension résultante par d'autres mesures de densité optique que la turbidi-métrie, telles que la colorimétrie.
Pour ce qui est du dosage de l'activité d'anticorps totale, c'est-à-dire de l'activité des anticorps IgM + IgG (le sérum exemplifié ci-dessus ne contenant pas d'anticorps IgA) on utilise du tampon GBS seul à la place des anticorps anti-Fc et on utilise du LxLPS à la place du LxLPS + LPS.
Pour déterminer la concentration en anticorps IgG seule, on utilise le même procédé que pour la détermination de l'activité d'anticorps totale, à l'exception que l'on détruit les anticorps IgM de l'échantillon en traitant préalablement l'échantillon par du dithio-
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l'eau à une concentration de 10 mg/ml et on incube ensuite le mélange entier à 37[deg.]C pendant 30 minutes, après quoi on arrête la réaction
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à 0,2%. On procède ensuite comme décrit ci-dessus et on dilue
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susmentionnées.
La figure annexée montre les concentrations en anticorps IgM du même sérum d'un patient qui a contacté une infection à Brucella abortus, obtenues par un procédé de radioimmunoessai (RIA)
(en coups par minute) et par le procédé de l'invention (en unités d'agglutination arbitraires) sur une période d'un an.
Comme on pourra le noter, les deux courbes sont similaires, ce qui démontre que le procédé de dosage de l'invention est fiable .
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
Ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, on pourrait bien entendu utiliser comme particules finement divisées, à la place des particules de latex, des globules rouges.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de dosage immunologique d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant au moins des anticorps IgM et IgG, tel qu'un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en réaction dudit échantillon liquide contenant les anticorps IgM, IgG et éventuellement des anticorps IgA, d'anticorps dirigés contre les anticorps IgG et d'anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon susdit contient des anticorps IgA, l'addition au produit de réaction ainsi obtenu d'un antigène lié à des particules finement divisées et d'un antigène libre du même type que l'antigène lié et la détermination du degré d'agglutination ou de non agglutination de ces particules finement divisées, la quantité d'anticorps IgM étant inversement proportionnelle à la quantité de ces particules finement divisées non agglutinées.
"Method for the immunoassay of antibodies of various classes in a liquid sample".
"Method for the immunoassay of antibodies of various classes in a liquid sample"
The present invention relates to an immunological assay method for antibodies of various classes and more particularly of IgM antibodies in a liquid sample containing antibodies IgM, IgG and possibly other classes, such as IgA, IgD, IgE, such than a biological fluid.
When a person is infected with a bacterium or virus, they develop antibodies, generally of various classes, to destroy the infectious agents. Initially, the antibodies are mainly of the IgM class, but gradually the IgGs predominate and can persist for several years. Therefore, simply determining whether antibodies exist is impractical in diagnosing an infection, although it may be helpful in determining whether the person has immunity or resistance to a particular type of infection. If, however, the antibody that formed first, that is, IgM, is detected and its relative concentration is estimated compared to IgG, one can tell whether the infection is recent or old.
These estimates are extremely important during the early stages of pregnancy when, for example, various infections due to bacteria, protozoa or viruses may have reached the fetus.
One difficulty with this estimation is the difference between the concentration of IgG and IgM. in terms of molecular concentration, we can expect, for example, 10 times more IgG present in human serum than
of IgM. It can be expected that the proportion of IgM antibodies <EMI ID = 1.1>
are the same for both immunoglobulins.
A large number of processes described in the literature
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Britain].
All processes except the agglutination process
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on the binding of an antigen or an antibody to the walls of a tube or well of a microtiter plate to selectively absorb the antibody chosen. Tubes or wells are washed to remove any interference caused by unwanted immunoglobulins or other substances that may interfere, and
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IgG) to quantify the antibody to be measured [see, for example, the description of Organon Teknika, Oss, Holland, their
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These methods require a large number of manual steps, physical separation of bound and non-bound antibodies, washes and long incubation times. A major interference substance in most trials is the antibody called "rheumatoid factor" or "RF", which is an IgM that binds to any IgG that has reacted with a polyvalent antigen or has been aggregated by physical or chemical processes, and which appears in significant proportions in all the samples. In addition, a large number of tests are only semi-quantitative, that is to say that the results cannot be expressed in weight quantities.
The object of the present invention therefore consists in overcoming the aforementioned drawbacks of the assay methods <EMI ID = 6.1>
IgM antibody pool in a liquid sample containing IgM, IgG and possibly other classes, such as IgA, IgD, IgE, such as a biological fluid, extremely fast, requiring no more than 45 minutes and which is quantitative. The method of the invention does not require any physical separation of the IgM antibodies from the IgG antibodies or of the serum or of the body fluid in which the measurement is carried out. In addition, the same technique can be used to measure, for example, the amount of non-IgM antibodies in a liquid sample containing IgM antibodies and other classes. Unlike the other techniques, the process of the present invention can also be fully automated.
To this end, according to the invention, the liquid sample containing the antibodies IgM, IgG and possibly other classes, such as IgA, IgD, IgE, is reacted with antibodies directed against the IgG antibodies and antibodies directed against IgA antibodies in the case where the sample contains IgA antibodies (the IgD and IgE antibodies are generally in negligible quantity), an antigen linked to finely divided particles, such as, for example, is added to the reaction product thus obtained. latex particles or red blood cells, and a free antigen of the same type as the bound antigen, and the degree of agglutination or non-agglutination of these finely divided particles is determined, the quantity of IgM antibodies being inversely proportional to the amount of these finely divided non-agglutinated particles.
According to a particular embodiment of the process of the invention, after adding the antibodies directed against the IgG antibodies and optionally the antibodies directed against the IgA antibodies and incubating the solution thus obtained, aggregated IgG immunoglobulins are added thereto. neutralize the effect caused by the rheumatoid factor and thus avoid a strengthening of the agglutination by the IgG antibodies which would not have been completely neutralized by the anti-IgG antibodies and by the free antigen.
According to another particular embodiment of the invention, the amount of finely divided particles agglutinated or non-agglutinated in the resulting suspension is determined by measuring the nephelometric or turbidimetric effect thereof.
The invention also relates to a method for the immunological assay of IgG + IgA antibodies in a liquid sample containing IgM, IgG and IgA antibodies, such as a biological fluid, in which the quantity of IgM antibodies in the liquid sample by the aforementioned method, and in which the quantity of IgM antibodies thus obtained is then subtracted from the quantity of total IgM + IgG + IgA antibodies so as to obtain the quantity of IgG + IgA antibodies , the amount of total antibody activity being based, for example, on the principle of agglutination by antibodies of latex coated with the antigen and counting of non-agglutinated particles, as described in a large number of publications [eg Masson et al., Particle Counting Immunoassay (PACIA) in Methods in Enzymology (1981) 74;
106 Academic Press].
The characteristic of the process of the present invention is to limit the agglutinating activity to IgM antibodies and therefore to use the well-established agglutination technique to accurately estimate the presence of these IgM antibodies in the presence of the other antibodies, that is to say IgG and possibly IgA. As is well known, when "Lx" latex is coated with an "Ag" antigen (eg, from the bacteria or virus causing the disease giving rise to the antibody) and pass the LxAg through a cell counter, it will give a proportional peak to the concentration of isolated LxAg particles.
When antibodies of the IgM class (IgMAc) are brought into contact with LxAg, these antibodies will cause a certain agglutination of LxAg, by decreasing the number of free particles LxAg and by decreasing, consequently, their concentration. This decrease is directly proportional to the amount of total antibody (IgGAc, IgMAc and possibly IgAAc) present in the sample measured.
It seemed logical that one can eliminate the reaction by IgGAc by adding a substance which would aggregate IgGAc and, consequently, which would eliminate them from the reaction with latex, by simply leaving the reaction with IgMAc, as has was described by Gispen et al. [Clin.
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Clin. Microbiol. (1975), 1, 132]. In the case where the liquid sample examined also contains IgA antibodies (IgAAc), these could also be eliminated from the reaction with the latex by adding to them a substance which would aggregate them. According to the present invention, an antiserum originating from goat, directed towards the so-called Fc region of human IgG (anti-Fc) and known to selectively aggregate, is chosen as the specific reagent for completely separating the IgGs. human IgG antibodies. When all of the IgM antibodies are inactivated by treatment with dithiothreitol (DTT), which does not inactivate the IgG antibodies, agglutination of LxAg is obtained, but much less. If anti-Fc antibodies are added to this suspension to aggregate. IgG antibodies, we no longer notice any agglutination of LxAg.
It is therefore assumed that agglutination of the latex by IgG antibodies is inhibited by the antibodies directed against IgG. Unexpectedly, LxAg agglutinates more weakly than expected when known, relatively high amounts of IgMAc (without DTT treatment) are added to IgGAc which have been aggregated by anti-Fc antibodies; which shows that the Ag antigen on the latex is probably masked by the IgGAc-anti-Fc complexes. To block the reaction between the IgG antibodies and the LxAg antigen, free "Ag" antigen is then added to the suspension. One would have supposed that a
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to agglutinate the latex. Surprisingly, this blocking does not take place in the case where the concentration of free antigen is not excessive. By using free Ag antigen with anti-Fc antibodies to aggregate all of the IgG antibodies, the concentration of free particles is apparently the same as in the case where agglutination is due to IgM antibodies alone. This finding, although surprising in its effect, is consistent with the known characteristics of the two antibodies. IgMAc usually has a lower affinity than IgGAc. However, because of their multiple valence (10 valences), the IgMAc react preferentially with the antigen carrying repeated antigenic determinants. The coupling of 1 '. Latex Ag makes Ag repetitive and therefore highly reactive with IgMAc.
A low concentration of free antigen can therefore saturate the total binding capacity of IgG antibodies while a much higher concentration of Ag, as long as it does not contain repetitive antigenic determinants, is required to saturate IgM antibodies.
The method of the present invention therefore makes it possible to measure the activity of IgM antibodies by using, for example, anti-Fc antibodies directed against IgG antibodies and, of course, antibodies directed against IgA antibodies in the case where the liquid sample to be examined contains IgA antibodies, the IgD and IgE antibodies being generally, as already specified previously, in negligible quantity, and a free antigen, the IgG antibodies actually coming to combine with free antigen, this combination with the antigen thus completing the inactivation of IgG antibodies and possibly IgA antibodies.
The method of the invention also makes it possible, as already specified above, to assay the IgG + IgA antibodies in a liquid sample containing IgM, IgG and IgA antibodies, by first determining the amount of IgM antibodies in the liquid sample to be examined by the method of the invention, which has just been described, and then subtracting the amount of IgM antibody thus obtained from the amount of total antibody IgM + IgG + IgA so to obtain the quantity of IgG + IgA antibodies. To obtain the quantity of IgG antibodies, it will of course suffice to add anti-IgA antibodies to the reaction mixture and, in the same way, to obtain the quantity of IgA antibodies, it will suffice to add to the reaction mixture anti-IgG antibodies.
One problem that has led many prior art methods to receive false positive results is the interference caused by rheumatoid factor (FR) which is an IgM antibody which binds to most complexes IgGAc-Ag. According to the invention, the effect of this rheumatoid factor was neutralized by the addition of aggregated IgG immunoglobulins. The effectiveness of this step was tested by adding a serum containing a very high concentration of rheumatoid factor but devoid of IgMAc, after the addition of the antibodies directed against the IgG antibodies and possibly the antibodies directed against the IgA antibodies and incubation of the mixture thus obtained. In no case was a significantly different result obtained.
It should be noted that a latex agglutination test for the specific determination of IgMAc has recently been described [J.S. Remington et al., Detection of Immunoglobulin M Antibodies with antigen tagged latex particles in an immunosorbent assay, 3. Clin. Microbiololgy (1983), volume
17, n [deg.] 5, page 939]. As with almost all tests
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humans are bound to the well walls of a microtiter plate. When serum is added, a certain proportion of all IgM adheres to the walls, including IgM antibodies. Once this reaction has been carried out, particles of latex coated with antigen are added. After several hours, the amount of latex bound to the microplate is noted and the latter is compared with the results obtained by known concentrations of IgM antibodies and an estimate is therefore made of the amount of antibody present. The limitations of this process lie in the fact that the estimate is only semi-quantitative. The process only takes IgM antibodies into account, has long incubation periods, requires washing to separate the interfering substances, and is labor intensive.
In addition, when the patient has a high IgM immunoglobulin level, the proportion of bound IgMAc will decrease, thereby reducing sensitivity with the danger that positive results may be missed.
It will be noted, for this purpose, that the incubation periods used in the method of the present invention are short. Thus, after adding the antibodies directed against the IgG antibodies and optionally the antibodies directed against the IgA antibodies, the solution thus obtained is incubated with stirring at a temperature of approximately 37 [deg.] C for a period of in the range of 1 to 15 minutes. On the other hand, after adding the bound antigen to finely divided particles and the free antigen, the suspension thus obtained is also incubated with stirring at a temperature of about 37 [deg.] C for a period of time. in the range of 5 to 15 ninutes, a similar incubation being necessary after the possible addition of the aggregated IgG immunoglobulins used to neutralize the effect caused by rheumatoid factor.
Although the method of the invention can be applied to any infection, for example of the toxoplasmosis, cytomegalovirus, herpes, rubella, etc. type, an embodiment will be described relating to the determination of IgG and IgM antibodies. in a patient who contacted an infection caused by Brucella abortus while handling infected cattle. The antigen is in this case a lipopolysaccharide from Brucella (LPS). Example.
Preparation of LPS.
Brucella LPS is extracted using the water-phenol process from Westphal et al. [Methods in Carbohydrate Chemistry, volume 5 (1965), page 83, Académie Press, N.Y.]. The phenolic phase is then precipitated with three volumes of "methanolic reagent" and treated with
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by Moreno et al., [3. Bacteriology (1979), 361, 138, n [deg.] 2]. The lipopolysaccharide (LPS) is then dialyzed against deionized water and lyophilized.
Preparation of latex-antigen (LxLPS).
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diluted 5 times (dGBS) (GBS: buffered saline solution based
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weight / volume) (K109 - Rhône-Poulenc, Courbevoie, France) and the mixture is subjected to ultrasound for 1 minute at 30 watts (ultrasound device model B12, Branson, Danbu- <EMI ID = 13.1>
Human serum mine (HSA, Behringwerke, Marburg / Lahn, FRG) in GBS, and the suspension is again subjected to ultrasound. After 20 minutes of incubation at room temperature and centrifugation for 10 minutes at 10,000 rpm in an SS 34 rotor of a Sorvall R5 CB centrifuge, the latex is resuspended in 1 ml of aqueous sodium dodecyl sulfate solution , subjected to ultrasound and incubated for 1 hour at 37 [deg.] C. The latex is then washed twice with 1 ml of dGBS and it is resuspended in 1 ml of EDTA (ethylene diaminetetraacetate) -GBS-BSA
(bovine serum albumin). It is found that the latex stored frozen at -20 [deg.] C or lyophilized is stable for at least 6 months. It is subjected to ultrasound for 15 seconds at
30 watts of LxLPS which has been thawed or resuspended after lyophilization.
Before use, the LxLPS is diluted 100 times in EDTA-GBS-BSA.
Anti-Fc antibodies.
The Fc fragment of human IgG is prepared by papain digestion according to the method of Cerottini et al., [3. Immunology (1968) 101, page 433]. We inject
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intradermally in a goat at 3 week intervals. The serum is collected 15 days after the final injection, the immunoglobulins are extracted and they are used diluted in GBS (1 mg / ml) after checking their anti-Fc specificity.
Process.
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diluted 50 times in GBS. The mixture is incubated at 37 [deg.] C for 2 minutes while stirring. Then add 25
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25 mg / ml and the mixture is incubated again for <EMI ID = 17.1>
the resulting mixture is then passed through an optical cell counter where the concentration of non-agglutinated LxLPS is determined, by measuring the light scattering of this mixture. The concentration of IgM antibodies is inversely proportional to the concentration of free latex particles. One could obviously also directly measure the amount of agglutinated LxLPS or use for counting another optical method than light scattering, for example counting of particles by electrical resistance. To avoid errors due to an excessive concentration of IgM antibodies, the process is repeated with serum diluted 100 times and 200 times.
According to a variant, the agglutination of the latex can be measured by turbidimetry in the case where the concentrations of IgM and IgG antibodies are relatively high. The same quantities of human serum in GBS and of anti-Fc are incubated for 2 minutes at 37 [deg.] C with shaking. We add
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born and the mixture is allowed to incubate for 1 hour, after which i
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quickly mix and measure the turbidity at 620 nm and 405 nm, the wavelength of 620 nm constituting the baseline. The mixture is then left to incubate for 2 hours, after which the turbidimetric effect of the latter is measured a second time at the two wavelengths mentioned above. The decrease in the difference between the measurements taken initially at 620 nm and 405 nm and those taken after the 2 hour incubation is inversely proportional to the remaining free particles. One could also determine the amount of finely divided particles agglutinated or non-agglutinated in the resulting suspension by other optical density measurements than turbidity, such as colorimetry.
With regard to the assay of the total antibody activity, that is to say of the activity of the IgM + IgG antibodies (the serum exemplified above containing no IgA antibody), buffer is used. GBS alone in place of anti-Fc antibodies and LxLPS is used in place of LxLPS + LPS.
To determine the concentration of IgG antibody alone, the same method is used as for the determination of the total antibody activity, except that the IgM antibodies in the sample are destroyed by treating the sample beforehand. dithio-
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water at a concentration of 10 mg / ml and the whole mixture is then incubated at 37 [deg.] C for 30 minutes, after which the reaction is stopped
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0.2%. Then proceed as described above and dilute
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mentioned above.
The attached figure shows the IgM antibody concentrations of the same serum from a patient who contacted a Brucella abortus infection, obtained by a radioimmunoassay (RIA) method.
(in counts per minute) and by the method of the invention (in arbitrary agglutination units) over a period of one year.
As will be noted, the two curves are similar, which demonstrates that the assay method of the invention is reliable.
It should be understood that the present invention is in no way limited to the above embodiments and that many modifications can be made thereto without departing from the scope of this patent.
As has already been specified above, one could of course use as finely divided particles, instead of latex particles, red blood cells.
CLAIMS.
1. Method for the immunological assay of IgM antibodies in a liquid sample containing at least IgM and IgG antibodies, such as a biological fluid, characterized in that it comprises reacting said liquid sample containing the IgM, IgG antibodies and optionally IgA antibodies, antibodies directed against IgG antibodies and antibodies directed against IgA antibodies in the case where the aforesaid sample contains IgA antibodies, the addition to the reaction product thus obtained of a bound antigen to finely divided particles and of a free antigen of the same type as the bound antigen and the determination of the degree of agglutination or non-agglutination of these finely divided particles, the quantity of IgM antibodies being inversely proportional to the quantity of these finely divided, unagglutinated particles.