KR20000057315A - 항원-특이적 ＩｇＭ 검출방법 - Google Patents

항원-특이적 ＩｇＭ 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체액내 IgG 계열 면역글로불린과 류마토이드 인자와 같은 간섭인자의 존재하에 시료를 2 이상의 상이한 수용체 R1과 R2및 임의의 추가적인 수용체와 반응시켜 면역글로불린 M 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 다량체 형태의 결합파트너가 R2의 실질적인 성분이고, 동일한 특이성을 갖는 IgG 항체의 탁화효과가 단량체 형태의 결합파트너에 의해 억제되는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 면역글로불린 M 계열 항원-특이적 항체 검출방법용 시약 및 를 항원-특이적 IgM 항체 검출시 IgG 항체의 탁화효과를 억제시키는데 있어서 단량체 형태의 결합파트너의 용도에 관한 것이다.

Description

항원-특이적 ＩｇＭ 검출방법 {Antigen-specific IgM detection}
본 발명은 시료를 2 이상의 상이한 수용체 R1및 R2(상기 두 수용체들은 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, R1은 고형상에 결합되어 있거나 결합될 수 있고, R2는 표식을 운반한다) 와 반응시켜 체액내의 면역글로불린 M 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로, R1의 필수성분, 경우에 따라 R2의 필수성분 또한 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너이고, IgG 항체에 의한 간섭을 감소시키기 위하여 동일한 특이성을 갖는 단량체 형태의 결합파트너를 사용하는 것을 특징으로 한다.
특히, 본 발명은 IgG 계열 면역글로불린과 류마토이드 인자와 같은 간섭인자의 존재하에 IgM 계열의 면역글로불린을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
외래 물질의 도입에 반응하여, 포유류의 면역계는 면역글로불린이라 불리는 항체를 생성한다. 그들은 항원이라 칭하는 외래 물질에 대항하여 방어작용을 한다. 면역글로불린은 5 개의 상이한 종류로 분류될 수 있다. 이는 M, G, A, E 및 D 종의 면역글로불린으로 구별된다. 상기 5 면역글로불린 종류 각각은 μ, γ, α, ε 및 δ 사슬로 칭하는 중쇄(heavy chain) 의 조성이 상이하다.
각 면역글로불린 종류는 유기체내에서 상이한 기능을 갖는다. M 계열의 면역글로불린은 항원과 처음 접촉하여 일차 면역반응을 나타낸다. 그러나, 상기 면역글로불린의 농도는 감염이 진행됨에 따라 급속하게 감소한다. G 계열의 면역글로불린은 일차 면역반응후 처음에는 천천히 형성되다가, 동일한 항원으로 이차 감염되는 경우에 대량으로 생성된다. A 계열의 면역글로불린은 유기체의 점막 표면상에서 발견되고 거기에서 방어 작용들을 담당한다. E 계열의 면역글로불린은 주로 알레르기 반응을 담당한다. D 계열 면역글로불린의 정확한 기능은 지금까지 밝혀지지 않았다.
각각의 면역글로불린 종류는 혈액중에 매우 상이한 농도로 존재한다. 따라서, G 계열의 면역글로불린 (IgG) 은, 혈청성분의 약 75 % 에 해당하는 8 내지 18 mg/ml 농도로 존재하는 정상적인 사람 혈청의 주된 종류이다. 두번째로 많이 존재하는 면역글로불린은 평균 혈청 농도가 0.9 내지 4.5 mg/ml 인 IgA 이다. M 계열 면역글로불린은 0.6 내지 2.8 mg/ml 의 농도로 존재하고, D 계열의 면역글로불린은 0.003 내지 0.4 mg/ml 의 농도로 존재한다. IgE 항체의 비율은 가장 낮으며, 혈청중 0.02 내지 0.05 ㎍/ml 의 농도로만 존재한다.
많은 질병들의 차별적인 진단을 위해서, 특정 항원에 특이적인 하나 이상의 매우 특정한 면역글로불린 계열의 항체를 검출하는 것이 중요하다. 바이러스성, 박테리아성 및 기생충에 의한 감염의 만족할 만한 진단은 계열-특이적 항체 시험에 의해서 또는 특정 면역글로불린 계열의 존재를 배제함으로써만이 (예를 들어, IgG 및 IgA 항체는 검출되나 IgM 항체는 검출되지 않음) 이루어질 수 있다. 이는 새로운 또는 급성 감염과 초기에 일어나는 감염의 구별뿐만 아니라 감염 경로의 임상학적 모니터를 위해서 특히 중요하다. 항체의 계열-특이적 검출은 HIV, A형 간염, B형 간염, 톡소플라스마증, 풍진 및 클라미디아 감염에 특히 중요하다. 특정 항원에 특이적인 항체의 계열-특이적 검출은 방어항체 적정값의 결정 및 면역반응의 성공을 확인하는데도 필요하다. 새로운 급성 감염의 진단을 위해서, 항원에 특이적인 IgM 계열의 항체를 검출하는 것이 특히 주목할 만하다. 그러나, 예를 들어 동일한 특이성을 갖는 IgG 항체의 존재와 같은 다양한 간섭인자들이 항원-특이적 IgM 항체의 검출을 방해한다.
항원에 특이적인 특정 계열의 항체를 검출하기 위한 각종 방법들이 당 분야의 보고서에 기재되어 있다. 그러므로, 특정 계열의 항원-특이적 항체는 흔히 특정 항원으로 도포된 고형상에 특이적 항체를 결합시켜 검출된다. 고형상에 현재 결합되어있는 항원 특이적 면역글로불린 (Ig) 은 특정 계열의 사람 Ig 에 대해 특이적으로 만들어진 항체를 검출될 Ig 분자에 결합시켜 검출된다. 사람 Ig 에 대해 만들어진 항체를 표지시켜 검출을 수행하게된다. 그러나, 상기 시험 방법은 모든 비특이적이고 결합되지 않은 Ig 를 사람 Ig 에 대해 만들어진 계열-특이적이고 표지된 항체와 반응시키기 전에 세척하여 제거하여야만 가능하다. 그러므로, 자동화 시스템을 위해 자주 요구되는 1-단계 시험 방법은 불가능하다. 또한, 첫번째 단계에서, 항원에 특이적인 모든 계열의 항체는 고형상에 결합한다. 고형상의 항원도포가 충분히 높지 않을 경우, 항원에 결합할 각종 항체 계열의 경쟁적 반응이 일어날 수 있다. 이는 시험의 민감도를 약화시킬 수 있다.
1-단계 시험으로의 항체 검출은 일명 브릿지 시험 (Bridge test) 에 의해 수행될 수 있다. 브릿지 시험의 개요는 EP-A-0 280 211 에 기재되어 있다. 상기 방법에서, 예를 들어 항원과 같이, 검출될 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 수용체가 고형상에 결합된다. 검출될 항체는 고형상에 결합되어 있는 항원에 결합된다. 또한, 보다 특이적 항원이 표지된 상태로 시험 혼합물중에 존재한다. 항체는 상기 표식에 의해 검출된다. 그러나, 상기 시험에서는 특정 계열의 항체만이 아니라 모든 항원-특이적 항체들이 검출된다.
항원-특이적 IgM 항체를 검출하는 경우, 류마토이드 인자에 의해 추가적인 간섭이 일어난다. 일반적으로, 류마토이드 인자는 통상 그 자체로 IgG 항체의 Fc 영역에 높은 친화성을 갖는 IgM 계열의 항체이다. 그 결과, 류마토이드 인자는 특이적 IgM 항체용 면역검정법에서 상기 류마토이드 인자가 결합되도록 표면적으로 IgG 항체를 제공한다. 류마토이드 인자가 검출될 정도의 특이성을 갖는 IgG 분자를 갖고 있는 경우, 이는 잘못된 포지티브 측정결과를 초래할 수 있다.
항원-특이적 항체의 계열-특이적 검출에서 이러한 문제점이 DE 33 03 793 의 주제이다. 상기 문헌은, 안티-IgG 항체를 첨가하여 류마토이드 인자에 의한 간섭이 배제되는, 특정 Ig 계열 ("IgX") 의 항원-특이적 항체를 검출하는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법에서는, 바이러스 항원과 같은 특이적 항원을 고형상에 적용시킨다. 고형상에 결합된 바이러스 항원을 시료와 접촉시킨다. 다음 단계에서, 미결합 시료를 제거하고, 안티-IgX 항체를 이용하여 항원-IgX 의 고형상-결합 복합체를 검출한다. 특히 IgM 시험에서는 류마토이드 인자에 의한 간섭을 피하기 위하여, 시험전에 시료를 안티-IgG 항체로 처리한다. 따라서, 상기 방식으로 복합체화된 IgG 항체는 더 이상 류마토이드 인자에 의한 공격받을 수 없게 되고, 따라서 류마토이드 인자가 항원-특이적 IgG 분자에 결합할 수 없게되어, 잘못된 포지티브 결과를 초래할 수 없다. 그러나, 그들의 특이성과 관계없이 모든 IgG 항체가 결합되게 된다. 안티-IgG 항체와 간섭성 IgG 항체의 침전은 원하지 않는 침전물과 탁도를 초래하여 전체 시험에 부정적인 효과를 미칠 수 있다. 또한, 안티-IgG 항체로 시료를 예비처리하는 것은 공정을 복잡하게 만든다.
동일한 특이성을 갖는 기타 계열 항체에 의한 간섭을 배제하는 또 다른 방법이 WO 96/14337 에 개시되어 있다. 이 경우, IgG 항체에 의한 간섭을 배제하기 위하여 IgG 중쇄의 Fd 부분과 특이적으로 반응하는 항체 또는 항체 단편이 사용된다. 그 결과, IgG 의 항원결합능이 너무 강하게 차폐되어 더 이상 특이적 항원을 인식할 수 없게된다. 유사한 개념이 WO 96/14338 에 개시되어 있다.
상기 문헌에서는, 류마토이드 인자에 의한 간섭을 감소시키기 위하여 간섭-배제 시약으로 안티-Fd 항체 또는 그의 단편이 사용된다. 그러나, 높은 특이성을 갖는 안티-Fd 시약에 의한 간섭의 감소는 복잡하고 비용이 많이 든다.
당 분야의 방법으로는, 정교하고 값비싼 간섭-배제 시약 및/또는 몇종류의 특이적 항체를 첨가하지 않고, 1-단계 방법으로 면역글로불린 IgM 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 것이 불가능하다. 실제로는, 표지된 항원 및 고형상에 결합될 수 있는 항원을 사용하는 브릿지 시험 개념을 기초로 하여 당 분야의 문헌에 공지되어 있는 면역학적 검출방법으로 1-단계 시험이 가능하다. 그러나, 상기 단순한 원리를 이용해서는, 이제까지 IgG 및 IgM 계열의 항체를 함께 검출하는 것만이 가능하였다.
따라서, 이제까지의 과제는 특이적 항원에 대항하여 만들어진 IgM 계열의 항체를 검출하는 보다 향상된 방법을 제공하는 것이었다. 상기 방법은 정교하고 값비싼 간섭-배제 시약을 필요로 하지 않아야 되고, 또한 자동화 시스템에 유리하게 사용되도록 1-단계 시험 원리로 구성되어야만 한다.
상기 과제는 시료를 둘 이상의 상이한 수용체 R1및 R2(상기 두 수용체들은 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, R1은 고형상에 결합되거나 결합될 수 있고, R2는 표식을 운반한다) 와 반응시켜 면역글로불린 M 계열의 항원-특이적 항체를 검출하기 위한 본 발명의 방법에 의해 달성되며, 본 방법은 R1의 필수성분이 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너이고, 또한 단량체 형태의 결합파트너를 첨가하여 시료내에 존재하는 동일한 특이성을 갖는 IgG 분자에 의한 간섭을 배제하는 것을 특징으로 한다.
검출될 IgM 항체와 동일한 특이성을 갖고 있고 시료내에 존재하는 IgA, IgD 및 IgE 항체는 IgG 항체와 비교하여 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에 IgA, IgD 및 IgE 계열에 의한 간섭은 예상되지 않는다. IgA, IgD 및 IgE 항체 계열 (IgG 분자와 유사하고 5량체 형태로 존재하는 IgM 항체와는 대조적임) 은 단일 분자 형태로 존재하는 항체로서, 각각은 두 개의 항원 결합부위를 갖고 있다. 따라서, IgG, IgA, IgD 및 IgE 항체의 구조적인 유사성 때문에, 하기에 기재되어 있는 항원-특이적 IgM 검출방법에 의해, IgG 항체에 의해 야기되는 간섭효과와 더불어 IgD, IgA 및 IgE 항체에 의한 간섭효과 또한 감소되어질 것으로 생각된다.
본 발명의 방법은 동일한 항원 특이성을 갖는 IgG 계열의 항체가 존재하는 시료내에서 면역글로불린 M 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 방법은 류마토이드 인자의 존재하에서 수행될 수 있다. 시료의 정교한 예비처리는 필요치 않다.
놀랍게도, 항원-특이적 IgM 항체 검출용 면역검정법에서 본 발명에 따른 단량체 형태의 결합파트너를 사용하는 것이 동일한 항원-특이성을 갖는 IgG 항체에 의해 야기되는 간섭효과의 효과적인 배제를 가능하게 한다는 것이 밝혀졌다. 상기 방법에서는, 단량체 형태의 결합파트너가 IgG 항체의 항원 결합부위에 특이적으로 결합한다. 놀랍게도, 동일한 시료내에 존재하며 동일한 특이성을 갖는 검출될 IgM 항체는 단량체 형태의 결합파트너와 반응하지 않거나 또는 무시할 정도로 약하게만 반응한다. "무시할 정도로 약하다" 라는 말은 IgM 항체의 항원 결합부위가 단량체 형태의 결합파트너에 의해 블로킹되지 않는다는 것을 의미한다. 이는, 개별적인 분자 형태로 존재하며 단량체성 에피토프에 대해 실질적으로 보다 높은 친화성을 갖고 있는 IgG 항체와 비교하여, 단량체성 에피토프에 대한 5량체성 IgM 항체 훨씬 낮은 친화성이 기인하는 것으로 생각되어진다. 이는, 단량체 형태의 결합파트너가 존재함에도 불구하고, IgM 시험의 민감도가 손상되지 않음을 의미한다. 단량체 형태의 결합파트너에 의해 차폐된 IgG 항체는 IgM 시험을 간섭하지 않는다.
또한, 놀랍게도, 결합된 IgG 항체를 갖고 있는 류마토이드 인자에 의한 간섭효과도 에 결합하는 단량체 형태의 결합파트너에 의해 효과적으로 배제될 수 있다는 것이 밝혀졌다. IgG 항체의 항원 결합부위가 블로킹되기 때문에, 미리 IgG 항체 또는 류마토이드 인자를 분리해내지 않고도 항원-특이적 IgM 항체를 검출할 수 있다. 단량체 형태로 사용되는 결합파트너는 차폐된 IgG 항체 또는 류마토이드 인자의 응집반응을 촉발시킬 수 없다. 이는 전체 시험 과정에 부정적인 효과를 미칠 수 있는 침전물에 기인하는 원하지 않는 탁도를 예방한다.
따라서, IgM 항체를 분리하기 위한 연속적인 시험 공정은, 상기 항체가 간섭효과를 유발하지 않기 때문에, 본 발명에 따른 방법에 절대적으로 필요한 것은 아니다. 그러므로, 본 방법 특유의 장점은 시험 공정의 간편성이다.
시험 시약들이 액상으로 존재하는 일명 습식 시험과는 별개로, 단백질 또는 항체의 검출에 적합한 모든 표준 건식 시험 형식 또한 사용될 수 있다. 상기 건식 시험 또는 예를 들어 EP-A-0 186 799 에 기재된 시험 스트립에서, 시험 성분들이 캐리어에 도포된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법이 시험 스트립 형식으로 수행되는 경우 세척단계는 필요가 없다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 습식 시험으로 수행되는 것이 바람직하다.
모든 수용체들과 단량체 형태의 결합파트너를 시료와 함께 반응시켜 상기 방법을 1 단계로 수행하는 것이 가능하다. 이는 경우에 따라 반응후 단 1 회의 세척 단계를 필요로 한다.
일반적으로, 본 발명의 방법을 수행하기 위해서는 두 개의 상이한 수용체 R1과 R2및 단량체 형태의 결합파트너가 사용된다. 습식 시험이 사용되는 경우, 수용체 R2는 액상으로 존재한다. R1은 액상으로 존재하거나, 또는 미리 고형상에 결합될 수 있다. 단량체 형태의 결합파트너는 액상으로 존재하는 것이 바람직하다.
고형상에 결합할 수 있으나 아직 고형상에 결합되지 않은 수용체가 R1로 사용되는 경우, 시료를 수용체 R1과 R2및 단량체 형태의 결합파트너와 반응시킨다.
상기 방법에서, 시료항체는 R1및 R2에 결합한다. 상기 반응은 고형상의 존재하에 일어날 수 있다. 상기 과정에서 고형상-R1-시료항체-R2- 로 구성된 복합체가 형성된다. 이어서, 고형상을 액상으로부터 분리해 내고, 경우에 따라 고형상을 세정하고, R2의 표식을 측정한다. 표식은 통상 고형상내에서 측정되나, 액상에서도 측정될 수 있다.
시료를 R1과 R2및 단량체 형태의 결합파트너와 반응시키는 것은 고형상의 부재하에 수행되며, 이후 전체 시험 혼합물을 고형상과 접촉시켜야 하고, 경우에 따라 세척을 수행하고, 표식을 측정한다.
수용체 R1이 미리 고형상에 결합된 형태인 경우, 고형상에 결합된 수용체 R1에 시료 및 수용체 R2를 첨가한 후 함께 반응시킨다. 상기 시험 방법에서, 시험 혼합물을 고형상에 결합된 수용체 R1에 첨가하기 전에 시료를 단량체 형태의 결합파트너 및 R2와 예비반응시키는 것이 바람직하다. 이후의 방법은 상기 기술된 바와 동일하다.
본 발명의 방법을 여러 단계로 수행하는 것도 가능하다. 이 경우, 시료를 단량체 형태의 결합파트너 및 이후에 수용체 R1및 R2와 반응시키는 것이 바람직하다. 이후, 시험 혼합물을 다른 수용체와 반응시킴으로써 여러 단계로 수행할 수 있다. 이후의 시험 방법은 앞에서 기술된 방법과 동일하다.
R1의 중요한 성분은 폴리햅텐이라고도 칭해질 수 있는 검출될 IgM 항체에 의해 특이적으로 인식되어지는 단량체 형태의 결합파트너이다. 본 발명에 따른 다량체 형태의 결합파트너는, 바람직하게는 동일하거나 유사한, 수개의 동일한 에피토프 영역이 검출될 항체와 특이적으로 반응하는 캐리어에 결합되는 구조로 이해되어진다. "유사" 또는 "동일" 하다는 말은 다량체 형태의 결합파트너상에 존재하는 구조가 반드시 동일할 필요가 없다는 것을 의미한다. 유일한 조건은 검출될 IgM 항체가 상기 에피토프 영역에 특이적으로 반응해야 한다는 것이다. 에피토프 영역은 예를 들어 항원 또는 안티-이디오타입 항체로부터 유래될 수 있다. 또한, 에피토프 영역은 예를 들어 글리케이트된 단백질내에 존재하는 것과 같은 슈가 사슬로부터 유래될 수도 있다. 이는 또한 예를 들어 인지질 또는 리포단백질 형태로 존재하는 것과 같은 지질 구조로부터 유래될 수도 있다. 따라서, 폴리햅텐 또는 다량체 형태의 결합파트너는 다수의 동일하거나 유사한 에피토프 영역으로 구성되며, 이에 따라, 이미 상기에서 설명한 바와 같이, 다수의 유사한 시료항체용 결합부위를 갖는다. 단백질이 항원인 경우의 결합부위는 그의 서열이 단백질 항원 (피검체) 의 단백질 서열중 일부이고, 여기에 상기 단백질에 대항하여 만들어진 항체가 특이적으로 결합하는 펩티드로 이해되어진다. 슈가 구조를 함유하는 항원의 경우, 결합부위는 시료항체가 특이적으로 결합하는 슈가분자의 영역이다. 지질 구조의 경우, 지질분자가 시료항체용 결합부위일 수 있다. 또한, 결합부위는 펩티드성 영역과 슈가 및/또는 지질의 조합물로 구성될 수도 있다. 그러나, 펩티드를 기초로 하는 폴리햅텐이 다량체 형태의 결합파트너로 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 다량체 형태의 결합파트너의 경우, 5량체성 IgM 시료항체가 다량체 형태의 결합파트너에 높은 친화성을 갖고 특이적으로 결합하도록 에피토프 밀도가 높은 것이 중요하다. 본 발명에 따른 다량체 형태의 결합파트너의 개별적인 펩티드 성분에 대한 다른 기준은 단량체 형태의 결합파트너용으로 하기에 기재된 요건과 동일하다.
예를 들어 라텍스, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 또는 골드입자가 폴리햅텐용 캐리어 물질로 사용될 수 있다. 덱스트란과 같은 중합체나 폴리리신, 소 혈청 알부민, β-갈락토시다제, 비특이적 면역글로불린 또는 그의 단편과 같은 폴리펩티드 또한 폴리햅텐용 캐리어 물질로 사용될 수 있다. 캐리어 선택의 유일한 조건은 이것이 시료액내 항체와 교차반응성이 없어야 한다는 것이다. 다른 조건은 햅텐이 캐리어에 결합될 수 있어야 한다는 것이다. 에피토프 영역 또는 햅텐은, 예를 들어 EP-A-0 650 053 및 WO 96/03652 에 기재되어 있는 방법과 같이, 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 캐리어에 결합된다. 또한, 상기 언급된 특허출원 공개공보에도 기재되어 있는 에피토프 영역과 캐리어 물질 사이에 스페이서 영역이 삽입될 수도 있다. 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 모든 스페이서가 사용될 수 있다. 한 가지 요건은 이들이 면역학적으로 불활성이어야 한다는 것이다. 즉, 이들이 시료내 항체와 교차반응해서는 안된다.
R1은 고형상에 직접 결합할 수 있거나, 특이적 결합 시스템을 이용하여 고형상에 간접적으로 결합된다. R1이 고형상에 직접 결합하는 것은 당분야의 숙련자에게는 공지된 방법에 의해 달성된다. R1이 특이적 결합 시스템을 이용하여 고형상에 간접적으로 결합되는 경우, R1은 본 발명에 따른 다량체 형태의 결합파트너와 특이적 결합 시스템의 결합파트너로 구성된 컨쥬게이트이다. 이 경우, 특이적 결합 시스템은 서로 특이적으로 반응할 수 있는 두 개의 파트너로 이해되어진다. 이 경우, 결합능은 면역학적 반응 또는 또 다른 특이적 반응에 기초할 수 있다. 바이오틴과 아비딘 또는 바이오틴과 스트렙트아비딘의 조합이 특이적 결합 시스템으로 사용되는 것이 바람직하다. 기타 바람직한 조합은 바이오틴과 안티바이오틴, 햅텐과 안티-햅텐, 항체의 Fc 단편과 상기 Fc 단편에 대한 항체, 또는 탄수화물과 렉틴이다. 이러한 특이적으로 결합가능한 쌍의 결합파트너중 하나는 수용체 R1을 형성하는 컨쥬게이트의 일부이다.
이때, 특이적 결합 시스템의 다른 하나의 결합파트너는 고형상내에 존재한다. 특이적 결합 시스템의 다른 하나의 결합파트너는 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 통상의 방법에 의해 불용성 캐리어에 결합될 수 있다. 이 경우, 공유 및 흡착성 결합이 적당하다. 특히 적합한 고형상은 내부표면이 특이적 결합 시스템의 반응파트너로 도포되어 있는 폴리스테렌 또는 유사한 플라스틱 재질의 시험관 또는 마이크로타이터 플레이트이다. 라텍스 입자, 분자체 물질, 글래스 비드, 플라스틱 튜브와 같은 입자성 물질도 적합하며 특히 바람직하다. 종이와 같은 다공성 층구조의 캐리어 또한 캐리어로 사용될 수 있다.
수용체 R2는 시료항체 및 표식과 특이적으로 반응하는 분자로 구성되어 있다. 시료항체와 특이적으로 반응하는 분자는, 예를 들어, 시료항체에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 단백질, 항원 또는 햅텐일 수 있다. R2의 성분인 분자의 유일한 조건은 그것이 검출될 시료항체와 특이적으로 반응해야 한다는 것이다. 이러한 분자는 시료항체에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 다형체 형태의 결합파트너인 것이 발마직하다. R2내에 포함되는 다량체 형태의 결합파트너는 R1용 다량체 형태의 결합파트너와 동일한 방법에 의해 제조된다.
수용체 R2의 다른 성분으로는 표식이 있다. 표식으로는, 예를 들어, 화학발광물질, 형광물질 또는 방사성 물질 또는 금속졸, 라텍스 또는 골드입자와 같이 직접 검출가능한 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 햅텐과 같은 효소 또는 기타 생물학적 분자 또한 표식으로서 바람직하다. 햅텐중에서 디그옥시게닌이 표식으로 특히 바람직하다. 표지방법은 당 분야의 숙련자에게는 잘 알려져 있으며, 더 이상 설명할 필요는 없다. 표식은 화학발광물질, 형광물질 또는 방사성 물질 또는 금속졸, 라텍스 또는 골드입자를 측정하거나 또는 효소에 의해 변환된 기질을 측정함으로써 직접적으로 검출된다.
표식은 또한 간접적으로 검출될 수 있다. 이러한 경우에 수용체 자체가 시그날-생성기와 차례로 연결되는 또 다른 수용체가 디그옥시게닌과 같은 햅텐인 R2의 표식에 특이적으로 결합한다. 시그날-생성기, 예를 들어, 화학발광물질, 형광물질 또는 방사성 물질 또는 효소 또는 골드입자는 당 분야의 숙련자에게 친숙한 방법에 의해서 검출된다. 항체 또는 항체 단편은 예를 들어 R2의 표식에 특이적으로 결합하는 또 다른 수용체로서 사용될 수 있다. 표식의 상기 간접적 검출이 사용되는 경우, R2표식은 디그옥시게닌 또는 또 다른 햅텐인 것이 바람직하고, 검출은 디그옥시게닌 또는 햅텐에 대해 생성된 퍼옥시다제와 커플된 항체를 통해 수행된다.
동일한 항원 특이성의 IgG 항체에 의한 간섭을 줄이기위해, 본 발명에 따라 시험 화합물에 단량체 형태의 결합파트너가 첨가된다. "단량체"란 용어는 본 발명에 따른 단량체 형태의 결합파트너가 하나의 에피토피 영역만을 또는 IgG 항체와 면역학적으로 특이적으로 반응하는 구조인, 간섭 효과가 감소될 항원에 대한 단 하나의 결합 부위를 함유하는 것을 의미한다. 이들 결합파트너의 단량체 구조는 간섭이 감소될 항원-특이적 IgG 항체가 단량체 형태의 결합파트너에 결합하고, 검출될 IgM 항체에 결합하지 않도록 하는 것이 중요하다.
에피토프 영역은 다량체 형태의 결합파트너에 대해 상기에 기재한 것 처럼, 예를 들어 항원 또는 안티-이디오타입 항체로 부터 유래될 수 있다. 다량체 형태의 결합파트너를 위한 선행 조건에 따라, 단량체 형태의 결합파트너의 에피토프 영역은 또한 슈가 및/또는 지질 구조 또는 펩티드에 의한 지질 및/또는 슈가성분들의 조합된 구조로부터 유래될 수 있다. 간섭 효과가 저하될 IgG 계열의 항체가 동일한 특이성의 IgM 항체의 존재하에서 특이적으로 결합하는 결합부위를 갖는 에피토프 영역이 유래될 수 있는 모든 구조가 사용될 수 있다. 결합 부위, 즉 단량체 형태로 사용되는 결합파트너를 위한 유일한 선행 조건은 IgG 에 결합하는 특이적인 능력이 보유되어야 한다는 것이다. 이러한 조건은 또한 슈가 또는 지질 구조가 결합부위내에 존재하는 경우에도 적용된다.
본 발명에 따르면, 간섭 효과가 제거될 IgG 항체가 특이적으로 결합되는 결합부위의 측면에 위치하거나 또는 겹치는 단량체 형태의 결합파트너를 사용하는 것도 가능하다. 그러므로, 또한 검출될 IgM 항체에 의해 인지되는 에피토프와 정확하게 동일하지 않은 에피토프를 함유하는 결합부위를 가진 IgG 항체에 의해 간섭을 제거할수 있다. 이들 IgG 항체는 검출될 IgM 항체와 다소 교차-반응성을 가질수 있다. 이들 교차-반응 항체의 에피토프에 상응하며, 따라서 이들에 대해 높은 친화성을 가지는 단량체 형태의 결합파트너의 첨가는 또한 이들 IgG 항체에 의한 간섭 효과를 제거한다. 바람직하게는 검출될 IgM 항체의 에피토프와 다소 겹치는 단량체 형태의 결합파트너의 혼합물이 IgG에 의한 간섭을 제거하는데 사용될수 있다.
펩티드는 바람직하게는 단량체 형태의 결합파트너로 사용된다. 분석물질이 단백질인 경우에, 다량체 형태의 결합파트너에 대한 정의와 마찬가지로, 결합부위는 펩티드인 것으로 이해되며, 그의 서열은 단백질 항원의 단백질 서열의 일부이고 항체, 본 발명의 경우 IgG 항체가 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합한다. 또한, 상기 펩티드에 대해서 결합부위는 또한 앞서 언급된 펩티드와 같이 검출될 IgG 항체에 대한 동등한 결합 특이성 및/또는 친화성을 본질적으로 가진 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 펩티드는 바람직하게는 개별적인 아미노산 잔기들을 치환, 결손 또는 삽입시킴으로써 상기 언급된 펩티드로부터 유래될 수 있다.
특이적 결합부위에 상응하는 본 발명에 따른 펩티드는 또한 하나 이상의 아미노산이 화학반응에 의해 유도체화된 펩티드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 펩티드 유도체의 예는 특히 주쇄 및/또는 반응성 아미노산 측쇄기, 예를 들어, 유리 아미노기, 유리 카르복실기 또는/및 유리 히드록실기가 유도체화된 상기 분자이다. 아미노기 유도체의 구체적인 예는 술폰아미드 또는 카르복사미드, 티오우레탄 유도체 및 암모늄염, 예를 들어 히드로클로라이드이다. 카르복실기 유도체는 염, 에스테르 및 아미드이다. 히드록실기 유도체의 예는 O-아실 또는 O-알킬 유도체이다. 펩티드는 바람직하게는 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법들에 따라서 화학적 합성에 의해 생성되므로 특별히 여기에서 설명할 필요는 없다.
덧붙여, 용어 펩티드 유도체는 또한 하나 이상의 아미노산이 천연 발생 또는 비-천연 발생적인 20 개의 "표준" 아미노산의 아미노산 상동체로 대체된 펩티드를 포함한다. 상기 상동체의 예는 4-히드록시프롤린, 5-히드록시리신, 3-메틸히스티딘, 호모세린, 오르니틴, β-알라닌 및 4-아미노부티르산이다. 펩티드 유도체는 그들이 유래되는 펩티드로서 간섭 효과가 저하될 IgG 항체에 대한 결합 특이성 및/또는 친화성이 본질적으로 동등해야만 한다.
특이적 결합부위에 상응하는 본 발명에 따른 펩티드는 또한 상기 언급된 펩티드 또는 펩티드 유도체와 같이 간섭 효과가 저하될 IgG 항체에 대한 동등한 결합 특이성 및/또는 친화성을 본질적으로 가지고 있는, 하기에서 펩티드-유사체라 불리는 펩티드-유사물질로 언급된다. 펩티드-유사체는 검출될 항체와의 상호작용 면에서 펩티드를 대체할 수 있고 특히 프로테나제 및 펩티다제에 대해 천연 펩티드 보다 더 높은 안정성을 가질 수 있는 화합물이다. 펩티드-유사체의 제조방법은 문헌 [Giannis 및 Kolter, "Angew. Chem." 105 (1993), 1303-1326 및 Lee 등, Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010] 에 기재되어 있다.
결합부위의 길이, 예컨데 본 발명에 따른 단량성 펩티드의 길이는 대체적으로 4 개 이상의 아미노산이다. 길이는 바람직하게는 4 내지 20 개, 6 내지 15 개의 아미노산, 또는 특히 바람직하게는 9 내지 12 개의 아미노산이다. 펩티드-유사체 또는 펩티드 유도체의 경우에 있어서, 분자의 크기에 있어서 유사길이가 필요하다.
단량체 형태의 결합파트너로서 본 발명에 따른 단량체형 펩티드는 간섭 효과가 저하될 IgG 항체가 특이적으로 결합하는 에피토프를 함유한다. 그러나, 더 이상 특이적 에피토프에 상응하지 않는 그 이상의 플랭킹 펩티드 서열이 펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단 끝에 존재할 수도 있다. 이러한 수단이 펩티드의 용해도를 개선시키는데 필요할수도 있다. 유일한 선행 조건은 단량체 형태의 결합파트너로서 펩티드가 실제 단량체로서 존재하고 간섭 효과가 감소될 IgG 항체와 강력하게 결합하는 능력을 보유하는 것이다.
단량체 형태의 결합파트너(이경우 펩티드)의 사용을 위한 선행 조건은 동일한 에피토프가 다량체 형태의 폴리햅텐 또는 다량체 형태의 결합파트너상에 존재하는 것처럼, 동일한 에피토프가 단량체의 형태로 존재하는 것이다. 이것은 효과적으로 간섭을 제거하기위해, 단량체 형태의 결합파트너에 결합하는 IgG 항체가 검출될 IgM 항체와 같이 동일한 면역특이성을 가지고 있어야 한다는 것이다. IgM 항체 시험에 있어서, 간섭은 동일한 항원 특이성을 가진 IgG 항체로부터 항상 제거되어야한다.
단량체 형태의 결합파트너는 바람직하게는 다량체 형태의 결합파트너상의 에피토프의 농도에 비해 10-배 내지 10,000-배 과량으로 사용된다. 단량체 형태의 결합파트너는 바람직하게는 10-배 내지 1000-배 및 특히 바람직하게는 100-배 과량으로 사용된다. 단량체 형태의 결합파트너의 농도는 단량체 형태의 결합파트너가 일정 농도이상에서 더이상 용해성이지 않는 한에만 제한된다. 다량체 형태의 결합파트너상의 에피토프의 농도는 캐리어 물질의 크기에 의존하며, 당 분야의 기술자에 의해 어떤 시험 절차 및 어떤 검출 파라미터로도 개별적으로 용이하게 결정될 수 있다. 캐리어 물질당 5 내지 500 ng 펩티드의 다량체 형태의 결합파트너상의 에프토프의 농도에 대한 가이드 값이 펩티드 에피토프의 경우(길이: 6 내지 20 아미노산)에 적당한 것으로 밝혀졌다.
단량체 형태의 결합파트너에 더하여, 예를 들어 도입부분에 기술된 안티-Fd 항체와 같은 추가의 간섭-제거제가 IgG 항체에 의한 간섭 효과를 추가로 감소시키기 위하여 또한 사용될 수 있다.
동종법(homogeneous methods) 뿐만 아니라 이종법(heterogeneous methods)도 항원-특이적 IgM 시험에 대한 시험 절차로서 사용될 수 있다. 동종 시험 절차에서, R1, 시료-IgM 및 R2로 구성된 복합체는 고형상에 결합되지 않는다. 대신에 그러한 여러 복합체의 서로간의 응집이 IgM의 농도의 측정 수단이 되는 혼탁도를 유도한다. IgG 저촉 효과를 감소시키는 단량체 형태의 결합타트너는 응집을 방해하지는 않는다.
그러나, 바람직하게는 이종법이 실시된다. 특히 바람직하게는 브릿지-시험 원리 (EP-A-0 280 211 참조) 에 따른 방법이 실시된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리햅텐 및 특이적 결합 시스템의 결합파트너, 바람직하게는 바이오틴의 컨쥬게이트가 R1로서 사용된다. R2는 본 발명에 따른 폴리햅텐 또는 다량체 형태의 결합파트너 및 표식, 바람직하게는 디그옥시게닌으로 이루어진다. 특히 바람직하게는 동일한 폴리햅텐이 R1및 R2에서 사용된다. 이러한 바람직한 구체예에서, 수용체 R1및 R2는 이 경우에 바람직한 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로, 동시에 시료 및 단량체 형태의 결합파트너, 바람직하게는 펩티드로 피복된 고형상의 존재하에 항원배양된다. 이 공정에서, R1및 R2의 다량체 형태의 결합파트너는 검출될 IgM 항체와 특이적으로 반응하는 반면, 동일한 특이성의 IgG 항체는 펩티드, 즉 단량체 형태의 결합파트너에 의해 차폐되어 다량체 형태의 결합파트너에 결합할 수 없다. 따라서, 아비딘/스트렙트아비딘-R1-IgM-시료항체-R2의 전체 복합체가 고형상에 결합된다. 액상으로 부터 고형상을 분리시키고, 임의로 고형상을 세척한후, 고형상에 결합된 복합체는 R2의 표식을 특이적으로 인식하는 추가의 수용체와 함께 (이경우에 디그옥시게닌에 대항하여 만들어진 항체와 함께) 항원배양된다. 또 다른 수용체 바람직하게는 퍼록시다제 효소와 함께 신호-발생기에 결합된다. 또 다른 임의의 세척 단계후에, 시료항체는 신호-발생기를 통해, 이경우 효소에 의해 전환된 기질에 의해 검출된다. 이 시험 절차에서, R1, R2단량체 형태의 결합파트너 및 추가의 수용체와의 시료의 항원배양은 또한 동시에 실시될 수 있다. 이는 시험 절차를 더욱 단순화시킨다.
상기 시험 절차는 또한 자동화된 시스템의 용도에 매우 적합하다. 다양한 HIV 항원에 대항하는 HIV 항체들과 같은 여러 항원-특이적 IgM 항체를 검출하는 것이 또한 가능하다. 그러한 경우에, 추가적 수용체가 R2의 표식을 특이적으로 인식하므로, 추가적 수용체가 또한 범용 표식으로 사용될 수 있다. 만약 상이한 항원 특이성을 갖는 여러 IgM 항체가 동시에 검출된다면, 간섭 효과를 감소시키는데 사용되는 단량체 형태의 결합파트너뿐만 아니라 R1및 R2의 폴리햅텐 성분도 적당한 특이성을 가져야만 한다.
당 분야의 기술자에게 공지된 생물학적 액체가 시료로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액 등과 같은 체액이 시료로서 사용된다.
시료에 더하여, 고형상 및 상기 수용체, 완충액, 염, 세정제, BSA 와 같은 단백질 첨가제와 같이 용도에 따라 요구되는 기타 첨가제들이 시험 혼합물에 존재할 수도 있다. 당 분야의 기술자에 알려진 필수 첨가제는 단순한 방법에 의해 그에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 과제는 또한 면역글로불린 M 계열 항원-특이적 항체의 검출방법용 시약으로, 이는 면역검정용 일반적인 시험 첨가제들외에, 단량체 형태의 결합파트너, 즉 바람직하게는 펩티드, 및 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너가 필수 성분이고 고형상에 결합할 수 있는 검출될 항체에 결합가능한 수용체 R1을 함유한다.
본 발명의 또 다른 과제는 면역글로불린 M 계열 항원-특이적 항체의 검출방법용 시약으로서, 이는 면역검정법용 일반적인 시험 첨가제들외에, 단량체 형태의 결합파트너, 즉 바람직하게는 펩티드, 및 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너가 수용체 R1및 R2각각의 필수 성분이고 R1이 고형상에 결합할 수 있고 R2가 표식을 운반할 수 있는 검출될 항체에 결합가능한 두개의 수용체 R1및 R2를 함유한다.
본 발명의 또 다른 과제는 본 발명에 따른 상기 방법들중 하나에 의한 IgM 항체의 항원-특이적 검출을 위한 다량체 형태의 결합파트너의 용도이다.
본 발명의 추가적인 과제는 항원-특이적 IgM 항체의 검출방법에서 IgG 항체 및/또는 류마토이드 인자에 의한 간섭 효과를 감소시키기 위한 단량체 형태의 결합파트너, 즉 바람직하게는 펩티드의 용도이다..
본 발명은 하기 실시예에 의해 규명되어진다.
항원-특이적 IgM 시험: 안티-HIV 2-IgM
바이오틴으로 표지되고 또한 디그옥시게닌으로 표지된 다형체성 항원 (HIV 2) 를 시료항체 및 스트렙트아비딘으로 도포된 고형상과 반응시킨다 (25℃ 또는 37℃ 에서 약 60 내지 180 분간 반응, 본 실시예에서는 25℃ 에서 120 분간 반응시킴). 세정단계후, 벽면에 결합된 면역 복합체를 안티-디그옥시게닌-퍼록시다제 결합물과 반응시킨다 (25℃ 또는 37℃ 에서 약 30 내지 120 분간 반응, 본 실시예에서는 25℃ 에서 60 분간 반응시킴). 추가적인 세정단계후, 퍼록시다제 결합물로 표지된 면역 복합체를 기질반응에 의해 검출한다 (25℃ 또는 37℃ 에서 약 30 내지 120 분간 반응, 본 실시예에서는 25℃ 에서 60 분간 반응시킴).
상기 반응단계들 (기질반응 제외) 은 약 0.05 내지 0.4 % 의 세정제 (여기에서는 0.2 % 폴리도칸올) 와 약 0.5 % 의 단백질/단백질 유도체 첨가물 (여기에서는 특히 락트알부민에서 추출한 펩톤과 BSA) 을 함유하는 Tris/HCl 완충액 (pH 7.5, 50 내지 150 mM, 본 실시예에서는 100 mM) 내에서 수행된다.
이 경우, 시료항체는 안티-HIV 네가티브 인간 혈청중에 약 2-10 ㎍/ml 의 농도로 희석된 HIV2 에피토프에 대해 만들어진 모노클론성 마우스 항체 (IgM 및 IgG) 이다.
경쟁 시험은 유리상태의 비표지 HIV 2 펩티드 항원을 폴리햅텐상의 펩티드 에피토프 농도에 대해 10배 또는 100배 과량으로 사용하여 수행된다.
mA 에서의 시험 시그날:
시료〈HIV 2〉MABs 유리펩티드를넣지 않은 폴리햅텐 평가 10배의 유리 펩티드를첨가한폴리햅텐 평가 100배의 유리펩티드를첨가한폴리햅텐 평가
IgM2.6.6 2460 포지티브 2488 포지티브 2457 포지티브
IgM2.22.8 1950 포지티브 1990 포지티브 1985 포지티브
IgG A 2490 포지티브 376 경계선 189 네가티브
IgG B 626 포지티브 167 포지티브 152 네가티브
IgG C 5699 포지티브 1575 포지티브 286 네가티브
IgM 과 IgG 인식 IgM 과소량의IgG 인식 IgM 에특이적
단량체성 펩티드의 첨가는 HIV 2 항체 시험을 IgM 에 대해 특이적이게 한다. 일부의 시료는 펩티드의 첨가 없이도 잘못된 포지티브 시험결과를 나타낸다.

Claims (10)

  1. 시료를 2 이상의 상이한 수용체 R1및 R2와 반응시켜 면역글로불린 M 계열의 항원-특이적 항체를 검출하는 방법으로, 상기 수용체 R1및 R2는 모두 항체에 특이적으로 결합할 수 있고, R1은 고형상에 결합되어 있거나 결합될 수 있고, R2는 표식을 운반하며, R1의 필수성분은 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너이고, 단량체 형태의 결합파트너를 첨가하여 시료내에 존재하며 동일한 특이성을 갖는 IgG 항체에 의한 간섭효과를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, R1및 R2의 필수성분은 검출될 항체에 의해 특이적으로 인식되는 다량체 형태의 결합파트너이고, 단량체 형태의 결합파트너를 첨가하여 시료내에 존재하며 동일한 특이성을 갖는 IgG 항체에 의한 간섭효과를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 고형상에 R1을 결합시키는 특이적 결합 시스템으로 바이오틴/아비딘, 바이오틴/스트렙트아비딘, 바이오틴/안티바이오틴, 햅텐/안티햅텐, 항체의 Fc 단편/상기 Fc 단편에 대항하는 항체, 또는 탄수화물/렉틴을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 수용체 R2가 화학발광물질, 형광물질 또는 방사성 물질이나 효소 또는 다른 생물학적 분자로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 시료를 R1과 R2및 간섭효과를 감소시키기 위하여 사용되는 단량체 형태의 결합파트너와 동시에 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, R2의 표식용 특이적 수용체와 표식의 컨쥬게이트로서 수용체 R2의 표식에 특이적으로 결합하는 추가적인 수용체와 시험혼합물을 반응시킨 후, 표식을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, 간섭효과를 감소시키기 위하여 사용되는 단량체 형태의 결합파트너를 R1및 R2의 다량체 형태내 결합파트너상의 에페토프 농도와 비교하여 10 배 내지 10,000 배 과량으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 통상의 면역검정용 시험 첨가물에 추가하여, 고형상에 결합할 수 있는 검출될 항체에 결합가능하고 그의 필수성분이 다량체 형태의 결합파트너인 수용체 R1과 단량체 형태의 결합파트너를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 M 계열 항원-특이적 항체 검출방법용 시약.
  9. 통상의 면역검정용 시험 첨가물에 추가하여, 검출될 항체에 결합가능하고 그의 필수성분이 다량체 형태의 결합파트너인 두 개의 수용체 R1과 R2및 단량체 형태의 결합파트너를 함유하며, 이때 R1은 고형상에 결합가능하고 R2는 표식을 운반하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 따른 면역글로불린 M 계열 항원-특이적 항체 검출방법용 시약.
  10. 항원-특이적 IgM 항체의 검출방법에서 IgG 항체 및/또는 류마토이드 인자에 의한 간섭효과를 감소시키기 위한 단량체 형태의 결합파트너의 용도.
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