TW434405B - Process to determine antigen-specific antibodies of the immunoglobulin class M (IgM) and reagents used therein - Google Patents

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經濟部中央樣準局負工消费合作社印製 在34405钱 A7 ----------------B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關一種測定體液內所含Μ類免疫球蛋白抗 原特異性抗體的方法’其係經由將樣品與至少兩種不同的 受體111與1^2 —起溫浸’其中該兩種受體皆適宜特異性結 合到該抗體，Ri係結合或可結合到一固相且只2載著一標 誌’其中R :及視情況R 2的一必需成分爲可被要測定的抗 體特異性辨識出之個別多體形式結合伴體且使用單體形式 的結合伴體來減少IgG抗體的千擾。 特別者，本發明係有關一種可在I g G類免疫球蛋白 及干擾因子如類風濕因子存在中特異性偵檢IgΜ類免疫 球蛋白之方法。 對於外來物質侵入的反應中，哺乳動物生物所具免疫 系統會產生也稱爲免疫球蛋白之抗體。彼等可抵抗也稱爲 抗原之外物。免疫球蛋白可分成五種不同類別：Μ，G， A，Ε和D。彼等所含分別稱爲u，X，α，ε，5的重 鏈各具不同組成。 每一類免疫球蛋白在生物體內各具不同的功能β 乂類 免疫球蛋白係在與抗原的首先接觸時出現，所請的第一免 疫作用。不過，隨著感染的進展這些免疫球蛋白的濃度會 迅速地減少。在第一免疫作用過程中1 G類免疫球蛋白會 慢慢地形成且在發生相同抗原的第二次感染時以大量發生 。Α類免疫球蛋白係發現於生物體的黏膜表面上並負責這 些區域的抵抗程序。E類免疫球蛋白主要負責這敏反應。 D類免疫球蛋白的正確機能則爲至此爲止尙未知悉者。 個別免疫球蛋白類別在血液中的濃度彼此極爲不同。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中固國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -4- 經濟部中央標隼局負工消費合作社印製 434405® λ? B7 五、發明説明〇2 ) G類免疫球蛋白（I gG)係正常人類血淸中的最強類， 百分比爲7 5%，相當於8至1 8毫克/毫升之血淸濃度 。在IgG之後者爲血淸濃度爲0.9至4·5毫克/毫 升之I gA類免疫球蛋白的存在濃度爲〇 . 6至 2 . 8毫克/毫升，D類免疫球蛋白的存在濃度爲 0 · 00 3至0 . 4毫克/毫升。I gE抗體的比例最低 ，在血淸中的濃度只有0.002至0.05微克/毫升 〇 對於許多疾病的差別診斷1重要者爲偵檢一或數種對 特殊抗原具特異性的頗爲特殊免疫球蛋白類別之抗體。病 毒，細菌和寄生物感染的充足診斷只能利用類別-特異性 抗體偵檢或經由排掉某些免疫球蛋白類別的存在（例如， 偵檢到I g G和I g A抗體但未偵檢到I g Μ抗體）予以 完成。此點對於新的或急性的感染與過去發生的感染之間 的區別以及對於感染過程的臨床控制皆爲特別重要者。類 別特異性抗體偵檢對於Η I V，Α型肝炎，Β型肝炎，住 血原蟲病，德國麻疹和披衣菌屬感染係特別重要者•對於 保護性抗體的力價測定及免疫成功性的檢核也需要用到對 某一抗原具特異性的類別特異性抗體偵檢。對某一抗原具 特異性的I g Μ類抗體偵檢對於新鮮和‘急性感染的診斷特 別重要。不過，抗原-特異性I g Μ抗體的偵檢常會被不 同的干擾性影響如具相同特異性的I g G抗體之存在所困 擾。 根據現時技藝狀態，己述及多種方法來保護對一抗原 本紙張尺度適用T國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ *?τ. 經濟部中央螵準局貝工消费合作社印製 43在4〇5锤 A7 B7五、發明説明¢3 ) 具特異性的某一組別之抗體。例如常經由將特異性抗體結 合到塗被著特定抗原的固體相來偵檢某一類別的抗原一特 異性抗體β對於已結合到固體相的抗原一特異性免疫球蛋 白（I g)係經由將針對某一類別的人類1 S有特異關聯 之抗體結合到要偵檢的I g分子上而予以偵檢。對人類1 g有關聯的抗體上裝有用來進行偵檢的標誌〔label )。不 過，彼等程序只有在與針對人類I g的類別特異性經標示 抗體反應之前將所有非特異性，未結合Ϊ g洗除後才可行 。如此，對於自動系統常需要的一步驟檢驗程序即爲不可 能。再者，於第一步驟中’係將對抗原具特異性的所有類 別抗體都結合到固體相。若固體相的抗原塗被不夠高，則 可能導致不同抗體類別對結合到抗原之競爭性反應。如此 可能損及檢定的敏感度。 於一步驟檢驗中進行抗體偵檢的一種可能性係由所謂 橋式檢驗（bridge test)提供的。該橋式檢驗槪念載於_ E P - A - 〇 2 8 0 211之中，於此方法中，將適 於特異性結合到欲測定抗體的第一受體例如抗原結合到一 固定相》該欲測定抗體會結合到經固體相結合住的抗原。 此外，檢驗混合物也含有另一特殊抗原，其上裝有標誌。 抗體即利用該標誌予以偵檢。不過此檢定係偵檢到所有抗 原-特異性抗體而不是只有一特殊類別的抗體。 抗原特異性IgΜ抗體測定中的另一干擾係由類風濕 因子所引起的。類風濕因子主要爲對I g G抗體的F c — 區具有槪括地高親和性之IgM—類抗體。 (請先閱讀背面之注項再填寫本頁) ,4 訂 < s ! 本紙張尺度適用中國國家標率{ CNS ) Α4規格（210X297公釐.) -6 - 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 __：______B7 五、發明説明& ) 因此’類風濕因子可能或多少呈I g G抗體使得在一 對特異性I g Μ抗體所作的免疫檢定中，類風濕因子被結 合住，若類風濕因子結合任I g G分子而被偵檢到其特異 性，則可能導致假的陽性測量値。 這種抗原-特異性抗體的類別-特異性偵檢問題在 DE 33 03 793中有處理。其述及一種某一

Ig類（'MgX·)抗原一特異性抗體偵檢程序，其中 係經由添加抗-I g G抗體來壓抑類風濕因子。於此程序 的過程中，係將特定抗原如病毒抗原，固定在一固體載體 之上。將結合到固體相的病毒抗原與樣品接觸。於下一步 驟中，去除未結合樣品並用抗- I gX抗體偵檢含有抗原 - I g X的經固體相結合之複合物。爲了避免類風濕因子 所引起的干擾，特別是在偵檢I gM時，乃在檢定起始之 前用抗—I gG抗體處理樣品。似如此複合過的I gG抗 體即不再遭受類風濕因子所作用致使類風濕因子不能結合 到易於提供假的陽性結果之抗原一特異性I g G分子《而 不論其特異性爲何，所有的I g G分子都被結合時。干擾 性I gG抗體在使用抗- I gG抗體予以沈澱時可能導致 對整體檢驗可能具有負影響.的非所欲沈澱物和渾濁物質》 再者，樣品同抗- I g G抗體進行的預處理係一種複雜的 程序。 W 0 9 6/1 4 3 3 7揭示出一種排除掉具有相同 特異性的其他類別抗體所致干擾之可能性。其中爲了減少 I gG抗體的千擾，係使用對I gG重鏈的Fd —區會特 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

* 經濟部中夬標準局負工消費合作社印製 434405* A7 B? 五、發明説明) 異性反應之抗體或抗體片段。如此導致I g G所具抗原結 合能力的密集掩蓋使其不再能夠辨識特定抗原。一種類似 的槪念載於W0 96/14338之中，其中係使用抗 - F d抗體或抗體片段作爲減少類風濕因子干擾的壓抑劑 。不過，以高度特異性抗一 F d劑行干擾減低之舉皆爲時 間和費用密集性者" 以現時技藝方法而言*在不添加複雜且昂貴的壓抑劑 及/或幾種特定的抗體之下，不可能以一步驟程序偵檢I gM類免疫球蛋白抗原特異性抗體。現有技藝中根據使用 經標示抗原和能夠結合到固體相的抗原之橋式檢驗槪念所 構成的免疫學偵檢方法則確能達成一步驟檢驗。不過，到 目前爲止使用這種簡單的原理仍只能一起地偵檢I g G和 I g Μ兩類別的抗體。 由‘此導致有需要提出一種改良的偵檢針對一指定抗原 的I gM —類抗體之方法。此方法意欲在不同到時間和費 用密集性壓抑劑之下進行且較佳者包括一步驟檢驗原理以 在用於自動化系統中時有其效益。 此需求可經由本發明測定類免疫球蛋白抗原特異性抗 體之方法而達到，該方法包括將樣品與至少雨種不同的受 體只1與112 —起溫浸，其中該兩種受體皆能夠特定地結合 到該抗體，係經結合或可被結合到一固體相而R 2載有 —標誌，其中R 1的二必需成分爲可被要測定的抗體特異性 辨識，呈多體形式之結合伴體且樣品中所含具有相同特異 性的I g G分子係經由添加單體形式的結合伴體予以壓抑 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁}

434405* A7 ______ _ Β7 五、發明説明) ο 樣品中所含具有與要偵檢的IgM抗體相同的特異性 之I gA，I gD和I gE諸抗體係以比I gG抗體遠較 爲低的濃縮存在的致使必不會預期有來自Ϊ gA，I g_D 和I g E類的干擾效應。抗體類別I g A，I g D和 IgE如同I gG分子而異於I gM分子之處在於彼等呈 五體物（pentamer )—抗體形式，以單一分子發生且具有 兩個對抗原的結合部位。

由於I gG，I gA，I gD和I gE諸抗體的構造 相似性*假設除了IgG抗體之外，IgDvIgA和 I g E諸抗體也會被下文所述本發明抗原一特異性I gM 偵檢方法所壓抑。 本發明方法可用來測定同時含有具相同抗原-特異性 的1 gG類抗體之樣品中所含Μ類免疫球蛋白抗原一特異 性抗體β本發明方法也可以在類風濕因子存在中實施。不 需要對樣品進行時間一和費用-密集性前處理。 經濟部中央標準局員工消費合作社印取 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 令人訝異地證明可以經由使用本發明單體形式結合伴 體在偵檢抗原一特異性IgM抗體的免疫檢定過程中有效 地壓抑具有相同抗原特異性之I g G抗體。該單體型結合 伴體會特異性結合到I g G抗體所具抗原結合部位。要被 偵檢且存在於相同樣品中，具有相同特異性之1 gM抗體 不會與單體形式的結合伴體反應或只有可忽略地輕微反 應。、可忽略地輕微^意指I gM抗體的抗原結合部位不 被單體形式的結合伴體所封阻。此點可能源自五體型 本&張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（公釐] 〇 經濟部中央標準局負工消.費合作社印製 434405* A7 ____B7 五、發明説明θ ) I g Μ抗體對單體型抗體的親和性明顯地較低於以單一分 子型式發生且對單體型抗原決定部位顯示出明顯較高親和 性昀I g G抗體所具者之事實。此點意請著雖有單體形式 結合伴體的存在，I gM偵檢的敏感度也不會受損。被單 體形式結合伴體所掩蔽住的I gG抗體不會干擾I gM的 偵檢。 令人訝異地，也證明經結合到抗體的類風濕因子也會 被結合到I g G所含抗原結合部位的相同單體形式結合伴 體所有效地壓抑》 由於I g G抗體所含抗原結合部位被封阻之事實，抗 原-特異性I gM抗體的偵檢可以在不必事先分離掉I g G抗體或類風濕因子之下進行。所用的單體形式結合伴體 不會引起被掩蔽的I g G抗體或類風濕因子發生凝集反 應=如此可以避免沈澱物所引起的對整個檢驗可能具有負 面影響之不良渾濁性。 因此在本發明方法中絕對不需要用來分離I g G抗體 之後續檢驗程序，以彼等抗體不會干擾之故。所以本發明 方法的一項特殊優點爲檢驗程序的簡單性。 除了檢驗藥劑都存在於液相中的所謂濕式檢驗之外， 適合用來偵檢蛋白質或抗體的所有常用乾式檢驗方式也都 可以使用。於這些乾式檢驗或如例如EP-A — 0 18 6 7 9 9中所載檢驗條之中，檢驗成分都是結合到一載 體上者。因此若本發明方法係以檢驗條方式進行時，.就不 需要洗滌步驟。不過’本發明方法較佳者係以濕式檢驗進 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ο X 297公楚） <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-10- 434403* 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8 ) 行。 此外可以將所有受體和單體形式結合伴體與樣品一起 溫浸而於一步驟中進行本方法。如此在溫浸後視需要只要 一道洗條步驟即可。 通常係使用兩種不同的受體並施加單體形式 結合伴體來進行本發明方法。若使用濕式檢驗時，受體r2 係以液相形式存在的。Ri可液相中被結合或爲已結合到固 相者。單體形式結合伴體較佳者係存在於液相中。 若使用適於結合到一固體相但尙未結合到固體相的受 體作爲Ri時’樣品係與受體Ri與R 2及單體形式結合伴 體一起溫浸β於此程序中，樣品抗體會結合到R i和R 2 這種溫浸可以在固體相存在中發生。於此程序中形成一複 合物，其包括固體相一 Ri -樣品抗體一 R2。 隨後將固體相從液相中分離出，將固體相視需要洗滌 並測量R2的標誌。該標誌通常是在固相中測量，不過，其 也可以在液相中測定。 若樣品與R :和尺2及單體形式結合伴體的溫浸係在不 含固體相之下進行時，則整個檢驗製備物必須於隨後與固 體相接觸，視需要進行洗滌及測量標誌。 若受體R :已爲經結合到固體相時，則將樣品和受體R 2加到該經固體相結合的受體R 1並一起溫浸、於此程序中 較佳者係將樣品與單體形式結合伴體和R 2預先溫浸後將檢 驗製備物加到已結合到固體相的受體Ri。其餘程序步驟都 對應於上述方法。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之Ji意事項再填寫本頁) - 訂 -11 - 434405* 經濟部中央標孳局員工消费合作社印掣 ΑΊ B7 五、發明説明（9 ) 也可以用幾個步驟來實施該方法。較佳者，係將樣品 先與單體形式的結合伴體溫浸後，與受體R 1和R 2溫浸》 隨後可將檢驗製備物與其他受體以幾個步驟溫浸。其餘檢 驗過程皆對應於上述方法。

Ri的一重要成分爲單體形式的結合伴體，其可被要測 定的I gM抗體所特異性偵檢，其也稱爲多附著素 (polyhapten )»本發明多體形式的結合伴體爲具有幾個， 較佳者爲相同或類似的，等效抗原決定區的構造偶合一載 體所形成的組成物，其顯示出與要偵檢的抗體有一特異性 反應。 類似"或t等效〃 （equivalent ) —詞意指結合伴體 上的諸多體型氣體不一定要相同。唯一的條件爲要測定的 I g Μ抗體要特異性結合到這些抗原決定區β抗原決定區 可以衍生自例如抗原或抗—遺傳性型抗體（anti-idiotype antibody )»其也可以衍生自糖鏈，例如呈糖化蛋白者。其 也可以衍生自脂質構造例如在磷脂質或脂蛋白之中者。如 此，多附著素或多體形式結合伴體包含許多相同或類似的 抗原決定區且如上述者對相同抗體提供幾個類似的結合部 位。於抗原爲蛋白質的情況中，結合部位爲一肽，其具有 表蛋白質抗原（分析物）構成物的序列且爲針對此蛋白質 的抗體所特異性結合之處。於抗原包括碍構造之情況中’ 結合部位爲樣品抗體所特異地結合之糖分子區°於脂質構 造中，脂質分子可構成樣品抗體的結合部位。結合部位也 可以包括肽區與糖及/或脂質的組合。不過在使用多體形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐} (請先閲讀背面之注項再填寫本頁)

A7 B7 經濟部中央榡準局貝工消费合作社印製 午344〇5· 五、發明説明（10 ) 式的結合伴體時較佳者爲以肽爲基質之多附著素。只要關 係於本發明多結合伴體，就必需要有高抗原決定部位密度 使得五體I g Μ樣品抗體可以特異且以高親和性地結合到 該多體形式的結合伴體。有關本發明多體型結合伴體所含 個別肽成分的其餘條件皆對應於下文所提單體形式結合伴 體的先決條件。 由乳膠，聚苯乙烯，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯或 金所構成的粒子可用爲多附著素的載體。聚合物例如葡聚 糖或多肽如聚離胺酸，牛血淸白蛋白，/5 -半乳糖苷酶， 非特異性免疫球蛋白或彼等的片段也都可以用爲多附著素 的載體材料》選擇載體的唯一條件在於其不會顯示出與樣 品液體所含抗體之任何交叉反應性。另一條件爲附著素必 須可與載體連接。 抗原決定區或附著素係根據專家所知例如載於Ε Ρ -A ™ 〇 6 5 0 053 和WO 96/03652 中的 方法偶合到載體材料。於抗原決定區與載體材料之間可以 插入間隔質區（spacer regions )，其亦揭示於上述公開專 利說明中。專家所知的所有間隔質區都可以使用。其先決 條件爲彼等須爲免疫學鈍性者，亦即彼等不會與樣品中的 抗體交叉反應。

Ri可直接結合到固體相或經由特異性結合系統間接結 合到固體相。Ri對固體相的直接結合係循專家所知方法而 行的。若該結合係經由特異性結合系統完成時，Ri爲一拼 合物，其包括本發明多體型結合伴體及一特異性結合系統 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之：it!意事項再填寫本頁}

434405* A7 B7 五、發明説明（11 ) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的反應伴體。於本發明情況中，特異性結合系統係由可彼 此特異性反應之兩個伴體所構成。其結合能力可爲根據免 疫學反應或另一種特異性反應者。較佳者爲使用生物素與 抗生物素蛋白或用生物素與鏈徽抗生物素蛋白之組合作爲 該特異性結合系統•其他較佳的組合爲生物素與抗生物 素，附著素與抗-附著素，抗體的F c片段與對抗此F c 片段的抗體，或醣類與外源凝集素（lectin )等組合。此種 適於特異性結合的配對所含反應伴體之一因而即爲形成受 體尺：的拼合物之一部份。 特異性結合系統的第二反應伴體即爲以固體相存在 者。特異性結合系統的第二反應伴體可經由諳於此技者知 悉的習用方法結合到不溶性載體物質之上於此情況中， 適合採用共價或吸附性結'合。特別適用的固體相爲用聚苯 乙烯或類似塑膠製成的試管或微滴板，其內表面塗被著該 特異性結合系統的反應伴體。 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 其他適用的物質特別較佳者爲粒狀物質例如乳膠粒 子，分子篩物質，玻璃珠粒，塑膠管等，多孔型層狀載體 例如紙，也可以用爲載體。 受體R2包括一可與樣品抗體特異性反應之分子和一標 誌。該可與樣品抗體特異性地反應之分子可爲例如一可特 異性結合到樣品抗體之抗體，一抗體片段，一蛋白質，抗 原或附著素。有關作爲R2成分的分子之唯一條件爲其要與 被偵檢的f品抗體特異性反應。此分子較佳者爲可特異性 結含到樣品抗體的本發明多體型結合伴體。R2所含呈多體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14- 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 3 44 0 5* A7 —_；— B7 五、發明説明（12 ) 形式的結合伴體係根據與R1所含呈多體形式的結合伴體相 同之方法製成者。 受體R2的另一成分爲標誌物。較佳的標誌爲可直接偵 檢的物質，例如化學發光性，螢光性或放射性物質或金屬 溶膠（metal sol)，乳膠或金的粒子。其他較佳的標誌物 質爲酵素或其他生物分子，例如附著素β於諸附著素中， 異羥洋地黃毒甙元爲特別較佳的標誌。標示方法爲諳於此 技者所熟悉者，不需要在此進一步引述。標誌係以通常所 知方式經由測量化學發光性 > 螢光性或放射性物質或金屬 溶膠-，乳膠-或金粒或經由測量被酵素轉化的受質而直 接偵檢。 標誌也可以間接地偵檢。於此情況中，係將其本身偶 合到一訊號產生性基的另一受體特異性結合到R2的標誌例 如附著素如異羥洋地黃毒甙元。該信號產生性基，例如化 學發光性，螢光性或放射性物質，或酵素，或金粒子，係 用諳於此技者所熟知的方法偵檢的。 另一種可以使用的受體爲例如可以特異性結合到R 2所 含標誌之抗體或抗體片段》使用這種間接式標識偵檢時， 該R2標誌較佳者爲異羥洋地黃毒甙元或不同的附著素：該 胺基酸係利用與過氧化酶偶合且針對異羥洋地黃毒甙元或 附著素之抗體而進行的。 爲了壓抑具相同抗原特異的I g G抗體，根據本發明 要在檢驗製備物中加入單體形式的結合伴體。、單體型， 一詞意指本發明單體型結合伴體只含有一個抗原決定部位 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公酱） (請先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -15 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α3Α405» A7 __ B7 五、發明説明（13 ) 或只有一個該要被壓抑的抗體之結合部位，亦即與I g G 抗體免疫地且特定地反應之構造。這些結合部位的單體型 構造對於要確使抗原特異性I g G抗體而不使要偵檢的 I g Μ抗體結合到單體形式的結合伴體而言係重要者。 抗原決定區一如上文中對多體形式中的結合伴體所說 明者-可以衍生自抗原或抗遺傳型抗體。根據多體形式結 合伴體的情況，單體形式結合伴體的抗原決定區也可以衍 生自糖及/或脂質構造或肽，脂質及/或糖成分的組合構 造。衍生自抗原決定區的所有構造都可以使用，只要其顯 示出一結合部位可讓要壓抑的IgG-類抗體在具有相同 特異性的I gM抗體存在中被特定地結合即可。結合部 位，亦即所用單體形式的結合伴體，之唯一條件爲保存住 I g G的特定性結合能力<此條件也應用於結合部位中所 含糖或脂質構造》 . 根據本發明也可以使用與要讓被壓抑的I g G抗體特 定地結合之結合部位側接或重叠之單體形式結合伴體。因 此|也可以使用包含與被要偵檢的I gM抗體所辨識的抗 原決定部位不完全相同的抗原決定部位之結合部位來壓抑 I g G抗體。 這類I gG抗體可能展現出與要偵檢的I gM抗體或 多或少的高交叉反應性。這類I g G抗體也可以經由添加 對應於這些交叉反應性抗體所具抗原決定部位因而具有針 對彼等的高親和性之單體形式結合伴體予以壓抑。較佳者 係使用與要偵檢的I gM抗體所具抗原決定部位或多或少 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ------打------^ si I _ 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：W公t〉 -16 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 ______B7 五 '發明説明（14 ) 重叠的單體形式結合伴體之混合物來壓抑I g G抗體。 較佳者係使用單體形式的肽作爲結合伴體，於分析物 爲蛋白質的情況中，結合部位-類似於多體形式結合伴體 的定義者-爲肽，其序列爲蛋白質抗原所具蛋白質序列的 —部份且爲針對此蛋白質的抗體*其於本發明情況中爲一 I g G抗體所特異性結合之處。除了這類肽之外，結合部 位也可包括其胺基酸序列具有與前述肽幾乎相當的對要被 壓抑的I g G抗體之結合特異性及/或親和性之肽。此類 肽較佳者可從前述肽經由個別胺基酸殘基的置換，消去或 插入而衍生出。 本發明對應於一特定結合部位的肽也可爲肽衍生物， 其中一或數個胺基酸係經由化學反應而衍生過者。肽.衍生 物的例子包括特別者其主鏈及/或反應性胺基酸側基，例 如自由胺基，自由羧基或/及自由羥基已被衍化過之分 子。胺基衍生物的特殊例子爲磺醯胺或羧醯胺，硫代胺基 甲酸酯衍生物和銨鹽例如鹽酸鹽。羧基衍生物爲鹽，酯和 醯胺。羥基衍生物的例子爲0 -醯基或0 -烷基衍生物。 這類肽較佳者係經由諳於此技者已知的方法以化學合成製 成者，其不需要在此特別闡述。 此外，肽衍生物一詞也包括彼等肽，其中一或數個胺 基酸被天然發生或非天然發生的2 0 ^標準^胺基酸之胺 基酸同系物所取代者。彼等同系物的例子爲4 -羥基脯胺 酸，5 -羥基離胺酸，3 -甲基組胺酸，同絲胺酸，鳥胺 酸，/3 -丙胺酸和4 -胺基丁胺酸。肽衍生物必須具有與 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -17- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 43仏〇5 at ___B7 五、發明説明（15 ) 衍生彼等的肽幾乎相當的對被壓抑的I g G抗體之結合特 異性及/或親和性。 本發明對應於一特定結合部位的肽也稱爲擬肽物質， 於下文中稱爲擬脏（peptide-mimetics )，其具有與前述狀 或肽衍生物幾乎相當的對被壓抑IgG抗體之結合特異性 或/及親和性。擬肽爲可在與被測抗體的交互作用中取代 肽之化合物且可具有比原狀（native peptides )較高的安定 性 > 特別是針對蛋白酶和肽酶者。擬肽的製造方法載於 Giannis and Kolter, Angew. Chem. ' , 105 (1993), 1 303-1 326 和 Lee et al·，Bull. Chem. Soc. Jpn. 66(1993)，2006-2010 之中。 結合部位的長度，亦即本發明單體肽的長度通常至少 爲4個胺基酸。其長度較佳者係介於4與20，6與15 或特別較佳者9與1 2個胺基酸之間。於擬肽或肽衍生物 的情況中，需要有類似的分子尺寸或長度。 本發明單體肽或單體形式作爲結合伴體時包含被要壓 抑的I g G抗體所要特異性結合之抗原決定部位。不過， 在該肽的N -端及/或C _端可以含有不再對應於特定抗 原決定部位的其他側接肽序列。爲改良肽的溶解度，這種 作法可能變得有其需要。其唯一的先決條件爲以單體形式 作爲結合伴體的肽確實以單體存在且保留著對要被壓抑的 Ϊ g G抗體之高結合能力〜 / 使用單體形式結合伴體（此處爲肽）的一先決條件爲 彼等含有與多體形式結合伴體或多體形式多附著素上的含 <請先閱讀背面之注項再填寫本頁.) 訂 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 4344 〇 5® ' A 7 ____ Β7 五、發明説明（16 ) 抗原決定部位相同的抗原決定部位。此意謂著爲了有·效減 少干擾，結合到單體形式結合伴體上的I g G抗體必須具 有與要偵檢的I gM抗體相同之免疫特異性。具有相同抗； 原特異性_的I g G抗體總爲在偵檢I g Μ抗體時要予以壓 抑者* 較佳者要使用比多體形式結合伴體上所含抗原決定部 位濃度超過1 0至1 0 0 0 0倍的單體形式結合丨半體。較 佳者爲使用1 0至1 0 0 0倍超量的單體形式結合伴體且 特別較佳者爲使用1 0 0倍超量者。單體結合伴體濃度上 限只存在於超過苯一濃度時不再確保單體形式結合伴體的 溶解度之情況中》多體形式結合伴體上的抗原決定部位濃 度決定於載體物質的尺寸且可爲專家針對每一程序和偵檢 參數分別輕易地決定。於肽抗原決定部位（長度：6至2 0個胺基酸）之情況中，5至5 0 0毫微克每毫升載體物 質的濃度係經證明適合作爲多體形式結合伴體上所含抗原 決定部位濃度之近似値者· 除了單體形式結合伴體之外，也可以使用其他減少干 擾的物質，例如引言部份中所述的抗- F d抗體來達到對 I g G抗體的附加干擾減低效應" 異相和同相程序皆爲IgM抗原-特異性偵檢的可能 方法。在使用同相程序時，R1，樣品1 8%和尺2皆不結 合到固相上。相反地’幾種複合物的凝集可能導致渾濁物 質，其爲IgM濃度的量度。 作爲I g G壓抑劑的單體形式結合伴體不會抑制該凝 本紙伕尺度適用中國國家捸準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---^ I ---^--^------訂------> IK. (請先閱讀背面之注碩再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 4344 0 5麵 A7 B7 五、發明説明（17 ) 集作用。 不過’較佳者係使用異相程序。特別較佳者係使用根 據橋式檢驗原理的程序（參看 E P - A - 0 2 8 0 211)。於一較佳檢驗實施例 中，係使用由本發明多附著素和一特異性結合系統所含結 合伴體所構成的拼合物作爲Ri。R2包括一多附著素或多 體形式結合伴體及一標誌，較佳者異羥洋地黃毒甙元*特 別較佳者係在Ri和R2中使用相同的多附著素。對於此較 佳實施例係將受體R :與R 2在固體相存在中與樣品和單體 形式結合伴體較佳者肽，一起溫浸，其中該固體相於此例 中係塗被著抗生物素蛋白和鏈徽抗生物素蛋白。於此程序 中，多體形式的Ri與結合伴體會與要偵檢的 I gM抗體特異性反應而具有相同特異性的I g G抗體則 被肽，亦即單體形式結合伴體，所掩蔽使彼等不能結合到 多體形式的結合伴體上。整個抗生物素蛋白/鏈黴抗生物 素蛋白一Ri—IgM-樣品抗體一R2複合物即依此結合 到固體相。在從液相中分離出該固體相且視需要洗滌該固 體相之後，即將結合到固體相的複合物與可特異性辨識R £ 的標誌之另一受體一起溫浸》此另一受體係偶合到一信號 一產生基，較佳者過氧化酶酵素。在另一視需要的洗滌步 驟之後，係利用該信號產生基偵檢樣品抗體，於此情況中 係經由該過氧化酶酵素所轉化的受質。在使用此程序時， 樣品與Ri，R2，單體形式結合伴體和另一受體的溫浸也 可以同時實施。此爲該檢驗程序的另一簡化。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ如兄格（210X297公t > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-20- 經濟部中央橾準局員工消费合作社印製 奶 44 〇5* A7 B7 五、發明説明（18 ) 上述程序非常適用於自動化系統中。可以偵檢幾種抗 原—特異性I gM抗體例如對抗Η I V抗原的Η I V抗 體。於彼種情況中可加入另一受體作爲通用受體以其可特 異性辨識R2所含標誌之故。若要同時偵檢具有不同抗原特 異性的數和I gM抗體時，111和1^2所含多附著素成分以 及用以減少干擾的單體形式結合伴體都必須具有對應的特 異性。 專家所知的所有生物液體都可用爲樣品。較佳者係使 用體液例如全血液，血淸，血漿，尿液，唾液等作爲樣 品。 除了樣品，固體相和前述諸受體之外，檢驗製備物中 也可以含有視應用所需的其他添加劑例如緩衝劑，鹽，淸 潔劑，蛋白質添加劑例如B S A。所需的添加劑係專家所 知者或可容易地找出者。 本發明另一主體爲_種用以測定免疫球蛋白Μ類抗原 -特異性抗體之藥劑，其除了免疫檢定一般所用添加劑之 外，還包含單體形式結合伴體，較佳者肽，及一適合結合 到要測定的抗體且適於結合到固體相的受體R1且其所含必 需成分爲多體形式，可被要測定的抗體特異性辨識之結合 伴體。 本發明另一主體爲用以測定免疫球蛋白Μ類抗原-特 異性抗體之藥劑，其除了一般免疫檢定用的添加劑之外， 含有單體形式結合伴體，較佳者肽，及兩種受體只1和1^ 2，其皆適於結合到要偵檢的抗體，其中Ri適於結合到一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-21 - 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 4 344 0 5* A7 B7 五、發明説明（19 ) 固體相而R2載有一標誌，且其中受體尺1和112的一必需 成分爲個別的多體形式，可被要測定的抗體特異性辨識出 之結合伴體。 本發明的另一主體爲多體形式結合伴體對於循上述本 發明任一方法用於IgΜ抗體的抗原-特異性測定之用 途。 再者，本發明另一主體爲單體形式結合伴體，較佳者 肽，對於在測定抗原一特異性I g Μ抗體時用以減低 I g G抗體及/或類風濕因子的干擾之用途。 本發明要用下列實施例進一步說明。 實施例

抗原一特異性I gM檢定：抗—Η I V2 — I gM 用經生物素標示及經異羥洋地黃毒甙元一標示的多體 型抗原（Η I V 2 )與樣品抗體和經鏈撇抗生物素蛋白-塗被的固體相溫浸（在2 5°C或3 7°C溫浸約6 0至1 8 0分，於此實施例中：25 °C，120分）。於一洗滌步 驟之後，將結合到壁上的免疫複合物與一抗-異羥洋地黃 毒甙元-過氧化酶拼合物反應（在2 5 °C或3 7 °C下溫浸 約30至120分，於此實施例中：25 °C，60分）。 在另一洗條步驟之後，經由受質反應偵檢經過氧化酶拼合 物-標示的免疫複合物（在2 5 °C或3 7°C溫浸約3 0至 1 2 0分，於此例中：2 5 °C，6 0分鐘）。 諸反應步驟（除了受質反應之外）係在含有約〇 . 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-22- 434405* A7 _____B7 五、發明説明（20 ) 5至0.4%淸潔劑（此處爲〇.2%的〇〇1丨<1〇〇&11〇1)和 約0 . 5%的蛋白質/蛋白質衍生物添加劑（此處爲衍生 自乳白蛋白和BSA等的腺）的Tr i s/HC 1緩衝液 (pH7 5，50至15〇mM.，於此實施例中爲1〇 0 m Μ )中進行的。’ 於此例中，樣品抗體爲對抗Η I V 2抗原決定部位的 單株小鼠抗體（IgM和IgG)，其經在抗一 HIV陰 性大類血淸中稀釋到約2 — 2 0微克/毫升。 用相對於多附著素上所含肽抗原決定部位濃度分別超 出1 0倍和1 0 0倍的自由未經標示Η I V — 2肽抗原進 行競爭反應。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央樣準局貝工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中固國家搮準（CNS ) Α4規格（210 X 297公麓）-23 - 5® Λ7 B7 五、發明説明这1 ) 檢驗信號，m E : 樣品 <IIV2> MAB 沒有自由 肽的多附 著素 評估 多附著素 加上10倍 超量的自 由肽 評估 多附著素 加上100 倍超量的 自由肽 評估 igM 2460 陽性 2488 陽性 2457 陽性 2.6,6 IgM 1950 陽性 1990 陽性 1985 陽性 2.22.8 IgG A 2490 陽性 376 限値 189 陰性 IgG B 626 陽性 167 陰性 152 陰性 IgG C 5699 陽性 1575 陽性 286 陰性 檢驗辨識出 檢驗辨識 檢驗具 IgM 和 IgG 出IgM和 IgM特異 某些IgG 性 經濟部中央標率扃員工消費合作社印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -24 五、發明説明（22 )經由添加單體型肽使Η I V - 2抗韹偵檢變成具特異 性。在沒有添加肽時，某些樣品導致假的陽性檢驗結果。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局—工消費合作社印掣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210X297公釐} .25-

Claims (1)

1. 附件（u): 第861Π602號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國88年3月修正 1 .—種測定免疫球"蛋白Μ類之抗原特異性抗體之方 法’其包括將樣品與至少兩種不同的受體R i和R 2 —起溫 浸，其中該兩種受體都能夠特定地結合到該抗體，Ri係結 合到一固體相上或適於結合到一固體相上且載有一標 其中R1的一必需成分是可被要測定的抗體特異性辨 識’呈多體形式之結合伴體，且樣品中所含具有相同特異 性的I g G分子係經由添加單體形式結合伴體予以壓抑， 其中受體R 2係經用化學發光性，螢光性或放射性物 質，酵素或另一不同的生物分子所標示者。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中 R 1和尺2個別的必需成分爲可被要測定的抗體特異性 辨識，呈多體形式之結合伴體，且樣品中所含具有相同特 異性的I g G分子係經由添加單體形式的結合伴體予以壓 中 央 標 牟 局

   消 费 合 作 社 印 % 抑。 3 .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中使用生 物素/抗生物素蛋白；生物素/鏈黴抗生物素蛋白；生物 素/抗生物素；附著素/抗附著素；抗體的F c片段/對 抗此F c -片段的抗體；醣類/外源凝集素作爲特異性結 合系統的汉1結合到該固體相。 本紙張尺度遑用中國國家揲準（CNS ) Α4规格（210X297公釐） 434405* 六、申請專利範圍 ABCD

   4 .如申請專利範圍第1或2 經濟部中央樣率扃貝工消费合作社印装 係與R ,和1^ 2及經選擇用來減少干擾的單體形式結合伴體 同時溫浸的。 5，如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該檢驗 製備物係與可特定地結合到薆體所含標誌之一加添受體 一起溫浸’其中該加添的受體係由對該尺2所含標誌具特異 性的受體與一標誌所構成的拚合物，且該標誌係於隨後測 定的。 6 .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中用以減 少干擾的該單體形式結合伴體係以相對於R 1和尺2所含多 體形式結合伴體上所含抗原決定部位濃度超出10至 1 0 0 0 0倍之濃度添加。 7種用以測定免疫球蛋白Μ類之抗原特異性抗體 之藥劑，其係用於如申請專利範圍第1至6項中任一項之 方法，其中， 除了免疫檢定所用一般添加劑以外，更含有單體形式 結合伴體及一適於結合到要測定體且適於結合到一固 定相之受體R:，其必需成分爲一 形式的結合伴體。 ，其中該單體形式 如申請專利範圍第7項之, 結合伴體係用以在測定抗原-特異g Μ抗體時減少 Ij G抗體及/或類風濕因子的干擾者。 9 · 一種用以測定免疫球蛋白Μ類之抗原特異性抗鹡 劑，其係用於如申請專利範圍第1至6項中任一項;2 寒隹，其中， 本紙張尺度逋用中國國家樣率（CNS > Α4規格（210Χ297公釐）-2 - (請先Μ讀背面之注^^項再填寫本I) 訂 A. —D8 111 _____ _ ____ ___ 六、申請專利範圍 « 除了免疫檢定所用·一般添加劑以外，更含有單體形式 的結合伴體及適於結合到要測定的抗體之兩受體111和 R2 ’其各具有作爲必需成分的多體形式結合伴體’其中 能夠結合到一固體相且只2載有一標誌。 請 先 閱 背 之 注 頁 订 鲤濟部中央揉窣局負工消费合作杜印簟 紙 本 丰 揉 家 國 國 t 用 通 21 釐 74Γ 29 ~—―堀管士产86117602號專利申請案羡g 中文說明書修粟塁·一^民國^年8月修正 ^;V： ί i\L ,\ ' Π 本 申资许勘 別.，0丨" 11 曰 9A 口 案 cl »R117Rn〇 類 一 ㈣/Η (以上各棚由本局填註） Λ4 h:4 434405 |專利説明書 中文 發明 新型 名稱 拥定免疫球蛋白Μ類（I gM)之抗原特異性抗釀的方法，及用拉 族方法之試薄- 英文 Process to deteroine antigen-specific antibodies of the inaunoglofaulin class M (Ig H) and reagents used therein 姓 名 國 籍 ⑴艾克♦费兹Faatz, Elke Ϊ25 歎本 * 舒密待 Schaitt, Urban ⑶披他斯•奥芬蘭-哈諾Ofenloch-HShnle, Beatus 發明 創作/ 住、居所 (1)徳國 . 0徳國 ⑶ 徳國⑴徳國哈格飛史坦克舞玆一號 Steinkreuz 1, D-82386 Huglfing, Gemany 0徳國歃伯梏森瓦徳路三十六號 Waldstr, 36, D-82386 Oberhausen, Germany (3徳國波林*播格一洛克特街17號 Georg-Ruckert-Str« 17, D-82398 Polling, Genany 裝 訂 姓名 (名稱） ⑴嫌氏診斷法有限公司 Roche Diagnostics GnbH 線 人請 中 _^_ 經濟部眢慧2:4场0!工>/1費合作社印製 國 籍 住、居所 (事務所） 代表人 姓 名 ⑴徳囲 ⑴徳囲曼罕市善厚佛街一一六號 Sandhofer StraBe 116, D-88305 Mannhei·, Germany ⑴曼福徳*韋伯Veber: Manfred 麥可•榮格 Jung, Michael 本紙張尺度遙用中國国家樣準（CNS ) A4规格（210X297公釐）

   附件（u): 第861Π602號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國88年3月修正 1 .—種測定免疫球"蛋白Μ類之抗原特異性抗體之方 法’其包括將樣品與至少兩種不同的受體R i和R 2 —起溫 浸，其中該兩種受體都能夠特定地結合到該抗體，Ri係結 合到一固體相上或適於結合到一固體相上且載有一標 其中R1的一必需成分是可被要測定的抗體特異性辨 識’呈多體形式之結合伴體，且樣品中所含具有相同特異 性的I g G分子係經由添加單體形式結合伴體予以壓抑， 其中受體R 2係經用化學發光性，螢光性或放射性物 質，酵素或另一不同的生物分子所標示者。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中 R 1和尺2個別的必需成分爲可被要測定的抗體特異性 辨識，呈多體形式之結合伴體，且樣品中所含具有相同特 異性的I g G分子係經由添加單體形式的結合伴體予以壓 中 央 標 牟 局

   消 费 合 作 社 印 % 抑。 3 .如申請專利範圍第1或2項之方法，其中使用生 物素/抗生物素蛋白；生物素/鏈黴抗生物素蛋白；生物 素/抗生物素；附著素/抗附著素；抗體的F c片段/對 抗此F c -片段的抗體；醣類/外源凝集素作爲特異性結 合系統的汉1結合到該固體相。 本紙張尺度遑用中國國家揲準（CNS ) Α4规格（210X297公釐）