JPS6017358A - 分析容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫学的測定法用分析容器に関し、更に詳し
くは定量的免疫学的測定法用分析容器に関する。

〔従来技術〕

生物学的流体試料中に極微量含有される物質を検出する
方法として、各種分析方法の開発がなされてきた。その
分析方法は、生として免疫反応をその原理とするもので
ある。上記原理を用い−る測定法として、種種のものが
開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫測
定法が知られている。

免疫測定法は、１９５−８年、ベルソン（Ｂｅｒｓｏｎ
）とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標識
した、ウシインシュリノと糖尿病患者血清中の抗インシ
ュリン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定する
ことに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられて
いる。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が橿種開発がなされてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオファージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性分子等
が挙けられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て結合を起した物質と起さなかった物質との分離がある
。

該分離のための１つの手段が不溶化試薬である。すなわ
ち免疫測定法においては、測定すべき物質と免疫反応に
より特異的に結合する抗原又は抗体を水に不溶の形態と
した不溶化試薬を用いるが、その性能が分析成果の良否
を犬きく左右する。当初は、不溶化試薬に用いる担体と
して、セルロース、架橋デキストラン、架橋アクリルア
ミドゲルなどの天然高分子物質又は合成高分子物質が微
粒状で用いられた。これらの担体は、微粒であるため、
分析の過程において測定対象を特異的に結合した試薬を
液より分離するに際しくＢ／Ｆ分離という）、通常は遠
心分離を必要とし、また分離した試薬を十分に洗浄する
ことも必要で、操作に手間がかかる欠点があった。これ
を避けるため適当な寸法、形状に成形したプラスチック
やガラスを担体に用いたものや、試験管の内面を担体に
利用したものなどが出現した。

上記のような成形した担体は、微粒状のものに比べて利
点もあるが比表面積が小さく、このため抗体又は抗原の
担持量が少なく、その量のバラツキも避けられず、測定
範囲が狭くなシ、かつ再現性も悪化しやすいという欠点
を有している。

このため、この分野における自動化、省力化を著しく困
難なものとしている。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、前記欠点を改良し、簡便で、自動化の
可能な免疫分析用の分析容器を提供することにある。

〔発明の構成〕

本発明を概説すれば、本発明は分析容器の発明であって
、流体試料中の特定成分を免疫分析する際に使用する分
析容器において、該分析容器内に分離膜を設け、その膜
上に免疫反応用緩衝液、及び該流体試料中の特定成分と
特異的に結合することが可能な物質を固定化した担体（
以下固定化担体と略記する）を保持し、かつ該分離膜は
、膜上からの加圧時のみ該緩衝液を含む反応溶液を透過
させることが可能な膜であることを特徴とする。

本発明の分析容器は、免疫分析時、に定量的免疫分析に
好ましく用いられるものである。これらは流体試料、す
なわち、血液（血漿、血清を含む）、尿、髄液等の中に
存在する特定成分と特異的に結合することが可能な免疫
活性物質（例えば、抗原、抗体、ハプテン抗体、ハプテ
ン、補体等）を水不溶性担体に固定化した固定化担体を
用い、更に測定のための既知量の標識化合物と結合した
特定成分及び、試料流体によって行われる。

本発明に係る、免疫活性物質を固定化するための担体に
は種種の公知のものが挙げられる。

例えば、ガラス、合成高分子重合体、天然及び合成繊維
、水不溶性無機化合物等が挙げられる。

また、その性質も親水性、疎水性を問わず用いることが
可能である。

例えば、親水性担体として、架橋デキストラン〔セファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）で知られるもの、ファル
マシア社製〕、架橋ポリアクリルアミド〔バイオゲル（
Ｂｉｏ−ｇｅｌ）として知られるもの、バイオラッド社
製〕等が挙げられる。

また、疎水性の担体としては、例えばポリスチレン及び
その誘導体、ポリアルキルアクリレート又は、ポリアル
キルメタクリレート及びその誘導体、ナイロン及びその
誘導体等の公知の高分子重合体が挙けられる。更に特開
昭５７−１０．１７６１号明細書記載の高分子重合体粒
子、％願昭５６−１５５７８８号明細書等に記載の疎水
性の核に親水性の殻を被覆した粒子等が好ましく用いら
れる。

これらの担体の形状及び大きさは分離膜を透過しないも
のであれば任意であるが、免疫活性物質を固定化する担
体の表面積を一定にするために、一定の均一な大きさ、
形状が好ましく更に球状が好ましい。

粒径は所望により変化させることで、表面積を、ひいて
は免疫活性物質の固定化量を変化させることが可能であ
る。具体的には、粒径が約１０　ｍｍ〜約１μｆｉ、好
ましくは約５ｍｍ〜約１０μｍのものが用いられる。

免疫活性物質の担体への固定化方法は、例えば物理吸着
による方法及び化学結合によシ抗原又は抗体を担持する
方法がある。

物理吸着法としては、抗原又は抗体を水又は適娼な緩衝
液に溶解させ、これに前記粒子単位又は粒子単位を粒子
結合体としたものを浸漬して吸着させることができる。

この際の緩衝液としては、０．０１〜１Ｍ程度の適当な
緩衝液を用いることができる。また、吸着させる物質の
濃度はｏ、　ｏ　ｏ　１〜１，０チの範囲で用い、表面
を十分に清浄にした担体を浸漬し吸着させる。

上記吸着のための温度は、室温又はそれ以下が好ましく
、時間は１０〜１００時間が好ましい。得られた固定化
担体は、分離の抜水又は緩衝液で洗浄し、吸着にあずか
らなかった免疫活性物質を取去ることが好ましい。

化学結合を用いる方法としては、免疫活性物質を担体表
面上の官能基と直接又は多官能性試薬を用いて結合する
ことが可能である。これらの方法は、例えば千畑一部編
「固定化酵素」（１９７５年講談社刊）に記載されてい
る酵素等の固定化技術を応用することができる。−例を
挙げればジアゾ化法、アミド法、アルキル化法及びグル
タルアルデヒドへキサメチレンジイソシアネート等があ
る。

また、担体には、必要に応じて免疫反応における非特異
的反応を排除する目的で、測定すべき免疫反応に関与し
ないタンパク）Ｘを固定化することが可能である。これ
らの代表的な例としては哺乳動物の正常血清タンパク質
、アルブミン・ゼラチン及びその分解物等が挙げられる
。

これらの固定化方法は前述と同じように物理吸着法及び
化学結合法を適宜用いることができる。

本発明において、免疫反応用緩衝液は柚棟のものを用い
ることが可能である。例えば、石川栄治、河合忠、宮井
潔編「酵素免疫測定法」（１９７８年医学書院刊）に記
載のようなリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液及び酢酸緩衝液
等を、所望に応じて適宜選定することができる。この際
の緩衝液の濃度は約０．０１モル／ｌ〜約１０モル／ｌ
であシ、また上記のｐＨは１０付近が望ましい。これら
の免疫反応用緩衝液には、塩化ナトリウムを添加して生
理食塩液条件にすることが好ましい。更に、免疫反応に
関与しないタンパク質、例えばウシ血清アルブミン等を
約０．０１％〜約５チ、好ましくは約０．０５　ｑ６〜
約１、　Ｏｑ６添加することで、免疫反応にかかわらな
い非特異的結合を回避することができる。

また、上記の免疫反応用緩衝液と固定化担体との割合は
、該担体が該緩衝液によって浸漬されている状態であれ
ば良い。例えば、担体の体積に対して、約１．５倍〜約
２００倍程度まで、任意に選択することが可能である。

本発明の分析容器内に設けられた分離膜は、常圧では、
反応溶液が保持可能であり、膜上からの加圧時に反応溶
液を透過させるものである。

更に、上記の膜は、加圧時において本発明の固定化担体
を透過させないことは自明である。また、免疫反応に用
膜る未結合の標識化合物は膜上からの加圧時に膜を透過
するものである。

上記性能を有する分離膜として、メンブランフィルタ−
が用いられるが特に好ましくは限外ｆ過（ウルトラフィ
ルトレージョン）用膜が用いられる。

分離膜は加圧に耐えるために必要とあればあらかじめ反
応緩衝液のめる側及び／又は反対側に網状の支持体を設
けることができる。

また、本発明の分析容器はｆ過した後、そのまま結果検
出することが可能である。その際、検出手段に適合した
材料、例えば、可視部吸収を用いた検出法の場合にはガ
ラス等の透明な素材を用いるとより０ 本発明の分析容器は、種種の免疫測定法に適用すること
ができる。例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、
蛍光免疫測定法等公知の測定法に用いることができる。

また、各測定法において、様様の様式が知られているが
、例えば競合法、サンドイツチ法、二抗体法等に用いる
ことができる。

また、標識化合物も結合物、未結合物のどちらも測定す
ることができる。

不発明の分析容器を用いた免疫分析の操作法について競
合法を例に説明する。

（１）　サンプル（又は標準液）及び標識化合物を本発
明の容器に一定量分取する。（必要に応じて希釈液を加
えることも可能である。）（２）上記混合液を一定温度
、一定時間保温を行った後、加圧を行い、担体（固定化
した物質と被検物及び標識化合物と結合したもの）と反
応溶液（未結合の標識化合物）とを分離（Ｂ／Ｆ分離）
する。

（３）濾過した反応溶液又は担体に対して、検出のため
の操作を行う。

更に検出のための操作は、標識化合物によってそれぞれ
異なることは自明である。

すなわち、放射免疫測定法においては標識化合物である
ラジオアイソトープの放射能を例えばシンチレーション
・カウンター等で測定することであり、酵素免疫測定法
においては標識化合物でるる酵素の基質又は合成基質を
加え生成物の増加又は基質の減少を分光学的に測定する
ことであシ、更に蛍光免疫測定法においては蛍光量を蛍
光光度計により測定することを表す。

また、競合性以外の他の様式、すなわちサンドイツチ法
又は二抗体法等は上記の検出操作の前に、更にもう一段
階免疫反応及び洗浄操作が加わるのみであり本質的には
同様である。

これら免疫測定法の実際については、入江實編［ラジオ
イムノアッセイｊ（１９７４年講談社刊〕及び前記石川
栄治ほか２名編［酵素免疫測定法Ｊ（１９７８年医学書
院刊）に詳細に記載されている。

本発明の分析容器は、血清、尿、リンパ液等の生物学的
流体試料に適用することが可能である。また上記の分析
容器の使用分野は、特に制限はない。ハプテン、抗原及
び抗体などの免疫測定法に適した測定対象に用いること
ができる。

例えば、α−１−フェトプロティン、ガン胎児性抗原（
ＣＥＡ）、免疫グロブリンＧ、Ａ、Ｍ、　（ＩｇＧ。

ＩｇＡ、　ＩｇＭ　）などの血清タンパク質、インスリ
ン、成長ホルモン等のホルモン、ステロイドホルモン、
ＨＢ抗原等のウィルス、更にテオフィリン等の薬物等の
広範囲な分野に使用できる。

本発明の免疫用分析容器は、操作が簡便でその製造が容
易であシ、バックグラウンドが小さく、測定範囲が広く
、かつ再現性が極めて良好な免疫測定法を達成すること
が可能である。

次に、本発明の分析容器を添付図面に基づいて説明する
。

すなわち、第１図及び第２図は本発明の分析容器の一実
施の態様を示す縦断面図であシ、第３図は第２図の分析
容器を分離した状態を示す縦断面図である。

添付図面において、符号１は分析容器、２は分離膜、３
は固定化担体、４は反応溶液、５は加圧の方向を６はｆ
液を受ける容器を意味する。

第１図は一体型の分析容器であり、反応用緩衝液、免疫
活性物質固定化担体、標識化合物、試料又は標準液を入
れ、反応終了後、５の方向から加圧し、未結合の標識化
合物を含む反応溶液を分離する。

第２図は分離膜を有する分析容器とｒ液である反応液を
受ける容器とを分離可能にした分析容器であ夛、第３図
のように分離することができる。この容器は加圧時の液
漏れ等を防ぐために両容器の間にバッキング等の部材を
用いてもよい。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、これ
によって本発明が伺ら限定されるものではない。

実施例１ （１）　担体への抗体の固定化 粒径２０μ舛のスチレン−グリシジルメタクリレート共
重合体（共重合重量比８ｔ／ＣＨＪＡ＝９／’１）の高
分子重合体粒子２０２を担体として用い、これを０．１
　Ｍ　ＮａＣ１溶液で十分洗浄した後、０．２５　Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ−７，６”’）　１００ｒ
ｎｌにヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製、以下抗Ｌ
ｇＧ抗体と略記する）を３η／ゴになるように溶解した
溶液に浸漬し、４℃で７２時間吸着を行った。この抗Ｉ
ｇＧ抗体固定化担体を０．２５　Ｍ　’Ｊリン酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ＝７６）で十分洗浄した。２８０　ｎｍ
の吸光度から上記担体への抗ＩｇＯ抗体の吸着量は１．
Ｅｌｖ／ｙＭｉ体であった。

（２）分析容器の作製 底辺１　ｃｍ　Ｘ　１　ｏｎ高さ４ｍのガラス筒の一方
の開口部に限外ｆ過膜を張シつけ、第２図における符号
１で示した分析容器とした。更に内辺１　ｏｎ　Ｘ　１
　ｃｍ高さ４譚の石英ガラス製の同図における符号６で
示したセルを用意し、第２図に示した形になるように組
合せ、完全に流体の漏れがないようにした。次いで符号
１で示した部分に前述の抗ＩｇＧ抗体固定化担体を０．
０１ｒ、００１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．
６、但しウシ血清アルブミン３係を含有）を６−を入れ
て、第２図で示した本発明の分析容器を作製した。

（３）　ヒトＩｇＧの分析 ヒトＩｇＧを６４０１ｔｆ／ｍｌからＯμｔ／ｍｔ、（
１）各種濃度になるようα０１Ｍリン酸すトリウム緩衝
液（ｐＨ＝７．６）で溶解し、ＩｇＧ標準液とした。

また、フルオレセインイソチオンアネートでヒｔ−Ｉｇ
ＧＫ標識した。蛍光標識と）ＩｇＧ（以下ＦＩＩＣ−Ｉ
ｇＧ　と略記する）を６６μｆ／ｒｎｌになるように、
０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．６）で
溶解し標識ＩｇＧ溶液とした。上記各溶液を１００μｔ
ずつ本発明の分析容器に加え、６７℃　１．′５時間の
保温を行った後、該容器の上方の開口部から２．０　Ｋ
９／ｃｍ”の圧力で加圧し、反応溶液と担体を分離し、
そのまま下の容器の部分を励起フィルター４８５ｎｍ、
発光フィルター５２５　ｎｍ　を有する蛍光光度計を用
すて、各濃度の蛍光強度を測定し、検量線を作製した。

以下の表１に結果を示す。

表　１ ヒトＩｇＧ濃度（μｆ／ｍｌ）　蛍光強度（任意単位）
６４０　１　８７ ５２０　１７０ １　６０　１４３ ａ　Ｏ１ｉｓ ４０　８８ ２　ｏ　６２ １０　４０ ５　２８ ０　２１ 上記表１に示した結果から明らかなごとく、本発明の分
析容器を用いるとと′で良好な検量線を作製することが
できた。

実施例２ 正常ヒト血清を免疫吸着体（イムノアトソルベント）で
処理することでヒトＩｇ（）を含まない血清とした後ヒ
トＩｇＧを添加し１０μｆ／ｍｔ。

１００μｔ／ｒａｔ、６００μｆ／ゴのＩｇＧ濃度とな
るように調製した血清を試料とし、実施例１で用いた分
析容器を用い、かつ同じ分析手順で各試料について１０
回ずつ測定を行い、表１の検量線からＩｇＧ濃度を読取
り、その平均値、標準偏差、変動係数をめた。結果を以
下の表２に示す。

表　２ 表２の結果から明らかなように本発明の発毛容器を用い
た分析法は良好な再現性を有してしる。

〔発明の効果〕

本発明の分析容器は、操作が簡便でその製造が容易であ
り、パックグラウンドが小さく、測定範囲が広く、かつ
再現性が良好な免疫分析法を達成できるという極めて顕
著な効果を持っている。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の一実施の態様を示す分析容
器の縦断面図であり、第６図は第２図を分離した状態を
示す縦断面図である。 １：分析容器、２：分Ｎ１膜、６：固定化担体、４：反
応溶液、５：加圧方向、６：１液を受ける容器。 特許出願人　小西六写真工業株式会社 代理人　中　本　宏 １　同　井　上　昭 ↓↓↓ 第３図 手続補正賽（自発補正） 昭和５９年　６月６゛日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　昭和５８年特許願第５６６５９号Ｚ発
明の名称　分析器 五補正會する者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号名　称　
（１２７）　小西六写真工業株式会社代表者井手恵生 （前代表者用本信彦退任） （１）　明細書の発明の名称の欄 （２）　明細書の特許請求の範囲の欄 （３）　明却１曹の発明の詳細な説明の欄ｌ補正の内容 ＋１）　明細書の発明の名称のｍｖｃおける「分析容器
」を「分析器」と補正する、。 （２）　明ａ誉の特許請求の範囲の欄を別紙のとおシ補
正する。 （３）　明細書の発明の詳細な説明の榴葡下記のとおり
補正する。 （イ）　明細書第１頁下から８行、同頁下から７行、第
４頁８行、１１行、１３行、第５頁１行、第９頁下から
４行、第１０頁１１行、同頁下から５行、第１１頁５行
、第１２頁下から５行、同頁下から３行、第１６頁９行
、１３行、１５〜１６行、１７行、路行、第１４頁６〜
７行、第１５貞１０行、第１６頁２行、同頁下から７行
、第１７頁下から６行、第１８頁３行、第２０頁２行及
び９行の「分析容器」？「分析器」と補正する。 （ロ）同第４頁下から８行の「該分析」を削除する。 ０９　同第６頁９行の「特願昭５６−１５５７８８号」
？「特開昭５８−７Ｏｆ６５号」と補正する。 に）　同第６頁終行の「５」を「Ｑ、５」と補正する。 （ホ）同第７頁３〜４行の「抗原又は抗体ｔ」全削除し
、同頁５行の「抗原」の前に「例えば」全力ａ人する。 （へ）同第１ｏ貞８行の「加圧」の前に「常圧以上〜５
ゆ／−の」を加入し、同頁９行の「反応」を「免疫反応
用」と補正し、同頁１２行の「際、」の次に「容器には
」を加入する。 （ト）　同第１１頁４行の「らも」を「らをも」と、同
頁８行の「容器」を「分析器の分離膜」と各々補正し、
同頁１６行の「化合物」の次に１を含む」を加入する。 （７）　同第１３頁４〜５行の［ホルモン等の・・”’
ＢＪｋｒホルモン、ステロイドホルモン等のホルモン、
ＨＢ　Ｊと補正し、同頁７行の「免疫用」、同頁下から
４行の「分析」及び同頁長打の「反応用緩」ｔいずれも
削除し、同頁下から３行の「反応浴液」？「免疫反応用
緩衝液」と補正する。 四　同第１４頁１行の［両液、・・・担体、」及び同頁
５行の「分析」をいずれも削除する。 休）　同第１５負下から９〜８行の「第２図・・・とじ
た。」を削除し、同頁下から７行の「同Ｊ’ｌｒｒ第２
」と、同負下ヵ・ら４〜５行の「符号１で示した部分」
ｋ「分Ｍ膜上」と各々補正する。 （ＳＩＫＩＪ！ｌ　６頁１ｏ行（ＤｆＦＸ工ＯＪ’ｋｒ
Ｆ’工ＴＯＪと補正する。 レフ　同第１９頁表２の下段の部分全下記のとおり補正
する。 」 □□□同第２ｏ頁１１行の「分析」を削除し、同頁１２
行の「反応浴液」を「免疫反応用緩衝液７液」と補正−
Ｉｏる。 λ特許請求の範囲 １．　流体試料中の特定成分を免疫分析する＃ｆｐ、Ｖ
Ｃ使用する分析！においエユ１器内に分離膜勿設け、そ
の膜上に免疫反応用緩衝液、及び該流体試料中の特定成
分と特異的に結合することが可能な物質を固定化した担
体會保持し、かつ該分離膜は膜上からの加圧時のみ該緩
衝液全室む反応Ｍｆｉ勿透過きせることが可能な膜であ
ることを特徴とする分析器。 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　昭和５８年特許願第５６６３９号２発
明の名称　分析器 五補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号名　称　
（１２７）　小西六写真工業株式会社代表者井手恵生 （ほか１名） ５、補正命令の日付 昭和５９年７月２６日（発送日　昭和５９年７月５１日
）６、補正の対象 昭和５９年６月６日提出の手続補正書の補正の対象の欄 ２補正の内容 別紙Ωとおり・ 手続補正書（自発補正） 昭和５９年６月６日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　昭和５８年特許願＠３６６５９号λ発
明の名称　分析器 五補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２号名　称　
（１２７）　小西六写真工業株式会社代表者　井　手　
恵　生 （前代表者　用本信彦　退任） （ほか１名） ５、補正命令の日付　自発補正 ６、補正の対象 （１）明細書の発明の名称の欄 （２）明細書の特許請求の範囲の欄 （３）明細書の発明の詳細な説明の欄 （４）明細書の図面の簡単な説明の欄

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｔ　流体試料中の特定成分を免疫分析する際に使用する
   分析容器において、該分析容器内に分離膜を設け、その
   膜上に免疫反応用緩衝液、及び該流体試料中の特定成分
   と特異的に結合することが可能な物質を固定化した担体
   を保持し、かつ該分離膜は膜上からの加圧時のみ該緩衝
   液を含む反応溶液を透過させることが可能な膜であるこ
   とを特徴とする分析容器。